Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах: экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа

Проведенные исследования позволили сформулировать новый подход к контролю сухих инстантных смесей для питания детей раннего возраста (в том числе для недоношенных и новорожденных детей), включающий количественный учет бактерий семейства Enterobacteriaceae и расширенную биохимическую идентификацию всех культурально - морфологических типов изолятов для исключения возможного присутствия E. sakazakii и других новых патогенов кишечной группы.

Обнаружение E. sakazakii в 300 г инстантных молочных продуктов, предназначенных для детей раннего возраста, должно рассматриваться как присутствие патогенных бактерий в исследуемых образцах, и служить основанием для запрета использования такой продукции с принятием соответствующих мер, направленных на обеспечение безопасности продуктов детского питания.

Новый микробиологический показатель безопасности (отсутствие E. sakazakii в 300 г продукта) послужил отправной точкой при пересмотре действующих нормативов с целью ужесточения требований в отношении продуктов для питания детей раннего возраста. Этот показатель включен в проект Санитарных правил «Дополнения и изменения к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», дополняющий требования безопасности продуктов детского питания микробиологическим нормативом «Патогенные микроорганизмы Enterobacter sakazakii».

Для практической реализации нового подхода к контролю детских продуктов разработаны и введены в действие Методические указания МУК 4.2.2428-08 «Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста». Методическая схема определения E. sakazakii представлена в табл.13.

Таблица 13 Схема исследования сухих детских смесей на наличие E.sakazakii

Этап	Время инкубации, ч	температура
1. Неселективное инкубирование пробы массой 100 г в фосфатном буферном растворе (ФБР) в соотношении 1:10	18-24	36оС
2. Посев 10 см3 проинкубированной суспензии в селективный питательный бульон (1:10) для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae (среда Кесслер с глюкозой или бульон Мак-Конки с глюкозой или бульон с желчью, бриллиантовым зеленым и глюкозой) и инкубация	18-24	36оС
3. Пересев 0,1 см3 проинкубированного бульона для выделения Enterobacteriaceae на поверхность фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG agar) или агара Эндо	18-24	36оС
4. Отбор 5 подозрительных на E.sakazakii колоний и пересев на триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и инкубация	48-72	25оС
5. Отбор колоний с желтым пигментом, микроскопия по Граму и подтверждение их видовой принадлежности
6. При обнаружении в 100 г продукта бактерий семейства Enterobacteriaceae - посев 3 проб по 100 г в соответствии с п.п.1 -4 для выявления или подтверждения отсутствия E.sakazakii по п.5
7.При необходимости - подсчет наиболее вероятного числа (НВЧ) по количеству положительных проб в каждой из навесок продукта

4. Значение некоторых потенциально патогенных микроорганизмов в возникновении эмерджентных пищевых токсикозов

Новые данные о появлении среди известных токсических метаболитов бактерий и грибов так называемых «суперантигенов» и других модуляторов системных иммунных реакций (в результате длительного селекционного давления, в том числе в окружающей среде) требуют углубленного изучения свойств этих микроорганизмов и их потенциальной роли в возникновения эмерджентных пищевых токсикозов. К ним относятся заболевания, вызываемые токсигенными штаммами S.aureus, пищевые отравления смешанной этиологии, вызываемые S.aureus в сочетании с B.cereus, протеем, E.coli и другими условно патогенными бактериями, а также микроскопическими грибами - продуцентами новых видов микотоксинов. Появление новых токсигенных штаммов и усиление вирулентных свойств продуцируемых ими метаболитов обуславливают необходимость проведения микробиологических и токсикологических исследований в этой области применительно ко всем аспектам безопасности питания.

В целях совершенствования системы микробиологического контроля пищевых продуктов выполнена работа по изучению условий накопления в них токсинов потенциально патогенными и токсигенными микроорганизмами с созданием методов их выявления, идентификации и количественного определения.

Установлена высокая степень контаминации сырого молока коагулазоположительными стафилококками (табл.14), продуцирующими энтеротоксины типов А и В, обладающими т-ДНКазной и лецитиназной активностью (в количестве 10³ - 10⁵ КОЕ/см³ - свыше 30% изученных проб). В 23,7% образцов «российского» сыра обнаружены S.aureus в количестве 45 - 500 КОЕ/г продукта. Показано, что молоко и сыр могут служить источником попадания в организм человека энтеротоксигенных стафилококков, способных стать причиной возникновения пищевых интоксикаций.

Таблица 14 Контаминация стафилококками сырого молока

Показатель	Количество образцов
	Число	%
Общее количество проб	49	100
Количество проб, обсемененных стафилококками	48	97,9
Количество проб с наличием коагулазоположительных стафилококков	26	53,1
В том числе с содержанием клеток в 1 см3: менее 1000	10	20,4
от 1000 до 10000	12	24.5
от 10000 до 100000	4	8,2
Количество выделенных штаммов стафилококков	57

Проведен анализ культуральных и биохимических свойств 137 штаммов стафилококков, выделенных из молока и сыров, установлена высокая степень корреляции между способностью S.aureus продуцировать энтеротоксины и наличием ферментов коагулазы, термостабильной ДНКазы и другими факторами патогенности (рис.9).

Рис.9. Факторы патогенности штаммов стафилококков, выделенных из молока и сыра: 1 - число исследованных штаммов; 2 - коагулаза (-), т-ДНКаза (-), энтеротоксин (-)3 - коагулаза (+), т-ДНКаза (-), энтеротоксин (-)4 - коагулаза (+), т-ДНКаза (+), энтеротоксин (-)5 - коагулаза (+), т-ДНКаза (+), энтеротоксин (+)6 - коагулаза (-), т-ДНКаза (-), энтеротоксин (+)

Изучены условия выживания энтеротоксигенных стафилокков при моделировании процессов производства и хранения плавленых сыров. Установлена возможность размножения S.aureus в сырной массе до плавления и накопления значительных доз энтеротоксина, устойчивого при термической обработке[Karlikanova N.R. et al., 1994].

Показано, что плавление сырной массы не приводит к инактивации энтеротоксинов, хотя их концентрация несколько снижается (на 23 - 42%). При малых исходных концентрациях (50 нг/г) в плавленом сыре выявлялись незначительные количества токсина - менее 3% от исходной дозы. В процессе хранения плавленого сыра в течение 30 и 45 суток существенных изменений в содержании энтеротоксинов не выявлено (рис.10).

Рис.10. Содержание энтеротоксина в модельных образцах плавленого сыра

Установлена возможность обнаружения стафилококковых энтеротоксинов в плавленых сырах при использовании сырья, обсемененного коагулазоположительными стафилококками, обладающими энтеротоксигенной активностью. Бактериальные клетки могут не обнаруживаться при микробиологическом контроле, тогда как накопившиеся в сычужных сырах или других пищевых компонентах энтеротоксины будут сохраняться после термообработки, достигая в готовом продукте значительного уровня, зависящего от исходной концентрации контаминанта и дозы токсина.

С целью создания метода выявления стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах проведена отработка оптимальных режимов и способов культивирования стафилококков, обеспечивающих накопление энтеротоксинов и других метаболитов S.aureus. Для получения концентрированных препаратов токсинов предложен метод выращивания культур на целлофане, помещенном на поверхность агаровой среды Хоттингера, обеспечивающий высокий выход энтеротоксина (50 - 100 мкг/см³). Для выявления низких концентраций токсинов в культуральных фильтратах стафилококков (0,5 - 1,2 нг/см³) рекомендовано использование ультрафильтрации через мембраны с диаметром с диаметром 0,70 и 0,45 нм, позволяющей сочетать концентрирование энтеротоксинов в ультрафильтрате с его обеспложиванием.

Показана возможность использования способности большинства энтеротоксигенных S.aureus образовывать термостабильную ДНКазу для экспресс-контроля пищевых продуктов на обсемененность коагулазоположительными стафилококками и наличие стафилококковых энтеротоксинов.

Для обнаружения стафилококковых энтеротоксинов предложено применение иммуноферментного твердофазного «сэндвич»-метода, что потребовало методической проработки некоторых стадий постановки ИФА. В частности, при подборе способов экстракции разработана модифицированная схема экстракции, очистки и количественного определения стафилококков. Применение данного метода позволяет выявить количественные закономерности степени сорбции энтеротоксинов, возможность расчетным путем устанавливать их фактическое содержание в продуктах различного физико-химического состава. Так, при исходном содержании энтеротоксина 10-50 нг/г (см³) степень его выявления данным методом ИФА в молоке и твороге составляет 50-60%, в сыре - 30 - 40%, в мясном бульоне - 50 - 55%, в кремово-кондитерских изделиях - 30 - 40%, в суфле - 15 - 20%. Тем самым создается возможность коррекции результатов анализа и установление истинных количеств токсина в исследуемых образцах, что имеет практическое значение при расследовании вспышек пищевых отравлений стафилококковой этиологии.

Углубленное комплексное исследование свойств энтеротоксигенных стафилококков послужило основой для совершенствования микробиологического нормирования возбудителя, а также для разработки эффективных ускоренных методов контроля пищевых продуктов на наличие стафилококков и стафилококковых энтеротоксинов. Результаты проведенных исследований практически реализованы при разработке Методических указаний МУК 4.2.2429-08 «Методы определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах», внедренных с 2009 г в лабораториях Роспотребнадзора и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Совместное вегетирование S.aureus c другими условно-патогенными и патогенными микроорганизмами в различных видах пищевой продукции регистрируется довольно часто, в том числе при вспышках отравлений. Эта проблема заслуживает особого внимания, поскольку закономерности формирования смешанных биоценозов изучены недостаточно, что обусловило более детальную ее проработку в плане исследования взаимовлияния токсигенных штаммов B.cereus, S.aureus, E.coli и др.

При изучении взаимодействия различных эмерджентных микроорганизмов проведены серии экспериментов по совместному культивированию стафилококков - продуцентов энтеротоксина А с наиболее распространенными условно-патогенными бактериями, в том числе споровыми аэробами B.cereus, бактериями рода Proteus и E.coli. Установлено, что при одновременном культивировании S.aureus и B.cereus отмечается определенное взаимное синергетическое воздействие, сопровождающееся активизацией процесса токсинообразования энтеротоксигенными штаммами S.aureus. Степень этого взаимовлияния в значительной мере определяется условиями культивирования, составом питательных сред и соотношением исходных уровней контаминантов.

Совместное вегетирование S.aureus и B.cereus приводило к более интенсивному накоплению стафилококковых энтеротоксинов как в среде культивирования, так и в модельных продуктах (рис. 11), тогда как выращивание S.aureus совместно с бактериями рода Proteus или с E.coli не оказывало потенцирующего эффекта на интенсивность продукции энтеротоксинов стафилококками.

Рис.11. Накопление энтеротоксинов (нг/г) в продуктах при их заражении S.aureus в смеси с B.cereus.

В связи с появлением новых продуцентов токсических метаболитов мицелиальных грибов проведены микологические исследования по изучению условий, способствующих загрязнению продовольственного сырья одним из малоизученных микотоксинов - цитринином. Результаты экспериментов, выполненных в модельных системах, имитирующих нарушения условий хранения зерна и зернопродуктов, показали возможность интенсивного накопления цитринина в зараженных токсигенными плесневыми грибами Рenicillium citrinum зерновых субстратах. Наиболее высокие уровни цитринина обнаруживали в результате роста P.citrinum в рисе (300-350 мг/кг) при хранении зерна в условиях повышенной влажности и при температуре 30^оС (рис.12). Установлена высокая частота обнаружения среди грибов рода Рenicillium токсигенных штаммов - продуцентов цитринина (5,9%), что указывает на значительную степень риска для здоровья по требителей контаминации продовольственного зерна этим достаточно широко распространенным видом микроскопических грибов. Для получения данных о частоте и уровнях загрязненности цитринином исследуемых субстратов предложено использовать метод твердофазного иммуноферментного анализа с применением тест-систем «Ридаскрин фаст цитринин».

Рис. 12. Влияние температуры на продукцию цитринина штаммом P. citrinum

5. Разработка методологии внедрения новых диагностических систем и средств измерения в лабораторную практику микробиологического контроля пищевых продуктов.

Анализ современной методологии и новых направлений в изучении ключевых таксономических и патогенетических свойств микроорганизмов послужили основой для разработки комплексных схем выделения и идентификации эмерджентных патогенов, включающих наряду с бактериологическими и иммунологическими тестами методы молекулярно-генетического анализа нового поколения, направленных на повышение эффективности лабораторной диагностики и развитие методической базы микробиологических исследований пищевых продуктов.

Приведенный в работе подробный аналитический обзор существующих методов исследования пищевых патогенов включает не только их детальные характеристики, но и может служить отправной точкой при выборе наиболее эффективных и адекватных схем микробиологического анализа. При этом методы, основанные на новейших достижениях молекулярной биологии, находят все более широкое применение в пищевой микробиологии и при исследованиях разнообразного биологического материала. Эти методы позволяют не только выявить наличие и этиологическую роль возбудителя в возникновении инфекционной патологии, но и расшифровать природу патогенности, которая генетически заложена в исследуемом микроорганизме [Fratamico P.M., Bhunia A.K.,2005, Hill W.E., 1996, Espy M.J.,2006, Mackay I.M., 2004, Huang J. et al., 2009, Liu K. et al., 2009].

Предложенные в рамках данного исследования комплексные схемы и комбинированные методы выявления, идентификации и количественного учета эмерджентных патогенов (Enterobacter sakazakii, Listeria monocytogenes, Salmonella) позволяют создать систему их эффективного мониторинга и контроля продуктов питания на этапах изготовления и хранения, обеспечивают получение более достоверных сведений о циркуляции возбудителей на предприятиях пищевой индустрии и в окружающей среде; позволяют повысить качество лабораторной диагностики.

Данными, полученными при проведении сравнительных испытаний методов ПЦР, ДНК-рРНК гибридизации и иммуномагнитной сепарации для выделения патогенных микроорганизмов родов Salmonella, Listeria, Campylobacter и Escherichia, подтверждена необходимость их обязательной межлабораторной апробации для оценки эффективности и успешной интеграции в традиционные схемы микробиологического анализа.

Между тем молекулярно-генетические методы исследования, для которых характерны технологическая новизна, высокая инвестиционная стоимость и отсутствие официально одобренных регламентов и инструкций, не получили еще широкого распространения в пищевой микробиологии. Это определило необходимость разработки общих критериев стандартизации и гармонизации бактериологических и молекулярно-генетических методов с целью создания единой методологии внедрения современных диагностических систем и средств измерений.

Предлагаемые критерии стандартизации молекулярно-генетических методов должны обеспечивать:

аналитическую и диагностическую точность анализа с минимальным уровнем ложнопозитивных и ложнонегативных результатов;

чувствительность метода - нижний предел определения 1 КОЕ на 25 г продукта;

сходимость и межлабораторную воспроизводимость результатов исследований;

наличие реагентных, внешних и внутренних контролей;

минимальный риск контаминации ампликонами;

возможность быстрой детекции патогена (минимальная или в режиме on-line скорость проведения анализа);

доступность и низкая стоимость стандартизованных непатентованных реагентов и наборов праймеров;

простота выполнения анализа и возможность его автоматизации;

универсальность способов пробоподготовки пищевых продуктов;

возможность определения количественных уровней загрязнения данным патогеном (количественный анализ).

Применение разработанных критериев позволило провести стандартизацию и адаптацию метода идентификации бактерий Salmonella spp., Listeria spp., Listeria monocytogenes, E.coli O157:H7, Campylobacter spp., выделенных из пищевых продуктов, с использованием системы BAX® Q7 на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.

Проведенная сравнительная оценка специфичности, чувствительности и воспроизводимости метода, выполненная путем тестирования 250 проб суспензий, экспериментально контаминированных штаммами листерий, кампилобактеров, сальмонелл и эшерихий, показала его пригодность и перспективность для экспресс-идентификации и подтверждения видовой принадлежности бактерий, выделенных на дифференциально-диагностических средах в виде чистых культур.

Сопоставление ПЦР-анализа на основе BAX® Q7 с культурально-биохимическими методами показало, что применение ПЦР на этапе идентификации позволяет повысить диагностическую достоверность исследования за счет снижения числа ложнопозитивных и ложнонегативных результатов и сократить общую длительность анализа. По результатам проведенной работы разработаны и введены в действие Методические рекомендации № 02.036-08 «Идентификация патогенных бактерий, выделенных при контроле пищевых продуктов, с применением системы BAX® System Q7».

С учетом специфики оснащения отечественных лабораторий проведены подбор и адаптация методов генодиагностики с использованием имеющихся в стране тест-систем и амплификаторов, предназначенных для проведения традиционной ПЦР в сочетании с электрофоретической детекцией результатов.

Установлено, что использование отечественных тест-наборов для клинической диагностики «АмплиСенс» обеспечивает возможность проведения родовой и видовой идентификации штаммов эмерджентных патогенов, выделенных из пищевых продуктов. При этом специфичность метода идентификации L.monocytogenes составляла 100% (при исследовании в ПЦР 16 штаммов различных видов листерий (рис.13). Высокая специфичность ПЦР- метода и его преимущества выявлены и при анализе проб, содержащих смешанные ассоциации различных видов листерий, идентификация которых затруднена в связи с отсутствием различий культурально-морфологических свойств при росте на дифференциально-диагностических средах.

Рис. 13. Оценка видовой специфичности метода ПЦР с электрофоретической детекцией

На основании полученных данных установлена пригодность метода ПЦР c электрофоретической детекцией для подтверждения принадлежности бактерий, выделенных на дифференциально-диагностических средах в виде чистых культур, к группе патогенных бактерий L.monocytogenes. Использование различных моделей амплификаторов отечественного и импортного производства обеспечивает в достаточной степени воспроизводимость и сопоставимость результатов испытаний, проведенных в разных лабораториях, использующих наборы «АмплиСенс L.monocytogenes».

Для осуществления основной задачи микробиологического контроля - выявления возбудителей непосредственно в пищевом продукте проведены подбор, адаптация и стандартизация методов генной диагностики, обеспечивающих с высокой степенью чувствительности экспресс-детекцию патогенных микроорганизмов на заданном уровне нормируемых показателей (1 КОЕ в 25, 50 или 100 г продукта).

На основе обобщения данных по применению ПЦР в отношении наиболее значимых эмерджентных патогенов и экспериментальной апробации ряда молекулярно-генетических методов был подобран для практической реализации вариант ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) с использованием тест-систем «АмплиСенс® - FL» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Для обеспечения заданных параметров чувствительности и специфичности метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (ПЦР-FRT) проведен подбор оптимальных способов предварительной пробоподготовки и селективного обогащения различных видов пищевых продуктов для детекции в них бактерий рода Salmonella и L.monocytogenes. Предложенные режимы подготовки проб обеспечивают ускорение проведения анализов в 2 - 3 раза за счет сокращения длительности предварительных этапов обогащения исследуемых образцов без снижения уровня чувствительности реакции и открываемости проб.

Апробация метода ПЦР-FRT в реальном времени на модельных образцах экспериментально контаминированных пищевых продуктов позволила определить его основные аналитические характеристики (чувствительность, специфичность, воспроизводимость) в сравнении с традиционными стандартизованными методами бактериологического анализа (табл.15).

Табл. 15 Выявление бактерий рода Salmonella в модельных системах

Расчетная доза Salmonella spp., клеток в 25 г (см3)	Фактическое содержание Salmonella spp., КОЕ в 25 г (см3)	Результаты обнаружения Salmonella spp. (НВЧ)
		Методом ПЦР, клеток в 25 г (см3)	Микробиологическим методом, КОЕ в 25 г (см3)
Мясо куриное - сырье
2,5 х 104 (n=3)	1,4 х 104	>1100	>1100
2,5 х 103 (n=3)	1,5 x 103	240	210
2,5 х 102 (n=3)	1,6 x 102	21,0	24,0
102 (n=2)	1,24 x 102	21,0	21,0
25 (n=2)	17,5	0,92	1,5
10 (n=3)	12,4	0,92	0,92
Контроль (неконтаминированное мясо)	Не обнаружено	Не обнаружено

Проведенный сравнительный анализ использованных способов детекции позволил выявить преимущества метода ПЦР-FRT, который обеспечивал возможность обнаружения L.monocytogenes и Salmonella spp. в пороговых дозах, соответствующих требованиям норматива (отсутствие патогена в 25 г продукта).

Полученные данные подтвердили высокую эффективность выбранного формата молекулярно-генетического метода диагностики; использование метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени для выявления эмерджентных патогенов позволяет не только повысить эффективность проводимого контроля, но и обеспечивает получение достоверных и сопоставимых результатов при существенном сокращении времени проведения анализа. Применение данного метода при микробиологическом контроле пищевых продуктов позволяет снизить трудоемкость исследований и улучшить качество проводимых анализов.

На основании полученных результатов разработаны и рекомендуются для практического внедрения комбинированные схемы микробиологического анализа пищевых продуктов на наличие патогенных микроорганизмов рода Salmonella и L.monocytogenes с применением ПЦР с гибридизационно - флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (рис.14).

Схема анализа пищевых продуктов на наличие патогенных микроорганизмов рода Salmonella и L.monocytogenes

Рис.14. Ускоренный комбинированный метод обнаружения эмерджентных патогенов Salmonella и L.monocytogenes в пищевых продуктах

Предлагаемые методические схемы могут быть адаптированы и распространены на другие виды эмерджентных возбудителей заболеваний, имеющих близких непатогенных представителей в пределах рода, идентификация которых должна основываться на определении патогенетических признаков.

Внедрение современных гармонизированных и стандартизованных схем анализа бактериальных патогенов ознаменует переход системы микробиологического контроля пищевых продуктов на новый научно-методический уровень. Возможность использования молекулярно-генетических, иммунологических, биохимических и бактериологических методов в едином диагностическом пространстве обеспечит выбор оптимальных решений для изучения эмерджентных пищевых патогенов и повышения эффективности исследований.

Выводы

1. Рассмотрен феномен новых и вновь возникающих заболеваний с пищевым путем передачи («эмерджентных пищевых инфекций»), связанных с появлением новых или эволюционно измененных патогенных микроорганизмов; анализ мирового рейтинга эмерджентных пищевых патогенов позволил выделить среди них в качестве объектов научного исследования наиболее эпидемиологически значимые бактерии: Listeria monocytogenes, Salmonella, энтерогеморрагические E.coli (ЕНЕС), Campylobacter jejuni, Enterobacter sakazakii.

2. Установлено, что общим и ведущим признаком для L.monocytogenes, Campylobacter spp., EHEC, Salmonella spp. является переход их во внешнюю среду, сырье и готовую продукцию вследствие фекальной контаминации с последующим пищевым путем передачи инфекта. Уровень загрязненности сырья молочного и мясного происхождения для отдельных видов патогенов достигает значительных величин (Campylobacter spp. - 100% в мясе кур, Salmonella spp. - до 23% в сырьевых птицепродуктах, L.monocytogenes - до 12% в сыром молоке) и находится в прямой зависимости от санитарно-гигиенических условий получения, хранения и первичной переработки животноводческой продукции.

3. Впервые в РФ при исследовании детских молочных продуктов выделены колиформные микроорганизмы с измененными биологическими свойствами, детальное исследование которых позволило идентифицировать их как малоизученный вид Enterobacter sakazakii; обнаружение среди хорошо изученных популяций семейства Enterobacteriaceae нового вида E. sakazakii свидетельствует о расширении сферы влияния эмерджентных патогенов и усилении роли оппортунистических инфекций.

4. Установлено наличие филогенетических связей между таксономически родственными группами микроорганизмов родов Enterobacter, Pantoea и вновь обнаруженными возбудителями неонатальных инфекций E.sakazakii. Сформулирован новый подход к контролю продуктов для питания детей раннего возраста, включающий подсчет бактерий семейства Enterobacteriaceae и расширенную биохимическую идентификацию всех культурально - морфологических типов изолятов для исключения возможного присутствия E. sakazakii и других новых патогенов кишечной группы.

5. Теоретически обоснована таксономическая принадлежность к роду Cronobacter выделенных штаммов Е.sakazakii и Pantoea spp. Введение новых таксономических единиц расширяет перечень потенциальных патогенов, которые не входят по традиционной классификации в группу колиформных бактерий и не учитываются при оценке безопасности детских инстантных продуктов, что повышает надежность системы контроля на наличие патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae.

6. С учетом значимости одного из наиболее опасных эмерджентных патогенов - L.monocytogenes проведено многоплановое изучение основных закономерностей эпидемиологии, экологии и биологических свойств возбудителя, включая экспериментальное исследование поведения этих микроорганизмов в модельных системах, имитирующих условия производства пищевых продуктов и основные физико-химические параметры технологических процессов. Результаты исследования свойств 125 штаммов листерий, персистирующих в продуктах, сырье и объектах внешней среды, позволили расширить базу данных о функциональных признаках возбудителя для оценки степени микробиологического риска пищевого листериоза.

7. Изучен характер воздействия физико-химических и биологических факторов на жизнедеятельность листерий, показана их высокая устойчивость, вариабельность основных функциональных свойств и механизмов патогенности. Разработана экспериментальная модель совместного культивирования, позволившая доказать способность молочнокислых микроорганизмов проявлять антагонистические свойства в сложном биоценозе не только с листериями, но и с другими эмерджентными патогенами.

8. Впервые в системе санитарно-эпидемиологического нормирования в России обоснован и введен в действие новый гигиенический норматив безопасности: «Listeria monocytogenes в 25 г продукта не допускается». Этот показатель конкретизирован в виде дифференцированных нормативов по основным группам пищевой продукции с учетом специальных требований к продуктам, предназначенным для наиболее уязвимых групп населения по степени риска заболеваемости листериозом.

9. В свете новых данных о появлении среди известных токсических метаболитов «суперантигенов» и других модуляторов системных иммунных реакций выполнена работа по изучению условий накопления в пищевых продуктах бактериальных токсинов; проведен анализ культуральных и биохимических свойств 137 штаммов стафилококков, установлена высокая степень корреляции между способностью S.aureus продуцировать энтеротоксины и наличием ферментов коагулазы, термостабильной ДНКазы и другими факторами патогенности; изучены условия выживания энтеротоксигенных стафилокков при моделировании процессов производства и хранения пищевых продуктов; теоретически и экспериментально обоснован системный подход к исследованию пищевых продуктов на обсемененность S.aureus и наличие стафилококковых энтеротоксинов: система включает разработанный способ экстракции токсинов из различных пищевых продуктов и использование высокоразрешающих методов иммуноферментного анализа.

10. Проведены экспериментальные исследования токсигенных свойств микромицетов - продуцентов малоизученных видов микотоксинов, выявлена способность грибов Penicillium citrinum накапливать микотоксин цитринин в количествах, представляющих опасность для здоровья потребителей, при нарушениях режимов хранения продовольственного зернового сырья.

11. На основе изучения биологии эмерджентных патогенов и системных механизмов регуляции экспрессии генов факторов патогенности этих бактерий разработаны новые методические подходы, позволяющие проводить ускоренную индикацию возбудителей в различных видах пищевых продуктов с использованием высокоспецифичных комбинированных схем бактериологического и молекулярно-генетического анализа путем подбора наиболее информативных биохимических тестов и генотипирования с применением методов ПЦР и ДНК-гибридизации. Для видовой идентификации L.monocytogenes предложен комплексный метод, включающий определение диагностически значимых фенотипических тестов (подвижность, способность к гемолизу, наличие специфичных лецитиназ) в сочетании с ПЦР-анализом участков генома, кодирующих выработку фосфолипаз, факторов инвазии и цитотоксичности. Разработан и впервые в России внедрен метод выявления эмерджентных патогенов Salmonella и L.monocytogenes на основе твердофазного гетерогенного гибридизационного ДНК-РНК анализа с хемилюминесцентным детектированием.

12. Предложены принципиальная схема стандартизации и алгоритм оценки пригодности новых методов на основе комплекса критериев, обеспечивающих успешную адаптацию и интеграцию средств измерений и диагностических тест-наборов в системе микробиологического контроля пищевых продуктов. На основе предложенной методологии проведены стандартизация и адаптация метода идентификации бактерий Salmonella spp., Listeria spp., L.monocytogenes, E.coli O157:H7, Campylobacter spp., выделенных из пищевых продуктов, с использованием ПЦР в режиме реального времени в системе BAX® Q7. Для прямого обнаружения эмерджентных патогенов в пищевых продуктах апробирован и рекомендуется к практическому использованию метод ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, обеспечивающий с высокой степенью чувствительности выявление этих патогенов на заданном уровне нормируемых показателей.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Монографии

1. Ефимочкина Н.Р. Эмерджентные бактериальные патогены в пищевой микробиологии (Монография) /М., Издательство РАМН, 2008, 256 с.

2. Карликанова Н.Р., Куваева И.Б., Карликанова С.Н. Листерии в молоке и молочных продуктах / Москва - Углич, 1999, 121 с.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

3. Ефимочкина Н.Р. Роль физико-химических и биологических воздействий в формировании толерантности бактерий, контаминирующих пищевые продукты./ ЖМЭИ, 2009, № 4, с.120-125.

4. Ефимочкина Н.Р. Идентификация нового вида патогенных микроорганизмов Enterobacter sakazakii с использованием современных таксономических подходов./ ж. Вопросы питания, 2009, № 3, с.25-32

5. Ефимочкина Н.Р., Чоха О.А., Пименова В.В., Шевелева С.А. Изучение токсигенных свойств мицелиальных грибов - продуцентов цитринина, выделенных из пищевых продуктов./ Вопросы питания, 2008, т.77, № 4, с. 70-76.

6. Ефимочкина Н.Р. Молекулярно-генетические методы в идентификации пищевых патогенных бактерий./ ж. Вопросы питания, 2007, № 2, с. 4-15.

7. Ефимочкина Н.Р. Некоторые закономерности появления эмерджентных пищевых патогенов./ ж. Вопросы питания, 2006, № 4, с.9-15.

8. Ефимочкина Н.Р., Быкова И.Б., Барбер Н.В., Нитяга И.М., Шевелева С.А. Обнаружение Enterobacter sakazakii в детских сухих молочных продуктах./ ж. Вопросы детской диетологии, 2005, т.3, № 4, с.46-49.

9. Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А., Нитяга И.М., Тартаковский И.С.и др. Современные подходы к идентификации листерий при производственном контроле ферментированных мясных продуктов /Вопросы питания, 2005, № 2, с.39-45

10. Ефимочкина Н.Р., Карликанова С.Н. Выделение L. monocytogenes из молока и молочных продуктов./ж. Молочная промышленность, №5, 2004, с.36-38

11. Ефимочкина Н.Р., С.А. Шевелева, И.Б. Куваева и др. Индикация и серологический скрининг условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из продуктов питания и объектов внешней среды./ж. Вопросы питания, 2002, № 6, с.29-34.

12. Ефимочкина Н.Р. Методы определения эмерджентных патогенных бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах / ж.Молочная промышленность, 2007, № 3, с.38-42.

13. Ефимочкина Н.Р., Миргородский Б.Г., Карликанова С.Н. и др. Совершенствование методических подходов к конструированию и оценке качества сухих питательных сред. /ж. Молочная промышленность, №3, 2006, c.36-41

14. Ефимочкина Н.Р., С.Н.Карликанова, В.Ф. Семенихина, И.В.Рожкова. Расширение ассортимента сухих питательных сред для санитарно-гигиенической оценки молочных продуктов./ж. Молочная промышленность, №7, 2005, с.44-45

15. С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина, А.А. Иванов и др. Пищевые отравления и инфекции в Российской Федерации за период 1992-2001 гг.: состояние проблемы и тенденции./Гигиена и санитария, 2003. № 3, с.38-45

16. Карликанова Н.Р., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. и др. Сухие питательные среды для микробиологического контроля. / Молочная промышленность, 1999, № 3, с.14-15

17. Карликанова Н.Р., Куваева И.Б., Захарова Н.П. Исследование возможности накопления энтеротоксинов S.aureus при выработке и хранении плавленых сыров./Вопросы питания, 1995, № 1, с.15-17

18. Карликанова Н.Р., Куваева И.Б., Лукина И.Б. Обнаружение энтеротоксигенных стафилококков в молоке и сыре ./ Вопросы питания, 1994, № 4, с.29-31

19. Карликанова Н.Р., Шевелева С.А. Выявление бактерий рода Erwinia при санитарно-микробиологическом контроле детских сухих молочных продуктов. / Вопросы питания, 1991, № 3, с.42-45

20. Батищева С.Ю., Кузнецова Г.Г., Быкова И.Б., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Влияние плесневых грибов, потребляемых с пищей, на кишечную микрофлору у крыс/ ж. Вопросы питания, 2009, № 2. с.42-46

21. С.А.Шевелева, И.В. Гмошинский, Ефимочкина Н.Р., и др.. Влияние потребляемых с пищей спор плесеней на протекание системной анафилаксии у крыс./ ж. Вопросы питания, 2004, № 6, с.14-17

22. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Нестеренко Л.Н., Тутельян В.А., Гинцбург А.Л. и др. Требования к медико-биологической оценке и гигиеническому контролю за оборотом пищевой продукции, полученной из генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов./ Вопросы питания, 2008, т.77, № 3, с.49-57

Работы, опубликованные в других изданиях:

23. Тутельян В.А., С.А. Шевелева, Н.Р.Ефимочкина. 7-й доклад Программы ВОЗ по контролю за пищевыми инфекциями и интоксикациями в Европе за 1993-1998 гг. Раздел: Российская Федерация. WHO Surveillance Programme for Control of Foodborne Infections and Intoxications in Europe./ FAO/WHO, Берлин, 2001 г., с.292-297

24. Тутельян В.А., С.А. Шевелева, Н.Р.Ефимочкина. 8-й доклад Программы ВОЗ по контролю за пищевыми инфекциями и интоксикациями в Европе за 1999-2000 гг. Раздел: Российская Федерация. /FAO/WHO, Берлин, 2003 г.

25. Шевелева С.А., Лисицын А.Б., Любченко В.И., Коршунова Т.Н., Карликанова Н.Р., Сохранность вареных колбас в оболочке «Амитан»./ Мясная Индустрия, 1997, № 6.

26. Шевелева С.А., Карликанова Н.Р. О регламентировании показателя Listeria monocytogenes в пищевых продуктах и сырье в России./ Информационный бюллетень. «Здоровье населения и среда обитания», МЗ РФ, ФЦСЭН, 1999, №11, с.22-24.

27. Карликанова Н.Р., Шевелева С.А., Куваева И.Б. и др. К вопросу о микробиологическом контроле препаратов и продуктов с пробиотическими свойствами. / Всероссийская. Конференция с межд. участием «Пробиотики и пробиотич. продукты в профилактике и лечении наиболее распрост. заболеваний человека», М., 1999, с.27-29.

28. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Народицкий Б.С., Нестеренко Л.Н. Нормативные требования к пищевым продуктам, полученным с использованием генно - инженерно-модифицированных микроорганизмов. Материалы 5 Московского межд. Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта 2009 г., с.133-134.

29. Ефимочкина Н.Р., Черкашин А.В., Шевелева С.А. Поиск новых штаммов молочнокислых бактерий - продуцентов антибактериальных веществ./ Материалы 5 Московского межд. Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», с.65-66.

30. Батищева С.Ю., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Оценка пробиотической микрофлоры в обогащенных пищевых продуктах и БАД к пище./ Материалы 5 Московского межд. Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», с.49-50.

31. Ефимочкина Н.Р. Совершенствование методов микробиологического контроля безопасности биотехнологических продуктов. /Материалы 5 Московского межд. Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта 2009 г., с.27-28.

32. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Чоха О.А. Экспериментальное изучение токсигенного потенциала продуцентов цитринина в зерне злаковых. /Материалы III Cъезда токсикологов России, г. Москва, 1 - 5 декабря 2008 г.

33. Черкашин А.В., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Изучение антагонистической активности лактобактерий из естественных заквасок в отношении патогенных бактерий - возбудителей пищевых токсикоинфекций. /Материалы Х Всероссийского конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», 1 - 3 декабря 2008 г., с.119-120.

34. Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А., Тартаковский И.С., Карпова Т.И. Выделение и идентификация листерий при микробиологическом контроле пищевых продуктов. /Материалы 6-й Всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007», 28-30 ноября 2007 г.

35. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р. Анализ микробиологического риска как основа для совершенствования системы оценки безопасности и контроля пищевых продуктов. /Мат. X Всероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей, М., 2007.

36. Ефимочкина Н.Р., С.А.Шевелева, А.М.Григорьев. Применение метода ДНК-РНК гибридизации для обнаружения патогенов в пищевых продуктах./ II Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2005, c.127.

37. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н., Н.Р.Ефимочкина. Проблемы и задачи изучения пищевого кампилобактериоза в Российской Федерации. /VIII Всероссийский конгресс «Оптимальное питание - здоровье нации», М., 26-28 окт. 2005 г., с.297.

38. Ефимочкина Н.Р., Тартаковский И.С., Ермолаева С.А. и др. Современные методы идентификации и типирования патогенных листерий и их применение для обеспечения безопасности продуктов питания. /VIII Всероссийский конгресс «Оптимальное питание - здоровье нации», М., 26-28 окт. 2005 г., с.250

39. Быкова И.Б., Н.Р.Ефимочкина. Сравнение эффективности молекулярно - биологических и культуральных методов при контроле качества пищевых продуктов. /III Моск. Межд. Конгресс «Биотехнология: состояние и персп. развития», М., 2005, ч.2, с.92-93.

40. Ефимочкина Н.Р., С.А. Шевелева, А.М. Григорьев, И.Б. Быкова. Оценка взаимодействия патогенных микроорганизмов рода Salmonella с технологической микрофлорой ферментированных продуктов./III Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 марта 2005, ч.2., с. 101-102.

41. Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Изучение выживаемости некоторых возбудителей заболеваний с пищевым путем передачи в ферментированных пищевых продуктах. /VIII Всеросс. конгресс «Оптимальное питание - здоровье нации», М., 2005 г., с. 93.

42. Барбер Н.В., Шевелева С.А., Н.Р.Ефимочкина и др. Задачи контроля остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах. /Материалы III межрегион. научно-практ. конф. «Питание здорового и больного человека», С-Петербург, 2005, с.12-13

43. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г., Батищева С.Ю, Н.Р.Ефимочкина. Функциональная эффективность различных кисломолочных и пробиотических продуктов. /Материалы Межд. Конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», М., 2004, с.11.

44. Шевелева С.А., Н.Р.Ефимочкина. Использование комплекса генотипических и фенотипических признаков - необходимый подход к идентификации малоизученных патогенов в пищевых продуктах. /Материалы I Международной Конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», М., октябрь 2004 г.

45. С.А.Шевелева, Ж.Н. Шурышева, Ефимочкина Н.Р. Проблемы и задачи изучения пищевого кампилобактериоза в Российской Федерации./Мат. Международной научно-практической Конференции «Политика здорового питания в республике Казахстан», Алматы, октябрь 2004 г.

46. С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина. Стратегия анализа риска в пищевой микробиологии и задачи её внедрения./Материалы Пленума Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ «Угрозы здоровью человека: современные гигиенические проблемы и пути их решения», Москва, 2002 г., с.286-289.

47. Ефимочкина Н.Р., С.А.Шевелева, И.М.Нитяга. Изучение выживаемости энтеротоксигенных эшерихий в процессе хранения ферментированных мясопродуктов./ Мат. 2 Межд. Конгресса «Биотехнология: состояние и персп. развития» М., 2003, с.154-155.

48. Ефимочкина Н.Р., С.А.Шевелева, Н.В.Барбер. Оптимизация иммуноферментного метода анализа для определения сульфаниламидов в пищевых продуктах животного происхождения./ Материалы YII Всероссийского Конгресса с международным участием «Здоровое питание населения России», Москва, ноябрь 2003, с. 181.

49. Ефимочкина Н.Р., С.А.Шевелева, И.М.Нитяга. Выделение L.monocytogenes из пищевых продуктов с применением метода иммуномагнитной сепарации. /Мат.YII Всеросс. Конгресса с межд. участием «Здоровое питание населения России», М.,2003 г., с. 182.

50. С.А.Шевелева, И.Б.Куваева. Н.Р.Ефимочкина. Пробиотические продукты: квалификация и регламентация требований к характеристикам. /Мат. Межд. научно-практ. Конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», М., 2002, с.13- 14.

51. Ефимочкина Н.Р., С.А.Шевелева. Микробиологический контроль пищевых продуктов, обогащенных пробиотическими микроорганизмами./ Мат. Межд. научно-практ. Конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», М., 2002, с. 14.

52. Тартаковский И.С., С.А.Шевелева, С.А.Ермолаева, Ефимочкина Н.Р. Выделение, идентификация и типирование листерий - новый важный компонент контроля безопасности продуктов питания. /Материалы YIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов., 2002, Москва, т.3, с.342

53. С.А.Шевелева, Ефимочкина Н.Р. Нормирование Listeria monocytogenes в пищевых продуктах в Российской Федерации. Сб. докл. Межд. Конф. «Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейцфельда - Якоба и др. прионные болезни; листериоз; болезнь Ауески; болезнь Тешена», г.Покров, с.11.

54. С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина. Принципы регламентации микроорганизмов в пищевых продуктах, выработанных по новым технологиям. /Материалы Всероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей, 2001, Москва, т.1.

55. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р. Современные подходы к оценке микробиологической безопасности продуктов для питания беременных, кормящих женщин и детей./ Материалы III Российского Форума «Мать и дитя», Москва, 22-26 окт. 2001, с. 636

56. Куваева И.Б., Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р. Особенности санитарно - микробиологической экспертизы продуктов детского питания. / Мат. I Всеросс. Конгресса с межд. участием «Питание детей: XXI век», М., 2000.

57. Ефимочкина Н.Р., С.А.Шевелева, В.Ф.Семенихина, И.В.Рожкова, С.Н.Карликанова. Применение сухих питательных сред для микробиологического контроля продуктов детского питания. / Мат. I Всеросс. Конгресса с межд. участием «Питание детей: XXI век», М., 2000, с.174-175.

58. С.А.Шевелева, Ефимочкина Н.Р. Гигиеническая оценка сроков годности продуктов детского питания. / I Всеросс. Конгр. «Питание детей: XXI век», М., 2000, с.172-173.

59. Куваева И.Б., Шевелева С.А., Н.Р.Карликанова. Создание сухих питательных сред для микробиологического контроля качества пищевых продуктов./Научно-практ. конференция «Прогрессивные, экологически безопасные технологии технологии хранения и комплексной переработки сельхозпродукции», М., 1998, с.193-194.

60. Zakharova N.P., Karlikanova N.R., Kuvajeva I.B. Presence of Staphylococcus enterotoxins in processed cheeses. 24th International Dairy Congress “Dairying in a new global environment”, 1994, Melbourne, Australia, p.290.

61. Шевелева С.А., Куваева И.Б., Карликанова Н.Р. Проблемы микробиологической безопасности продуктов детского питания при их гигиенической сертификации. /Межд. конференция. «Науч. и практ. аспекты совершенствования качества продуктов детского и геродиетического питания», М., Пищепромиздат, 1997.

62. Куваева И.Б., Шевелева С.А., Карликанова Н.Р., Быкова И.Б. Микроэкология молока и молочных продуктов в зависимости от санитарно-технического состояния. /Сессия РАМН «Химия и здоровье. Экология человека и инф. заболеваемость», С.-Пб., 1995.

63. Карликанова Н.Р., Куваева И.Б., Карликанова С.Н. Изучение возможности выживания листерий в процессе выработки и хранения плавленых сыров. /Межд. Симпозиум «Пищевые зоонозы - сальмонеллезы, кампилобактериоз, иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики»,1995, М., с.101

64. Карликанова С.Н., Куваева И.Б., Карликанова Н.Р. Изучение заготавливаемого молочного сырья по микробиологическим критериям безопасности. /Нучно-техническая конференция «Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия», 1994, г.Углич, с. 20.

65. Куваева И.Б., Карликанова Н.Р., Быкова И.Б. Степень контаминации молочных продуктов бактериями рода Klebsiella / Нучно-техническая конференция «Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия», 1994, г.Углич, с. 183.

66. Карликанова Н.Р., Куваева И.Б. Изучение возможности контаминации молочных продуктов условно-патогенной микрофлорой. /Нучно-техническая конференция «Вклад науки в развитие маслоделия и сыроделия», 1994, г.Углич, с. 182.

67. Куваева И.Б., Карликанова Н.Р. Исследование свойств энтеротоксигенных стафилококков. /Нучно-техн. конф.«Вклад науки в развитие маслоделия и сыроде лия»,1994, Углич, с. 184.

68. Калунянц К.А., Смирнова Т.А., Карликанова Н.Р. Интенсификация производства на основе применения протеолитических ферментных препаратов микробного происхождения в молочной промышленности. Обзорная информация «Молочная промышленность», М., АгроНИИТЭИ ММП, 1987, 108 с.

Размещено на Allbest.ru

...