Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах: экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа

Таблица 6 Ферментативная активность выделенных штаммов листерий

Виды листерий	Ферментация углеводов
	Ксилоза	Рамноза	Маннит	Арабиноза	Галактоза	Глюкоза	Лактоза	Мальтоза	Сахароза	Сорбит
Выделенные штаммы
L.monocytogenes	-	+	-	-	+	+	±	±	-	±
L.innocua	-	±	-	±	+	+	-	±	-	±
L.welshimeri	+	±	-	-	-	+	-	+	-	±
L.ivanovii	+	-	-	-	±	+	±	-	-	+
Коллекционные штаммы
L.monocytogenes 10527	-	+	-	-	+	+	-	+	-	-
L.monocytogenes № 766	-	+	-	-	+	+	-	+	-	+

При тестировании выделенных культур листерий с использованием наборов для идентификации «API Listeria» ф.«BioMerieux» были подтверждены вышеописанные результаты типирования штаммов традиционными бактериологическими и биохимическими методами, при этом сходимость полученных данных в эксперименте превышала 95%.

На основе анализа зарубежного опыта и обобщения накопленных экспериментальных материалов разработаны и введены в действие Методические указания 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах» и ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes». Этими документами регламентируется применение вышеописанных бактериологических и биохимических тестов, позволяющих проводить выделение и идентификацию листерий по комплексу основных родовых и видовых фенотипических признаков.

2.2 Cовременный комплексный подход к идентификации листерий при микробиологическом контроле на предприятиях пищевой индустрии

Освоение высокоспецифичных комбинированных методов быстрой идентификации и типирования направлено на создание современных схем эффективного мониторинга за L. monocytogenes в продуктах питания на этапах их изготовления и хранения, получение более достоверных сведений о циркуляции этого возбудителя на предприятиях пищевой индустрии.

С этой целью проведена разработка методологии детекции патогенных листерий на основе комплексного применения традиционных и новых методов анализа. Работа включала подбор и сравнительную оценку стандартизованных микробиологических и биохимических методов в сопоставлении с молекулярно-генетическими методами. При этом изучали информативность и диагностическую значимость отдельных тестов идентификации листерий, определяли эффективность и чувствительность различных модификаций методов генотипирования и возможность их практического применения для экспресс-индикации L.monocytogenes.

Метод иммуномагнитной сепарации. Изучена возможность применения иммуномагнитной сепарации (IMS) при исследовании пищевых продуктов на наличие Listeria monocytogenes в различных вариантах предварительного обогащения проб с использованием тест-наборов «Listeria A-Beads» («Aureon Biosystems»).

В модельных экспериментах за счет IMS удавалось достигнуть 10-100 кратного концентрирования тест-микроорганизма, продолжительность процедуры при этом составляла 30-40 мин (табл.7).

Таблица 7 Выявление L. monocytogenes в суспензиях, обработанных методом IMS

Расчетная концентрация тест-культур в пробах, lg КОЕ/см3	Содержание листерий, выявленное микробиологическим посевом, lg КОЕ/см3 (n = 4)
L. monocytogenes	L.innocua	До сепарирования	После сепарирования
1,0	-	-	-
2,0	-	0,9 + 0,3	1,6 + 0,51
3,0	-	2,60 + 0,27	3,36 + 0,33
4,0	-	3,61 + 0,44	5,15 + 0,79
-	3.0	3,09 + 0,55	-
-	4,0	4,08 + 0,35	-

Отмечено, что жизнеспособность клеток L. monocytogenes до и после сепарирования достоверно не изменялась. При оценке микро- и макроморфологии тест-штамма, а также скорости роста культуры установлено, что IMS не оказывает ингибирующего воздействия на L.monocytogenes и не меняет их культуральных свойств. Подтверждена специфичность метода: штаммы листерий вида L.innocua не взаимодействовали с индикаторными антителами, сенсибилизированными на магнитном носителе.

Получены сопоставимые результаты при использовании двух различных схем селективного обогащения L.monocytogenes при низком уровне контаминации (10² КОЕ/г) - 1-стадийной с последующей IMS и традиционной, предусматривающей двойное селективное обогащение посевов [Ефимочкина Н.Р. и др., 2003]. Включение в схему микробиологических исследований пищевых продуктов по показателю L. monocytogenes методики иммуномагнитной сепарации позволяет сократить время анализа до 4 суток в сравнении с классическим методом, продолжительность которого составляет не менее 6-7 суток. Данная схема может быть использована при разработке ускоренных методов определения L.monocytogenes в пищевых продуктах.

Метод ДНК-гибридизации. Исследована возможность определения L.monocytogenes в пищевых продуктах методом твердофазного гибридизационного метода ДНК-рРНК анализа с хемилюминесцентным детектированием в системе «LUMIProbe 24» (Франция). Мишенью в реакции ДНК - гибридизации являлась последовательность ДНК, кодирующая продукцию токсичного белка листериолизина.

Для оценки специфичности метода проведены исследования по видовой идентификации L. monocytogenes с использованием штаммов листерий как в монокультурах, так и смесях различных представителей рода. Результаты показали высокую специфичность (100%) и чувствительность метода. Данные были получены при анализе 11 штаммов L. monocytogenes и 14 штаммов листерий других видов - L. ivanovi, L. innocua, L. welshimeri. При оценке чувствительности метода с использованиием двух референс-штаммов L. monocytogenes было показано, что достоверная детекция возбудителя достигается при плотности бактериальной суспензии не менее 5х10⁵- 1х10⁶ КОЕ/см³. При меньших концентрациях клеток L. monocytogenes в испытуемых пробах величины люминесценции находились ниже или на уровне пороговой величины измерений.

Таким образом установлена возможность использования метода твердофазного ДНК-рРНК гибридизационного анализа с хемилюминесцентным детектированием для подтверждения видовой принадлежности штаммов L. monocytogenes, выделенных из пищевых продуктов и других объектов.

Для оценки эффективности метода ДНК-гибридизации при прямом выявлении L. monocytogenes в пищевых продуктах и объектах окружающей среды проводили экспериментальную контаминацию проб коллекционными штаммами L. monocytogenes. Контаминированные пробы инкубировали двукратно в течение 6 и 18 часов в бульоне Фрейзера и в RM Listeria бульоне, входящим в состав тест-наборов «LUMIProbe» и исследовали на наличие листерий (табл. 8).

Таблица 8 % открываемости проб продуктов, контаминированных L.monocytogenes

Объекты исследования	Дозы контаминации, КОЕ/г (см3)	Результаты анализа,% (n=5)
		Методом ДНК - гибридизации	Бактериологическим методом
Рыбные продукты	101	96,5	95,4
	102	100	100
Салат «Столичный»	101	85,0	85,0
	102	100	96,7
	103	100	100
Фарш куриный	101	84,7	84.7
	102	100	90,0
	103	100	100
Молоко сырое	101	85,8	85.8
	102	96,7	86,0
	103	100	100
Кисломолочные продукты	101	100	100
	102	100	100
Сыры «адыгейский», «сулугуни», брынза	101	67,0	67,0
	102	100	100

Анализ полученных данных показал, что метод ДНК-РНК гибридизации с наборами «LUMIProbe» позволяет определить наличие L. monocytogenes при уровнях исходной контаминации 10-100 КОЕ/г. Результаты исследований позволили разработать и впервые в России внедрить стандартизованный метод выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах на основе гибридизационного ДНК-анализа (МУК 4.2.1955-05).

Применение метода ПЦР для изучения L. monocytogenes. Сравнительное изучение существующих методов детекции эмерджентных пищевых патогенов позволяет выделить в качестве наиболее перспективного направления в генодиагностике L. monocytogenes применение различных форматов постановки полимеразной реакции (ПЦР).

В работе использовали Taq-полимеразу и другие реагенты производства фирмы «Бионем». Праймеры для родовой и видовой идентификации были синтезированы в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (табл.9). Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик». Режимы амплификации:

для пары prs 1- prs 2 - 94С- 2 мин., 5 циклов: 94С - 5c, 42С - 5c, 72С - 5c, затем 25 циклов - 94С - 1c, 42С - 1c, 72С - 1c.

для пары Plc 1- Plc 2 - 94С - 2мин., затем 5 циклов: 94С - 5c, 55С - 5c, 72С - 5c, затем 25 циклов - 94С - 1c, 55С - 1c, 72С - 1c.

для пары Act 1- Act 2 - 94С - 2мин., затем 5 циклов: 94С - 20с., 60С - 20с., 72С - 20с и еще 30 циклов: 94С - 5с, 60С - 5с, 72С - 5с.

Таблица 9 Праймеры для идентификации L.monocytogenes

Наименование праймера	Нуклеотидный состав праймера
Prs 1	GCATTGCGTGAAGCTGGCGCAAC
Prs 2	CAGAAGCATTTTCATGAAC
Plc 1	AGGGGGCCATTTTGTATAAG
Plc 2	ATCGTTGCTGTTTTGCTCGT
Act 3	CATGCGGTCGACCAGTATTCGGCGGG
Act 4	TCTGTTGGATCCCACTTATACTCCC

Амплифицированные фрагменты ДНК анализировали гель-электрофорезом в 1% агарозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии 5 мкг/мл бромистого этидия. Результаты учитывали путем окраски и выявления окрашенных ампликонов в УФ-свете (254нм), оценивая молекулярную массу полученных участков ДНК в сравнении со стандартными маркерами (100 bp DNA Ladder).

В качестве объектов исследования были выбраны различные образцы мясных продуктов, полуфабрикатов, мясного сырья, и смывы с технологического оборудования и инвентаря (всего 143 пробы). По результатам первичных посевов было выделено 49 культур, которые по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам (типичный рост на Оксфорд или ПАЛКАМ-агаре, подвижность при 22⁰C, наличие каталазы, отсутствие ферментации маннита) были отнесены к роду Listeria. При проведении видовой идентификации выделенных культур рода Listeria 24 штамма соответствовали культуральным и биохимическим характеристикам L.monocytogenes: они ферментировали рамнозу и маннозу, но не сбраживали маннит и ксилозу, и по остальным тестам API Listeria были типичны. Из них только 9 (37,5 %) образовывали четкие зоны -гемолиза. Эти же культуры обладали выраженной лецитиназной активностью на среде с добавлением желточной эмульсии в присутствии активированного угля. Ранее было показано [Ermolaeva S. et al., 2003], что секретируемый листериями продукт, выполняющий функции авторепрессора синтеза лецитиназы, может быть устранен из среды гидрофобным сорбентом, в частности активированным углем. При этом происходит активация генов патогенности и, как следствие, увеличение уровня экспрессии лецитиназы в среду. Использование данного теста позволяет дифференцировать L.monocytogenes от другого вида - L.ivanovii, синтез фосфолипаз которым не зависит от присутствия в среде авторепрессора.

Вышеописанные культуры L. monocytogenes были выделены из смывов с оборудования и инвентаря (конвейеры, пилы, рабочие столы, разделочные ножи, доски) - 8 штаммов и из свинины-сырья - 1 культура. Штаммы листерий, не обладающие гемолитической и лецитиназной активностью, по совокупности признаков были отнесены к виду L.innocua. Кроме того, фенотипическим характеристикам этого вида соответствовали еще 23 культуры, выделенные из фарша, полуфабрикатов, сырья для производства сырокопченых и сыровяленых колбас, смывов, а также из готовых продуктов. Приведенные данные свидетельствуют о том, что наибольшее число выделенных культур листерий - 77.6% относится к виду L. innocua. Три штамма, выделенные из смывов, были идентифицированы как L. welshimeri. Листерии видов L.ivanovii, L.seeligeri, L.grayi обнаружены не были.

Для идентификации многих микроорганизмов, в том числе «пищевых» патогенов, в настоящее время наиболее надежным признается комплексный подход, основанный на комбинировании молекулярно-генетических методов с тестированием наиболее специфичных фенотипических признаков рода, вида или серотипа. В отношении патогенных микроорганизмов, имеющих близких непатогенных представителей в пределах рода, к которым относятся L.monocytogenes, подбор наиболее информативных биохимических тестов и ДНК-зондов для идентификации должен основываться на определении именно патогенетических признаков, а не только метаболических свойств, большинство которых в пределах рода кодируются консервативными участками генома. При оценке фенотипа L.monocytogenes такими признаками являются подвижность, способность к гемолизу, наличие специфичных лецитиназ; при генотипировании - это индикация участков генома, определяющих выработку гемолизинов и фосфолипаз, факторов инвазии и цитотоксичности.

Дальнейшее изучение выделенных культур листерий проводили методом ПЦР с родоспецифическими и видоспецифическими праймерами. Для подтверждения родовой принадлежности использовали праймеры prs1 и prs2, направляющие синтез фрагмента гена, кодирующего консервативный для рода Listeria белок фосфорибозилпирофосфатсинтазу, участвующий в общем метаболизме бактериальной клетки. Подбор видоспецифических праймеров проводили путем выделения фрагментов ДНК, участвующих в кодировании наиболее значимых для L.monocytogenes факторов вирулентности. Для видовой дифференциации использовали две пары праймеров: act3-act4 - амплифицирующих участок гена, ответственного за синтез поверхностного белка АстА, индуцирующего полимеризацию актина и обеспечивающего способность к движению возбудителя в цитоплазме инфицированных клеток; plс1-plс 2, направляющих амплификацию гена PlcA - фосфатидилинозитол специфичной фосфолипазы С.

Результаты ПЦР - анализа культур полностью соответствовали данным микробиологических исследований в части родовой идентификации листерий. Положительные результаты ПЦР с видоспецифическими для L.monocytogenes парами праймеров Аct3 - Аct4 и Рlс1-Рlс2 были получены только у штаммов, обладающих лецитиназной и гемолитической активностью, что безусловно подтверждает диагностическую значимость этих тестов. Из 24 штаммов, первоначально (по данным тестирования с применением «API Listeria») отнесенных к L.monocytogenes, по результатам ПЦР-анализа подтверждена принадлежность к данному виду только 8-ми штаммов. Все они при этом обладали Я - гемолитической и лецитиназной активностью.

Применение комбинированного подхода к идентификации бактeрий рода Listeria на основе использования наиболее информативных фенотипических тестов и ПЦР-анализа с праймерами на участки генов, кодирующих факторы патогенности листерий, позволило сократить в три раза число культур, изначально признанных как L. monocytogenes по комплексу биохимических признаков. Положение о том, что только выявление участков ДНК возбудителя, кодирующих факторы патогенности, является достоверным критерием принадлежности к «эмерджентным» патогенам, было доказано также сопоставлением с другим молекулярно-биологическим методом - ДНК- гибридизации, где целевым являлся ген, кодирующий синтез листериолизина - одного из основных факторов вирулентности L.monocytogenes. Это подтверждается 100% специфичностью метода ДНК-рРНК гибридизации при определении видовой принадлежности L. monocytogenes.

Проведенные сравнительные методические исследования позволили разработать принципиально новый комплексный подход к идентификации бактeрий L. monocytogenes путем комбинирования наиболее информативных фенотипических тестов, характеризующих патогенетические свойства данного возбудителя, и ПЦР-анализа с праймерами на участки генов, направляющих экспрессию этих факторов патогенности (рис.2).

Рис.2. Биохимические и генетические тесты идентификации L. monocytogenes

Предлагаемый комбинированный метод индикации бактeрий L. monocytogenes включает следующие основные этапы:

· подготовка проб пищевых продуктов (измельчение и гомогенизация твердых субстратов в физиологическом растворе, нейтрализация продуктов до рН 7,0-7,5 1N раствором NaOH);

· первичное обогащение - инкубирование в бульоне Фрейзера Ѕ концентрации в течение 24 часов при температуре 30±1Сє (25 cм³ образца в 225 cм³ среды);

· вторичное обогащение - инкубирование в бульоне Фрейзера в течение 24-48 часов при температуре 36±1Сє (0,1 cм³ образца в 9 cм³ среды), или проведение IMS;

· высев на поверхность селективно-диагностических сред (ПАЛКАМ или Окфорд-агар), инкубирование в течение 24-48ч при 361єС;

· отбор 5 характерных колоний, пересев их на триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и одновременно - на поверхность хромогенных сред (ALOA или Rapid L'mono или лецитин-агар) и кровяного агара; инкубирование в течение 24 ч при 361єС;

· проведение ПЦР-анализа скультурами листерий, продуцирующими гемолизин и лецитиназу, с праймерами к генам PlcA и ActA.

В лабораториях, оснащенных системой «Люмипроб», возможно проведение экспресс-идентификации выделенных культур методом ДНК-гибридизации с хемилюминесцентной детекцией. Данный анализ может проводиться как в варианте прямого выделения возбудителя из пищевых продуктов, так и в качестве подтверждающего теста при исследовании L. monocytogenes.

Разработанная в результате проведенных исследований схема (рис.3) положена в основу арбитражного экспресс-метода выявления и видовой идентификации L.monocytogenes, который включен в проект Санитарных правил «Порядок учета и расследования пищевых отравлений и вспышек заболеваний с пищевым путем передачи».

Рис.3. Ускоренная идентификация L.monocytogenes

2.3 Экспериментальное изучение некоторых закономерностей выживания и размножения листерий в модельных системах

Для выявления механизма и условий выживаемости L.monocytogenes, а также с целью разработки предупредительных мер на предприятиях пищевой промышленности особое значение имеет изучение факторов, влияющих на жизнедеятельность листерий, которое может быть выполнено только путем экспериментального моделирования процессов производства и хранения различных видов продуктов.

Влияние тепловой обработки на L.monocytogenes

Многочисленные экспериментальные работы посвящены определению возможности выживания листерий в процессе пастеризации молока, поскольку чувствительность L.monocytogenes к тепловому воздействию трактуется авторами по-разному и порой противоречиво. Имеются сообщения о том, что листерии обладают повышенной устойчивостью к тепловой обработке, выдерживая общепринятые в сыроделии режимы кратковременной пастеризации молока [Карликанова Н.Р. и др., 1999]. Это положение подкрепляется известными данными о выживании L.monocytogenes в качестве факультативно интрацеллюлярного микроорганизма в фагоцитарных клетках, создающих защитную систему от внешних воздействий и тем самым снижающих чувствительность бактерий к тепловому воздействию, то есть высокая термоустойчивость L.monocytogenes объясняется их внутриклеточным паразитированием [Farber J.M., 1989].

Изучение возможности выживания листерий при тепловой обработке молока проводили, используя общепринятые в отечественном сыроделии температурные режимы пастеризации, а именно: 70 -:- 72^оС с выдержкой от 20 до 25 с (режим 1); 76^оС с выдержкой от 20 до 25 с (режим 2). Эффективность режимов пастеризации в значительной степени определялась исходным уровнем L.monocytogenes в молоке (рис.4). При содержании 10³ КОЕ/см³ и менее повышенная температура прогрева - 76^оС в течение 20с оказывалась достаточной для подавления бактериальных клеток листерий. При 72^оС с той же выдержкой наблюдалась значительная инактивация листерий под влиянием тепловой обработки, однако жизнеспособные клетки в таком молоке все-таки сохранялись в небольшом количестве. При массивном исходном обсеменении молока листериями в количестве 10⁵ и тем более 10⁸ КОЕ/см³ регламентированные в сыроделии режимы пастеризации оказывались недостаточно эффективными, обеспечивая лишь некоторое снижение числа жизнеспособных клеток.

Рис.4. Влияние температурных режимов пастеризации молока на L.monocytogenes.

Более эффективной в этом отношении была двойная тепловая обработка молока, включающая первоначальную термизацию (при 65^оС с выдержкой 20 - 25 с) и через 16 - 20 ч - обычную пастеризацию при 72^оС в течение 20 с (рис.5). Применение двойной тепловой обработки обеспечивало бактерицидный эффект в отношении листерий даже при массивном обсеменении ими молока в количестве 10⁵ КОЕ/см³. Такая значительная контаминация редко бывает в естественных условиях. Однако при резервировании сырого молока при низких температурах возможно увеличение числа попавших в него листерий до того уровня, который изучали в данном эксперименте. Поэтому применение термизации молока с последующей его пастеризацией создает определенные предпосылки для защиты перерабатываемого сырья от развития в нем L.monocytogenes.

Рис.5. Влияние двойной тепловой обработки молока на L.monocytogenes

Изучение выживаемости L.monocytogenes в молоке при длительном хранении

Изучение условий роста и выживания листерий в процессе длительного хранения молока проводили с использованием двух коллекционных штамма L.monocytogenes, которые выдерживали в течение 4 - 7 мес при температуре 4 - 8^оС. Наряду с определением основных культурально-морфологических признаков штаммов через 1, 2, 3 и 6 мес хранения ставили биопробу, заражая белых мышей исследуемым материалом.

Установлено очень длительное (в течение 7 месяцев и более) выживание листерий в молоке, необычное для вегетативных форм микроорганизмов. В то же время на других питательных субстратах выживаемость листерий была самой обычной и не превышала 2 - 3 месяцев.

Патогенность штаммов листерий в процессе хранения в молоке постепенно снижалась и к 6-7 месячному периоду они полностью становились непатогенными. По мере старения культур отмечались изменения их тинкториальных, морфологических и культурально-биохимических признаков: терялись подвижность и восприимчивость к окраске по Граму, при культивировании на МПА появлялись укрупненные, шероховатые R-формы, в микроскопических препаратах наблюдали некоторое увеличение размера клеток, появление цепочек или длинных нитей, а при посевах на кровяной агар - снижение или полную потерю гемолитической активности штаммов в 2 - 3 месячном возрасте. Кроме того, регистрировали некоторые сдвиги в гидролитических свойствах хранившихся культур листерий в части утраты способности ферментировать некоторые виды углеводов (галактозу, рамнозу, сахарозу).

Наблюдаемые изменения характерны для стареющих культур листерий, они являются одним из признаков изменчивости микроорганизмов и должны учитываться при установлении видовой принадлежности штаммов L.monocytogenes, выделяемых при исследованиях сырья и пищевых продуктов длительного хранения.

Чувствительность листерий к неблагоприятным воздействиям среды

Серия экспериментов по изучению воздействия некоторых факторов на рост и жизнеспособность L.monocytogenes включала наряду с тепловой обработкой оценку влияния рН среды, антагонистической активности молочнокислых бактерий или их субстратов и др.

При величине рН 5.2 обезжиренного молока, установленного добавлением молочной кислоты, происходило довольно активное развитие L.monocytogenes (увеличение числа клеток на 1.5 - 2 порядка). Почти при том же значении рН, но в гидролизате казеина с уксусной кислотой наблюдалось значительное подавление роста листерий (в среднем на 2 порядка). Практически полное ингибирование роста культуры L.monocytogenes наблюдалось при внесении ее в инактивированную культуральную среду L. acidophilus при рН 3,9 - 4,0. Это бактерицидное влияние проявлялось особенно наглядно в сравнении с жизнеспособностью листерий в обезжиренном молоке с той же кислотностью, но в присутствии молочной кислоты. Это позволяет предполагать, что наряду с низкой кислотностью в субстрате с L. acidophilus проявлялось бактерицидное действие на листерии антибактериальных веществ, продуцируемых ацидофильной палочкой.

Анализ данных о характере воздействия различных физико-химических и биологических факторов в отношении L.monocytogenes определили необходимость оценить способность листерий выживать в присутствии молочнокислых микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами с использованием модели совместного культивирования в соевом субстрате, используемом в производстве новых видов ферментированных продуктов. В зараженное листериями молоко вносили заквасочные культуры лактобактерий (L.fermentum и L.rhamnosus) в количестве 10⁴, 10⁶ и 10⁸ КОЕ/см³.

Результаты совместного культивирования листерий и заквасочной микрофлоры при параметрах, имитирующих нарушения технологического процесса ферментации соевого молока, показаны на рис.6. Заражение соевого молока бактериями L.monocytogenes в количестве 100 и 10 КОЕ/см³ не приводило к ингибированию возбудителя даже при высоких уровнях содержания заквасочной микрофлоры. При меньшей расчетной дозе листерий 1 КОЕ/см³ обнаружить L.monocytogenes удавалось в 66 % проб после 6 и 24 часов термостатирования. Во всех исследованных вариантах опыта снижение концентрации молочнокислых микроорганизмов и, соответственно, замедление процесса ферментации обеспечивали более благоприятные условия для выживания и накопления возбудителя.

Рис. 6. Ингибирование роста листерий заквасочной микрофлорой

Используя модель «ассоциативного роста», проведено сравнительное изучение особенностей размножения не только листерий, но и других видов эмерджентных патогенов, в частности энтерогеморрагических E.coli (штамм № 1330, серотипа О157:Н7).

При экспериментальной контаминации сырья энтеротоксигенным штаммом E.coli cеротипа О157:Н7 в дозе 100 КОЕ/см³ ингибирования роста возбудителя не удавалось достигнуть как при низких, так и при высоких уровнях заквасочной микрофлоры (рис.7). При малых дозах заражения - 1 - 10 КОЕ/см³ степень выживания E.coli зависела от концентрации молочнокислых микроорганизмов в среде и активности процесса кислотообразования. Рост E. coli после 6 ч ферментации отсутствовал в 52% проб, а к концу наблюдения (24 ч) ингибировался только в тех вариантах, содержание молочнокислых микроорганизмов в которых составляло не менее 10⁸ КОЕ/см³.

Таким образом установлено, что в процессе ферментации при заданных параметрах сквашивания и высоких уровнях заквасочной микрофлоры отмирание L.monocytogenes и E.coli О157:Н7 идет интенсивнее, чем при снижении активности заквасок, что может быть обусловлено как антагонистическими свойствами штаммов закваски в отношении патогенов, так и быстрым повышением уровня кислотности среды модельного продукта.

В целом полученные данные подтверждают предположение о высокой устойчивости эмерджентных патогенов с генетически закрепленными факторами вирулентности к воздействию внешней среды и о их способности выживать в среде с наличием технологической заквасочной микрофлоры, что указывает на необходимость более жесткого микробиологического контроля ферментированных продуктов.

Рис.7. Ингибирование роста E.coli 1330 заквасочной микрофлорой

По оси ординат - % проб, в которых после 6 или 24 ч ферментации не обнаружены L. monocytogenes и E.coli.

Исследование взаимодействия L.monocytogenes и других эмерджентных патогенов с антагонистически активной микрофлорой пищевых продуктов

Приведенные данные о характере воздействия разнообразных физико-химических и биологических факторов в отношении L.monocytogenes обусловили проведение специальных исследований по изучению способности некоторых микроорганизмов проявлять антагонистические свойства в сложном биоценозе не только с листериями, но и с другими патогенными микроорганизмами - возбудителями эмерджентных пищевых инфекций. Наибольшее значение в этом плане придается молочнокислым бактериям с выраженным антимикробным действием и выделенным из них субстанциям, которые могут использоваться для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, лечения и профилактики целого ряда заболеваний, что рассматривается в настоящее время как одно из перспективных направлений и в медицине, и в ветеринарии, и в животноводстве.

В связи с этим в 2007-2008 г.г. проведена работа по поиску и отбору антагонистически активных штаммов лактобактерий (LAB). Выделение LAB проводили из продуктов непромышленного производства, для изготовления которых традиционно используются методы микробной ферментации заквасочными культурами, полученными из естественных источников. Всего было исследовано свыше 200 образцов продуктов из 7 областей и регионов, территориально удаленных друг от друга и различающихся по климатическим и экологическим условиям, имеющим местные особенности в структуре питания населения. В процессе работы было выделено и идентифицировано 66 штаммов микроорганизмов, отнесенных к 4 родам молочнокислых бактерий.

Наиболее часто в ферментированных молочных продуктах обнаруживали микроорганизмы рода Lactococcus (50 %). Бактерии родов Leuconostoc и Lactobacillus преимущественно выделяли из сыров и овощных продуктов (100% и 70,6% выделенных штаммов, соответственно).

Анализ таксономической принадлежности исследованных штаммов показал большое разнообразие выделенных видов LAB, включающих представителей практически всех известных филогенетических групп лактобактерий в соответствии с общепринятой классификацией, основанной на комплексной оценке фенотипических свойств и данных 16s rРНК-гомологии [Vandamme P. et al., 1996, Шабанова Н.А. и др., 2009]. Наиболее часто антагонистически активные LAB относились к группе гомоферментативных лактобактерий группы L.delbrueckii - 6 штаммов из 16, 5 штаммов по результатам идентификации были отнесены к факультативно гетеротрофным лактобактериям группы L.casei.

Наибольшую антагонистическую активность проявляли штаммы Lactobacillus helveticus L8 и Lactobacillus curvatus L4 (табл.10). Эти штаммы обладали широким спектром ингибирующего действия практически на все изученные тест-культуры патогенных микроорганизмов. Наиболее выражен был антагонизм L. helveticus и L. curvatus в отношении патогенных L.monocytogenes. Достаточно высокий уровень активности был также отмечен у штамма L.fermentii (L1/1), выделенного из творога, произведенного в Ростовской области. Антимикробное действие данного штамма проявлялось в отношении L.monocytogenes, Salmonella, E.sakazakii.

Таблица 10 Антагонистическая активность выделенных штаммов LAB

Исследованные штаммы LAB	Тест - культуры (диаметр зон задержки роста, мм, n =4)
	L. monocytogenes 766	Salmonella typhimurium	E.coli O157:H7	E.coli M-17	Enterobacter sakazakii
Lactobacillus fermentii L1/1	11,0 + 0,5	9.5 + 0,2	0	9.5 + 0,3	10.0 + 0,5
Lactococcus lactis L14	-	-	10.5 + 0,5	21.0 + 1,0	-
Lactobacillus curvatus L4	16.5 + 2,0	-	11,0+ 0,5	15,2+ 0,4	10,8 + 0,6
Lactobacillus helveticus L8	13,6 + 1,2	10,3 + 0,75	11,75 + 0,8	9.5 + 0,5	9.5 + 0,3
Lactobacillus acidophilus L5	-	н/д**	н/д	18,0 + 2,0	-
Lactobacillus salivarius L17	н/д	н/д	-	10,0 + 0,5	14,0+ 0,6
Lactococcus lactis A 5.11	12,0 + 0,45	-	-	-	11.5 + 0,2

* - « - » - зоны задержки роста отсутствуют; ** - н/д - нет данных

С целью изучения способности культур LAB к синтезу антибактериальных веществ проведены исследования по оптимизации условий культивирования штаммов-продуцентов. По результатам оценки ростовых характеристик и рецептур различных питательных субстратов были составлены 4 варианта модифицированных сред, в которых варьировали ростовые факторы (в т.ч. триптон, углеводы, олигосахариды, микронутриенты). В качестве основы использовали стандартную рецептуру MRS-бульона. Эффективность исследуемых композиций сред культивирования оценивали по скорости накопления биомассы клеток LAB и уровню их антагонистической активности по отношению к патогенным тест - микроорганизмам. Результаты оценки ростовых и функциональных свойств испытанных субстратов приведены на рис. 8.

Проведенные исследования показали возможность улучшения условий культивирования LAB - продуцентов антимикробных субстанций при добавлении в состав MRS- бульона стимуляторов роста лактобактерий (дрожжевой экстракт, глюкоза, лактоза), а также при использовании соевого пептона в сочетании с инулином, моно- и дисахарами. Испытанные варианты сред могут быть использованы для получения антагонистически активных бактериальных препаратов или антимикробных субстанций LAB.

Рис.8. Функциональные свойства модифицированных сред (% прироста биомассы штаммов LAB)

В результате экспериментальных исследований отработана модель совместного культивирования молочнокислых микроорганизмов и эмерджентных патогенов. Отобрано 5 штаммов с наиболее выраженным антагонистическим потенциалом в отношении L.monocytogenes, которые могут быть рекомендованы для промышленного использования в составе бактериальных заквасок в производстве ферментированных и новых видов пищевых продуктов, а также микробных ассоциаций с направленным антилистериозным действием.

2.4 Применение общих принципов обеспечения микробиологической безопасности для эффективного контроля L.monocytogenes в пищевых продуктах

Результаты изучения свойств и распространенности L.monocytogenes, эпидемиологии листериозных заболеваний возбудителя постоянно систематизируются, обобщаются и используются гигиенистами в различных странах мира для разработки национальных программ и организационных мероприятий, направленных на производство и потребление безопасных пищевых продуктов. Принято считать, что анализ риска для одного из наиболее опасных эмерджентных возбудителей пищевых инфекций L.monocytogenes практически завершен, однако решение практических задач по внедрению программ HACCP в системы контроля предприятий отечественной пищевой индустрии остается чрезвычайно актуальным. Использование универсальной структурной модели АМР (анализ микробиологического риска) обеспечивает более целостный подход к безопасности пищи путем интеграции рисков по всей пищевой цепи, направлено на уменьшение количества связанных с ней инфекций, и способствует гармонизации национальных и международных стандартов, норм и санитарных правил.

Актуальность проблемы в условиях современной пищевой индустрии, переработки и хранения продукции, благоприятствующих выживанию листерий в пище, чрезвычайно обострилась. Она в первую очередь связана со способностью микроорганизма при пищевом пути передачи вызывать тяжелую, часто смертельную инфекцию у людей всех возрастов, его возрастающей ролью в перинатальной и неонатальной смертности. А во-вторых, обусловлена биологическими свойствами Listeria monocytogenes - психротрофных, факультативно-анаэробных и галотолерантных микроорганизмов, способности размножаться при холодильном хранении продуктов и в современных видах упаковки, ограничивающей доступ кислорода. Пять ключевых факторов определены как наиболее значимые, с которыми связан наибольший риск возникновения пищевого листериоза, а именно: микроорганизм эмерджентный стафилококк

· Количество и частота употребления продукта

· Частота и уровень контаминации продукта бактериями L.monocytogenes

· Способность продукта поддерживать рост L.monocytogenes

· Температура замораживания/охлаждения продукта при хранении

· Продолжительность хранения замороженного/охлажденного продукта

Комбинация этих категорий для оценки риска листериоза более эффективна, нежели определение влияния каждого фактора по отдельности. В дополнение к перечисленным ключевым моментам, влияющим на количество L.monocytogenes в продукте на момент его употребления, выделяется еще один значимый признак - индивидуальная восприимчивость потребителя к данному патогену.

Необходимость создания в нашей стране свода правил, предупреждающих возможность пищевого листериоза, анализ изученности этой проблемы за рубежом, материалов международных организаций, собственные экспериментальные данные и методические проработки позволили впервые в системе санитарно-эпидемиологического нормирования в России обосновать и ввести в действие новый гигиенический норматив безопасности по показателю Listeria monocytogenes: «Гигиенический норматив ГН 2.3.2.1010-01 (дополнение к СанПиН 2.3.2.560-96) - микробиологический норматив безопасности: “Listeria monocytogenes в 25 г продукта не допускается».

Этот показатель конкретизирован с учетом результатов собственных экспериментальных исследований и сформулирован в виде дифференцированных нормативов для наиболее значимых групп пищевой продукции в Санитарных правилах и нормативах 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов». В разработанном документе отражены также специальные (более жесткие) требования к продуктам, предназначенным для наиболее уязвимых групп населения по степени риска заболеваемости листериозом, в том числе детей раннего возраста, беременных и кормящих женщин, больных и ослабленных людей.

3. Enterobacter sakazakii - новый вид эмерджентных энтеробактерий в общей системе микробиологической оценки продуктов детского питания

Обширная группа колиформных бактерий, традиционно используемая в пищевой микробиологии в качестве санитарно-показательных микроорганизмов - индикаторов фекального загрязнения, в последние десятилетия все чаще становится объектом изучения этиологии новых и вновь возникающих пищевых инфекций, вызываемых измененными вариантами отдельных видов семейства Enterobacteriaceae.

Одним из наиболее наглядных примеров появления таких эмерджентных патогенов среди хорошо изученных популяций непатогенных и условно патогенных энтеробактерий является обнаружение среди бактерий Enterobacter cloacae нового вида Enterobacter sakazaki - возбудителя эмерджентных инфекций у новорожденных и детей раннего возраста. Названный в честь японского микробиолога Riichi Sakazaki, впервые выделившего этот микроорганизм, E.sakazakii в настоящее время интенсивно исследуется в различных странах мира [Gurtler J.B. et al., 2005, Iversen C. et al., 2008, Johler S. et al., 2009].

C целью выявления возможной контаминации сухих инстантных молочных смесей новыми видами патогенов проведены исследования по обнаружению E. sakazakii при санитарно - микробиологическом контроле продуктов детского питания. С применением метода количественного подсчета и расширенной биохимической идентификации в образцах детских сухих молочных смесей впервые в РФ были обнаружены эмерджентные патогенные бактерии E.sakazakii в количестве 0,04 - 0,4 КОЕ/г. Следует подчеркнуть, что E. sakazakii были выделены также при анализе 100 г продукта при использовании селективных сред для патогенных энтеробактерий. Интересен факт выявления этих микроорганизмов в ассоциации с Acinetobacter baumannii/calcoaceticus, которые достаточно часто обнаруживаются в клинических материалах, в смывах в отделениях интенсивной терапии, и считаются возбудителями некоторых нозокомиальных инфекций.

Проведенные исследования показали необходимость оценить диагностическую значимость традиционно используемых тестов идентификации и разработать схему, пригодную для дифференциации E.sakasakii от фенотипически близких вариантов энтеробактерий. Идентификация E. sakazakii вызывает значительные затруднения в связи с идентичностью этого вида по большинству культурально-биохимических признаков с другим представителем рода - E. cloacae. Основной дифференцирующий признак двух видов энтеробактеров - способность E. sakazakii к образованию желтого пигмента также является характерным для бактерий Erwinia herbicola, которые не относятся к колиформным, но достаточно часто обнаруживаются при анализе на БГКП в сухих детских продуктах, содержащих наряду с молочной основой компоненты растительного происхождения [Карликанова Н.Р. и др., 1991]. Известно, что E.herbicola, являясь одним из представителей микробиоты растительных экосистем, считается видом непатогенным для человека, однако имеющиеся литературные данные свидетельствуют о наличии у них фитопатогенных свойств, механизм регуляции которых недостаточно изучен.

Бактерии E. herbicola по своим таксономическим признакам относятся к микроорганизмам, роль и место которых в семействе Enterobacteriaceae многократно менялись: вначале E. herbicola отождествлялись с Enterobacter agglomerans; позднее, Erwinia выделяется как один из родов семейства (E. herbicola является одним из 13 входящих в него видов), а E. agglomerans признается отдельным видом в составе рода Enterobacter. В современной систематике бактерий E. herbicola и E. agglomerans вновь объединены в один вид под названием Pantoea agglomerans и переведены в род Pantoea. Данный представитель семейства энтеробактерий наряду со способностью к пигментообразованию обладает значительным числом одинаковых с E. sakazakii и E. cloacae биохимических и генетических признаков. Следует отметить, что в последние годы P. agglomerans неоднократно регистрировались как возбудители оппортунистических инфекций - ожоговых, раневых, мочевыводящих путей.

Биохимические свойства, наиболее четко дифференцирующие E. sakazakii от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл.11. Выделенные из детских сухих инстантных смесей культуры энтеробактерий, соответствующие комплексу признаков, указанных в таблице, имеющие желтый пигмент, не ферментирующие сорбит и не разжижающие желатину, с высокой степенью вероятности могут быть отнесены к Enterobacter sakazakii.

Таблица 11. Биохимическая дифференциация Enterobacter sakazakii.

Тест или субстрат	Реакции
	E. sakazakii	E. cloacae	P. agglomerans
Лизиндекарбоксилаза	-	-	-
Аргининдегидролаза	+	+	-
Орнитиндекарбоксилаза	+	+	(-)
Подвижность	+	+	(+)
Утилизация цитратов	+	+	+
Реакция с метиловым красным	-	-	-
Реакция Фогес-Проскауэра	+	+	(+)
Индол	-	-	(-)
Глюкоза	+	+	+
Лактоза	+	+	(+)
Сахароза	+	+	(+)
Дульцит	-	-	(-)
Адонит	-	(-)	-
Раффиноза	(+)	+	(+)
D-cорбит	-	+	(+)
б-метил-D-глюкозид	+	(+)	-
мальтоза	+	+	+
Маннит	+	+	+
Разжижение желатины (22ОС)	-	-	+
Мукоидный рост	+	+	+
Желтый пигмент при 24оС	+	-	(+)

Примечания: «+» - 90-100% штаммов положительные; «(+)» - 21-89% штаммов положительные; « - » - 0 - 9% штаммов положительные; «(-)» - 10-24% штаммов положительные.

Оценивая значение E. sakazakii как оппортунистического патогена для новорожденных, установлена вариабельность биологических свойств возбудителя и необходимость уточнения классификации на основе подробного анализа филогенетических связей выделяемых штаммов.

Общая направленность экспериментальных исследований по проблеме оценки риска возникновения E. sakazakii -ассоциированных заболеваний у новорожденных определялась и интерпретировалась в свете новейших данных о таксономическом положении возбудителя. С использованием последней (альтернативной) классификации E. sakazakii как пяти отдельных видов в составе нового рода «Cronobacter» были изучены и заново типированы штаммы E. sakazakii и Pantoea spp., выделенные при посеве 85 образцов продуктов, предназначенных для питания детей первого года жизни (табл. 12).

Таблица 12 Результаты типирования штаммов, выделенных из детских смесей

Исследованные штаммы	Источник выделения	Тесты идентификации	Видовая принадлежность по классификации рода Cronobacter
		Сбраживание дульцита	Индол	Утилизация малоната	Сбраживание метил -б-D- глюкозида	утили-зация сорбита
E.sakazakii № 1M	Сухая смесь	-	-	-	+	-	Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii
E.sakazakii № 4/2	Сухая смесь	-	-	+	+	-	Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus
Референс-штамм E.sakazakii		-	-	-	+	-	Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii
Pantoea spp. №1/1	Сухая каша	+	-	+	+	-	Cronobacter turicensis
Pantoea spp. № 2/5	Сухая смесь	-	-	+	+	-	Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus
Pantoea spp. № 4/5	Сухая каша	+	-	+	+	+	Не соответствует роду Cronobacter
Pantoea spp. № 8/2	Рисовая мука	+	-	+	+	+	Не соответствует роду Cronobacter
Buttiauxella agrestis№ 84/1	Сухая смесь	-	-

Подобные документы

• Способы размножения у различных микроорганизмов, сущность и химизм их дыхания

  Обзор способов размножения бактерий, актиномицетов, дрожжей, плесневых грибов. Влияние лучистой энергии и антисептиков на развитие микроорганизмов. Роль пищевых продуктов в возникновении пищевых заболеваний, источники инфицирования, меры профилактики.
  
  контрольная работа [21,2 K], добавлен 24.01.2012
  

• Стафилококки — возбудители пищевых токсикозов

  Краткая историческая справка и классификация, микроорганизмов, вызывающих пищевые токсикозы. Культуральные свойства данного класса микроорганизмов. Источники обсеменения продуктов стафилококками, диагностирование и лечение заболеваний, ими вызванных.
  
  курсовая работа [30,6 K], добавлен 18.12.2010
  

• Распространение микроорганизмов рода Clostridium в природе и пищевых продуктах

  Патогенные микроорганизмы рода Clostridium. Возбудители ботулизма, эмфизематозного карбункула, столбняка. Получение ацетона и бутанола в ходе бактериального брожения представителей рода Сlostridium. Применение ботулинического токсина в медицине.
  
  курсовая работа [74,3 K], добавлен 05.06.2009
  

• Общие сведения о дикорастущих пищевых, лекарственных и ядовитых растениях

  Пищевая ценность дикорастущих растений. Характеристика биогологически активных веществ лекарственных растений. Распределение дикорастущих пищевых, лекарственных и ядовитых растений по природным зонам. Правила сбора и употребления пищевых растений.
  
  реферат [24,3 K], добавлен 22.03.2010
  

• Пищевые отравления и вызывающие их микроорганизмы

  Источники пищевых отравлений: бактериальные (патогенные микроорганизмы) и небактериальные (токсические химические соединения, ядовитые растения, грибы). Попадание патогенных микробов в пищу. Особенности размножения бактерий. Цикл развития сенной палочки.
  
  контрольная работа [168,3 K], добавлен 04.03.2015
  

• Роль витаминов в питании

  История витаминов, их основные химические свойства и структура, жизненная необходимость для нормальной жизнедеятельности организма. Понятие недостатка витаминов, сущность гипоавитаминоза и его лечение. Содержание витаминов в различных пищевых продуктах.
  
  реферат [96,3 K], добавлен 15.11.2010
  

• Витамин Н

  Биохимическая роль и суточная норма потребления витамина Н (биотина), его содержание в пищевых продуктах и распределение в организме. Применение антибиотиков как причина авитаминоза, его проявления. Коферментная роль витамина в метаболических процессах.
  
  реферат [12,0 K], добавлен 09.12.2012
  

• Витамин С

  Понятия о витаминах, история открытия витамина С. Растительные источники богатые витамином, содержание витамина С в пищевых продуктах. Суточная потребность в зависимости от возраста, симтомы гиповитаминоза. Сохранность витамина при кулинарной обработке.
  
  курсовая работа [28,5 K], добавлен 12.11.2010
  

• Витамин E (токоферола ацетат)

  Синтез витамина Е. Содержание токоферолов в растительных маслах и пищевых продуктах. Длительность жизни красных кровяных клеток. Окисление липидов и формирование свободных радикалов. Формирование коллагеновых и эластичных волокон межклеточного вещества.
  
  реферат [28,5 K], добавлен 15.12.2010
  

• Пищевые растения – источники биологически активных веществ

  Классификация и ценность пищевых растений. Взаимодействие их с лекарственными веществами. Фармакологические и лекарственные свойства пищевых растений. Применение их современной медицине, пищевой, парфюмерно-косметической и ликеро-водочной промышленности.
  
  курсовая работа [1,8 M], добавлен 15.10.2014
  

• Обмен белков, жиров и углеводов

  Результат расщепления и функции белков, жиров и углеводов. Состав белков и их содержание в пищевых продуктах. Механизмы регулирования белкового и жирового обмена. Роль углеводов в организме. Соотношение белков, жиров и углеводов в полноценном рационе.
  
  презентация [23,8 M], добавлен 28.11.2013
  

• Основы микробиологии, физиологии питания и санитарии

  Морфология, классификация и физиология микроорганизмов, распространение в природе, влияние условий внешней среды на их развитие. Пищевые отравления бактериального и немикробного происхождения и их профилактика. Микробиология важнейших пищевых продуктов.
  
  методичка [91,3 K], добавлен 27.01.2013
  

• Интеграция обмена углеводов, белков и жиров в организме. Транспортные системы в организме человека

  Функции обмена веществ в организме: обеспечение органов и систем энергией, вырабатываемой при расщеплении пищевых веществ; превращение молекул пищевых продуктов в строительные блоки; образование нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и других компонентов.
  
  реферат [28,0 K], добавлен 20.01.2009
  

• Строение пищеварительной системы

  Жизнедеятельность организма человека. Поступление пищевых веществ. Здоровый образ жизни. Схема строения пищеварительной системы. Вторичные болезни недостатка и избытка питания. Основные правила предупреждения распространения инфекций водным путем.
  
  реферат [116,6 K], добавлен 30.03.2011
  

• Плесневые грибы

  Способы размножения плесневых грибов. Особенности образования и размножения спор. Условия распространения микроорганизмов в природе. Определение источников загрязнения пищевых продуктов и возникновения инфекций. Микробиологические дефекты и болезни хлеба.
  
  контрольная работа [25,3 K], добавлен 08.09.2010
  

• Слизеобразование - причины возникновения, методы борьбы. Биоциды

  Исследование основных типов микроорганизмов: бактерий, грибов и водорослей. Анализ условий, необходимых для роста микроорганизмов. Механизм образования микробиологических отложений. Изучение методов микробиологического тестирования и приборов мониторинга.
  
  презентация [707,5 K], добавлен 23.10.2013
  

• Биотехнология липидов

  Растительные и животные жиры как основные источники липидов для человека. Технологический процесс получения микробных липидов. Использование микробиологического способа производства липидов. Применение микробных липидов в пищевых производствах.
  
  реферат [137,7 K], добавлен 18.06.2013
  

• Анаэробные процессы

  Функции микроорганизмов: разложение растительных и животных остатков, использование в технологиях производства пищевых продуктов и биологически активных соединениях. Виды анаэробных процессов: спиртового, молочнокислого, пропионового и масляного брожения.
  
  реферат [99,2 K], добавлен 20.01.2011
  

• Биосинтез белков

  Молекулярная организация генетического материала. Транскрипция и трансляция мРНК прокариот. Роль рибонуклеиновых кислот в белковом синтезе. Расположение функциональных центров на субчастицах рибосомы. Свойства генетического кода. Активация аминокислот.
  
  курсовая работа [2,0 M], добавлен 19.11.2013
  

• Жизнедеятельность микроорганизмов

  Исторические сведения об открытии микроорганизмов. Микроорганизмы: особенности строения и форма, движение, жизнедеятельность. Строение клетки, доклеточные формы жизни – вирусы. Экология бактерий, селекция микроорганизмов, их распространение в природе.
  
  реферат [37,3 K], добавлен 26.04.2010
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам