Изучение генетики человека

3.4 Дополнение. Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была открыта в 1984 г. Кэри Б.Мюллисом. Она основана на том, что новосинтезируемые цепи нуклеиновых кислот могут служить матрицами в следующих циклах репликации.

Принцип метода ПЦР показан на рис. 3.6. ПЦР осуществляется последовательными циклами. В каждом цикле происходят следующие события:

двухспиральная ДНК при нагревании разделяется на составляющие одноцепочечные цепи и в таком состоянии может служить матрицей для репликации;

далее одноцепочечные нити ДНК инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы и раствора, содержащего смесь всех четырех нуклеотидов, а также специфические последовательности ДНК (праймеры), что приводит к синтезу копий двух молекул ДНК.

Затем процедуры повторяются сначала, и происходит копирование как старых, так и новых од-ноцепочечных цепей с образованием третьей и четвертой копий молекулы ДНК, затем все четыре снова копируются, и образуется уже восемь молекул ДНК, и т.д. число растет в геометрической прогрессии. В результате 20-30 циклов амплифицируется (увеличивается число копий) эффективное количество ДНК- Отдельный цикл занимает около 5 мин, а для бесклеточного молекулярного клонирования фрагмента ДНК требуется всего несколько часов.

Метод ПЦР отличается очень высокой чувствительностью: он позволяет обнаружить в пробе всего одну присутствующую в ней молекулу ДНК. Тот же способ пригоден и для анализа следовых последовательностей РНК, для этого РНК переводят в последовательности комплементарной ДНК (кДНК), используя обратную транскриптазу. Метод получил широкое использование в пренатальной диагностике наследственных болезней, выявлении генетическую «дактилоскопию» даже по одной единственной клетке (см. раздел 4.3).

3.5 Задание

1. Какова молекулярная масса гена двух цепей ДНК, если в одной цепи запрограммирован белок с молекулярной массой 1500?

Примечание: молекулярная масса одной аминокислоты в среднем -- 100, одного нуклеотида -- 345.

2. Исследования показали, что 34% общего числа нуклеотидов мРНК приходятся на гуанин, 18% на цитозин. Определите процентный состав азотистых оснований, соответствующих двухцепо-чечной ДНК.

3. На фрагменте одной цепи ДНК нуклеотиды располагаются в последовательности ТТЦТЦТАЦ-ГТАТ. Нарисуйте схему двухцепочечной молекулы ДНК, объясните, каким свойством ДНК при этом вы руководствовались? Какова длина в нм, если каждый нуклеотид занимает 0,34 нм по длине цепи ДНК- Сколько содержится нуклеотидов в этой последовательности ДНК?

4. Участок полипептида представлен следующими аминокислотами: -сер-вал-глут-мет-тир-ала-вал-. Какое количество нуклеотидов входит в состав гена?

5. Какую длину имеет участок молекулы ДНК, кодирующий участок полипептида, содержащего 20 аминокислот, если расстояние между двумя нуклеотидами равно 0,34 нм?

6. В чем выражается свойство триплетности генетического кода (выберите одно из утвержде-

ний): в кодировании трех аминокислот одним нук-леотидом; в соответствии одной аминокислоте трех триплетов нуклеотидов?

7. В чем выражаются свойства универсальности генетического кода (выберите одно из утверждений): в соответствии одних и тех же триплетов ДНК одним и тем же аминокислотам; в соответствии нескольких триплетов одной аминокислоте; генетический код един для всех организмов; в соответствии аминокислотам определенных триплетов?

8. Что такое вырожденность генетического кода (выберите одно из утверждений): аминокислоты кодируются несколькими триплетами; один и тот же триплет кодирует несколько аминокислот и большинство аминокислот кодируется несколькими триплетами?

9. Рибонуклеаза поджелудочной железы содержит в кодирующем участке ДНК 42 нуклеоти-да. Укажите количество аминокислот, входящих в этот белок.

10. Молекула инсулина состоит из 51 аминокислотного остатка. Сколько нуклеотидов несет участок ДНК, кодирующий данный белок?

11. Дан участок ДНК -- ГТТЦТААААГГГЦЦЦ... Какова структура закодированного гена? Какова структура белка, если под воздействием химических мутагенов восьмой нуклеотид будет заменен цитозиновым? К каким биологическим последствиям это может привести? Перейдет ли такое изменение ДНК к потомству?

12. Последовательность нуклеотидов на мРНК ЦГГГГЦУУЦУАГААЦГАУГАГ. Укажите соответствующий этой последовательности участок гена антисмысловой нити ДНК, а также фрагмент белка, соответствующий данному участку ДНК. вирусных инфекций, а также в судебной медицине, поскольку дает возможность проводить

13. Какие изменения произойдут в строении белка, если на участке гена ТААТЦАААГААЦАААА между 10 и 11 нуклеотидами включается цитозин, между 13 и 14 тимин, и в конце добавляется аденин?

14. Участок гена, кодирующий полипептид, имеет следующий порядок азотистых оснований: ААААЦЦААААТАЦТТГТАЦГА. Во время репликации четвертый слева аденин выпал. Определите структуру полипептидной цепи в норме и после выпадения аденина.

15. Всякое ли изменение последовательности нуклеотидов ДНК сказывается на структуре и функции белка? Ответ поясните.

16. Сколько белков может кодировать один и тот же участок ДНК?

Глава 4. Хромосомы

4.1 Упаковка генетического материала

Если всю ДНК одной клетки вытянуть в одну линию, то ее длина была бы 1,74 м. Представленной в виде линии суммарной ДНК одного человека можно три раза обернуть земной шар по экватору. Поэтому хромосомы ядер клеток должны представлять собой сильно конденсированные структуры ДНК. При конденсации происходит уменьшение продольных размеров молекулы ДНК в десятки тысяч раз за счет образования сверхспиралей ДНК.

У эукариотических организмов значительная часть ДНК окружена множеством различных белков. Эти белки вместе с ДНК образуют комплексную структуру -- хроматин, который обеспечивает специфический для эукариот тип регуляции экспрессии генов. В состав хроматина входят очень длинные двухцепочечные молекулы ДНК и белки гистоны, кислые белки и небольшое количество РНК- Всего известно пять типов гистонов: HI, H2A, Н2В, НЗ, Н4. Гистоны объединяют несколько групп основных белков. HI наиболее слабо свя-

зан с хроматином. Ядра нуклеосом состоят из гис-тонов 4-х классов: Н2А, Н2В, НЗ, Н4. Высокая консервативность свидетельствует об идентичности функций этих белков у всех эукариот.

В хромосоме ДНК с помощью гистонов упакована в специальные регулярно повторяющиеся структуры -- нуклеосомы. Так образуется структура, похожая на бусы, где каждая бусина -- нук-леосома (диаметр около 10 нм). Нуклеосома представляет собой сегмент ДНК длиной около 200 пар оснований, навитый на белковую сердцевину, состоящую из восьми молекул белков-гистонов. Нук-леосомный кор (минимальная нуклеосома) «маскирует» 146 пар оснований ДНК. В нуклеосом-ную сердцевину (нуклеосомный кор) входит по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, НЗ, Н4. Поверхности этих белковых молекул несут положительные заряды и образуют стабилизирующий остов, вокруг которого может закручиваться отрицательно заряженная молекула ДНК. Гистон HI размещается на участках ДНК, соединяющих одну нуклео-сому с другой. ДНК этих участков называют соединительной, или линкерной. Предполагают, что HI, возможно, регулирует транскрипционную активность хроматина и не участвует в стабилизации структуры хромосомы. Нуклеосомы, в свою очередь, упакованы в фибриллы, которые располагаются в хромосоме в виде хроматиновых петель. Хроматида построена из хроматиновых петель. Способ упаковки хроматина представлен на рис. 4.1.

Митотическая хромосома состоит из двух сестринских хроматид и центромеры. В зависимости от расположения центромеры хромосомы морфологически разделяют на метацентрические -- центромера расположена посередине хромосомы, субметацентрические -- больше смещена к одному из краев и телоцентрические -- центромера расположена в теломерном (концевом) участке хромосомы.

4.2 Организация генов

Хромосома состоит из одной единственной молекулы ДНК, содержащей множество генов. Гаплоидный набор хромосом человека содержит 3,5х109 нуклеотидных пар, этого достаточно для кодирования 1,5 млн. пар генов. Однако данные по изучению генома человека показывают, что организм человека имеет не более 100 тысяч белков. Это значит, что в клетках человека только 1% ДНК кодирует образование белков. В отношении остальных 99% существуют разные гипотезы. Некоторая часть не транслируемых последовательностей ДНК регулирует экспрессию генов в ходе развития, дифференцировки и адаптации. Другая часть избыточной ДНК входит в состав интронов, неко-дирующих участков генов, разделяющих кодирующие области. И все же большая часть избыточной ДНК представлена многочисленными семействами повторяющихся последовательностей. ДНК генома эукариот можно разделить на два класса последовательностей: уникальные (неповторяющиеся) и повторяющиеся (повторы) последовательности ДНК. К первому относятся однокопийные гены, кодирующие белки. Класс повторяющихся последовательностей ДНК представлен повторами, которые встречаются у человека от 2 до 107.

У человека выделяют структурные гены, функционирование которых тесно связано со специфическими последовательностями в молекуле ДНК, называемые регуляторными участками (рис. 4.3).

Структурные гены подразделяют на независимые гены, повторяющиеся гены, кластеры генов, прерывистые гены:

независимые гены -- транскрибируются независимо, их транскрипция не связана с другими генами. Однако их активность может регулироваться, например, гормонами;

повторяющиеся гены -- в хромосомах один ген может находиться в виде повторов, повторяясь много сотен раз, вплотную следуя друг за другом, образуя тандемы. Пример, гены рРНК;

кластеры генов -- группы различных генов, находящиеся в определенных участках или локу-сах хромосом, объединенных общими функциями. В геноме человека, например, кластеры гистоно-вых генов повторяются до 10--20 раз, образуя тан-демные группы повторов. Между генами, объединенными в кластере общими функциями, находятся спейсерные участки. Спейсерная ДНК не всегда транскрибируется. Иногда эти участки несут информацию о регуляции или инициации транскрипции, но в основном это просто короткие повторы избыточной ДНК, роль которой не выяснена.

Это отличие связано с чередованием смысловых участков, несущих информацию о последовательности аминокислот в белке -- экзонов, и участков некодирующих последовательностей, которые по длине значительно больше экзонов -- интронов. В результате общая длина гена оказывается больше, чем можно было ожидать, примерно, в 5-7 раз.

В начале гена (до его смысловой части) находятся участки, которые обеспечивают правильную регуляцию работы гена. Их делят на две группы: неспецифические (одинаковые для всех генов) и специфические (характерные только для данного гена). Неспецифические регуляторные участки у эукариот называют «TATA-БОКС» (рис. 4.5). В них чередуются тимин и аденин. Этот участок лежит на 30 нуклеотидов левее начала считывания гена. Установлено, что РНК-полимераза так ложится на ДНК, что ее опознающая часть закрывает TATA-БОКС, а активный центр РНК-полиме-разы оказывается над первым считываемым ну-клеотидом. Далее следует промоторный участок, состоящий из сайта-узнавания, сайта-связывания и сайта-инициации (А или Г) транскрипции. Комбинация нуклеотидов в промоторе такова, что если рамка считывания устанавливается неверно, то получается последовательность, характерная для стоп-кодонов, и транскрипция останавливается. За промоторным участком следует палиндром («перевертыш»), или инвертированный повтор. Это двух-цепочечная последовательность ДНК, которая одинаково читается в обоих направлениях («казак» -- справа налево и слева направо читается одинаково). Иногда такую последовательность называют «областью с двойной симметрией», где осью симметрии является центральная точка, относительно которой последовательность остается одинаковой. Важное свойство палиндромов -- возможность образовывать шпильки в РНК или структуры креста -- в ДНК.

Если рамка считывания установлена неверно, то палиндром ДНК превращается в «крест», что делает невозможным дальнейшее продвижение фермента. Иногда палиндромы могут находиться в конце гена после его смысловой части и также, образуя «крест», будут прекращать синтез мРНК. Смысловая часть гена, как мы уже писали выше, состоит из чередующихся интронно-эк-зонных последовательностей. В структурной части гена расположены промотор и палиндром.

В последнее время выделяют включения специфической регуляции гена -- энхансеры. Они расположены впереди гена на расстоянии "в сотни и тысячи нуклеотидных пар. У эукариот существуют специальные регуляторные белки, опознающие энхансер и присоединяющиеся к нему. Таким образом происходит активизация гена.

Геном образован не только ядерными, но и цитоплазматическими генами. В геноме гены выполняют разные функции. В зависимости от выполняемых функций гены подразделяют на обязательные гены, они кодируют жизненно важные функции в клетках всех типов (иногда их называют генами «домашнего хозяйства»), структурные гены, регуляторные гены, пунктуационные гены.

4.3 Дополнение. Геномная дактилоскопия

В 1987 г. впервые была проведена идентификация личности по анализу ДНК (геномная дактилоскопия). Это стало возможным благодаря открытию Элика Джеффриза в 1985 г., связанному с обнаружением у генов человека структурного полиморфизма определенных тандемов, которые образуют «картину», специфичную для молекулы ДНК конкретного человека.

Тандемные последовательности состоят из многократно повторенных единиц, чаще богатых ГЦ парами. Частота повторов варьирует у различных индивидуумов от 14 до 300 раз.

Процесс идентификации ДНК сложен, но высокоэффективен. Процесс начинается с выделения ДНК, с последующей ферментативной обработкой специфическими рестриктазами, которые разрезают ДНК на отрезки. Отрезки группируют по размерам, а потом их идентифицируют радиоактивными маркерами -- зондами. Зонды искусственно синтезируют и радиоактивно метят по фосфору, они содержат определенные последовательности (ми-нисателлиты), богатые ГЦ нуклеотидными парами. Таким образом, используя один зонд, можно наблюдать за наследованием большого количества аллелей (рис. 4.6).

Получаемый сложный набор вариабельных полос и заключает в себе специфическую картину геномного «дактоотпечатка» (DNA fingerprint), аллели, формирующие эту картину, стабильны в соматических и зародышевых клетках и наследуются в соответствии с законами Менделя.

Это метод часто применяется для установления отцовства, т.к. практически все полосы геномного отпечатка данного человека должны выявляться в отпечатках либо его матери, либо отца. Около половины всех полос должны иметь отцовское происхождение. Случайное появление или отсутствие полос маловероятно. Если предположить, что скорость мутирования равна Ю-4 т.п.н., то при использовании всех трех проб разрешению поддаются в среднем 15 фрагментов отцовского происхождения в диапазоне длин 4-20 т.п.н. Вероятность того, что предполагаемый отец будет случайно иметь 15 фрагментов < 4 х 10~п, в случае, если он родственник истинного отца, то вероятность совпадения фрагментов равна < 10~5.

Весь процесс диагностирования продолжителен во времени (от 3-х до 4-х недель) и достаточно дорогостоящий. В настоящее время можно воспользоваться услугами такой диагностики в медицинских и юридических целях (установление отцовства, идентификация преступных или разыскиваемых лиц).

Громадное преимущество генетического метода опознания -- это небольшое количество биоматериала: следы кожных покровов, корни волос, высохшие капли крови и т.д., в этих случаях сначала проводят ПЦР (см. раздел 3.4).

4.4 Кариотип человека

Кариотип -- совокупность признаков хромосомного набора: форма хромосом, их количество, размеры, характерные для каждого вида.

Препараты хромосом человека можно приготовить из всех тканей и клеточных суспензий, содержащих делящиеся клетки. Но чаще препараты метафазных хромосом готовят из лимфоцитов периферической крови, которые предварительно культивируют в присутствии митогена (вещество, способное индуцировать митоз, в частности, фи-тогемагглютинин). Этот метод был предложен Мурхедом с соавт. в 1960 г.

Классификация и номенклатура равномерно окрашенных хромосом человека была выработана на международных совещаниях, созывавшихся в Денвере (I960), Лондоне (1963) и Чикаго (1966). Согласно рекомендациям этих конференций, хромосомы располагаются в порядке уменьшения их длины. Все хромосомы разделены на семь групп, которые были обозначены буквами английского алфавита от А до G. Все пары хромосом было предложено нумеровать арабскими цифрами.

Группа А (1--3) -- самые крупные хромосомы. Хромосомы 1 и 3 -- метацентрические, 2 -- суб-метацентрическая. Группа В (4--5) -- две пары довольно длинных субметацентрических хромосом. Группа С (6--X--12) -- хромосомы средних размеров. Хромосомы 6, 7, 8 и 11 больше похожи на метацентрики (центромерный индекс 40-30%). Хромосомы 9, 10 и 12 -- субметацентрики. Х-хромосома по размеру и морфологии сходна с хромосомами 6 и 7. Группа D (13--15) -- акроцентрические хромосомы средних размеров. Группа Е (16-- 18) -- довольно короткие хромосомы. Хромосома 16 более метацентрична, часто на промаксималь-ном конце длинного плеча имеется вторичная перетяжка. Группа F (19--20) -- самые маленькие метацентрики, практически между собой не различимы. Группа G (21--22) -- две пары самых мелких акроцентрических хромосом. Y-хромосома выделяется как самостоятельная (рис. 4.7, 4.8).

При этом хромосомы различных групп хорошо отличаются друг от друга, в то время как внутри группы их невозможно различить, за исключением группы А.

В начале семидесятых годов был разработан метод дифференциальной окраски хромосом, который позволил идентифицировать каждую из хромосом. На рис. 4.9 показана хромосома 1-го человека с изображением дифференциального окрашивания и нумерации сегментов.

Каждая хромосома человека содержит только ей свойственную последовательность полос, что позволяет точно идентифицировать каждую хромосому и с более высокой точностью определить, в каком сегменте произошла перестройка. Поперечная исчерченность хромосом есть результат неравномерной конденсации гетеро- (высокоспирализованная ДНК) и эухроматина (релаксиро-ванная ДНК) на протяжении всей длины хромосомы, отражающий порядок расположения генов в молекуле ДНК



Хромосомы в метафазе максимально конденсированы, в профазе и прометафазе более расплетенные, что позволяет выявлять еще большее количество сегментов -- 800-1200, некоторые авторы описывают более 2000. Этот метод используют для более точной идентификации точек разрывов хромосом и микроделеций (рис. 4.10).

На метафазной хромосоме .(рис. 4.10, 1М) слева приведены символы, которыми принято обозначать короткие (р) и длинные (q) плечи хромо- I сом, а также номера расположения сегментов. Эти обозначения используются при описании карио-типа. Сначала указывают общее число хромосом и набор половых хромосом, затем отмечается, какая хромосома лишняя или какой не хватает.



Указывается номер хромосомы и обозначается плечо, в котором произошли изменения (символы хромосомных аберраций см. в гл. 12), после написания символа плеча указывается номер сегмента. Например:

В настоящее время существуют ДНК-маркеры (или зонды) для многих еще более мелких сегментов практически всех пар хромосом. С помощью таких ДНК-зондов можно точно оценить наличие или отсутствие определенного, даже очень маленького, сегмента в хромосоме (рис. 4.11).



4.5 Дополнение. Феномен ассоциаций акроцентрических хромосом человека

Среди разновидностей неслучайного расположения хромосом в метафазе выделяют феномен центромерных ассоциаций (рис. 4.12).

Феномен ассоциации акроцентрических хромосом (ААХ) был впервые описан в 1961 г. M.A.Fer-gusson-Smith and S.D.Handmaker и получил название «спутничная ассоциация». Способность акроцентрических хромосом вступать в спутничные ассоциации была подтверждена многими исследователями (Прокофьева-Бельговская А.А. и др., 1969; Захаров А.Ф. и др., 1982 и др.).

Феномен ААХ привлекает пристальное внимание в связи с ядрышкообразующей функцией акроцентрических хромосом. С активностью ядрышка связывают процесс синтеза рРНК, из которой впоследствии формируются в цитоплазме рибосомы (рис. 4.13), а также и другие важные процессы функционирования ядра,.такие как транспорт различных видов РНК из ядра в цитоплазму, поэто+ му ААХ рассматривают как специфический показатель структуры и функции интерфазного ядра.

Уже в первых исследованиях было установлено, что феномен ААХ связан с ядрышкообразующей функцией акроцентрических хромосом в профазе митоза, когда еще сохраняется ядрышко и спирализация хромосом только начинается, остаточное ядрышко обычно связано со спутничными районами коротких плечей акроцентрических хромосом. Позже было показано, что короткие плечи всех 10 акроцентрических хромосом человека содержат 3 сегмента: Р1 -- проксимальная часть, прилегающая к центромере; Р2 -- спутничная нить, в районе которой располагается ядрышковый организатор (ЯОР); РЗ -- маленькое гетерохроматическое тельце, содержащее теломеру короткого плеча (Paris Conferens, 1971).

Одна из первых гипотез, объясняющих природу ААХ, была сформулирована А.А.Прокофьевой-Бельговской (1966): специфическая ориентация акроцентрических хромосом является следствием соматической конъюгации гомологических участков. Конъюгация происходит за счет относительной гомологии амплифицированных участков ДНК, расположенных в коротких плечах ААХ. Благодаря этому свойству гетерохроматиновых районов в интерфазном ядре формируются хромоцентры из гомологичных и негомологичных хромосом, что способствует определенной их упорядоченности в интерфазном ядре, которые сохраняются во время митоза в виде неслучайного расположения в ме-тафазной пластинке.

Если гипотеза А.А.Прокофьевой-Бельговской предполагает, что «формирование общего ядрышка представляет собой не причину ассоциаций, а следствие этого процесса», то противоположную точку зрения имеют авторы «нуклеолярной гипотезы» M.A.Fergusson-Smith and S.D.Handmaker. Они полагают, что если ядрышки в интерфазном ядре имеют тенденцию к слиянию, то этот процесс приводит к ААХ. По мнению многих исследователей, частота ядрышек в интерфазе высоко коррелирует с числом ААХ (Гиндилис В.Я., 1967; Ми-кельсаар А.В., 1979 и др.).

Данные последних лет о химическом составе хромосом, их молекулярной организации, строе нии и функции ЯОР акроцентрических хромосом человека позволяют сделать заключение, что «конъ-югационная» и «нуклеолярная» гипотезы о природе ААХ не взаимоисключают, а взаимодополняют друг друга.

По мнению исследователей, частота ААХ в популяции лимфоцитов является более информативным показателем, чем аберрации хромосом, так как она отражает все процессы жизнедеятельности клеток. Образование ААХ в интерфазе является нормальным и физиологическим процессом. Частота ААХ в лимфоцитах тесно связана с их иммунореактивностью, что постоянно наблюдается при развитии иммунных реакций, так как этот показатель характеризует пролиферативную активность лимфоцитов (Фролов А.К. и др., 1993). Все это позволяет широко применять метод учета ААХ как иммуноцитогенетический тест.

4.6 Задание

1. Что такое хромосома? хроматида? хромонема? хроматин? хромомера?

2. На каких стадиях митоза хромосомы хорошо видны? Ответ обоснуйте.

3. Что такое кариотип? Выберите правильный ответ: а) совокупность всех признаков и свойств организма; б) совокупность хромосом, характерных для данного вида; в) совокупность всех генов организма.

4. По какому признаку отличаются кариоти-пы мужчины и женщины: а) по количеству ауто-сом; б) по количеству гетерохромосом; в) по форме гетерохромосом; г) по гетерохромосомам; д) по соотношению аутосом и Х-хромосом?

5. Могут ли быть в кариотипе человека 30 хромосом отцовскими? Ответ поясните.

6. Объясните, чем различаются между собой следующие кариотипы: 47, XY, +21; 46, ХХ,-р21; 46, XX; 46, XY,+q21.

Глава 5. Клеточный цикл

Клеточный цикл -- период жизнедеятельности клетки от конца одного до конца следующего деления -- состоит из деления клетки и интерфазы. Интерфаза (период жизнедеятельности клетки между делениями) имеет 3 стадии: G, -- пресинтетическая, когда клетка увеличивается в размерах, специализируется и дифференцируется (2n2C); S

-- синтетическая, редупликация ДНК (2n4C); G2

-- постсинтетическая, когда клетка готовится к делению (2п4С), С -- количество молекул ДНК.

Интерфаза обычно занимает не менее 90% всего времени клеточного цикла.

Клеточный цикл может быть изображен в виде круга (рис. 5.1), на котором отмечены отдельные фазы цикла.

Клеточные циклы имеют разную продолжительность у одного и того же организма в зависимости от тканевой принадлежности. Например, у человека продолжительность клеточного цикла составляет: для лейкоцитов 3-5 суток, эпителия кожи -- 20-25 суток, эпителия роговицы глаза -- 2-3 суток, клеток костного мозга 8-12 ч, а нервные клетки живут, как правило, столько, сколько и человек, не завершая клеточный цикл (G,).

5.1 Пресинтетическая фаза

Процессы, протекающие в этой фазе, зависят от дальнейшей судьбы клетки. Если это бластная клетка -- она готовится к делению, и в этот период происходит накопление продуктов, необходимых для репликации хромосом, для удвоения цен-триолей и построения митотического аппарата. В этих клетках существует специальная система, контролирующая клеточный цикл в фазе Gr Эта система задерживает переход в фазу синтеза ДНК до тех пор, пока в клетке не будет достаточного запаса компонентов для завершения всех последовательных биосинтезов, необходимых в фазах S, G2 и деления клетки. Считают, что работа такой системы связана с триггерными белками (р21, р 16 и р27), которые ингибируют начало S-фазы. Высокая специализация клетки «обрекает» ее На дальнейшее совершенствование для организма -- сохранить высокоспециализированные клетки (например, нервные), такие клетки не завершают свой клеточный цикл. Каждая клетка организма имеет свою генетическую «программу жизни», которая включает выполнение специфических функций, и имеет определенную продолжительность жизни (например, лимфоциты живут от 3 дней до трех месяцев, эритроциты -- 120 дней, а сегментно-ядерные нейтрофилы -- 8 часов). Одна из современных гипотез предполагает, что на определенном этапе жизнедеятельности в клетках вырабатываются специфические белки семейства -- ВАХ, определенная концентрация которых приводит к гибели клетки.

В последние годы ведущая роль в регуляции клеточного цикла отводится белкам семейства циклинов, обуславливающих различия в длительности клеточного цикла в основном за счет изменения продолжительности фазы G, (рис. 5.2). Некоторые клетки делятся очень медленно, оставаясь в этой стадии месяцы и годы.



5.2 Синтетическая фаза

Поскольку каждая хромосома человека состоит из одной молекулы ДНК (в среднем содержащей около 150 млн нуклеотидов), то для полной репликации такой молекулы с помощью одной репликационной вилки -- репликона -- потребовалось бы 0,2 х 150 х 106 = 3 х 106 с, т.е. около 800 часов. Реально фаза S продолжается 8-10 часов. Показано, что репликация ДНК в фазе S у человека начинается сразу во многих точках генома, и каждая хромосома имеет несколько репликонов (от 20 до 80). На протяжении фазы S активизация новых репликонов происходит до полного завершения репликации всей ДНК- Скорость репликации не меняется, и работа репликационной вилки прекращается при встрече с соседней вилкой репликации.

5.3 Постсинтетическая фаза

Фаза G2 обеспечивает подготовку клеток к делению. Показано, что деление клетки не наступает, если блокируется синтез белков в G2. Существует гипотеза о том, что незадолго до конца фазы G2 активизируется киназа, что способствует переходу клеток из G2 к делению. В этот период происходит активное накопление энергии и ферментов, необходимых для реализации последующего деления, увеличение числа митохондрий, накопление АТФ, активизация биосинтеза для обеспечения репликации центриолей и начала образования веретена деления. Далее клетки вступают в период деления. Ниже приведены возможные типы деления клеток, каждое из которых заканчивается распределением органоидов и цитоплазмы (цитокинез).

5.4 Типы делений клеток

В основе передачи наследственной информации лежит деление клеток, являющееся частью жизни клеток.

Амитоз -- при этом способе деления клетка «перешнуровывается» нацело вместе с ядром. В результате из одной клетки образуются две дочерние, не идентичные друг другу, клетки (т.к. распределение наследственного материала и цитоплазмы неравномерно). У человека амитоз встречается в норме в клетках печени, эпителиальной ткани серозных оболочек, а также при необходимости быстрого восстановления тканей (после операций, травм и т.д.).

Митоз -- деление клеток, в результате которого из одной исходной материнской клетки получаются две дочерние, идентичные друг другу. Идентичность получается в результате механизма равномерного распределения наследственного материала между клетками за счет прохождения клетками ряда фаз (рис. 5.3).

Профаза -- хромосомы спирализуются, ядрышко и ядерная оболочка распадаются, кариоплазма и цитоплазма смешиваются, образуя миксоплазму, вязкость миксоплазмы уменьшается, хромосомы перемещаются в экваториальную плоскость. Это самая продолжительная фаза митоза. Затем клетка вступает во вторую стадию митоза -- метафазу. Хромосомы выстраиваются в одной плоскости по экватору, их центромеры расположены строго в экваториальной плоскости. Число фигур равно диплоидному набору, каждая фигура представлена парой сестринских (идентичных) хроматид, образованных в процессе репликации ДНК (в S -- период интерфазы). По продолжительности это самая короткая фаза митоза, так как она длится то мгновение, когда центромеры удвоенных хромосом располагаются строго по линии экватора. Уже в следующий момент начинается следующая фаза. Центромера начинает делиться, сестринские хроматиды расходятся к противоположным полюсам -- эта стадия называется анафаза. Далее хромосомы концентрируются вокруг соответствующих клеточных центров и деспирализуются. Начинают формироваться ядрышко и ядерные оболочки, образуется мембрана между сестринскими клетками, органоиды распределяются между новыми клетками. Эта последняя стадия митоза называется -- телофаза.

Митоз лежит в основе процессов роста, приводящих к образованию из зиготы взрослого организма. Фактически, это «биологическая штамповка» клеточного материала. В некоторых случаях образуются новые ядра, но цитокинез не происходит. Такая разновидность митоза называется митозом с задержкой цитокинеза, что приводит к образованию многоядерных клеток, выполняющих специфические функции (например, клетки печени человека).

Значение митоза:

точная передача наследственной информации;

увеличение числа клеток, т.е. один из главных механизмов роста организма;

способ регенерации клеток.

Мейоз -- способ деления, возникновение которого связано с появлением полового размножения (созревание гамет), поэтому его называют делением созревания. Мейоз состоит из двух последовательных делений ядра, каждое из которых состоит из про-, мета-, ана- и телофазы с индексами I или II (рис. 5.4).

Между 1-м и 2-м делением мейоза бывает стадия интеркинеза (ДНК не удваивается). Важным моментом является профаза I мейоза.

Лептотена -- стадия «букета», начало конденсации хроматина, образование хромомер (2n, 4C, где п -- число фигур деления, а С -- количество молекул ДНК).

Зиготена -- продолжение конденсации хроматина, начало конъюгации гомологичных хромосом (синапсис) и образование бивалентов (тетрад) и синаптонемального комплекса.

да гомологичные хромосомы конъюгируют между собой.

Мейоз иногда называют редукционным делением, или делением созревания, т.к. формирование гамет связано с этим типом деления клетки.

5.5 Задание

1. Укажите разновидности митоза, которые могут встречаться в клетках человека, и дайте им характеристику.

2. Перечислите известные вам типы деления клеток у человека, дайте им характеристику.

3. Могут ли соматические клетки в норме у человека иметь 45, 46, 47 хромосом? Ответ обоснуйте.

4. Правомочно ли называть интерфазу «паузой» между двумя мейотическими делениями?

5. Сколько хроматид отойдет к полюсам в ана-фазе-2 в мейозе у человека?

6. Если в культуре ткани человека произошла элиминация одной хромосомы, то сколько хромосом будет в дочерних клетках после митоза (рассмотрите возможность элиминации в разных фазах митоза).

7. Сколько бивалентов образуется в клетках человека и сколько хроматид в профазе-1 и про-фазе-2 мейоза?

8. Могут ли в клетках человека 24 хромосомы быть отцовскими?

9. Сколько хроматид отойдет к полюсам в клетках человека в анафазе-1 и анафазе-2 мейоза?

10. Если во время митоза у человека не разошлась одна пара хромосом? две пары? Сколько хромосом будет в дочерних клетках?

11. Какое количество хромосом и молекул

ДНК содержится в клетке в G1 и G2 периодах? Выберите правильный ответ: 2n 2C; 2п С; 4n 4C;

2n 4C; n 4C.

12. В каком из периодов клеточного цикла и фаз митоза хромосома состоит из одной хроматиды?

13. Какое количество хромосом и молекул ДНК содержится в телофазе митоза? Выберите правильный ответ: 2n 2C; 2п С; 4n 4C; 2n 4C; n 4C.

5.6 Лабораторная работа

Определение уровня митотической активности клеток

Для оценки пролиферативной активности (интенсивность деления клеток) ткани необходимо определить митотический индекс. Митотический индекс чаще всего определяется соотношением числа клеток, находящихся в митозе, к общему числу учтенных клеток исследуемой ткани. Кроме того, производится подсчет клеток, находящихся на разных стадиях фаз митоза, что позволяет определить относительную длительность различных фаз митоза к проценту от общего количества клеток, вступивших в митоз. Подсчет клеток на разных фазах митотического цикла проводят в нескольких полях зрения, при этом препарат необходимо передвигать последовательно через одно поле в сторону и затем снизу вверх и т.д., чтобы избежать просмотра одного и того же поля дважды. Данные по подсчету клеток по полям зрения заносятся в таблицу (табл. 5.1.) по каждой стадии митоза, а затем суммируются.

В связи с тем, что взятие биологического материала (биопсии) различных тканей человека практически не реально, предлагаем провести данную лабораторную работу по исследованию пролиферативной активности на примере корневой меристемы проростков однолетних растений (лук, пшеница, подсолнечник и т.д.) Семена растений предварительно замачивают в воде на 12 ч, затем проращивают на смоченной фильтровальной бумаге в чашках Петри в течение 24 ч. Кончики проросших корешков фиксируют в ацетаталкогольном растворе (3 части спирта: 1 часть уксусной кислоты) от 2 до 24 ч и окрашивают ацетоорсеином. Затем готовят временные давленные препараты.

Глава 6. Развитие зародыша человека

6.1 Гаметогенез

Материальной основой преемственности поколений является процесс оплодотворения, состоящий в слиянии гамет (яйцеклетки и сперматозоида), приводящий к образованию зиготы, из которой развивается новый организм.

Процесс формирования гамет у двуполых организмов называется гаметогенезом. В зависимости от того, какие формируются гаметы, он будет называться оогенезом (развитие женских гамет) или сперматогенезом (развитие мужских гамет). Кратко проследим эти процессы.

Сперматогенез

Сперматогенез происходит в извитых семенных канальцах семенников. Развитие сперматозоидов начинается в период пренатального развития при закладке генеративных тканей, затем возобновляется в период наступления половозрелости и продолжается до старости. Сперматогенез складывается из четырех периодов: размножения, роста, созревания и формирования (рис. 6.1).

Период размножения соответствует ряду следующих друг за другом митозов, приводящих к увеличению количества клеток, называемых спер-' матогониями. Некоторые сперматогонии вступают в период роста и называются сперматоцитами 1-го порядка.

Период роста соответствует периоду интерфазы клеточного цикла, в которой происходит удвоение наследственного материала спермацитов 1-го порядка (2п4С), и затем они вступают в профазу I мейотического деления. Во время профазы-1 происходит конъюгация гомологичных хромосом и обмен между гомологичными хроматидами (кроссин-говер). Кроссинговер имеет важное генетическое значение, так как приводит к возникновению генетических различий между индивидуумами.

Период созревания протекает в два этапа, что соответствует I мейотическому (редукционному) и II мейотическому (эквационному) делениям. При этом из одного сперматоцита 1-го порядка сначала получаются два сперматоцита 2-го порядка (1п2С), затем 4 сперматиды. (lnlC). Сперматиды отличаются друг от друга набором хромосом: они все содержат по 22 аутосомы, но половина клеток содержит Х-хромосому, а другая половина -- Y. Аутосомы отличаются между собой и от родительских различным сочетанием аллелей, поскольку произошел обмен во время кроссинговера.

Период формирования характерен только для сперматогенеза. Количество клеток и число хромосом в них на данной фазе не меняется, т.к. в этот период из 4 сперматид формируются 4 сперматозоида, в которых происходит морфологическая реорганизация клеточных структур, формируется хвост, у человека эта фаза продолжается 14 дней. Мужские половые клетки не развиваются одиночно, они растут в клонах и объединены между собой цитоплазматическими мостиками. Цитоплазматические мостики имеются между сперматогониями, сперматоцитами и сперматидами. В конце фазы формирования сперматозоиды освобождаются от цитоплазматических мостиков. У человека максимум дневной продуктивности сперматозоидов 10s, продолжительность существования сперматозоида до 2,5 ч во влагалище и до 48 ч в шейке матки.

Оогенез

Развитие женских половых клеток происходит в яичниках. Оогенез протекает в три периода: размножения, роста и созревания (рис. 6.2).

Период размножения наступает у оогоний еще у зародыша и прекращается к моменту рождения девочки.

Период роста при оогенезе более протяженвлиный, т.к. кроме подготовки к мейозу осуществляется накопление запаса питательных веществ, которые необходимы будут в дальнейшем для первых дроблений зиготы. Оогоний, вступившие в период роста, превращаются в ооциты 1-го порядка. Ооциты окружают фолликулярные клетки яичника. Ооцит вместе с фолликулярными клетками называют фолликулом. Накопление питательных веществ протекает в две фазы: фазе малого роста и фазе большого роста. В фазе малого роста происходит образование большого количества разных типов РНК. Быстрое накопление РНК происходит за счет специального механизма -- амплификации генов (множественное копирование отдельных участков ДНК, кодирующих рибосомную РНК). Быстрое увеличение мРНК идет за счет образования хромосом типа «ламповых щеток» (рис. 6.3). В результате образуется более тысячи дополнительных ядрышек, которые являются необходимой структурой для синтеза рРНК, из которой впоследствии формируются рибосомы, необходимые для синтеза белка. В период малого роста в ооците происходят мейотические преобразования хромосом, характерные для осуществления профазы 1-го деления.

В результате образуется более тысячи дополнительных ядрышек, которые являются необходимой структурой для синтеза рРНК, из которой впоследствии формируются рибосомы, необходимые для синтеза белка. В период малого роста в ооците происходят мейотические преобразования хромосом, характерные для осуществления профазы 1 деления.

В период большого роста в цитоплазме происходит накапливание питательных веществ. Фолликулярные клетки яичника образуют несколько слоев вокруг ооцита 1-го порядка, что способствует переносу питательных веществ, синтезированных в других местах, в цитоплазму ооцита. Завершив период роста, ооцит 1-го порядка вступает в период созревания (рис. 6.4).

Период созревания. В этот период осуществляется мейотическое деление клеток, так же как и в период созревания мужских половых клеток. При первом редукционном делении из ооцита 1-го по-

рядка образуется один ооцит 2-го порядка (1п2С) и одно полярное тельце (1п2С). При втором экваци-онном делении из ооцита 2-го порядка образуются созревшая яйцеклетка (lnlC), сохранившая практически все накопленные вещества в цитоплазме, и второе полярное тельце маленьких размеров (lnlC). В это же время происходит деление первого полярного тельца, дающего начало двум вторым полярным тельцам (In 1С). В результате при оогенезе получается 4 клетки, из которых только одна станет в дальнейшем яйцеклеткой, остальные 3 (полярные тельца) редуцируются. Биологическая значимость этого этапа оогенеза -- сохранить все накопленные вещества цитоплазмы около одного гаплоидного ядра для обеспечения нормального питания и развития оплодотворенной яйцеклетки. У женщин на стадии 2-й метафазы образуется блок, который снимается во время оплодотворения, и фаза созревания заканчивается только после проникновения сперматозоида в яйцеклетку.

У женщин процесс оогенеза -- это циклический процесс, повторяющийся примерно через каждые 28 дней (начиная с периода роста и заканчивая период только после оплодотворения). Этот цикл называется менструальным. В событиях, проходящих во время этого цикла, принимают участие яичники и матка, при этом цикл регулируется гормонами яичников (эстроген и прогестерон), секреция которых, в свою очередь, регулируется гипофизарыыми гормонами гонадотропина (рис. 6.5). Различают три гона-дотропных гормона, продуцируемых гипофизом:

О фолликулостимулирующий (ФСГ) -- вызывает рост овариальных фолликулов;

О л'ютеинизирующий (ЛГ)' -- сам по себе не влияет на увеличение яйцеклетки, но вместе с ФСГ вызывает образование фолликула, овуляцию и образование желтого тела;

лютеотропный (ЛТГ) -- ответствен за секрецию молока и поддержание желтого тела в функционирующем состоянии.

Связь между гормонами гипофиза и яичника показана на схеме (рис. 6.6).

Гормон гипофиза ФСГ, действуя вместе с небольшими дозами ЛГ, вызывает рост эстрогена в яичнике. Эстроген действует на гипофиз, стимулируя секрецию ЛГ и ЛТГ и понижая секрецию ФСГ. При этом происходят овуляция и образование желтых тел. Желтые тела продуцируют прогестерон при участии гипофизарного гормона ЛТГ.

Когда желтые тела начинают дегенерировать, количество гормонов яичника уменьшается, в результате чего вновь усиливается действие ФСГ в гипофизе, и овариальный цикл повторяется. Во время беременности желтое тело сохраняется и продуцирует гормон прогестерон, который тормозит рост фолликулов и овуляцию, затем регуляторные функции переходят от гормонов яичника к плацентарным гормонам.

6.2 Оплодотворение

Оплодотворение -- совокупность процессов, приводящих к слиянию мужских и женских гамет (сингамия), объединению их ядер (кариогамия) и образованию зиготы, из которой в дальнейшем будет развиваться организм. Значение оплодотворения: восстановление диплоидной генетической структуры в результате объединения отцовских и материнских генов, которое приводит к различному сочетанию родительских задатков и разнообразию особей; активация яйцеклетки, так как развитие яйцеклетки у млекопитающих останавливается на стадии метафазы второго деления, продолжение развития яйцеклетки наблюдается только после оплодотворения.

Оплодотворение состоит из 3-х последовательных этапов: первый этап характеризуется сближением сперматозоида и яйцеклетки до их контакта. Второй этап начинается с прикрепления сперматозоида к поверхности яйцеклетки и осуществления контактных взаимодействий между ними. Третий период начинается после проникновения сперматозоида в яйцеклетку и завершается объединением их ядер.

Дистантное взаимодействие между спермием и яйцом -- узнавание на расстоянии, разрыхление оболочки яйцеклетки при изменении рН среды в присутствии большого числа сперматозоидов. Эти процессы обеспечиваются рядом факторов, среди которых особое место принадлежит га-монам (вещества, выделяемые половыми клетками, способствуют встрече сперматозоида с яйцеклеткой и их соединению). При контакте сперматозоида с оболочкой яйца происходит акросом-

ная реакция. Она сводится к очень быстрым (занимающим не более 10-20 с) изменениям в акро-сомном аппарате головки сперматозоида, приводящим к высвобождению специальных ферментов, в частности, гиалуронидазы, которая разрушает слой фолликулярных клеток и позволяет сперматозоиду достичь поверхности яйца.

Слияние гамет и предотвращение полиспермии (цитогамия). Сперматозоид приближается к поверхности яйцеклетки и сливается с ее плазматической мембраной боковой поверхностью головки, образуя цитоплазматический мостик, по которому в цитоплазму переходят ядро и центриоль сперматозоида. Сперматозоид проникает в цитоплазму яйцеклетки, изменяется агрегатное состояние яйцеклетки, уплотняется оболочка, яйцеклетка становится непроницаемой для других сперматозоидов. У человека проникновение сперматозоида в яйцеклетку является сигналом для начала второго мейотического деления, которое приводит к образованию гаплоидного ядра яйцеклетки и трех полярных телец.

Слияние генетического материала. Высококон-денсированное ядро сперматозоида начинает набухать, хроматин разрыхляется, и ядро превращается в структуру, названную мужским пронук-леусом. Такие же изменения происходят в женском ядре, которые приводят к образованию женского пронуклеуса. В процессе формирования про-нуклеуса происходит синтез ДНК. (1п2С), и про-нуклеусы перемещаются к центру яйцеклетки. Затем ядерные оболочки пронуклеусов разрушаются, и пронуклеусы сливаются (кариогамия). При объединении пронуклеусов образуется зигота с диплоидным числом хромосом (2п4С).

В результате оплодотворения в зиготе получается набор парных хромосом: половина хромосом отцовского, половина -- материнского происхождения. В зиготе заложены новые комбинации генов и признаков. Восстановление диплоидности набора -- сигнал к запуску первого митоза.

6.3 Особенности раннего онтогенеза

Зигота начинает делиться митотически. Далее проходят все этапы пренатального развития:

дробление -- серия митотических делений, в результате которых огромный объем цитоплазмы разделяется на различные клетки (бластомеры), у человека процесс заканчивается образованием бластоцисты;

гаструляция -- интегрированный процесс перераспределения клеток бластулы. Во время гаструлы клетки занимают новое положение и приобретают новых соседей. В этот период устанавливается план строения тела животного, состоящего из эктодермы (наружный слой) и энтодермы (внутренний слой), между экто- и энтодермой образуется третий слой -- мезодерма -- стадия трех зародышевых листков. Из каждого зародышевого листка формируются различные ткани и органы (табл. 6.1);

О нейруляция -- процесс формирования нервной трубки, которая затем даст начало головному и спинному мозгу.

На 6-9-й день после оплодотворения развивающаяся зигота (бластоцист) погружается в стенку матки -- имплантация (рис. 6.8).

Наружные клетки бластоциста образуют трофобласт, а из внутренней массы будет развиваться сам зародыш. В трофобласте развиваются многочисленные выросты -- ворсинки, в которые врастают клетки внезародышевой мезодермы, образуя там кровеносные сосуды. Трофобласт с ворсинками называют хорионом. Хорион играет важную роль в питании развивающегося зародыша и удалении конечных продуктов обмена. На ранних стадиях обмен веществами между зародышем и матерью проходит через ворсинки хориона, затем развивается особый орган -- плацента, который более эффективно осуществляет обмен между зародышем и материнским организмом (рис. 6.9).



В конце 3-й недели у зародыша начинают закладываться органы: начинает формироваться нервная, пищеварительная, кровеносная и др. системы. На пятой неделе образуются зачатки рук и ног. Между 6-й и 8-й намечаются черты лица. К 8-й неделе заканчивается закладка органов. Зародыш имеет длину 4 см и весит 5 граммов.

Таблица 6.1 Зародышевые листки и закладка органов

Зародышевые листки	Системы органов
Эктодерма	Кожа, нервная система, органы чувств
Энтодерма	Пищеварительная и дыхательная системы и пищеварительные железы
Мезодерма	Все ткани внутренней среды, мышечная ткань, выделительная система, семенники, яичники

В конце 2-го месяца дифференцированы голова и туловище, на 3-м -- конечности, на 5-м прослушивается сердцебиение, плод начинает двигаться, в конце 6-го созревают внутренние органы, на 8-м плод жизнеспособен, но еще нуждается в условиях внутриутробного развития (табл. 6.2).

Таблица 6.2 Основные морфогенетические процессы развития человека

Морфогенетический процесс	Дни после оплодотворения
Дробление	0-8
Имплантация	6-7
Появление нервн. пластинки	18-20
Первая жаберная дуга	20
Первое биение сердца	22
Начало развития нервной, пищеварительной систем и кровеносных сосудов	24
Появл. щитовидной железы	27
Появление зачатка легкого	Зародыш чувствителен к медикаментам, к вирусу краснухи	28
Появление пальцевых лучей верхн. конечностей		35
Дифференцировка семенников у мужского пола	43
Разделение пальцев	43
Образование перегородок в сердце	46-47
Полное закрытие неба	56-58
J-e мейогическое деление ооцитов 1-го порядка У зародыша жен.пола	75
Сформированы все основные системы органов (но размеры их очень малы)	90
Роды	270

Перинатальный период начинается с 28 недели беременности, включая роды (натальный период), и заканчивается через 7 дней. После чего начинается постнатальный период, включающий всебя всю жизнь человека от рождения до-смер-ти послеродовой (новорожденный, первый месяц после рождения: грудной до 12 месяцев), ясельный (1--з года), дошкольный (3-7 лет), школьный (детский, подростковый и юношеский), молодость, зрелость, пожилой возраст, старость.

6.4 Дополнение. Тератология

Процесс индивидуального развития организма, начинающийся с момента оплодотворения, Имеет ряд критических периодов. Критическими периодами называют определенные этапы в онтогенезе, когда организм является наиболее уязвимым И различным факторам, воздействующим на организм. Группу факторов, которая приводит к развитию грубых аномалий, называют тератогенами, а науку, изучающую эти аномалии, тератологией;

...