Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах: экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт питания РАМН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах: экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа

14.02.01 - гигиена

Ефимочкина Наталья Рамазановна

Москва - 2010

Работа выполнена в лаборатории санитарно-пищевой микробиологии и микроэкологии Учреждения Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт питания РАМН.

Научный консультант Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Тутельян Виктор Александрович.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Пивоваров Юрий Петрович;

доктор биологических наук, профессор Алешкин Владимир Андрианович;

доктор биологических наук, профессор Ревазова Юлия Анатольевна.

Ведущая организация: Федеральное государственное Учреждение науки Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана Роспотребнадзора.

Защита диссертации состоится 2010 г. на заседании Диссертационного совета Д.001009.01 Научно-исследовательского института экологии человека и гигиены окружающей среды имени А.Н. Сысина РАМН по адресу: 119992, Москва, ул. Погодинская, д.10/15, стр.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Н.Н. Беляева.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Обеспечение микробиологической безопасности пищевых продуктов является одной из приоритетных задач, решение которой непосредственно направлено на охрану здоровья населения. Во всем мире эта проблема приобретает особую актуальность в связи с увеличением числа заболеваний, передающихся через пищевые продукты.

Необходимость всестороннего изучения данной проблемы очевидна и включает многоплановую оценку факторов, воздействующих на здоровье человека, наиболее значимым из которых в настоящее время является микробное загрязнение пищевых продуктов возбудителями новых или так называемых «эмерджентных» бактериальных инфекций с пищевым путем передачи (Listeria monocytogenes, Salmonella, энтерогеморрагические E.coli (ЕНЕС), Campylobacter jejuni, Enterobacter sakazakii и др.).

На современном этапе происходит формирование новых представлений о том, какие эволюционные изменения претерпевают пищевые бактериальные патогены в условиях антропогенной трансформации внешней среды, влияющие на этиологические и патогенетические свойства возбудителя, пути передачи инфекции и восприимчивость к ним человеческой популяции [Покровский В.И., 1996, Тутельян В.А., 2002, Гинцбург А.Л., 2002, Литвин В.Ю., 1997, Бухарин О.В., 2009, Тартаковский И.С., 2002, Куликовский А.В., 2004, Fratamico P.M. et al., 2005, Солодовников Ю.П., 2009].

Феномен появления новых возбудителей пищевых инфекций и токсикоинфекций должен рассматриваться с общих позиций эпидемиологической экологии бактерий, изучающей в первую очередь те аспекты существования бактериальных популяций в окружающей среде, которые определяют возможность возникновения инфекционных заболеваний у человека. При этом пищевые продукты и процессы их производства представляются как качественно новая «внешняя среда» обитания или экологическая ниша, сформировавшаяся в условиях развитого индустриального производства и благоприятная для ряда патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов.

Выживание бактерий, находящихся в той или иной экологической нише, непосредственно связано с генетически закрепленной способностью включать регуляторные системы изменчивости и адаптации на различных стадиях развития бактериальной популяции [Бондаренко В.И., 1997, Ермолаева С.А., 2001, Доморадский И.В., 2002, Маркова Ю.А. с соавт., 2009]. Однако в свете современных концепций перестройка популяционных структур патогенов по вирулентности и факторам патогенности в условиях окружающей среды существенно отличается от характера персистенции возбудителя в клеточных системах макроорганизма при разных типах инфекций, что требует углубленного изучения биохимических и молекулярно-генетических аспектов этой проблемы.

Оценка частоты появления новых возбудителей пищевых инфекций свидетельствует об ускорении процессов адаптации бактериальных патогенов в неблагоприятных условиях внешней среды, вследствие чего микроорганизмы даже с весьма ограниченным ареалом распространения способны в короткие сроки превращаться в возбудителей острых пищевых инфекций с тяжелым течением и высоким процентом летальных исходов (листериоз, энтерогеморрагический эшерихиоз и др. инфекции).

Нарастающая озабоченность мировой общественности проблемой микробиологической безопасности пищи обусловила появление концепции «эмерджентных пищевых инфекций», в соответствии с которой они рассматриваются не только в медико-генетических аспектах, но и с учетом экологических и технологических факторов, что позволяет расшифровать структуру заболеваемости и прогнозировать появление новых возбудителей [Smith J.L., Fratamico P.M., 2005, MMWR, 2009].

Термин «эмерджентные пищевые инфекции» широко используется в научных публикациях и официальных документах международного сообщества и Всемирной организации здравоохранения, он происходит от английского «emergent» и означает «внезапно появляющиеся» или «вновь возникающие»; в отечественной терминологии используется понятие «новые или возвращающиеся» инфекции.

По определению ВОЗ эмерджентные инфекции - это болезни (и возбудители), возникающие или появляющиеся внезапно и этим обуславливающие чрезвычайные эпидемиологические ситуации, как правило, очень напряженные. Эти заболевания, особенно пищевые зоонозы, являются наиболее эпидемиологически значимыми, наносящими большой социально-экономический ущерб.

Современные подходы к организации системы обеспечения безопасности пищевых продуктов требуют детального исследования особенностей новых патогенов, биохимических и генетических механизмов их вирулентности, а также регулирующей роли технологических факторов в условиях индустриального производства. Это обосновывает необходимость разработки новых критериев в системе санитарно - эпидемиологического контроля продовольственного сырья и готовой продукции, в том числе на основе создания и внедрения высокочувствительных и эффективных методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа.

Цель работы: совершенствование системы обеспечения микробиологической безопасности пищевых продуктов путем разработки и внедрения современных методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа и новых нормативов безопасности для основных групп пищевых продуктов на основе подробного изучения экологии и особенностей выживания новых видов патогенных микроорганизмов, оценки роли технологических факторов в формировании измененных свойств этих патогенов в условиях пищевых производств.

Задачи исследования:

1. Провести анализ распространенности наиболее значимых эмерджентных пищевых патогенов (Listeria monocytogenes, Salmonella, ЕНЕС, Campylobacter jejuni, Enterobacter sakazakii и др.) в пищевых продуктах и объектах окружающей среды;

2. Изучить основные закономерности эпидемиологии и экологии бактерий Listeria monocytogenes, роль физических, химических и биологических стрессовых факторов в формировании различных типов поведения патогенных листерий, контаминирующих пищевые продукты в процессе их производства и хранения, и обосновать необходимость введения нового норматива безопасности для основных групп пищевых продуктов;

3. Разработать новые методические подходы, позволяющие проводить ускоренную индикацию L. monocytogenes в различных видах пищевых продуктов с использованием высокоспецифичных комбинированных схем бактериологического и молекулярно-генетического анализа;

4. На основе изучения культурально-биохимических свойств и генетических характеристик нового вида патогенных микроорганизмов E. sakazakii сделать анализ диагностической значимости ряда фенотипических и генотипических тестов идентификации и разработать на их основе схему и методику выделения возбудителя; теоретически и экспериментально обосновать необходимость введения нового микробиологического норматива для продуктов питания детей раннего возраста;

5. Определить значение некоторых потенциально патогенных микроорганизмов в возникновении эмерджентных пищевых токсикозов; изучить условия, влияющие на жизнедеятельность токсигенных стафилококков и биосинтез энтеротоксинов в пищевых продуктах; разработать методы выделения и количественной оценки стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах с применением иммуноферментного анализа; исследовать токсигенные свойства новых видов мицелиальных грибов - возбудителей пищевых микотоксикозов.

6. Провести сравнительные испытания методов ПЦР, ДНК- гибридизации и иммуномагнитной сепарации для выделения патогенных микроорганизмов родов Salmonella, Listeria, Campylobacter и Escherichia с традиционными стандартизованными методами анализа; на основе полученных данных разработать критерии стандартизации и гармонизации бактериологических и молекулярно-генетических методов с целью создания единой системы внедрения современных диагностических систем и средств измерений в лабораторную практику микробиологического контроля пищевых продуктов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменение свойств микроорганизмов в условиях развитого индустриального производства и антропогенной трансформации внешней среды сопровождается нарастанием патогенного потенциала некоторых видов бактерий, появлением новых или эволюционно измененных возбудителей заболеваний с пищевым путем передачи (эмерджентных пищевых патогенов).

2. В свете современных концепций микроорганизмы Listeria monocytogenes, Salmonella, энтерогеморрагические E.coli, Campylobacter jejuni, Enterobacter sakazakii, S.aureus характеризуются экологическим своеобразием, детерминированностью источников выделения и по частоте обнаружения являются доминирующими среди обширной группы возбудителей пищевых зоонозов.

3. Феномен появления новых и вновь возникающих патогенов сопровождается усилением роли оппортунистических инфекций и их возбудителей: обнаружение среди энтеробактерий нового вида Enterobacter sakazakii характеризует тенденцию изменения экологической ниши и расширения спектра эмерджентных патогенных бактерий среди хорошо изученных популяций семейства Enterobacteriaceae; уточнение таксономических характеристик потенциальных патогенов с неясным систематическим положением повышает надежность системы микробиологического контроля.

4. Изучение основных закономерностей эпидемиологии, экологии и биологических свойств Listeria monocytogenes, а также экспериментальное исследование поведения этих микроорганизмов в модельных системах, имитирующих условия производства пищевых продуктов, позволит расширить базу данных для разработки новых критериев безопасности и анализа степени микробиологического риска возникновения пищевого листериоза.

5. Появление среди известных токсических метаболитов бактерий и грибов «суперантигенов» и других модуляторов системных иммунных реакций повышает степень риска, связанную с накоплением в пищевых продуктах токсинов потенциально патогенных и токсигенных микроорганизмов (S.aureus, B.cereus, микромицеты и др.), что диктует необходимость изучения условий токсинообразования и создания методов их выявления и идентификации.

6. Изучение биологии эмерджентных патогенов и системных механизмов регуляции экспрессии генов факторов патогенности этих бактерий позволяет разработать новые методические подходы с использованием высокоспецифичных комбинированных схем бактериологического и молекулярно-генетического анализа путем подбора наиболее информативных биохимических тестов и генотипирования.

Научная новизна.

Впервые детально изучены экологические особенности, распространение, видовой состав и свойства эмерджентных патогенов Listeria spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Enterobacter sakazakii , выделенных из сырья молочного и мясного происхождения, пищевой продукции на различных этапах изготовления и объектов внешней среды (свыше 1500 образцов). Полученные новые данные о характере и количественных уровнях контаминации различных звеньев пищевой цепи позволили выявить наиболее вероятные источники попадания опасных возбудителей в готовые продукты, обуславливающие высокую степень риска даже при соблюдении технологических режимов производства и хранения продукции.

Обоснованы теоретические положения о возможном присутствии в пищевых продуктах новых видов патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, подтвержденные наличием филогенетических связей между таксономически родственными группами микроорганизмов родов Enterobacter и Pantoea с обнаруженными возбудителями неонатальных инфекций. Впервые в РФ из детских инстантных смесей выделены колиформные микроорганизмы с измененными биологическими свойствами, детальное исследование которых позволило идентифицировать их как малоизученный вид Enterobacter sakazakii. Установлена высокая степень идентичности фенотипических профилей выделенного нового патогена с бактериями вида E.cloacae и фитопатогенными вариантами P.agglomerans, свидетельствующая о возможных единых генетических регуляторных механизмах экспрессии вирулентных свойств этих микроорганизмов.

С использованием новейшей классификации теоретически обоснована таксономическая принадлежность ряда штаммов Е.sakazakii и Pantoea spp., выделенных из детских продуктов, к роду Cronobacter. Введение новых таксономических единиц расширяет перечень потенциальных патогенов, которые не входят по традиционной классификации в группу колиформных бактерий и не учитываются при оценке безопасности детских инстантных продуктов. С учетом значимости E. sakazakii как оппортунистического патогена для новорожденных и вариабельности биологических свойств возбудителя разработана новая схема идентификации.

Анализ основных закономерностей эпидемиологии, экологии и биологических свойств эмерджентных бактерий L.monocytogenes, а также экспериментальное изучение поведения этих микроорганизмов в модельных системах, имитирующих условия производства пищевых продуктов и основные физико-химические параметры технологических процессов, позволили расширить отечественную базу данных о функциональных признаках возбудителя для разработки новых критериев безопасности и анализа степени микробиологического риска возникновения пищевого листериоза. Впервые подробно изучены особенности выживания листерий в процессе длительного хранения в молоке при низких температурах. Установлены исключительно высокая жизнеспособность штаммов L.monocytogenes в этих условиях и длительный период выживания, составивший более 7 месяцев. Выявлена изменчивость основных морфологических и культурально-физиологических свойств штаммов в процессе их длительного хранения в молоке, в частности, постепенное ослабление патогенности, вплоть до полной утраты этого признака после 6-7 месячного периода наблюдения.

В результате изучения биологии L. monocytogenes и системных механизмов регуляции экспрессии генов факторов патогенности этих бактерий разработаны новые методические подходы, позволяющие проводить ускоренную индикацию возбудителя в различных видах пищевых продуктов с использованием высокоспецифичных комбинированных схем бактериологического и молекулярно-генетического анализа на основе подбора наиболее информативных биохимических тестов и их генотипирования с применением ПЦР. Разработанные методические подходы могут быть распространены на другие виды эмерджентных возбудителей заболеваний, имеющих близких непатогенных представителей в пределах рода, идентификация которых должна основываться на определении патогенетических признаков.

На основе проведенного анализа и экспериментального сравнения эффективности существующих модификаций молекулярно-биологических методов, обладающих технологической новизной и универсальностью в отношении различных групп эмерджентных бактериальных патогенов, осуществлены подбор и адаптация твердофазного метода ДНК-гибридизации. Метод включает использование специфических ДНК-зондов для выявления кодируемых признаков патогенности L.monocytogenes или видоспецифических последовательностей рибосомальной ДНК бактерий рода Salmonella, c последующей хемилюминесцентной детекцией продуктов гибридизации нуклеиновых кислот.

Разработана новая методология внедрения современных диагностических систем и средств измерения на основе создания специальных требований и общих критериев стандартизации методик для гармонизации их с традиционными и общепринятыми схемами контроля в пищевой микробиологии; интеграция новых методов молекулярной биологии в действующую систему микробиологического контроля позволит повысить эффективность проводимых исследований, обеспечит сопоставимость и достоверность результатов испытаний.

Практическая значимость.

В результате проведенных аналитических и экспериментальных исследований:

· обоснованы и введены в действие новые дифференцированные микробиологические нормативы безопасности, регламентирующие отсутствие патогенных микроорганизмов Listeria monocytogenes в основных группах пищевых продуктов, предназначенных для различных категорий населения;

· предложено введение нового микробиологического норматива («отсутствие E. sakazakii в 300 г продукта») для снижения риска возникновения новой пищевой инфекции и обеспечения безопасности продуктов, предназначенных для новорожденных, недоношенных и больных детей раннего возраста;

· экспериментально обоснован системный подход к исследованию пищевых продуктов на обсемененность S.aureus и наличие стафилококковых энтеротоксинов, который включает разработанный способ экстракции токсинов из различных пищевых продуктов и использование высокоразрешающих методов иммуноферментного анализа.

Разработаны, адаптированы и стандартизованы новые методы исследования условно-патогенных и патогенных микроорганизмов - контаминантов пищевых продуктов, основанные на применении бактериологического, биохимического, иммуноферментного анализа, ДНК-гибридизации и ПЦР в реальном времени. Апробированы и внедрены в практику микробиологического контроля пищевых продуктов:

методы выявления Listeria monocytogenes в пищевых продуктах (МУК 4.2.1122-02);

метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-рРНК анализа (МУК 4.2.1955-05);

метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста (МУК 4.2.2428-08);

методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов (МУК 4.2.577-96);

метод определения Campylobacter spp. в пищевых продуктах (МУК 4.2.2321-08);

метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах (МУК 4.2.2429-08);

метод real-time ПЦР для идентификации патогенных бактерий, выделенных при контроле пищевых продуктов (МР № 02.036-08);

количественный микробиологический анализ пищевых продуктов НВЧ-методом при использовании автоматического анализатора ТЕМПО (МР № 02.031-08).

Результаты работы использованы при разработке 27 нормативных и методических документов, в том числе СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы определения и выделения Listeria monocytogenes», СанПиН 2.3.2.1324-03 «Гигиенические требования к срокам годности и условиям хранения пищевых продуктов», МУК 4.2.1847-2004 «Санитарно-эпидемиологическая оценка обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов».

Апробация работы. Полученные материалы и основные положения диссертации представлены в 40 докладах и тезисах, которые были доложены и обсуждались на 15 международных научных форумах, 13 всероссийских конгрессах, симпозиумах, межрегиональных совещаниях и научно-практических конференциях.

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации опубликованы в 2 монографиях и 66 научных работах, в том числе 20 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 327 страницах машинописного текста, состоит из введения, 11 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 445 наименований, в том числе 355 на иностранных языках. Работа содержит 102 таблицы и 61 рисунок.

Личный вклад автора составляет более 80% и заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач работы, выборе методов исследования, выполнении аналитической и экспериментальной работы, обобщении и интерпретации полученных данных, подготовке научных публикаций. Теоретические и экспериментальные исследования выполнялись лично автором и совместно с другими исследователями в НИИ питания РАМН в рамках программ и планов НИР №№ 030, 087, 111, 018, 063, 095.

Автор выражает искреннюю глубокую благодарность доктору медицинских наук, академику РАМН, профессору В.А.Тутельяну, заслуженному деятелю науки и техники Российской Федерации, доктору биологических наук, профессору И.Б. Куваевой, доктору медицинских наук С.А. Шевелевой, доктору биологических наук, профессору И.С. Тартаковскому за поддержку, консультативную помощь и сотрудничество.

Cобственные исследования

Организация проведения работ, материалы и методы исследований

Аналитическая часть работы включала литературный поиск, сбор информационных и статистических материалов, публикуемых в отечественных и зарубежных научных изданиях, в официальных сборниках Роспотребнадзора и ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии», Международной программы ВОЗ по контролю и надзору за пищевыми инфекциями и токсикоинфекциями в Европе, Центра по контролю заболеваемости в США и других опубликованных источниках.

Всего обработано свыше 480 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Собранный материал обобщен, систематизирован и опубликован издательством РАМН в виде монографии «Эмерджентные бактериальные патогены в пищевой микробиологии» (Н.Р.Ефимочкина, 2008) и справочно-обзорного издания «Листерии в молоке и молочных продуктах» (в соавторстве с И.Б.Куваевой и С.Н.Карликановой, 1999 г.).

Материалы о вспышках пищевых бактериальных отравлений и острых кишечных инфекций в Российской Федерации в период с 1992 по 2006 г.г. обработаны с использованием формализованных схем и включены в Международные сборники программы ВОЗ по контролю и надзору за пищевыми инфекциями и токсикоинфекциями в Европе.

Экспериментальная часть исследований проведена в 1989 - 2009 г.г. в лаборатории санитарно-пищевой микробиологии и микроэкологии НИИ питания РАМН (с 1989 г. по 1998 г. руководитель лаборатории - Заслуженный деятель науки и техники РФ, доктор биологических наук, профессор Куваева И.Б., далее - доктор медицинских наук Шевелева С.А.).

Отдельные этапы экспериментальных работ, включая методическое обоснование и технику выполнения молекулярно-генетических исследований L.monocytogenes проведены на базе лаборатории легионеллеза НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН под руководством доктора биологических наук, профессора Тартаковского И.С. Исследования микробиологического состава и свойств молока, сыра и других молочных продуктов, касающиеся непосредственно обнаружения L.monocytogenes, S.aureus и др., выполнены в творческом сотрудничестве с лабораториями ГНУ ВНИИМС и ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Для разработки новых и усовершенствованных методов анализа использовали приборы и диагностические средства (тест-системы, реактивы, питательные среды и др.), представленные в рамках договоров о научном сотрудничестве с ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, фирмами «Ниармедик плюс», «Стайлаб», «Дюпон», «Био-Мерье».

Работа проводилась с использованием музейных и промышленных штаммов, полученных из коллекций ГИСК им. Л.А.Тарасевича, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Всеросийской коллекции микроорганизмовИнститута биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. В экспериментах также использовали штаммы энтеробактерий, выделенных из пищевых продуктов, смывов и клинического материала в ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве». Всего использовано свыше 300 штаммов бактерий и микроскопических грибов, подробные характеристики которых приведены в соответствующих главах и разделах данной работы.

В работе были использованы коллекционные и выделенные штаммы бактерий рода Listeria (L.monocytogenes, L.innocua, L.ivanovii, L.welshimeri - всего около 200 штаммов), E.coli - 75 штаммов, Salmonella spp. - 11 штаммов, Enterobacter sakazakii - 7 штаммов, других видов семейства Enterobacteriaceae - 190, S. аureus - 137 штаммов, B.cereus - 11 штаммов, Lactobacillus spp. - 66 штаммов, Campylobacter spp. - 5 штаммов, Penicillium citrinum - 17 штаммов (всего более 600 штаммов).

Объектами исследования служили образцы сырья и пищевых продуктов различных групп, а также смывы с поверхностей оборудования, инвентаря, посуды, вспомогательных средств на разных стадиях производства и этапах хранения готовой продукции (свыше 1700 образцов). Отбор проб проводили в соответствии с утвержденными стандартными методами на конкретные виды пищевой продукции.

Выделение и изучение свойств эмерджентных патогенов проводили с использованием стандартных методов микробиологических исследований. Для подтверждения и сравнительного сопоставления полученных данных подбирали или разрабатывали специализированные и адаптированные к поставленным задачам методики, подробное изложение которых приведено в соответствующих разделах диссертационной работы.

Результаты исследований

1. Анализ распространенности некоторых патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды

Оценивая рейтинг возбудителей по частоте возникновения вспышек, числу пострадавших и тяжести заболевания, международные организации (например, ФАО/ВОЗ) относят к числу наиболее важных эмерджентных патогенов следующие виды: бактерии рода Salmonella, в том числе S.enteritidis и S.typhimurium DT104; энтерогеморрагические E.coli; Listeria monocytogenes;Campylobacter jejuni;Yersinia enterocolitica.

Характеризуя роль этих микроорганизмов в возникновении эмерджентных пищевых инфекций, следует отметить, что их доминирующее влияние было установлено в результате анализа этиологии и патогенеза массовых вспышек заболеваний в различных странах мира начиная с 70-80-х гг. двадцатого века. Подавляющее большинство вспышек относились к пищевым зоонозам и возникали как вследствие потребления продуктов, полученных от больных животных, так и в результате вторичной контаминации при заготовке и переработке животноводческого сырья, в процессе приготовления и хранения пищи. В данной работе изучены особенности распространения, частота и источники выделения наиболее значимых эмерджентных пищевых патогенов L.monocytogenes, Campylobacter spp., EHEC, Salmonella spp.

L.monocytogenes.

Существующие данные об обнаружении листерий в мясопродуктах весьма противоречивы и свидетельствуют о разных уровнях выявления L. monocytogenes (от 0,5% до 30-40% проб в количествах от 0,1 до 10³ КОЕ/г и более) и широкой распространенности наиболее близких к ним по фенотипическому профилю листерий, в первую очередь вида L.innocua. При этом используются различные методические схемы идентификации штаммов листерий, что затрудняет сопоставление полученных данных и существенно усложняет анализ ситуации [Beumer R.R. et al., 1996; Farber J.M. et al., 1999; Wilson I.G., 1995].

Несмотря на большое число зарубежных публикаций о выделении L. monocytogenes на различных пищевых предприятиях, данных о частоте обнаружения листерий на отечественных заводах крайне недостаточно. Для получения информации о циркуляции этого возбудителя на предприятиях пищевой индустрии проведено изучение распространения бактерий рода Listeria при производстве мясных продуктов (табл. 1).

Таблица 1 Частота обнаружения бактерий рода Listeria на мясоперерабатывающих предприятиях

Установлено, что в технологических циклах происходит постоянное инфицирование объектов производственной среды бактериями рода Listeria, частота обнаружения листерий на поверхностях оборудования достигала 71,4%, инвентаря - 29,2%, что безусловно может приводить не только к обсеменению сырья, но и к загрязнению готовых мясных изделий. Из 24 культур, предварительно идентифицированных как L.monocytogenes 9 штаммов (37,5 %) обладали типичными для этого возбудителя факторами патогенности. Наибольшее число штаммов (77,6%) относились к виду L. innocua. Три штамма, выделенные из смывов, были идентифицированы как L. welshimeri. Другие виды листерий в данном исследовании обнаружены не были.

Частота обнаружения L.monocytogenes в смывах с технологического оборудования и инвентаря - 9,7 % - свидетельствует об интенсивной циркуляции возбудителя листериоза на мясоперерабатывающих предприятиях и требует ужесточения санитарно - гигиенических требований к производству и хранению мясопродуктов. С этой целью должен быть регламентирован и налажен контроль на наличие L.monocytogenes не только в сырье и готовой продукции, но и наиболее значимых участков технологических процессов, включая посев смывов с технологического и холодильного оборудования, инвентаря, посуды, вспомогательных материалов, рук и одежды работников.

Фекальным загрязнением объясняется преимущественно контаминация листериями сырого молока. По данным многочисленных анализов сырого сборного молока в течение ряда лет было показано, что частота обнаружения L. monocytogenes в основном колеблется в пределах от 1 до 12% от числа исследованных проб. Попадание такого сырья на завод обуславливает постепенное накопление возбудителя и массивную контаминацию помещений предприятия, оборудования, инвентаря, создавая условия вторичного обсеменения готовых молочных продуктов.

Источниками экзогенного, или постсекреторного обсеменения сырого молока являются корма, включая сено и концентраты; частота обнаружения в них L.monocytogenes варьирует от 1 до 8,7 % [Farber J.M., 1989; Husu J.R., 1990], и вероятность такого способа заражения сырого молока очень велика даже при отсутствии на фермах больных животных. Это в свою очередь может приводить не только к попаданию возбудителя в заготавливаемое сырье, но и к заражению емкостей, в которых собирают молоко на фермах, посуды, инвентаря и т.п.

Исследования по выявлению листерий в образцах сырого молока, полученных в хозяйствах Центрального региона РФ (свыше 60 проб) показали, что 5,7% проб содержали L.monocytogenes в количестве до 100 КОЕ/см³ (табл. 2). Листерии обнаруживали на фоне высокого уровня микробной контаминации молока, санитарно-гигиенические характеристики которого свидетельствовали о неудовлетворительных условиях производства и хранения молочного сырья: уровень колиформных бактерий колебался в зависимости от сезона, в летне-осенний период количество БГКП в молоке достигало величин 10⁷ - 10⁸ КОЕ/см³ и в среднем находилось на уровне 5 х 10⁶ КОЕ/см³; содержание бактерий рода Enterococcus превышало 10⁴ КОЕ/см³.

Таблица 2. Результаты исследования сырого молока по санитарно-микробиологическим показателям и на наличие L.monocytogenes

* - приведенные колебания цифровых показателей отражают результаты исследований в различные сезоны года.

Роль сырого молока в передаче возбудителя на молокоперерабатывающих предприятиях очень велика. Заражение молочных продуктов, и в первую очередь сыров, как правило, происходит после пастеризации молока во время производственного процесса: L.monocytogenes и другие виды листерий, попадая с сырым молоком на завод, могут здесь обитать и размножаться, обуславливая вторичное обсеменение вырабатываемой продукции. В каждом конкретном случае заражение предприятия может происходить своим путем, который бывает довольно трудно установить, поскольку возбудитель распространен повсеместно и массивность контаминации, как правило, зависит от санитарно - гигиенического состояния производства.

Энтерогеморрагические E.coli. Рассматривая фекальное заражение сырья как наиболее вероятный источник энтерогеморрагических E.coli, авторы многих работ приводят данные по частоте обнаружения их в пробах фекалий. Данные о частоте обнаружения E.coli O157:H7 или других энтеротоксигенных эшерихий колеблются в большом интервале (1,6 - 8,5%) и, вероятно, отражают климатические, сезонные и географические условия, различия в методиках отбора проб и проведения исследований. Взрослые животные обычно являются бессимптомными бактерионосителями и выделяют эти микроорганизмы в окружающую среду в течение длительного времени. Имеются сообщения о выделении животными в течение месяца шигатоксинпродуцирующих E.coli, патогенных для человека [Chapman P.A. et al., 1997, Brichta-Harhay D.M. et al., 2008].

Основные пути трансмиссии возбудителя и удельный вес (%) некоторых видов сырья, пищевых продуктов и воды как факторов передачи E.coli O157:H7- инфекций показаны на рис.1. Приведенная схема в значительной мере отражает характер распространения и пути передачи большинства эмерджентных зоонозов. Очевидно, что сырые продукты, такие как мясо, молоко, овощи, фрукты и салаты из них, а также любые другие продукты, подвергнутые прямо или косвенно фекальной контаминации, или контактировавшие с зараженной водой, являются потенциальными источниками пищевых инфекций. Ферментированные продукты из сырого молока или мяса, которые вырабатываются без применения технологий, снижающих бактериальную контаминацию (например, пастеризация), также представляют опасность в санитарно-эпидемиологическом отношении.

Микробиологические исследования, проведенные в 2002-2007 гг. показали, что среди 270 штаммов энтеробактерий, выделенных из мясного сырья, полуфабрикатов и смывов, 75 относились к виду E.coli. Один штамм E.coli, выделенный из мясного сырья - говядины, относился к серотипу О157:Н7 (1,3 %) и обладал выраженной способностью к токсинообразованию. Этот токсигенный штамм характеризовался типичными для энтерогеморрагических эшерихий культуральными и метаболическими свойствами (в том числе был сорбитнегативным и не обладал в-D-глюкуронидазной активностью), что подтвердило реальную возможность контаминации пищевой продукции этими патогенными микроорганизмами.

В исследованных образцах выделяли преимущественно бактерии видов E.сoli (36,6%), цитратассимилирующие бактерии видов Citrobacter braakii (14,6%) и Citrobacter freundii (7,3%), а также Enterobacter сloacae и aerogenes (7,3 %), Serratia odorifera (2,4%). Кроме того, в образцах готовых колбас присутствовали Hafnia alvei и Pantoea spp. (табл.3).

Таблица 3 Частота выявления различных видов энтеробактерий

Одновременно проводили сравнительное изучение загрязненности колиформными бактериями различных объектов: пищевых продуктов, питьевой воды, смывов с оборудования предприятий общественного питания, фекалий взрослых и детей [Ефимочкина Н.Р. и др., 2002]. Данные о частоте обнаружения энтеробактерий приведены в табл.4.

Рис.1. Основные пути передачи ЕНЕС и удельный вес сырья, пищевых продуктов и воды в этиологии возникновения инфекций.

Таблица 4 Характеристика штаммов энтеробактерий, выделенных из различных объектов

Количество штаммов E.coli, типичных по культурально-биохимическим признакам, в том числе обладающих способностью к образованию индола, не превышало 45% от общего числа исследованных штаммов. Из 70 исследованных штаммов эшерихий 3 были отнесены к серогруппе О157; эти культуры были выделены из клинического материала (при анализе на дисбактериоз и из мочи), а также из одного образца кисломолочного продукта - йогурта.

Большинство выделенных штаммов E.coli характеризовались высокой степенью патогенности, что подтверждалось наличием одного или нескольких факторов агрессии (токсинообразование, антилизоцимная, антиинтерфероновая активность, антибиотикорезистентность). Было установлено, что частота обнаружения штаммов E.сoli, обладающих антиинтерфероновой и антилизоцимной активностью, была более чем в 2 раза выше при исследовании клинического материала, нежели при анализе продуктов питания. Вместе с тем привлекает внимание факт проявления вышеназванных признаков патогенности не только эшерихиями, но и культурами родов Klebsiella и Enterobacter. Однако в этом случае штаммов с выраженной аггрессивностью обнаруживалось больше в продуктах питания (Klebsiella - 50%, Enterobacter - 24%). Результаты серологического типирования выделенных штаммов свидетельствовали о возможной контаминации пищевых продуктов энтерогеморрагическими эшерихиями, которые при определенных условиях могут способствовать развитию заболеваний, связанных с пищевым путем передачи.

Campylobacter spp. Учитывая значительную распространенность и циркуляцию в природе кампилобактеров, большое внимание исследователей уделяется частоте обнаружения этих микроорганизмов в различных объектах. Они присутствуют в окружающей среде как комменсалы или патогены в организме домашней птицы или животных, и могут персистировать длительное время при неблагоприятных условиях. В первую очередь C.jejuni рассматривается как нормальный комменсал кишечника птиц. Степень бактерионосительства у домашней птицы очень высока и достигает 90% [Куликовский А.В., 2004]. В содержимом кишечника кур количество C.jejuni может достигать 10⁶ КОЕ/г.

Частота обнаружения бактерий рода Campylobacter у других видов сельскохозяйственных животных и птицы, а также в полученном от них сырье свидетельствует о значительном распространении этих микроорганизмов и о возможной контаминации вырабатываемых пищевых продуктов По данным различных авторов частота выделения кампилобактеров при обследовании мясного скота колеблется от 43 до 83%, молочных животных - 6 -64%, свиней - 50 - 69%, овец - 18 - 44%. Уровень обсеменения мяса домашней птицы достигает в отдельных случаях 100%, в среднем % положительных проб при исследовании тушек кур, индеек и уток составляет 58 -78% [Т. Humphrey et al., 2007]. Установлено, что при сравнительно высокой частоте обнаружения этих бактерий в разных видах мясного сырья наибольший риск для здоровья человека связан с употреблением куриного мяса, поскольку его удельный вес в структуре питания населения очень велик.

Результаты проведенных исследований показывают, что обсемененность Саmpylobacter spp. сырых птицепродуктов составила 37% (42 из 113), при этом Саmpylobacter наиболее часто обнаруживали в мясе и полуфабрикатах птицы натуральных, а также в субпродуктах, обсемененность которых составила 40% и 35% соответственно.

Salmonella spp. Для большинства зоонозных инфекций, в том числе для сальмонеллеза и кампилобактериоза, первостепенное значение имеет загрязнение сырья интестинальным содержимым при его производственной разделке и обработке. При этом уровень вторичной контаминации готового продукта находится в прямой зависимости от интенсивности заражения и степени бактерионосительства птиц и животных. По данным ФДА частота выделения сальмонелл в США в среднем составляла 5% от общего количества (более 4000) исследованных проб пищевого сырья [Shao-hua Jhao et al., 2003, Foley S.L. et al., 2008]. Контаминированное куриное мясо идентифицируется как один из основных пищевых источников бактерий рода Salmonella. При исследовании более 200 цыплят - бройлеров сальмонеллы были выделены в 23% случаев, при изучении загрязненности куриного мяса - сырья было обнаружено, что более 19% тушек бройлеров обсеменено бактериями рода Salmonella, 32% проб - C.jejuni, и около 20% - L. monocytogenes [Whyte P. Et al., 2002, van Nierq W. et al., 2005].

Тем не менее, собственные исследования 48 образцов мяса кур и субпродуктов, отобранных на предприятиях оптового продовольственного комплекса Московского региона, показали отсутствие бактерий рода Salmonella (в 25 г продукта). В тех же образцах L.monocytogenes были обнаружены в 3,9% случаев, а C.jejuni - в более 50% проб.

Обобщение сравнительных данных о частоте выделения некоторых видов эмерджентных патогенных бактерий показывает, что они характеризуются высокой степенью распространения в продовольственном сырье, поскольку являются зоонозными микроорганизмами и могут присутствовать в организме сельскохозяйственных животных и птиц (табл. 5).

Таблица 5 Частота выделения некоторых видов эмерджентных пищевых патогенов, %

Таким образом, проведенные исследования вышеназванных патогенов позволили выявить экологическое своеобразие этих возбудителей, которое определяется специфическими закономерностями их распространения, детерминированностью источников выделения, вариабельностью уровней контаминации и частоты выделения. Неудовлетворительные условия получения, первичной обработки и хранения сырья становятся основной причиной интенсивного накопления широкого спектра условно патогенной и патогенной микрофлоры, на фоне которого возможно присутствие наиболее опасных возбудителей пищевых инфекций, в том числе энтерогеморрагических E.coli, сальмонелл, C.jejuni, L.monocytogenes и др. Дальнейшая переработка такого сырья сопровождается перекрестной контаминацией и попаданием возбудителей в готовые продукты, обуславливая высокую степень риска даже при соблюдении технологических режимов производства и хранения пищевой продукции. В свою очередь имеющие место нарушения традиционной технологии и внедрение новых, порой недостаточно изученных способов переработки, упаковки и хранения продуктов и полуфабрикатов являются не менее важными факторами риска обнаружения новых патогенов.

2. Оценка роли L.monocytogenes как одного из наиболее значимых новых патогенов

На современном этапе одной из наиболее актуальных задач обеспечения микробиологической безопасности пищевых продуктов является снижение риска возникновения пищевого листериоза - заболевания, вызываемого бактериями Listeria monocytogenes. Решение данной проблемы связано с необходимостью совершенствования методологии выделения и идентификации возбудителя, разработки эффективных ускоренных способов обнаружения L. monocytogenes в пищевых продуктах, основанных на применении современных методов анализа.

Существующие данные об обнаружении листерий в пищевых продуктах весьма противоречивы и свидетельствуют как о разных частоте и уровнях выявления L. monocytogenes, так и о большой распространенности наиболее близких к ним по фенотипическому профилю бактерий L.innocua. При этом используются различные методические схемы идентификации листерий, что затрудняет сопоставление полученных данных и существенно усложняет анализ эпидемиологической ситуации.

2.1 Межвидовая дифференциация и изучение фенотипических свойств листерий

Начиная с 2000 года проведена многоплановая работа, включающая изучение свойств листерий, скрининг новых штаммов L.monocytogenes и создание коллекции отечественных культур, персистирующих в пищевых продуктах, сырье и объектах внешней среды продовольственных предприятий. Для накопления данных о циркуляции различных видов листерий на основных стадиях пищевой цепи выполнены исследования с использованием традиционных методов бактериологического и биохимического анализа, позволяющих проводить выявление и видовую дифференциацию выделенных штаммов путем оценки ключевых фенотипических свойств микроорганизмов рода Listeria.

Всего проанализировано свыше 200 культур, выделенных из мясного и молочного сырья, полуфабрикатов, готовых мясопродуктов, сыра, творога, и различных объектов внешней среды (смывы с оборудования, инвентаря, посуды и др.). По результатам родовой идентификации к листериям были отнесены 125 штаммов, которые имели типичные морфологические и культурально-биохимические свойства. Исследованные штаммы по комплексу изученных свойств были отнесены к 4 видам: L.monocytogenes - 48 штаммов, L.innocua - 69 штаммов, L.welshimeri - 6 штаммов , L.ivanovii - 2 штамма.

Все культуры L.monocytogenes обладали гемолитической активностью, формируя на поверхности кровяного агара зоны просветления, интенсивность которых варьировала в зависимости от свойств штамма (от очень слабого до умеренного или хорошо выраженного Я-гемолиза). У слабо гемолизирующих штаммов активность культур усиливалась после нескольких пассажей на кровяном агаре. Штаммы L.innocua и L.welshimeri не обладали гемолитической активностью, рост L.ivanovii на кровяном агаре сопровождался образованием широких зон лизиса диаметром 3 мм и более. Лецитиназная активность была четко выражена у всех штаммов L.monocytogenes и L.ivanovii, тогда как листерии видов L.innocua и L.welshimeri не проявляли этого признака при культивировании на хромогенных средах и в присутствии активированного угля.

Все изученные штаммы L.monocytogenes не сбраживали ксилозу, маннит, лактозу, сахарозу и арабинозу; ферментировали с образованием кислоты (без газа) рамнозу, глюкозу и галактозу (табл. 6). Гидролиз сорбита, лактозы и мальтозы был непостоянным и определялся индивидуальными особенностями штаммов. По совокупности изученных признаков была подтверждена наибольшая информативность ферментативных тестов в отношении 3 углеводов - ксилозы, рамнозы и маннита, позволяющая проводить видовую дифференциацию L.monocytogenes от непатогенных листерий. Некоторые отклонения в сахаролитической активности тех или иных культур, подвижности, степени выраженности гемолиза, а также способности диссоциировать в стареющих культурах нередко отмечаются различными исследователями и характерны для внутривидовой изменчивости штаммов [Hammer P. et al., 1989, Карликанова С., 1994].