Наиболее изученными негистоновыми белками хроматина является группа белков высокой подвижности - HMG (high mobility group). Первоначально они были обнаружены как примесь к гистону H1, отличаясь более высокой электрофоретической подвижностью. В настоящее время хорошо изучены 5 белков этой группы - HMG-1, -2, -14, -17, -20. Белки HMG-1 и HMG-2 (молекулярная масса 26 кД) имеют близкие последовательности, они способны приобретать глобулярную форму и связываться с ДНК. Белки HMG-14 и HMG-17 (молекулярная масса около 10 кД) также гомологичны между собой, но отличаются от предыдущих белков, обладая способностью связываться с гистонами. Белок HMG-20, или убиквитин (молекулярная масса 8,5 кД), содержится не только в ядре, но и в цитоплазме. Он способен ковалентно присоединяться к C- концу других белков, ускоряя их протеолиз. Так, например, при созревании эритроцитов удаление белков, уже выполнивших свою функцию, осуществляется путем АТФ-зависимого протеолиза с участием убиквитина. В ядре убиквитин присоединяется к гистону H2A, формируя белок A24, который локализован в местах активной транскрипции ДНК. Все HMG-белки содержат ДНК-связывающий домен (HMG-домен), состоящий из 80 аминокислотных остатков. В последнее время этот домен обнаружен и в других белках хроматина, например, в некоторых регуляторах транскрипции.

Все HMG-доменные белки подразделяются на два типа. К первому типу относятся HMG-1, HMG-2 и белок UBF, который регулирует РНК-полимеразу I, синтезирующую рРНК. Эти белки имеются у всех клеток, могут содержать несколько HMG-доменов, но не обладают селективностью к нуклеотидным последовательностям ДНК. Второй тип HMG-белков содержит только один домен, который узнает участки ДНК с высокой специфичностью. Эти белки встречаются у ограниченного числа клеточных типов. Примером может служить транскрипционный фактор LEF-1, который характерен для лимфоцитов. Белки, имеющие один HMG-домен, распознают и с высокой эффективностью связываются с нерегулярными структурами ДНК. К ним относятся одноцепочечные участки, крестообразные хиазмы, химически модифицированные участки и другие структуры в молекуле ДНК.

5.2.3 Уровни структурной организации хроматина

Молекулы ДНК имеют диаметр 2 нм, но их длина в хромосомах может достигать нескольких сантиметров. Очевидно, что упаковка таких длинных молекул в объеме клеточного ядра, имеющего диаметр всего 58 мкм, должна быть в высшей степени регулярной. Проблема укладки молекул ДНК в ограниченном объеме ядра осложняется еще и тем, что одновременно необходимо обеспечить возможность локальной распаковки ДНК и доступа к ней ферментов репликации и транскрипции. Вот почему хроматин в клеточном ядре образует сложные пространственные структуры с несколькими уровнями организации.

Первый уровень укладки ДНК в хроматине обеспечивается нуклеосомами. Они представляют собой округлые частицы диаметром 15 нм, которые связаны между собой участками ДНК длиной около 20 нм. Отдельная нуклеосома состоит их белковой сердцевины, на которую накручена молекула ДНК.

Белковая сердцевина нуклеосомы, или кор, имеет форму диска диаметром 11 нм и толщиной 6 нм. Она содержит по две молекулы гистонов H2A, H2B, H3 и H4. Если развернуть сердцевину, то можно обнаружить, что молекулы гистонов соединены в последовательности H2A, H2B, H4, H3, H3, H4, H2B, H2A. При сворачивании сердцевины молекулы гистонов располагаются как бы в два этажа, наподобие винтовой лестницы.

Молекула ДНК в виде левозакрученной суперспирали совершает 1,75 оборота вокруг сердцевины. При этом в непосредственный контакт с гистонами вступает 146 пар нуклеотидов. Длина линкерной ДНК, соединяющей соседние нуклеосомы, колеблется в пределах 4070 пар нуклеотидов в зависимости от типа клетки. Таким образом, на одну нуклеосому приходится в среднем около 200 пар нуклеотидов ДНК.

Нуклеосомы укорачивают молекулу ДНК примерно в 7 раз. Они обнаружены во всех эукариотических клетках и даже у ДНК-содержащих вирусов. Однако это не означает, что вся ДНК клеточного ядра связана с нуклеосомами, и некодирующие повторы могут иметь другую укладку.

Второй уровень укладки ДНК обеспечивается взаимодействием линкерной ДНК с гистоном H1. Молекула гистона H1 своим глобулярным доменом связывается с двумя витками ДНК на нуклеосоме. Одновременно C-концевой фибриллярный домен гистона H1 вступает в контакт с линкерной ДНК. В результате соседние нуклеосомы приближаются друг к другу, формируя группы из 68 частиц - нуклеомеры (супербусины) диаметром 2530 нм.

Последовательность аминокислот в C-домене гистона H1 гомологична первичной структуре некоторых регуляторов транскрипции. В связи с этим предполагается, что гистон H1 конкурирует с факторами транскрипции за связывание с линкерной ДНК, контролируя тем самым активность генов.

Третий уровень укладки ДНК представлен хроматиновыми фибриллами диаметром 30 нм, которые хорошо видны в электронном микроскопе в интерфазных ядрах и митотических хромосомах. Они имеют суперспиральную структуру и содержат максимально сближенные между собой нуклеомеры. В формировании фибрилл диаметром 30 нм принимают участие гистон H1, а также негистоновые белки с HMG-доменом. За конденсацию хроматина в фибриллу диаметром 30 нм отвечает, прежде всего, C-концевой домен гистона H1. При этом первостепенное значение приобретает уже не взаимодействие гистона с ДНК, а взаимные связи гистоновых молекул между собой.

Образование нуклеомеров и хроматиновых нитей диаметром 30 нм вызывает дальнейшую компактизацию ДНК в 4050 раз.

Четвертый уровень укладки ДНК обеспечивается взаимодействием фибрилл диаметром 30 нм с ядерным матриксом. При этом формируются петлевые домены, содержащие в среднем 90 тысяч пар нуклеотидов. В расправленном состоянии их длина может достигать 20 мкм. Концы таких петель прикреплены к ядерному матриксу в особых точках, обозначаемых как MARs (matrix attachment regions) или SARs (scaffold attachment regions). Эти точки содержат молекулы свободной ДНК (“форум-ДНК”) длиной 50150 пар нуклеотидов, которые устойчивы к действию нуклеаз и выделяются из ядра независимо от высокомолекулярной ДНК. Точки MARs содержат также топоизомеразу II, участвующую в формировании изгибов ДНК. Со стороны ядерного матрикса прикрепление хроматиновых нитей обеспечивается ламином A.

Петлевые домены являются типовой структурно-функциональной единицей хроматина. Домен во многом автономен, независимо реплицируется и транскрибируется. В своем составе домены имеют кластеры генов, которые связаны функционально. Петлевые домены обеспечивают компактизацию молекулы ДНК в 700 раз.

Пятый уровень укладки ДНК связан с формированием групп из 1820 петлевых доменов, прикрепленных в виде розетки к общему центру из белков ядерного матрикса. Розетки из петлевых доменов находятся в хроматине в компактном состоянии, образуя округлые гранулы диаметром около 150 нм - хромомеры. При активации локализованных в хромомере генов его величина может возрастать до 300 нм и более.

Шестой уровень укладки ДНК определяется формированием хромонемы - фибриллярной структуры диаметром 200300 нм, состоящей из плотно упакованных хромомеров. В хроматине интерфазного ядра хромонемы обычно не выявляются. Они становятся видимыми только при конденсации хроматина в профазе митоза, а также в ранней телофазе при деконденсации хромосом. Хромомерный и хромонемный уровни укладки позволяют укоротить длину молекулы ДНК в 10 000 раз.

Седьмой уровень укладки ДНК состоит в образовании хроматид (однохроматидных хромосом) из хромонем. Толщина хроматиды составляет в среднем 700800 нм. Если учесть, что толщина хромонемы обычно равна 100-200 нм, то коэффициент упаковки для хромосомного уровня составляет не более 10. Способ укладки хромонемы в хромосоме изучен недостаточно. У одних видов хромонема имеет вид спирали, у других в одной хромосоме могут обнаруживаться две и более параллельные друг другу хромонемы. Хромосомный уровень укладки ДНК в большей степени, чем другие уровни, отражает видовые особенности организации генома эукариот.

Каждый вид, как известно, имеет характерный для него набор хромосом. Однако хромосомы можно наблюдать в микроскоп только при делении клеток митозом или мейозом. В ядрах неделящихся клеток хромосомы находятся в деконденсированном состоянии, образуя хроматин. Тем не менее, даже в интерфазном ядре хромосомы сохраняют свою индивидуальность, занимая в нем определенные хромосомные территории. Согласно К. Раблю (1885) хромосомы прикреплены к нуклеолемме теломерными концами, тогда как центромерные участки располагаются ближе к центру ядра. Новейшие исследования интерфазного ядра с помощью конфокальной микроскопии подтверждают эту концепцию, добавляя к ней ряд существенных деталей. В частности, гомологичные хромосомы локализованы на противоположных сторонах ядра. При активации генов и сопутствующей этому деконденсации хромосомы удлиняются, смещаясь к центру ядра. Вот почему в животных и некоторых растительных клетках гетерохроматин концентрируется преимущественно по периферии, тогда как эухроматин занимает центральную область ядра.

5.3 Ядрышко

Ядрышко выявляется внутри ядер в живых и фиксированных клетках как округлое тельце диаметром 15 мкм. Основным химическим компонентом ядрышка являются белки, которые составляют до 90 % его массы. Кроме белков они содержат также РНК (1016 %) и ДНК (до 8 %). Ядрышко способно отделяться от хроматина и удерживать при этом участки ДНК, связанные с ним.

Крупные ядрышки обнаруживаются у всех активно синтезирующих белки клеток, которые отличаются базофилией цитоплазмы из-за большого числа рибосом. Подобная картина наблюдается как в интенсивно делящихся клетках, так и в неделящихся клетках, для которых характерна продукция большого количества белка (например, в железистом эпителии). Ядрышки отсутствуют в клетках дробящихся яиц, а также в некоторых высокодифференцированных клетках со сниженным уровнем метаболизма (например, в лейкоцитах крови).

Ядрышко является местом синтеза рРНК и образования предшественников рибосом. В нем выделяют следующие структурные компоненты:

ядрышковый организатор (фибриллярный центр);

плотный фибриллярный компонент;

гранулярный компонент;

околоядрышковый гетерохроматин;

белковый сетчатый матрикс;

Ядрышковый организатор, морфологически выявляемый в виде фибриллярного центра, представляет собой хроматин, в котором локализованы гены рРНК. Он является наиболее стабильной частью ядрышка и сохраняется при делении клетки, когда функционирование ядрышек временно прекращается. Ядрышки клеток человека могут содержать до 30 фибриллярных центров.

В электронном микроскопе фибриллярные центры выглядят как небольшие округлые образования низкой электронной плотности, образованные фибриллами диаметром 23 нм. Эти фибриллы представляют собой нити ДНК, содержащие неактивные гены рРНК. Активно транскрибируемые гены рРНК локализуются по периферии фибриллярных центров.

Рибосомные гены представлены в геномах эукариот сотнями и тысячами копий. У человека имеется 540 копий рибосомных генов, но в ядрышке активируется не более 140. У амфибий число копий может достигать 20 000. Рибосомные гены собраны в кластеры, локализованные в районах вторичных перетяжек хромосом.

Фибриллярные центры отличаются пониженным содержанием гистона H1 и избирательно импрегнируются AgNO3. Это свойство фибриллярных центров обусловлено особыми белками, которые содержат аминокислоту диметиларгинин и сильно фосфорилированы.

Плотный фибриллярный компонент окружает фибриллярные центры, отличаясь от них повышенной электронной плотностью. Он образован фибриллами диаметром 48 нм, содержащими РНК. Эти фибриллы состоят из высокомолекулярного предшественника рРНК (45S пре-рРНК), который образуется на границе с фибриллярным центром путем транскрипции рибосомных генов РНК-полимеразой I. Они также содержат рибосомные белки, которые связываются с первичным транскриптом.

В дальнейшем происходит расщепление предшественника рРНК на более короткие фрагменты при помощи нуклеаз. Специфическими маркерами процессинга рРНК являются белки нуклеолин и фибрилларин.

Гранулярный компонент состоит из гранул размером 1520 нм, которые заполняют пространство вокруг фибрилл, занимая до 80 % объема ядрышка. Эти гранулы содержат РНК и белки и являются предшественниками субъединиц рибосом различной степени зрелости. Маркерным белком сборки предшественников рибосом является полипептид B23.

Гранулярный компонент возникает в результате расщепления фибриллярного компонента. Если обработать клетки антибиотиком актиномицином D, который подавляет синтез РНК, то происходит сегрегация фибриллярного и гранулярного компонентов и постепенная деградация последнего. Иногда фибриллярный и гранулярный компоненты ядрышка образуют комплекс удлиненных тяжей шириной до 200 нм - нуклеолонему.

Околоядрышковый гетерохроматин окружает ядрышко по периферии, но может также заходить в него между петлями нуклеолонемы. В электронном микроскопе видно, что он состоит из хроматиновых фибрилл диаметром 30 нм. Околоядрышковый гетерохроматин, вероятно, определяет локализацию ядрышка в клеточном ядре.

Белковый сетчатый матрикс выявляется в ядрышке после экстракции из него РНК, ДНК и белков. Он представлен рыхлой фибриллярной сетью, которая заполняет весь объем ядрышка. Белковый матрикс ядрышка является составной частью ядерного матрикса.

В некоторых клетках вблизи от ядрышек располагаются тельца Кахаля (клубочковые тельца) округлые аргирофильные образования диаметром от 100 нм до 1 мкм. Они были открыты в нейронах головного мозга млекопитающих испанским цитологом С. Рамон-и-Кахалем в 1903 г. Позднее они были обнаружены также в клетках растений, насекомых и амфибий. В эмбриональных клетках тельца Кахаля формируют парную структуру - gem. В последнее время установлено, что эти органоиды содержат ферменты, регуляторные белки и рибонуклеопротеиды, принимающие участие в транскрипции ДНК. Специфическим маркером телец Кахаля является белок коилин с молекулярной массой 80 кД. Предполагается, что тельца Кахаля, тесно взаимодействуя с ядрышками, обеспечивают созревание транскриптосом особых органоидов, обеспечивающих транскрипцию гистоновых и других крупных генных локусов. На роль транскриптосом претендуют интерхроматиновые гранулы.

6. Включения

В отличие от органоидов включения рассматриваются как необязательные (временные) компоненты клетки. Тем не менее, они широко распространены в клетках простейших, растений и животных. Как правило, включения возникают при накоплении в клетке большого количества какого-либо органического или неорганического вещества. Если вещество поступает в клетку извне, такие включения называются экзогенными. Выведенные из метаболизма продукты самой клетки могут формировать эндогенные включения. Особый тип представляют собой вирусные включения, которые наблюдаются у инфицированных вирусами клеток. Хотя они и возникают в результате синтетической деятельности клетки, первичным источником этих включений является вирусный геном, который проникает в клетку извне.

Включения имеют различные размеры и форму и могут обнаруживаться как в цитоплазме, так и в ядре, Пользуясь только световым микроскопом, включения трудно отличить от органоидов. С помощью электронного микроскопа можно, однако, убедиться в том, что включения не имеют собственной мембранной оболочки и располагаются непосредственно в гиалоплазме, ядре или матриксе митохондрий и пластид. Природу включений можно установить, используя цитохимические методы.

6.1 Экзогенные включения

Попадающие извне вещества могут откладываться в виде экзогенных включений. Включения этого типа часто содержат соли металлов, порошки, пигменты растительного происхождения и другие вещества, которые придают клеткам характерную окраску. Например, серебро, поглощаясь эпидермисом, формирует включения, которые придают коже сероватый оттенок. Избыточное потребление моркови или помидоров может приводить к появлению у кожи желто-красного оттенка из-за накопления в жировых клетках растительного пигмента каротина. При поступлении свинца в организм он откладывается в деснах в виде синей каймы. Большое количество включений обнаруживается в погибших макрофагах легких, которые очищают альвеолы от попавшей туда пыли.

6.2 Эндогенные включения

Этот тип включений связан с регуляцией метаболизма клеткой и обеспечивает накопление в цитоплазме продуктов обмена углеводов, липидов, белков и других биогенных веществ, в том числе и продуктов распада. Например, в цитоплазме животной клетки часто формируются включения гликогена, который используется как источник вещества и энергии при делении, мышечном сокращении, голодании и других физиологических процессах. Особенно много включений гликогена обнаруживается в печени, служащей главным местом депонирования глюкозы. Включения гликогена в клетках печени имеют вид собранных в небольшие гроздья гранул диаметром 70 нм. В клетках сердечной мышцы человека гранулы гликогена одиночные, округлой формы, несколько крупнее рибосом. В лейкоцитах тюленей крупные неправильной формы гранулы гликогена можно наблюдать не только в гиалоплазме, но и в митохондриях, что объясняется своеобразной энергетикой морских млекопитающих.

У растений запасание глюкозы происходит в виде зерен крахмала, которые располагаются не только в гиалоплазме, но и в матриксе хлоропластов. Морфология включений растительной клетки, содержащих крахмал и другие углеводы, в значительной мере видоспецифична.

Основным местом депонирования липидов у животных являются специализированные клетки липоциты. Белая жировая ткань образована клетками, которые содержат одну большую каплю нейтрального жира. Бурая жировая ткань также состоит из липоцитов, но липиды в их цитоплазме формируют многочисленные мелкие капли. Липидные капли часто встречаются в цитоплазме низших растений, а также в семенах некоторых высших растений.

Белки в здоровой животной клетке не депонируются. Поэтому белковые включения в основном характерны для растительных клеток, где они часто образуют псевдокристаллы. Такие включения могут быть локализованы как в гиалоплазме, так и в пластидах.

Пигментные включения содержат окрашенные органические вещества и поэтому легко обнаруживаются в растительных и животных клетках при помощи светового микроскопа. В хлоропластах пигментные включения пластоглобулы накапливают каротиноиды, которые придают окраску цветкам и плодам. Цвет глаз, кожи и ее производных у животных и человека обусловлен размерами и количеством зерен, содержащих черный пигмент меланин. При старении в остаточных тельцах клеток сердечной мышцы и печени накапливаются гранулы золотисто-коричневого пигмента липофусцина.

6.3 Вирусные включения

Впервые этот тип вкелючений был обнаружен Д. Ивановским в клетках, зараженных вирусом табачной мозаики (1882). Он выявляется в зараженных вирусами клетках как с помощью светового, так и электронного микроскопа. Вирусные включения состоят из вирусных частиц, их компонентов, а также из патологически измененных клеточных органоидов. Их формирование характерно для большинства ДНК-содержащих и ряда РНК-содержащих вирусов, что используется в диагностике вирусных инфекций.

При оспе в цитоплазме зараженной вирусом клетки образуются тельца Гварниери. Они окрашиваются красителем Романовского-Гимзы в красный цвет и дают положительную реакцию Фельгена на ДНК. Изучение ультраструктуры телец Гварниери показало, что они состоят из скоплений созревающих вирусных частиц, паракристаллических образований, гипертрофированного пластинчатого комплекса и митохондрий.

Вирус герпеса также вызывает образование округлых оксифильных включений, но не в цитоплазме, а в ядре зараженной клетки. Они состоят из вирусных ДНК, белков и вирусных частиц различной степени зрелости.

Для зараженных РНК-содержащим вирусом бешенства нейронов характерны цитоплазматические включения Бабеша-Негри, которые представляют собой обширные скопления вирусной РНК и белков.

Образование вирусных включений обусловлено тем, что вирусные молекулы синтезируются инфицированной клеткой с большим избытком и не расходуются полностью в процессе созревания нового поколения вирусных частиц.

7. РАЗМНОЖЕНИЕ И ГИБЕЛЬ КЛЕТОК

Эукариотические клетки размножаются с помощью деления. То, что деление клеток эукариот осуществляется кроме прямого деления - амитоза еще и непрямым делением - митозом, или кариокинезом, стало известно после выхода в свет монографии немецкого цитолога В. Флемминга “Клеточная субстанция, ядро и клеточное деление” (1882). С тех пор до середины XX в. считалось, что клетка может или размножаться путем деления, или находиться в состоянии покоя, которое обозначается как интерфаза.

В 1951 году М. Говард и С. Пелк с помощью радиоактивно меченого предшественника ДНК H3-тимидина обнаружили, что интерфаза не является состоянием покоя, поскольку в ней происходит редупликция ДНК. После этого открытия период времени от одного деления клетки до другого стали называть клеточным циклом, имея в виду, что в интерфазе происходит подготовка клетки к делению.

Однако не всегда клетки готовятся к делению. Значительная часть клеток в организме может временно или необратимо выходить из клеточного цикла. В связи с этим возникло понятие “пролиферация клеток”, под которым понимают такое состояние клетки, когда она готовится к делению или совершает его. Другими словами, пролиферирующие клетки находятся в клеточном цикле, а непролиферирующие вышли из него.

В 1961 г. американский цитолог Л. Хейфлик обратил внимание на то, что выделенные из тканей клетки (первичные культуры клеток) после нескольких делений погибают. Число делений клеток до гибели зависит от возраста донора. Если клетки брать у эмбриона, то число делений достигает 5070, если у новорожденного - то 2030. Клетки, полученные от взрослого организма, могут делиться всего несколько раз. Только раковые клетки и длительно культивируемые клеточные линии (перевиваемые культуры клеток) могут делиться неограниченное число раз.

Из этих наблюдений следовало, что продолжительность жизни клеток ограничено числом делений, а их принудительная гибель находится под генетическим контролем. В 1972 г. Д. Керр подтвердил существование физиологической гибели клеток, назвав ее апоптозом. Роль апоптоза во многом противоположна роли митоза. Если с помощью митоза в организме создается необходимое количество клеток, то с помощью апоптоза из него удаляются изношенные, поврежденные или лишние клетки.

Часть клеток в организме участвует в половом размножении, образуя гаметы. Эти клетки были названы А. Вейсманом в 1892 г. клетками зародышевого пути, чтобы отличить их от всех остальных, не участвующих в образовании нового поколения соматических клеток. При образовании гамет клетки зародышевого пути переходят от деления митозом на деление мейозом. Мейоз в отличие от митоза обеспечивает редукцию диплоидного числа хромосом в гаплоидное, чтобы скомпенсировать удвоение их количества при оплодотворении.

7.1 Клеточный цикл и митоз

Клеточным циклом (митотическим циклом) называют весь период существования клетки от ее появления в результате деления до элиминации вследствие либо деления, либо апоптоза.

Клеточный цикл подразделяется на четыре периода: пресинтетический G1, синтетический S, постсинтетический G2 и митоз M. Периоды G1, S и G2 составляют в совокупности интерфазу, во время которой клетка сохраняет оформленное ядро, тогда как при делении митозом оно временно исчезает. Эта схема также подразумевает, что синтез ДНК происходит в интерфазе в ограниченный период времени, причем между ним и митозом существуют паузы (gaps).

Во время пресинтетического периода клетка активно синтезирует РНК и белки, восстанавливает органоиды, утраченные при делении, накапливает молекулы и энергию, необходимые для репликации, репарирует повреждения ДНК. Преобладание анаболических процессов в G1-периоде вызывает увеличение объема цитоплазмы, благодаря чему наблюдается рост клетки. Продолжительность периода G1 варьирует в широких пределах. Так, например, у лимфоцитов тимуса она составляет около 3 час., в кишечном эпителии - 10 час., в печени - 48 час., в эпидермисе кожи - 64 час.. При неблагоприятных условиях продолжительность G1-периода возрастает, а при стимуляции клеток гормонами, факторами роста и митогенами - снижается.

В синтетическом периоде происходит синтез ДНК и белков хроматина, что приводит к удвоению хромосом и увеличению размеров клеточного ядра. Репликация ДНК осуществляется в геноме эукариот параллельно во многих участках - репликонах, которым соответствуют петлевые домены хроматина. Число репликонов зависит, прежде всего, от количества ДНК в ядре и поэтому варьирует в пределах от 1 тыс. у дрожжей до 4060 тыс. у млекопитающих. Репликоны собраны в кластеры, которые содержат от 20 до 80 точек инициации. Все репликоны, принадлежащие данному кластеру, реплицируются одновременно.

В репликации ДНК эукариот принимает участие большое количество ферментов. Наиболее важные из них - ДНК-полимеразы, праймазы, лигазы, топоизомеразы, ДНК-азы и РНК-азы. Репликация ДНК происходит по полуконсервативному механизму, при этом в точке инициации возникают две репликативные вилки, которые двигаются в противоположных направлениях со скоростью 13 тыс. пар нуклеотидов в минуту. Репликация ДНК в клеточном ядре происходит закономерным образом, распространяясь от эухроматина к гетерохроматину. Позже всех реплицируется сателлитная ДНК, которая локализуется в районе первичных перетяжек хромосом - центромер.

Одновременно с репликацией ДНК в ядро поступают гистоны и другие белки хроматина, которые синтезируются рибосомами в цитоплазме. Они взаимодействуют со вновь синтезированной ДНК и воспроизводят многоуровневую структуру хроматина, существовавшую в ядре до начала репликации. К концу S-периода количество ДНК и гистонов в клеточном ядре увеличивается ровно в два раза. При этом однохроматидные хромосомы, которые остались от материнской клетки, превращаются в двухроматидные. Это можно наблюдать непосредственно, вызывая конденсацию хромосом в интерфазе осмотическим шоком.

Продолжительность S-периода составляет для лимфоцитов тимуса 6 час., клеток кишечного эпителия - 8 час., печени - 16 час. В течение S-периода происходит также удвоение центриолей.

В постсинтетическом периоде клетка начинает непосредственную подготовку к делению. При этом в ней синтезируются тубулины, которые необходимы для формирования микротрубочек веретена деления, а также белки, участвующие в конденсации хромосом и других процессах митоза. В G2-периоде может также происходить незначительный репаративный синтез ДНК. Для этого периода клеточного цикла характерен высокий уровень посттрансляционных модификации белков, в особенности фосфорилирования и ацетилирования. Основными субстратами для соответствующих ферментов являются белки цитоскелета и ядерного матрикса. В G2-периоде происходит также активация тканеспецифических генов. Продолжительность этого периода у разных клеток меняется мало, составляя в большинстве случаев 24 часа.

После окончания G2-периода клетка приступает к делению. Митотическое деление клетки состоит из четырех фаз - профазы, метафазы, анафазы и телофазы.

Переход из G2-периода в профазу митоза сопровождается повышением вязкости цитоплазмы и округлением клеток. Одновременно наблюдаются изменения в хроматине, мелкозернистая структура которого меняется на глыбчатую. В ранней профазе в ядре более отчетливыми становятся интенсивно окрашенные теломерные участки хромосом, которые располагаются по периметру ядра у нуклеолеммы. В поздней профазе видно, что от теломерных участков к центру ядра отходят плечи хромосом.

В профазе митоза происходит расхождение двух диплосом клеточного центра в противоположные концы - полюса клетки. Между ними формируется состоящее из микротрубочек веретено деления (митотическое, или ахроматиновое веретено). Число радиально расположенных вокруг диплосом микротрубочек увеличивается, и они образуют астросферу.

В конце профазы наступает диссоциация ядрышка, а содержимое цитоплазмы и ядра сливаются в миксоплазму. Одновременно происходит разрушение пластинчатого комплекса. Продолжительность профазы составляет от 15 до 60 мин.

В начале метафазы (прометафаза, или метакинез) хромосомы перемещаются в плоскость экватора, которая располагается в середине веретена деления перпендикулярно линии, соединяющей полюса клетки. В результате образуется структура, которая называется метафазной пластинкой, или материнской звездой.

Митотические хромосомы в составе метафазной пластинки отличаются характерной морфологией. Обычно они имеют форму вытянутого цилиндра диаметром 12 мкм и длиной 150 мкм. В центре хромосомы находится первичная перетяжка, или центромера, которая делит ее на два плеча. В районе центромеры располагается прицентромерный гетерохроматин. Хромосомы с равными по длине плечами называются метацентрическими, с неравными плечами - субметацентрическими, а с очень коротким вторым плечом - акроцентрическими.

Некоторые хромосомы, кроме первичной перетяжки, имеют вторичную перетяжку. Она расположена ближе к концу хромосомы, отделяя от нее небольшой участок - спутник. В районе вторичной перетяжки локализован ядрышковый организатор, который содержит кластер генов рРНК и служит в интерфазном хроматине местом формирования ядрышка. Вторичная перетяжка окружена гетерохроматином.

Концы хромосом содержат особые участки - теломеры, которые состоят из гетерохроматина. Теломеры обеспечивают в интерфазном ядре прикрепление хромосом к нуклеолемме.

Между центромерой и теломерой с помощью методов дифференциального окрашивания в хромосомах выявляются различной ширины вставки из гетерохроматина полоски, или бенды. Они структурируют хромосому на отдельные блоки, расположение которых видоспецифично.

Каждая митотическая хромосома состоит из двух идентичных сестринских хроматид, связанных между собой центромерой. У большинства клеток в организме хромосомы представлены двойным диплоидным набором в отличие от одинарного гаплоидного набора у гамет.

Метафазная пластинка представляет собой сложный пространственный комплекс, который состоит из центриолей, отходящих от них микротрубочек веретена деления и хромосом. Микротрубочки веретена присоединены к центромерам с помощью особых белковых структур - кинетохоров. В кинетохоре имеются три слоя - прилежащий к хромосоме плотный внутренний слой, рыхлый средний слой и плотный внешний слой. От внешнего слоя отходят многочисленные микротрубочки, образующие корону кинетохора. Белки плотного внешнего слоя CENP способны специфически связываться с сателлитной ДНК. Белки внутреннего слоя кинетохора обеспечивают соединение сестринских хроматид. В состав кинетохора входят также механохимические белки динеины, которые участвуют в перемещении хромосом по микротрубочкам. Продолжительность метафазы составляет 530 мин.

Переход клетки из метафазы в анафазу происходит очень быстро. При этом сестринские хроматиды в хромосомах метафазной пластинки утрачивают связь между собой и начинают синхронное движение по направлению к противоположным полюсам клетки. Скорость движения хроматид, которые теперь превратились в самостоятельные хромосомы, может достигать 2 мкм/мин. В процессе движения ориентация хромосом меняется, и, поскольку центромеры опережают теломеры, они приобретают V-образную форму.

У животных анафаза слагается из двух процессов - движения хромосом к полюсам (анафаза А) и расхождения полюсов (анафаза В). У растений расхождения полюсов не наблюдается.

Движение хромосом в анафазе связано со скольжением микротрубочек веретена и моторными функциями динеина. Оно зависит от АТФ, кальция и температуры и может блокироваться колхицином и другими веществами, которые подавляют полимеризацию микротрубочек. Анафаза - самая короткая стадия митоза, продолжительность ее варьирует от 5 до 20 мин.

Телофаза митоза в общих чертах напоминает профазу, но события в ней происходят в обратном порядке. Она начинается с остановки хромосом, которые, не меняя ориентации, начинают деконденсироваться. Одновременно происходит восстановление нуклеолеммы из мембранных пузырьков, контактирующих с боковыми поверхностями хромосом. После полной реконструкции нуклеолеммы в ядре формируются новые ядрышки. Параллельно с восстановлением клеточного ядра происходит разборка веретена деления. Она начинается у полюсов клетки и заканчивается у экватора. Сохраняющиеся некоторое время в телофазе микротрубочки веретена могут формировать остаточные тельца.

Митоз завершается цитотомией, или цитокинезом распределением цитоплазмы между двумя дочерними клетками. У животных цитотомия обеспечивается инвагинацией плазмолеммы между двумя ядрами и формированием перетяжки. У растений цитотомия происходит путем построения дополнительной внутриклеточной перегородки. Общая продолжительность митоза составляет обычно от 1 до 4 час.

После завершения митоза две дочерние клетки могут опять вступить в G1-период клеточного цикла. Однако такое поведение клеток характерно только для быстрорастущих тканей и культур клеток в экспоненциальной фазе роста. В остальных случаях часть клеток после митоза переходят из клеточного цикла в состояние пролиферативного покоя G0. Остающиеся в цикле клетки составляют пролиферативный пул.

Величина пролиферативного пула определяется как отношение пролиферирующих клеток к общему числу клеток в популяции. Пролиферирующие клетки идентифицируются по включению радиоактивно меченых предшественников ДНК или с помощью моноклональных антител к ядерному антигену пролиферирующих клеток - PNCA. Величина пролиферативного пула отражает характер роста тканей и клеточных культур. В стабильных, не растущих и не обновляющихся клеточных популяциях, например, в мышечной и нервной тканях, величина пролиферативного пула составляет менее 1 %. В растущих или обновляющихся тканях величина пролиферативного пула варьирует в пределах от 10 до 30 %. Наиболее высокие значения пролиферативного пула характерны для быстро растущих опухолей более 90 %.

7.2 Регуляция клеточного цикла и митоза

Клеточный цикл регулируется как внутриклеточными, так и внеклеточными факторами.

Генетический контроль цикла обеспечивается семейством генов, которые обозначаются как гены клеточного деления - cdc (cell division control). Продукты этих генов представляют собой киназы ферменты, фосфорилирующие белки по определенным аминокислотам. Поэтому гены клеточного цикла могут обозначаться также cdk (cell division kinase). Основной принцип регуляции клеточного цикла состоит в фосфорилировании и дефосфорилировании участвующих в пролиферации структурных и регуляторных белков.

Последовательность активации киназ клеточного деления определяется циклинами - регуляторными белками, концентрация которых закономерно изменяется в клеточном цикле. Например, концентрация циклина А нарастает к концу G1-периода и снижается по завершению S-периода, причем подавление репликации ДНК оксимочевиной не влияет на этот процесс. К настоящему времени обнаружено 12 циклинов, которые демонстрируют различную динамику концентрации в клеточном цикле. Наряду с комплексами Cyc/Cdk (циклин/циклинзависимая киназа) в регуляции цикла участвуют фосфатазы PP1 и PP2a, которые дефосфорилируют белки, фосфорилированные ранее киназами, циклин-активирующие киназы CAK и ингибиторы киназ CDI.

Важная роль в регуляции клеточного цикла принадлежит белку p53. Он способен узнавать специфические последовательности в ДНК и регулировать активность контролирующих пролиферацию генов. Концентрация p53 в ядре увеличивается к концу G1-периода, но резко снижается при переходе клетки в S-период. Если в клетке возникли повреждения ДНК, концентрация p53 остается на высоком уровне, клетка задерживается в конце G1-периода и не приступает к репликации ДНК до тех пор, пока повреждения не будут исправлены. Если повреждения ДНК репарировать не удалось, p53 выключает гены, блокировавшие апоптоз. Переход G1/S является первой контрольной точкой клеточного цикла (точкой рестрикции R1), в которой клетка принимает решение о репликации ДНК.

Кроме R1 в клеточном цикле есть и вторая контрольная точка R2. Она соответствует переходу G2/M, когда клетка принимает решение о начале митоза. Главными молекулами, регулирующими начало митоза, являются фосфатаза Cdc25, а также киназы CycB/Cdk1 и weel. Фосфатаза Cdc25 способна активировать киназу CycB/Cdk1, тогда как киназа weel, наоборот, ингибирует ее. Поэтому начало митоза определяется балансом активности ферментов Cdc25 и weel.

События митоза также регулируются циклинами. В частности, циклин B (CycB) контролирует образование митотического веретена, циклин A (CycA) влияет на расхождение хроматид, а циклин B3 (CycB3) контролирует конденсацию хромосом. Для завершения митоза необходима не только определенная последовательность активации циклинзависимых киназ и фосфатаз, но также их своевременная деградация. Она контролируется APC (anaphase promoting complex) комплексом протеаз с участием убиквитина.

Клеточный цикл регулируется также внешними по отношению к клетке молекулярными сигналами. К ним относятся гормоны, медиаторы, факторы роста, лимфокины, митогены, а также их ингибиторы.

Пролиферирующие клетки отвечают на молекулярные сигналы двух типов. Первый из них усиливает пролиферацию, вызывая переход клеток из состояния G0 в G1 и их прогрессию в клеточном цикле (так действуют многие факторы роста, например, фактор роста фибробластов ФРФ). Второй тип регуляторных белков позволяет клеткам подавлять рост их соседей (как это происходит, например, при секреции макрофагами фактора некроза опухолей ФНО).

Таким образом, в управление клеточным циклом и митозом вовлечено большое число генов. Если функция каких-либо из них утрачивается из-за мутации или нарушения экспрессии, клетки становятся нечувствительными к подавляющим их рост молекулярным сигналам, переходят в режим автономной пролиферации и могут сформировать в итоге опухоли.

7.3 Апоптоз

Термин “апоптоз” обозначает генетически контролируемый процесс разрушения генома с последующей гибелью клетки.

Гибель клеток путем апоптоза в различных клеточных популяциях имеет сходные морфологические проявления, которые разворачиваются по единому сценарию. В начале процесса клетка утрачивает микроворсинки и контакты с соседними клетками, округляется и отделяется от клеточного пласта. Одновременно в ядре наблюдается маргинация хроматина: он смещается к периферии, тогда как центральные области ядра просветляются. Затем в ядре появляются выпячивания нуклеолеммы (протуберанцы), которые заполняются гетерохроматином. В результате гетерохроматин формирует по периметру ядра скопления с четко очерченными границами. Маргинация хроматина и образование кольца из его глыбок по периферии ядра носит название кариорексис.

Параллельно изменениям ядра при апоптозе наблюдается конденсация цитоплазмы. При этом длительное время сохраняется целостность большинства цитоплазматических органоидов, в том числе лизосом и митохондрий. На более поздних этапах апоптоза плазмолемма начинает формировать глубокие инвагинации, которые приводят к распаду клетки на гроздь апоптозных телец. В некоторых из них содержатся остатки клеточного ядра, состоящие из окруженных нуклеолеммой плотных скоплений хроматина. В дальнейшем апоптозные тельца фагоцитируются макрофагами и другими клетками. Иногда апоптозные тельца не фагоцитируются, а слущиваются в полости, кровеносное русло или почечные канальцы. Длительность апоптоза варьирует в пределах от 1 до 12 час.

В некоторых тканях отдельные морфологические проявления апоптоза могут быть выражены слабо или вообще отсутствовать. Например, у лимфоцитов маргинация хроматина приводит к формированию одного скопления в форме полумесяца. Ядра клеток при апоптозе могут сжиматься, что обозначается термином пикноз. Апоптоз в сердечных мышечных клетках происходит вообще без маргинации и конденсации хроматина. Распад клетки на апоптозные тельца также наблюдается не всегда. Несмотря на это, по комплексу морфофизиологических свойств апоптоз значительно отличается от случайной гибели клеток - некроза, для которого характерна гипертрофия ядра и цитоплазмы вследствие самопереваривания клетки лизосомальными ферментами.

Апоптоз инициируется молекулярными сигналами, которые распознаются специальными рецепторными белками на плазмолемме. Наиболее изученным примером лиганд-рецепторного комплекса, который обеспечивает запуск апоптоза у многих клеток, является пара молекул лиганд Fas - рецептор Fas (CD95). Лиганд Fas экспрессируется, главным образом, на активированных Т-лимфоцитах. Он имеет молекулярную массу 46 кД и находится в мембране в виде димера или тримера. В отличие от лиганда, рецептор Fas экспрессируется не только на T-лимфоцитах, но и на многих других клетках. Его молекулярная масса составляет 36 кД. На цитоплазматической стороне рецептора имеется участок из 70 аминокислот, который участвует в передаче сигнала внутрь клетки “домен смерти”. Другими примерами запускающих апоптоз молекул могут служить фактор некроза опухолей (ФНО), фактор роста нервов (ФРН) и другие. Все они распознаются специфическими рецепторами, которые на цитоплазматической стороне содержат “домен смерти”.

Основным процессом, происходящим в клетке при апоптозе, является деградация хроматина в клеточном ядре. Она осуществляется путем сочетанного воздействия на хроматин специфических для апоптоза ферментов. Белки хроматина при этом расщепляются цистеиновыми протеазами - каспазами, тогда как ДНК разрезается на фрагменты под действием эндогенных ДНК-аз.

К настоящему времени обнаружено более 10 каспаз. Субстратами для них являются сами каспазы, ламины, топоизомеразы, гистоны и другие белки хроматина.

При запуске апоптоза через рецепторные комплексы Fas и ФНО важная роль принадлежит каспазе-1, которая является продуктом гена ice. Первоначально она была идентифицирована как цистеиновая протеаза, расщепляющая предшественник одного из факторов роста интерлейкина-1-бета. Каспаза-1 синтезируется в виде неактивного предшественника с молекулярной массой 45 кД, который затем превращается в субъединицы р10 и р20. Активный фермент представляет собой тетрамер, содержащий по две копии каждой субъединицы и атакующий пептидную связь после аспарагиновой кислоты. Активируемая каспазой-1 каспаза-3 подавляет функцию фермента, который участвует в репарации однонитевых разрывов ДНК. Одновременно каспаза-3 активирует ДНК-азу CAD (DFF40), которая разрезает ДНК между нуклеосомами. Субстратом для каспазы-6 является ламин A, который входит в состав ядерного матрикса.

Разрушение ядерной ДНК рассматривается как ключевое событие апоптоза, после которого процесс клеточной гибели становится необратимым. При этом сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, входящих в состав петлевых доменов хроматина. Позднее величина образующихся фрагментов снижается до 200 пар нуклеотидов, что соответствует длине ДНК, приходящейся на одну нуклеосому. Фрагментация ДНК при апоптозе представляет собой активный процесс, требующий затрат энергии, синтеза РНК и белка. В разрушении ядерной ДНК участвуют CAD, ДНК-азы I и II, а также апоптоз-активирующий фактор АИФ.

Таким образом, апоптоз представляет собой генетически запрограммированную реакцию клетки на специфический молекулярный сигнал, результатом которой является уничтожение ее генома. Апоптоз обеспечивает удаление клеток из нормально развивающихся и функционирующих тканей, не вызывая при этом повреждения соседних клеток и не запуская воспалительный процесс.

7.4 Мейоз

растительный клетка рибосома митоз

Процесс оплодотворения, который лежит в основе полового размножения организмов, заключается в слиянии мужской и женской половых клеток гамет и формировании оплодотворенной яйцеклетки - зиготы, дающей начало новому организму. Клеточную природу яйца предполагал еще Т. Шванн, но только в 1870 г. бельгийский цитолог Э. ван Бенеден в “Исследовании о составе и значении яйца” доказал, что клеткой является все яйцо в целом, а его зародышевый пузырек представляет собой клеточное ядро. В 1875 г. О. Гертвиг, бывший в то время ассистентом в Иене, опубликовал работу “Материалы к познанию образования, оплодотворения и деления животного яйца”. Прозрачные яйца иглокожих позволили ему увидеть проникновение мужского ядра из головки сперматозоида в яйцеклетку и показать, что оплодотворение состоит в слиянии женского и мужского пронуклеусов в единое ядро зиготы.

Слияние мужского и женского пронуклеусов при оплодотворении вызывает удвоение числа хромосом. Поэтому полиплоидизирующий эффект оплодотворения должен в каждом поколении компенсироваться процессом, приводящим к уменьшению числа хромосом в два раза. Таким процессом и является мейотическое деление клеток, или мейоз. У организмов с половым размножением при созревании гамет и оплодотворении происходит смена состояний клеток, которые различаются по числу хромосом. Развивающийся из зиготы организм, клетки которого содержат диплоидный набор хромосом, называется диплофазой, или диплонтом. Если организм состоит из клеток с гаплоидным набором хромосом, он называется гаплофазой, или гаплонтом.

Известно три типа мейоза, которые отличаются местом в жизненном цикле организмов, обеспечивая редукцию числа хромосом и переход либо к диплофазе, либо к гаплофазе:

1. Зиготный (начальный) мейоз происходит сразу же после оплодотворения, с первыми делениями зиготы. Он обнаружен у многих водорослей и простейших. В жизненном цикле этих организмов преобладает гаплофаза, а диплофаза занимает небольшой период времени, пока существует зигота.

2. Гаметный (конечный) мейоз наблюдается у животных, а также у некоторых простейших и водорослей. В этом случае мейоз происходит во время гаметогенеза, а гаплофазе соответствуют гаметы яйцеклетки и сперматозоиды.

3. Споровый (промежуточный) мейоз характерен для растений. В их жизненном цикле происходит чередование поколений спорофита, который размножается спорами, и гаметофита, который размножается половым путем с помощью гамет. Мейоз происходит в клетках диплоидного спорофита в процессе спорогенеза, в результате которого образуются споры с гаплоидным числом хромосом. Они развиваются без оплодотворения в гаметофит, продуцирующий гаметы, слияние которых в зиготу опять дает начало диплоидному спорофиту. Таким образом, у растений спорофит соответствует диплофазе (диплонту), а гаметофит - гаплофазе (гаплонту).

Несмотря на различное место мейоза в жизненном цикле растений, животных, простейших и других организмов его морфологические проявления однотипны у всех эукариот. Мейоз состоит из двух последовательных клеточных делений, которые напоминают митоз. Первое деление мейоза (мейоз I) обеспечивает редукцию числа хромосом в два раза и называется редукционным. Второе деление (мейоз II) превращает сестринские хроматиды в самостоятельные хромосомы аналогично митозу и называется эквационным (выравнивающим).

Перед началом мейоза клетка проходит все периоды клеточного цикла - G1, S и G2. Предмейотическая интерфаза имеет, однако, особенности, которые связаны с подготовкой клетки к мейозу. В частности, в предмейотической интерфазе обнаружены изменения состава гистонов и других белков хроматина, не характерные для митотической интерфазы.

Каждое из двух делений мейоза состоит из четырех последовательных фаз - профазы, метафазы, анафазы и телофазы. Между двумя делениями мейоза клетка некоторое время находится в состоянии, внешне сходном с интерфазой, но оно не сопровождается удвоением ДНК. Пауза между мейозом I и II обозначается как интеркинез.

Наиболее длительной фазой мейоза является профаза I. Именно в ней происходят процессы, обеспечивающие редукцию числа хромосом. Профазу I подразделяют на пять стадий:

лептотену, или стадию тонких нитей;

зиготену, или стадию слияния нитей;

пахитену, или стадию толстых нитей;

диплотену, или стадию двойных нитей;

диакинез, или стадию расхождения нитей.

Лептотена внешне напоминает раннюю профазу митоза. Однако в отличие от профазы митоза хромосомы на стадии лептотены значительно тоньше и длиннее, что не позволяет различить в них сестринские хроматиды. По всей длине мейотических хромосом располагаются небольшие утолщения - хромомеры. Число, размеры и расположение хромомеров специфично для каждой хромосомы. Количество хромомеров видоспецифично: у тритона их около 2500, у сверчка - около 200, у риса - 645.

Мейотические хромосомы располагаются в объеме ядра закономерным образом, контактируя теломерами с нуклеолеммой. У отдельных животных они могут формировать структуру, напоминающую букет. Такая структура состоит из сближенных между собой дугообразно изогнутых хромосом, связанных теломерными концами с ограниченным участком нуклеолеммы. У некоторых растений хромосомы в конце лептотены собираются в клубок, что обозначается термином “синезис”. В лептотене начинается процесс конъюгации гомологичных хромосом - синапсис. Он заключается в сближении гомологичных хромосом диплоидного набора в пространстве ядра. При этом хромомеры одной гомологичной хромосомы оказываются напротив соответствующих хромомеров другой гомологичной хромосомы.

Зиготена отличается от лептотены формированием комплексов конъюгирующих хромосом - бивалентов. Каждый бивалент состоит из четырех хроматид - двух сестринских и двух несестринских. Сестринские хроматиды связаны в биваленте центромерами, а несестринские хроматиды соединяются особой белковой структурой - синаптонемальным комплексом.

Синаптонемальный комплекс имеет ширину 160240 нм и состоит из трех слоев: два одинаковых латеральных слоя толщиной по 3060 нм располагаются на расстоянии 60120 нм друг от друга, а между ними находится центральный элемент толщиной 1040 нм. Латеральные слои контактируют с несестринскими хроматидами.

Формирование бивалента начинается на теломерных концах хромосом, связанных с нуклеолеммой, а также в центромерных районах. Затем объединяются и остальные участки двух гомологичных хромосом. Образование синаптонемального комплекса происходит при сближении хромосом на расстояние около 100 нм, причем структурные компоненты его взаимодействуют между собой наподобие застежки “молния”.

В зиготене синтезируется небольшое количество ДНК (z-ДНК), которая состоит из распределенных по всей длине хромосом уникальных последовательностей длиной 510 тыс. пар нуклеотидов. У соматических клеток z-ДНК, составляющая около 0,3 % всей ДНК клетки, реплицируется совместно с остальной ДНК в S-периоде клеточного цикла. Подавление синтеза ДНК в зиготене приводит к отмене конъюгации гомологичных хромосом. Предполагается, что z-ДНК участвует во взаимном распознавании гомологичных хромосом при формировании бивалента.