Морфофизиологические изменения в организме питающихся клещей иксодин (ixodinae), взаимодействие клещей с организмом хозяина и патогенами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА

Людмила Анатольевна

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ОРГАНИЗМЕ ПИТАЮЩИХСЯ КЛЕЩЕЙ ИКСОДИН (IXODINAE), ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КЛЕЩЕЙ С ОРГАНИЗМОМ ХОЗЯИНА И ПАТОГЕНАМИ

03. 00. 19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 2007

Работа выполнена в лаборатории паразитологии Зоологического института РАН

Научный консультант: Чл.-корр. РАН, доктор биологических наук БАЛАШОВ Юрий Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор БЕЛОЗЕРОВ Валентин Николаевич

доктор биологических наук, профессор КОРЕНБЕРГ Эдуард Исаевич

доктор медицинских наук, профессор КОЗЛОВ Сергей Сергеевич

Ведущая организация: ФГОУВПО Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Защита состоится « 13 » ноября 2007 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.223.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук Зоологического института РАН по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.,1, факс: (812) 328-29-41.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Зоологического института РАН

Автореферат разослан «___»____________ 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук ОВЧИННИКОВА Ольга Георгиевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

иксодины борелии клещ питание

Актуальность темы. Иксодовые клещи представляют группу высокоспециализированных кровососущих членистоногих, паразитирующих на наземных позвоночных животных. В процессе длительной эволюции у иксодид (Ixodidae) развился комплекс морфофункциональных адаптаций к кровососанию и эктопаразитизму в первую очередь на млекопитающих и птицах (Балашов, 2004). Всем иксодидам свойственна жизненная форма длительно питающихся временных эктопаразитов. Личинки, нимфы и самки питаются однократно, каждый акт питания занимает от 3-6 у неполовозрелых особей до 6-12 сут у самок и сопровождается многократным увеличением массы и размеров тела по типу неосомии (Балашов, 1998). В связи с этим у особей одной фазы на стадиях свободного существования и питания существуют глубокие морфофункциональные различия. Иксодиды на каждой фазе развития чередуют периоды свободного существования и паразитизма, которые различаются глубокими морфофункциональные изменениями. Суммарное время питания на всех фазах значительно меньше периода свободного непаразитического существования. Однако, период питания является определяющим для продолжения онтогенеза особи, а морфо-функциональные изменения в организме питающихся клещей становятся основным регулирующим механизмом в системе отношений паразита с хозяином - прокормителем, что является базой образуемой ими природной паразитарной системы. В состав такой паразитарной системы могут входить многие виды микроорганизмов, простейших, нематоды, часть из которых является возбудителями инфекций и инвазий позвоночных. Медико-ветеринарное значение иксодид огромно вследствие их способности передавать при укусах многие виды возбудителей трансмиссивных инфекций, а также сохранять и накапливать их в периоды между питаниями. От собранных в природе иксодовых клещей было выделено более 100 вирусов, более 30 видов риккетсий, несколько видов бактерий, простейшие и филлярии, многие из которых патогенны для человека и животных (Балашов, 1995).

Клещей сем. Ixodidae, насчитывающего около 680 видов, принято разделять на 2 группы: Prostriata и Metastriata (Horak e. a., 2002), в современной русскоязычной литературе чаще применяют разделение на два подсемейства: Ixodinae и Amblyomminae (Филиппова, 1997). Количество надвидовых группировок в Metastriata и в Amblyomminae различно, а Prostriata и Ixodinae представляют один род Ixodes. Данные систематики, морфологии, экологии, зоогеографии, а также молекулярной таксономии показывают на целесообразность подобного разделения и свидетельствуют о раннем эволюционном разделении этих двух стволов (Балашов, 2004). К клещам рода Ixodes, образующего подсем. Ixodinae, относится 241 вид (Horak e. a., 2002).

При сходстве общей схемы паразито-хозяинных отношений у клещей подсемейств Ixodinae и Amblyomminae у них выявлены значительные отличия в различных аспектах этих отношений, в частности морфофункциональной реализации основных жизненно важных процессов, таких как питание, пищеварение, слюноотделение. Морфологические различия представителей этих двух подсемейств затрагивают основные системы органов. Кроме отличия в системе определения пола существуют вариации числа хромосом. Обе группы отличаются друг от друга строением выводных протоков самок, строением секреторных альвеол слюнных желез, строением дермальных желез, местом формирования линочного шва, а также особенностями прикрепления при питании (Балашов, 1998). Это обстоятельство позволяет предполагать, что морфофункциональная реализация жизненной схемы у клещей этих двух подсемейств иксодид различна.

Обращает внимание факт отсутствия общих возбудителей у представителей подсем. Ixodinae и Amblyomminae. Это указывает на наличие специфических особенностей у видов этих двух подсемейств и целесообразность их морфофункциональных исследований. К числу важнейших процессов, регулирующих комплекс паразито-хозяинных отношений клеща с возбудителями и прокормителями, относятся морфофункциональные перестройки кишечника и слюнных желез питающихся клещей. На стадии питания многие иксодины способны получать и передавать возбудителей трансмиссивных инфекций, судьба которых, в свою очередь, зависит от согласованности их циклов с морфофункциональными изменениями и способности к диссеминации в организме клеща.

Морфология и физиология основных систем органов клещей подсемейства Amblyomminae детально исследованы и описаны в нескольких, ставших классическими, обзорах (Балашов, 1967; Атлас..., 1979; Physiology of ticks, 1982; Sonenshine, 1991). Значительно меньше оказались изученными представители подсемейства Ixodinae (Таежный...,1985; Балашов, 1998), однако уже имеющиеся данные показывают значительные различия в строении и физиологии представителей этих подсемейств, так что экстраполировать данные морфологии амблиоммин на представителей р. Ixodes нам представляется ошибочным.

Таким образом, необходимость продолжения исследований морфофункциональных изменений у питающихся иксодин не вызывает сомнений. Особенно важными являются исследования основных систем органов иксодин, которые участвуют и находятся под непосредственным влиянием процессов питания и пищеварения - кишечник, слюнные железы, а также особенности прикрепления при питании.

Актуальность проведения данного исследования заключается в том, что, несмотря на детальное изучение морфологии и физиологии иксодовых клещей (сем. Iodide) на примере представителей подсемейства Amblyomminae, морфофункциональные особенности клещей подсемейства Ixodinae долгое время оставались не исследованными. Накопившиеся к настоящему времени данные свидетельствуют о принципиальных морфологических отличиях представителей двух подсемейств. Важно отметить, что факты переноса иксодинами возбудителей трансмиссивных инфекций, таких как клещевой энцефалит и иксодовые клещевые боррелиозы, делают исследования этих клещей не только актуальными, но и практически важными.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение морфофункциональных изменений в организме питающихся иксодин и их значения в регуляции клещом отношений с природными прокормителями и патогенами на примере боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l.

Для выполнения исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику питания и морфофункциональные перестройки в центральном отделе кишечника и в дивертикулах на протяжении питания нимф и самок клещей рода Ixodes.

2. Исследовать особенности морфофункциональных изменений при действии факторов, дестабилизирующих питание клещей (отсутствие оплодотворения у самок, иммунизирующие кормления на лабораторных животных).

3. Выяснить особенности морфофункциональных изменений в слюнных железах самок клещей рода Ixodes в голодном состоянии и на протяжении всего периода питания.

4. Исследовать особенности прикрепления при питании клещей рода Ixodes на их природных прокормителях, мелких млекопитающих, птицах, ящерицах. Провести сравнительный анализ особенностей питания иксодин на амниотах.

5. Провести сравнительный анализ морфофункциональных изменений в организме питающихся самок клещей подсем. Ixodinae и Ambliommynae.

6. Выявить особенности формирования резистентности у рыжих полевок, основных прокормителей преимагинальных фаз иксодин в лесных экосистемах северо-запада России.

7. Исследовать значение морфофункциональных перестроек в организме питающихся клещей иксодин для получения, сохранения и передачи патогенов, на примере боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l.

Научная новизна. Впервые проведено исследование изменений в кишечнике и слюнных железах на протяжении всего многодневного питания иксодин. Показано, что неосомия, или доразвитие организма клеща на стадии питания, происходит в результате образования, функционирования и смены нескольких морфофункциональных пластов кишечных клеток, обеспечивающих пищеварение. Впервые исследована динамика образования перитрофического матрикса различными пластами кишечных клеток на протяжении питания, обсуждается его роль в пристеночном пищеварении и защитная функция. Исследована динамика гранулосекреторной активности слюнных желез самок иксодин, показано изменение секреторных продуктов на протяжении питания. На основании обширных литературных данных об иммунохимическим факторах слюны и собственных морфофункциональных исследований клещей сделана попытка анализа фармакологических свойств секретов разных типов гранулосекреторных альвеол на протяжении питания.

Впервые описаны особенности питания и прикрепления клещей на представителях основных групп природных прокормителей (мелких млекопитающих, воробьиных, ящерицах) в сравнении с лабораторными животными. Показано, что у природных прокормителей при питании иксодин развивается воспаление продуктивного характера с образованием струпа, фибринового конуса и коллагеновой капсулы, локализующей очаг. Доказано, что при питании иксодины не образуют цементного футляра, в отличие от амблиоммин.

Впервые проведено исследование (иммуноферментный анализ) противоклещевой резистентности рыжих полевок из природы, основных прокормителей преимагинальных фаз иксодин, полученные данные проанализированы с учетом сезонной динамики активности иксодин и результатов лабораторных кормлений. Показано, что третья часть природной популяции рыжих полевок в условиях северо-запада России формирует иммунитет к таежному клещу.

Исследованы локализация, трансовариальная и трансфазовая передачи боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l. у таежного клеща. Установлено, что развитие боррелий в организме клеща адаптировано не только к морфофункциональным изменениям у каждой отдельной особи переносчика, но и к смене последовательных фаз в онтогенезе. Сделан вывод о том, что существование у клещей рода Ixodes специфических морфо-функциональных особенностей, таких как наличие перитрофического матрикса и пристеночное пищеварение, слабо выраженное внекишечное пищеварение, отсутствие фагоцитоза и цементного футляра, обеспечивает их участие как специфических переносчиков возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов и клещевого энцефалита в природных очагах этих инфекций, в отличие от представителей амблиоммин, не обладающих этими особенностями.

Обосновано положение о том, что в регуляции паразито-хозяинных отношений в природных очагах трансмиссивных инфекций основное значение имеет синхронизация морфофункциональных изменений в организме питающихся иксодин и их согласованность с защитными реакциями организма прокормителя, особенно в местах питания клещей, что обеспечивает возможность циркуляции патогенов.

Теоретическое и практическое значение работы определяется новыми данными о регуляции паразито-хозяинных отношений между питающимися клещами, их прокормителями и возбудителями боррелиозов. Они реализуются на клеточно-организменном уровне системой морфофункциональных перестроек в организме питающихся клещей рода Ixodes, основных переносчиков клещевого энцефалита и боррелиозов в России. Результаты исследования открывают широкие перспективы в дальнейшем исследовании паразито-хозяинных отношений иксодин, переносчиков возбудителей опасных инфекций.

Сведения, приведенные в работе, могут быть использованы в вузах при чтении лекций в курсах паразитологии и акарологии, а также могут найти применение при разработке систем контроля клещей ветеринарными и санитарно-эпидемиологическими службами.

Основные положения, выносимые на защиту.

Морфофункциональные изменения в организме питающихся клещей иксодин строго синхронизированы с защитными реакциями в организме хозяина-прокормителя на протяжении всего периода питания.

Гистопатологические изменения в местах питания иксодин на прокормителях происходят в последовательности, характерной для раневого воспаления. Цементный футляр иксодины не образуют.

В основе пищеварения у иксодин лежит смена морфофункциональных пластов кишечных клеток. Перитрофический матрикс формируется на поверхности кишечных клеток всех морфофункциональных пластов на протяжении всего периода питания, разделяет зоны внутриклеточного и полостного пищеварения и, вероятно участвует в пристеночном пищеварении.

Развитие боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l. в организме клеща адаптировано не только к морфофункциональным изменениям в организме каждой отдельной особи переносчика, но и к смене последовательных фаз особи в онтогенезе.

Апробация результатов работы. Результаты исследований прошли апробацию на российских симпозиумах (XI - 1998 г. и XII - 2002 г. Съезды Русского Энтомологического Общества, VII - 1999 г. и VIII - 2004 г. Акарологические совещания, Республиканские научные конференции 2000,2002 гг., В. Новгород «Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России»), участвовала в11-th International Course “ Biology of Disease Vectors”, Cheske Budejovice, June 16-30, 2001, в Отчетных научных сессиях зоологического института РАН, в 30-м и 35-м Чтениях, посвященных памяти академика Е.Н. Павловского (ЗИН РАН, ВМА).

Публикации. Всего диссертантом опубликовано 32 работы, из них по теме диссертации - 24 работы, все в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы (317 наименования, из них 91 - на русском языке). Работа проиллюстрирована 14 таблицами и 164 рисунками, включающими в основном оригинальные микрофотографии гистологических и электронно-микроскопических препаратов.

Благодарности. Автор выражает признательность сотрудникам лаборатории паразитологии Зоологического института РАН, оказавшим помощь и поддержку.

Представленная работа на разных этапах была поддержана грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проекты № 96-04-48389, 96-15-97882, 99-04-49658, 02-04-48666) и Грантом поддержки ведущих научных школ (№ НШ-1664.2003.4)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследования морфофункциональных изменений в организме питающихся клещей подсемейства Ixodinae проводили на клещах из культуры лаборатории паразитологии Зоологического института РАН (Ixodes pacificus Cool et Kohls, 1943, I. pavlovsky Pom., 1946, I. persulcatus Schulze, 1930, I. ricinus (L., 1758) и I. scapularis Say, 1821) и клещах (I. persulcatus, I. ricinus), собранных в природных биоценозах северо-запада России в Ленинградской, Новгородской и Псковской обл. в 1994-2006 гг.

Морфофункциональные изменения кишечника питающихся нимф были исследованы на примере нимф клещей I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus и I. scapularis при развитии без диапаузы (при 97%-ной влажности и 21-23С в режиме 18 ч света и 6 ч темноты). Морфофункциональные изменения кишечника нимф в состоянии диапаузы исследовали на нимфах I. ricinus L. (при 97%-ной влажности, 16-18С в режиме 16-14 ч света и 8-10 ч темноты). Для гистологических исследований использовали голодных и питающихся нимф через 10,18,24,36,44,60,69,84,96,108 ч после присасывания, а также через 10,20,30,40,45,50 и 60 сут после отпадения. Клещей фиксировали целиком в 9% -ном формалине и спирт-формалине, надрезая кутикулу. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином.

Исследование морфофункциональных изменений кишечника питающихся самок было проведено на оплодотворенных голодных и питающихся самках клещей I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus и I. scapularis из лабораторной культуры. Для гистологических исследований использовали оплодотворенных голодных и питающихся самок через 9-12 ч после присасывания и каждые последующие сутки в течение всего периода питания, а также через 3, 5, 10, 15, 20 и 33 сут после отпадения. Клещей вскрывали в фосфатном буфере (рН 7.4), желудок и пары дивертикулов, имеющие общие основания (1+2+3, 4+5, 6+7 пары), фиксировали в 9% -ном формалине и спирт-формалине, а затем исследовали отдельно. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином, а также выявляли двухвалентное железо по образованию турнбулевой сини.

Влияние оплодотворения на морфофункциональные перестройки в кишечнике самок исследовали на девственных самках I. ricinus, I. pacificus и I. persulcatus из культуры. Для гистологических исследований использовали голодных и питающихся самок на 3,4,5,6,8,11 и 12 сут после присасывания. Вскрытие клещей и подготовку гистологического материала проводили по описанным выше методикам.

Для выяснения влияния иммунитета хозяина-прокормителя на морфо-функциональные изменения в кишечнике при питании на иммунизированных хозяевах использованы самки I. persulcatus и I. ricinus , полученные в течение и после 2-го и 3-го иммунизирующих кормлений на лабораторных кроликах. Иммунизация заключалась в трехкратном последовательном кормлении самок клещей (по 10 особей каждого вида) на одних и тех же кроликах с интервалом в 1 месяц. Гистологическая подготовка материала описана выше.

Изучение особенностей образования и функционирования перитрофического матрикса проведено на самках клещей I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus и I. scapularis из лабораторной культуры. Для гистологических исследований использовали голодных самок и самок на разных сроках питания (9-12 ч после присасывания и каждые последующие сутки в течение питания), а также самок через 3, 5, 10, 15, 20 и 33 сут после отпадения. Клещей вскрывали в фосфатном буфере (рН 7.4), желудок и пары дивертикулов, имеющие общие основания (1+2+3, 4+5, 6+7 пары), фиксировали в 9% -ном формалине и спирт-формалине, а затем исследовали отдельно. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином, а также выявляли двухвалентное железо по образованию турнбулевой сини. Материал для электронно-микроскопитческих исследований фиксировали в 2%-ном глютаральдегиде на 0.1 М фосфатном буфере с последующей дофиксацией 1%-ной четырех окисью осмия. Дальнейшая обработка материала проводилась по стандартной методике. Заливочной средой служил эпон. Срезы изготавливали на ультратоме фирмы LKB, а затем исследовали на электронных микроскопах Tesla BS-500 и LEO-900.

Особенности строения и функционирования слюнных желез самок иксодин во время питания были исследованы на самках 5 видов рода Ixodes (Ixodinae): I. pacificus , I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus, I. scapularis. Голодных самок и самок на разных сроках питания (1, 4, 9-12, 12-15, 15-20 ч после присасывания и каждые последующие сутки в течение питания) вскрывали в фосфатном буфере (рН 7.4). Для световой микроскопии слюнные железы фиксировали в 9% -ном формалине и спирт-формалине. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином. Для электронно-микроскопических исследований отпрепарированные слюнные железы I. persulcatus фиксировали в 2% растворе глутаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере с последующей дофиксацией 1% раствором четырехокиси осмия на том же буфере с добавлением сахарозы. Дальнейшая обработка материала проводилась по общепринятым методикам. В работе были использованы электронные микроскопы Tesla BS 500 и LEO 900.

В основу работы по исследованию мест прикрепления клещей на природных прокормителях положен материал из природы - пробы кожи в местах присасывания и питания личинок, нимф и самок I. trianguliceps Birula, 1895 и личинок и нимф I. persulcatus на мелких млекопитающих: рыжей полевке (Clethrionomys glareolus Schr., 1780), красной полевке (C. rutilus Pall., 1779), обыкновенной бурозубке (Sorex araneus L., 1758), малой бурозубке (S. minutus L., 1766), малой лесной мыши (Apodemus uralensis Pall., 1811). Для более детального изучения процессов, происходящих в местах прикрепления и питания клещей, были использованы 25 особей рыжих полевок из культуры вивария лаборатории паразитологии Зоологического института. Биопсию кожи с питающимися клещами произвели у 20-и особей грызунов с последующей фиксацией через 2, 4, 12, 24, 39, 48, 69, 71 и 95 ч после присасывания. Пять особей через 15 сут после первого кормления были использованы для повторного, на них также кормили по 5 нимф. Материал фиксировали через 24, 48 и 72 ч после прикрепления. Для выведения лейкограммы у грызунов брали периферическую кровь до и после кормления. Биопсия кожи в местах питания нимф и самок I. trianguliceps и нимф I. ricinus и I. persulcatus на белых мышах, а также самок I. ricinus и I. persulcatus на кроликах произведена на разных сроках прикрепления для установления способности клещей этих видов к образованию цементного футляра. Всего исследовано более 250 проб кожи. Гистопатологию мест прикрепления изучали после фиксации материала 10% -ным формалином, спирт-формалином, глютаральдегидом или жидкостью Буэна. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы толщиной 5 и 7 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, азотнокислым серебром по Левадити. Часть материала после формалиновой фиксации исследовали в реакции иммунофлуоресценции с ФИТЦ мечеными сыворотками на иммуноглобулины белой мыши и кролика для определения видовой принадлежности тканей, окружающих ротовые части питающихся клещей.

Для исследования особенностей гистопатологии мест прикрепления и питания иксодин на птицах из природных биоценозов производили сборы клещей с воробьиных (Passeriformes) в Новгородской обл. В августе 1998 и июне 1999 гг. было отловлено 648 особей 38 видов воробьиных. Клещи обнаружены лишь на 21 птице 10 видов (лесной конек (Anthus trivialis (L.)), зарянка (Erithacus rubecula (L.)), зяблик (Fringilla coelebs L.), лесная завирушка (Prunella modularis (L.)), снегирь (Pyrrhula pyrrhula (L.), садовая славка (Sylvia borin (Bodd.)), дрозд белобровик (Turdus iliacus L.), черный дрозд (T. merula L.), певчий дрозд (T. philomelos C.L.Brehm.), дрозд рябинник (T. pilaris L.)), всего было собрано 20 личинок и 64 нимфы таежного клеща. Личинок, нимф и самок I. lividus Koch, 1844 собирали в колонии береговой ласточки (Riparia riparia (L.)) в песчаном карьере в Новгородской обл. в мае со взрослых птиц, а в июне и июле с птенцов. Для гистологических исследований брали биопсию кожи вместе с присосавшимися клещами. Материал фиксировали в 10% формалине и жидкости Буэна, заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Серийные срезы, толщиной 5 мкм, окрашивали азаном по Гейденгайну и азур-эозином. Всего исследована 31 проба кожи с I. persulcatus и 10 - с I. lividus.

Для исследования особенностей прикрепления при питании иксодин на пресмыкающихся в эксперименте были использованы пять особей Lacerta agilis. На трех ящериц были посажены нимфы I. ricinus, на двух - нимфы I. pacificus из лабораторной культуры. Для гистологических исследований было получено 19 кожных биоптатов, 12 с нимфами I.ricinus и 7 с нимфами I.pacificus. Биоптаты фиксировали в формалине и спирт-формалине, заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 и 7 мкм окрашивали азур-эозином и азаном по Гейденгайну.

Исследование резистентности рыжих полевок, природных прокормителей преимагинальных фаз иксодин в условиях биоценозов северо-запада России, проводили с использованием иммуноферментного анализа (ELISA). Пробы крови брали от живых особей рыжих полевок, отловленных в сезон активности личинок и нимф таежного клеща (с 20 августа по 30 сентября 2003 г и с 4 апреля по 29 сентября 2004г), всего исследовано 115 проб крови. Рыжих полевок (11 особей), разводимых и выращенных в культуре лаборатории паразитологии Зоологического института, использовали для опытных иммунизаций личинками и нимфами таежного клеща, полученных также в культуре лаборатории паразитологии. Количество прокармливаемых в лабораторном опыте личинок и нимф было приближено к средним показателям паразитарной нагрузки в природной системе, которая составляет 3- 5 личинок или 2-3 нимфы на одну особь рыжей полевки (Григорьева, Третьяков, 1998). В результате первичного иммунизирующего кормления на 6 трехмесячных рыжих полевках напиталось 12 (по 2) нимф из 36 посаженных для кормления, на 5 рыжих полевках - напиталось 25 (по 5) личинок из 75. При повторном иммунизирующем кормлении через 4 недели такое же количество клещей было прокормлено этими же особями рыжих полевок. Негативным контролем была сыворотка крови не иммунных рыжих полевок (3 особи 3-месячного возраста). Кровь от животных получали из ретроорбитального синуса, по 0.3-0.5 мл от каждой особи, соединяли в индивидуальных микропробирках с цитрат-фосфатным буфером и сохраняли при -21С до иммуноферментного исследования. В качестве основы для антигена использовали слюнные железы самок таежного клеща, полученные при анатомировании клещей, питавшихся в течение 2-3 сут. Дальнейшая подготовка антигена и исследование сывороток крови полевок было проведено на базе НПФ “Helex” (Cанкт-Петербург) по стандартной методике.

Изучение особенностей природных очагов клещевых боррелиозов в условиях северо-запада России проводилось на севере Новгородской обл. в подзоне южной тайги с преобладанием еловых лесов. За период 1995-1997 гг. в течение сезона активности клещей обследовано 928 зверьков мелких млекопитающих, с них собрано 357 личинок и 59 нимф I. persulcatus и 356 личинок и 71 нимфа I. trianguliceps. От мелких млекопитающих на боррелии исследовали мазки крови из полости сердца и мазки-отпечатки почек (Burgess e.a., 1990), окрашенные по методу Романовского-Гимза. Из личинок и нимф клещей изготавливали давленные прижизненные препараты, которые просматривали в режимах темного поля и фазового контрастов. Мазки из личинок и нимф клещей и мазки крови мелких млекопитающих после фиксации в ацетоне исследовали в непрямой реакции иммунофлуоресценции (нРИФ) с моноклональными антителами Н5332 и Н605, предоставленными д-ром Дж. Оливером (J. Oliver, Institute of Arthropology and Parasitology, Georgia Southern University, USA). Серологические реакции проведены с соблюдением положительного контроля с Borrelia burgdorferi s. str. североамериканского штамма В-31 и отрицательного контроля на B. hermsii (Крючечников и др., 1993). За три полевых сезона обследовано 716 особей мелких млекопитающих, 352 личинки и 55 нимф I. persulcatus, 353 личинки и 65 нимф I. trianguliceps.

Материалом для исследования локализации боррелий в организме таежного клеща послужили преимагинальные фазы и взрослые клещи, собранные на флаг с растительности в Ленинградской, Новгородской и Псковской обл. в 1994-1996гг. Всего исследовано 363 взрослых клеща (202 самки и 161 самец), 27 личинок и 52 нимфы из природных популяций, а также 50 самок 62 самца, 130 личинок и 30 нимф, полученных в лаборатории от инфицированных самок из природы. Кусочки кишечника, слюнных желез, мальпигиевых сосудов и яичников от клещей, вскрытых в ванночках с фосфатным буфером (рН 7.2), исследовали в темном поле, фазовом и аноптральном контрастах при увеличении х 600. Определение локализации боррелий в клещах основывали на методике серебрения по Левадити. Для этого инфицированные органы клещей фиксировали в 10%-ном формалине и обрабатывали 2%-ным азотнокислым серебром с последующим восстановлением пирогалловой кислотой. Далее органы клещей заливали в парафин и изготавливали из них срезы толщиной 5 мкм. Срезы заключали в канадский бальзам и просматривали при увеличении х 1200 и х1500 в масляной иммерсии.

Для выяснения распространения трансфазовой и трансовариальной передач на зараженность боррелиями обследовано потомство 20 инфицированных боррелиями самок I. persulcatus, включая 9 самок, собранных в природе, 6 самок первого и 5 - второго лабораторных поколений. Всего микроскопическими методами исследовано 250 личинок, 178 нимф, 59 самок и 70 самцов трех последовательных генераций, выращенных в культуре. При отлове мелких млекопитающих из природы собрано и обследовано 77 голодных личинок таежного клеща. Из личинок и нимф готовили прижизненные давленые препараты, которые просматривали в режимах фазового контраста или темного поля. Имаго вскрывали в фосфатном буфере и исследовали отдельно пробы из разных органов. Часть препаратов после фиксации в холодном ацетоне исследовали в непрямой реакции иммунофлуоресценции (нРИФ) с моноклональными антителами (МА) Н605 на флагелиновые белки спирохет рода Borrelia и Н5332 на ospA поверхностной оболочки Borrelia burgdorferi s.l. Серологические тесты проведены с соблюдением положительного (на B. burgdorferi s. str., B-31) и отрицательного (на B. hermsii) контролей. В нРИФ исследовали мазки от 50 личинок, 50 нимф, 20 самок и 20 самцов первого поколения; от 50 личинок, 10 нимф, 10 самок и 10 самцов из второй генерации и от 10 личинок и 10 нимф из третьей генерации лабораторной культуры, а также 77 голодных личинок из природы. Поскольку идентифицирование возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов мы не проводили, и это не входило в задачи исследования, отмечаем, что в работе учитывали все микроорганизмы, выявленные в клещах в темном поле и фазовом контрасте и реагирующие на специфические белки рода Borrelia.

Яичники части напитавшихся инфицированных самок были исследованы на присутствие боррелий в электронном микроскопе. Отпрепарированные кусочки яичников фиксировали 2.5%-ным глютаровым альдегидом на фосфатном буфере с дофиксацией осмием. Дальнейшая обработка проводилась по обычной методике с заливкой в эпон. Ультратонкие срезы контрастировались водным раствором уранилацетата и цитрата свинца.

Глава 2. ПРОЦЕСС ПИТАНИЯ (ДИНАМИКА КРОВОСОСАНИЯ), МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПИТАНИЯ И ПИЩЕВАРЕНИЯ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ

Для иксодид принято выделять три стадии, или фазы питания на основании увеличения показателей массы тела клеща (Балашов, 1967, 1998; Akov, 1982; Sonenshine, 1991). Первая - подготовительная - занимает 24-36 ч после прикрепления клеща и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов (Akov, 1982). Вторая - стадия роста - наиболее продолжительная фаза занимает период со 2-х по 7-е сут питания, за это время происходят значительные увеличения размеров покровов, кишечника, слюнных желез, половой и выделительной системы питающегося клеща. Последняя стадия характеризуется быстрым питанием, в результате которого клещ достигает окончательной массы за 12-24ч до отпадения.

2.1 Процесс питания иксодовых клещей (динамика кровососания)

У исследованных видов иксодин мы установили, что динамика кровососания укладывается в общую схему питания, разработанную еще Лисом (Lees, 1952), Балашовым (1972), Китаока и Фуджисаки (Kitaoka, Fujisaki, 1976). Изменения массы тела самок I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus, I. scapularis и насыщение клещей происходят в несколько этапов (табл. 1).

Таблица 1. Изменение массы (мг) тела самок клещей рода Ixodes во время питания.

Незначительные изменения массы тела в 1 и 2 фазы питания сменяются интенсивным набором веса в конце второй и, особенно в третью фазу. Они носят выраженный скачкообразный характер, первое значительное увеличение веса происходит на 5.5-6 сут, второе - на 9-10 сут питания. Изменения массы тела сопровождаются сходными морфо-функциональными перестройками кишечного эпителия. Вследствие растяжения кишки поступающей кровью происходит увеличение полости кишечника, оно обеспечивается не только расправлением складом базальной мембраны кишечника, но и уплощением пищеварительных клеток 1-ого и 3 -гой морфофункциональных пластов. Пищеварение осуществляют эти и клетки промежуточных 2-ого и 4-ого пластов. В основе смены фаз пищеварения лежат глубокие морфофункциональные изменения пищеварительной системы, и в частности кишечного эпителия. На протяжении 7-10 дневного питания в кишечнике самок клещей рода Ixodes одновременно с поглощением пищи происходят циклические изменения в составе кишечного эпителия, сменяется пять морфо-функциональных пластов клеток: один секреторных и четыре пищеварительных.

2.2 Морфофункциональные особенности пищеварения иксодовых клещей

Пищеварительная система иксодоидных клещей представлена ротовым аппаратом с предротовой полостью, парой слюнных желез, глоткой, пищеводом, средней кишкой, тонкой кишкой, ректальным пузырем и прямой кишкой, открывающейся анальным отверстием (Балашов, 1967). Средняя кишка является самым большим органом в организме клеща, в ней происходят процессы переваривания полученной пищи и депонирование резервных питательных веществ.

Средний отдел кишечника, или средняя кишка, состоит из короткого трубковидного центрального отдела, или желудка, и семи пар трубчатых дивертикулов, расположенных сверху над остальными внутренними органами. Несмотря на сложное морфологическое членение, все части средней кишки имеют сходное гистологическое строение. Стенки кишки построены из однослойного эпителия, клетки которого покоятся на тонкой базальной мембране, снаружи оплетенной сетью мышечных волокон. Кишечный эпителий представлен 3 типами клеток: резервными, пищеварительными и секреторными (Балашов, 1998).

Для иксодоидных клещей характерно сочетание трех форм пищеварения: внекишечного, полостного и внутриклеточного. Внекишечная фаза пищеварения, особенно развитая у иксодид, осуществляется за счет протеолитических ферментов слюны, в результате чего в кишечник всасывается гемолизированная кровь и продукты лизиса тканей хозяина. Полостное пищеварение ограничивается лишь первыми этапами физико-химического изменения крови, включающего удаление избыточной воды и солей, лизис форменных элементов крови. Основная роль в усвоении пищи, как и у других паукообразных, принадлежит внутриклеточному пищеварению, и все процессы пищеварения (за исключением внекишечного) происходят исключительно в среднем отделе кишечника (Атлас..., 1979).

Строение кишечных клеток и особенности внутриклеточного и полостного пищеварения были преимущественно исследованы у видов подсемейства Amblyomminae: Hyalomma asiaticum (Атлас.., 1979), Boophilus microplus (Agbede, Kemp, 1985,1987; Agyei e.a., 1992), Dermacentor variabilis (Tarnowski, Coons, 1989), из иксодин только у Ixodes persulcatus (Таежный клещ.., 1985). В результате обширных и разнообразных исследований на разных видах иксодоидных клещей установлено, что строение кишечника голодных и питающихся клещей существенно отличается. У голодных особей эпителий средней кишки находится в состоянии “физиологической недоразвитости”, проявляющейся в отсутствии готовых к функционированию зрелых пищеварительных и секреторных клеток. Во время многодневного питания клеща изменения кишечника проходят в две фазы: медленное питание, или фаза роста, и быстрое питание, или насыщение. Во время питания кишечные клетки переходят в функциональное состояние, резервные клетки дают начало новым секреторным и двум типам пищеварительных клеток (Балашов, 1967, 1998; Akov, 1982; Sonenshine, 1991).

2.2.1 Морфофункциональные изменения кишечника нимф клещей рода Ixodes (Acarina; Ixodidae) во время и после питания с развитием без диапаузы и с диапаузой

На стадии питающейся нимфы кишечный эпителий представлен пищеварительными клетками личиночной фазы. Переваривание основной части пищи осуществляют пищеварительные клетки нимфальной фазы после отпадения клеща, в период линьки, предшествовавший аполизису. В переваривании пищи принимают участие пищеварительные клетки нимфы только одной генерации. В период кровососания пищеварение осуществляют клетки личинки. Секреторные клетки у питающихся нимф не обнаружены, как, вероятно, и у личинок, в отличие от самок. Секреторные вакуоли формируются в пищеварительных клетках личинок. Все функционирующие клетки образуют на своей апикальной поверхности слой перитрофического матрикса. При бездиапаузном развитии у нимф наблюдается асинхронность в процессах смены систем органов одной жизненной фазы на другую. При линьке наблюдается замена кутикулы, трахейной системы, слюнных альвеол, формирование половой системы (Таежный клещ.., 1985), однако в период послелиночного доразвития и активности у голодной нимфы и в период питания кишечный эпителий представляют пищеварительные клетки личиночной фазы. Смена пищеварительных клеток личиночной фазы на клетки нимфальной происходит постепенно в течение первых 5-10 сут после отпадения клеща. Смена клеточного состава органов при линьке не синхронизирована, а кишечник является наиболее стабильной в организме клеща системой, не подвергающейся гистолизу. Смена кишечного эпителия, вероятно, синхронизируется с последовательными этапами линьки и послелиночного доразвития, в которые в связи со сменой клеточных пластов в средней кишке преобладает полостное или внутриклеточное пищеварение. Пищевые включения начинают откладываться в молодых пищеварительных клетках нимфальной фазы после отпадения клеща, на 10-15 сут. На 40-50 сут после отпадения клеща в полости кишки содержатся лишь скопления гематина, пищеварение заканчивается, пищеварительные клетки заполнены запасными пищевыми включениями.

Морфогенетическая диапауза, отличительным признаком которой является задержка линьки, по сути, приостанавливает процесс освобождения полностью сформированного в линочной полости клеща от старых покровов на период неблагоприятных природных условий. Подготовка к таким задержкам развития происходит во время питания и последующих за ним 60 сут, в течение которых развиваются новые системы органов следующей фазы и в кишечнике аккумулируются запасные питательные вещества, обеспечивающие переживание особи до следующего периода активизации.

Переваривание пищи у нимф с развитием с диапаузой в первые сутки питания осуществляют пищеварительные клетки личиночной фазы, а после насыщения и отпадения клеща - пищеварительные клетки нимфальной фазы. Cмена пищеварительных клеток личиночной фазы на клетки нимфальной происходит постепенно в течение 5-10 сут после отпадения клеща. Пищевые включения начинают откладываться в молодых пищеварительных клетках нимфальной фазы на 10-15 сут после отпадения клеща. На 40-60 сут после отпадения клеща в полости кишки содержатся лишь скопления гематина, полостное пищеварение заканчивается, пищеварительные клетки заполнены запасными пищевыми включениями. Описанные изменения синхронно происходят у нимф, развивающихся в состоянии диапаузы и без нее. В диапаузу вступают особи, завершившие полостное пищеварение, активное развитие организма прерывается на период действия неблагоприятных факторов, а пищевые резервы сохраняются в пищеварительных клетках до начала активизации особи на следующей фазе онтогенеза.

2.2.2 Морфофункциональные изменения средней кишки оплодотворенных и неоплодотворенных самок клещей рода Ixodes (Acarina; Ixodidae) во время и после питания

У голодных особей и в начале питания кишечный эпителий представлен пищеварительными клетками предыдущей, нимфальной, фазы и резервными клетками (Табл. 2). Через 1.5-2 сут после присасывания большинство пищеварительных клеток начинает отторгаться в полость кишки, они функционирую до 2-2.5 сут после присасывания. Через 24-36 ч после прикрепления клеща на смену этим клеткам приходят секреторные, на 3 сут они преобладают в пласте кишечных клеток. В конце 4-4.5 сут после присасывания клеща секреторные клетки выделяют пищеварительные ферменты по голокриновому типу, с отторжением всей клетки целиком в полость кишечника. На 4-4.5 сут стенку кишки выстилают пищеварительные клетки первого морфофункционального пласта. В этот период происходит первое значительное растяжение кишки и поглощение большой порции крови. Молодые пищеварительные клетки уплощаются. От крови, поступившей в полость кишки, их отделяет зона отторгнутых и разрушенных секреторных клеток. Пищеварительные клетки второго пласта появляются на 5.5-6 сут после отторжения клеток первого, функционируют до 8-8.5 сут в центральном отделе кишки. На 8.5-10 сут после прикрепления клеща приходится потребление последней, наибольшей по массе порции крови. В усвоении этой порции участвуют также пищеварительные клетки двух морфофофункциональных пластов, третьего и четвертого.

Пищеварительные клетки третьего пласта формируются под клетками второго в на 6.5-7 сут после прикрепления клеща. После отторжения пищеварительных клеток второго пласта они уплощаются, кишка растягивается, и ее объем увеличивается при поступлении крови. Клетки третьего пласта функционируют в желудке до 3-5-х сут после отпадения клеща. На 8.5-9 сут после прикрепления или на 1-2 сут после отпадения клеща под пищеварительными клетками третьего пласта формируются клетки четвертого. Они функционируют до конца жизни самки, не отторгаются, и в них формируются резервы, необходимые для завершения оогенеза.

Таблица 2. Морфофункциональные изменения в кишечнике самок клещей рода Ixodes во время питания.

Примечание: ПК1П, ПК2П, ПК3П, ПК4П - пищеварительные клетки 1,2,3,4 -ого морфофункциональных пластов, ПКНФ - пищеварительные клетки нимфальной фазы, ПМ - перитрофический матрикс, СК - секреторные клетки.

Внутриклеточное пищеварение у самок происходит в пищеварительных клетках 4-х последовательных морфофункциональных пластов. Пищеварительные клетки всех пластов принадлежат одному типу, в них происходит внутриклеточное переваривание гемоглобина. Фагоцитоз лейкоцитов у исследованных видов иксодин не обнаружен.

Кишечный эпителий функционирует послойно, представляя единый морфо-функциональный пласт, состоящий из клеток, сходных по строению и функции. Основу каждого пласта составляют клетки одного возраста, о чем свидетельствует сходство формы клеток, количества включений и вакуолей. Однако отмечено диффузное расположение более старых клеток, лишенных апикальной поверхности, но сохранивших основную часть цитоплазмы с ядром, и вероятно продолжающих функционировать. За период существования каждого морфофункционального пласта его клетки синхронно изменяют форму от кубической к столбчатой и булавовидной, накапливают продукты обмена (гематин) или секреторные вакуоли, а затем отторгаются в полость кишки. Смене пластов предшествует увеличение количества недифференцированных клеток вблизи регенерационных гнезд, расположенных диффузно в стенке кишки. В такие промежуточные периоды над клетками нового пласта располагаются булавовидные по форме клетки предыдущего. Кишечные клетки каждого пласта функционируют в желудке и дивертикулах синхронно, но в апикальных концах дивертикулов по сравнению с центральным отделом кишки, смена клеточных пластов может задерживаться не более чем на 12-24 ч.

В течение всего периода питания клеща его кишечный эпителий динамично обновляется, претерпевая цикличные изменения, проявляющиеся в функционировании пяти морфо-функциональных пластов клеток имагинальной фазы (рис.). Причем, процессы поглощения крови и ее переваривания не разобщены во времени, а происходят практически одновременно.

Неоплодотворенные самки полного насыщения не достигают. Изменения массы тела самок исследованных видов незначительны, за период питания их масса увеличивается в 25-29 раз и соответствует весу, который набирают оплодотворенные самки к концу фазы медленного питания на 6-8 сутки, масса тела оплодотворенных самок к концу питания увеличивается в 130-240 раз.

В переваривании поступающей в кишечник пищи у девственных самок участвуют пищеварительные клетки нимфальной фазы и два пласта пищеварительных клеток имагинальной фазы. Процесс кровососания у неоплодотворенных самок не завершается, а прерывается на второй фазе, когда происходит медленное питание и подготовка кишечника к третьей фазе - фазе быстрого питания.

Рис. Схема изменений кишечного эпителия самок клещей рода Ixodes во время питания и после отпадения.

Обозначения: I - пищеварительные клетки нимфальной фазы, II - секреторные клетки, III, IV, V, VI - пищеварительные клетки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го морфофункциональных пластов, аз - азурофильная зернистость, бм - базальная мембрана, гм - гематин, мк - мышечные клетки, нк - недифференцированные клетки, ок - отторгнутые клетки, пв - пищевые включения, пм - перитрофический матрикс, св - секреторные вакуоли.

Вторая фаза питания обеспечивает увеличение размеров кишечника с последующим интенсивным поглощением питательных веществ из кишечника, которые нужны прежде всего для развития яиц. Оплодотворение самок стимулирует начало эмбриогенеза, для которого необходимо поступление питательных веществ. Успешное завершение эмбриогенеза невозможно при потреблении тех количеств крови, которые может вместить кишечник голодной самки. Оплодотворение стимулирует доразвитие кишечника у самок, в результате которого он достигает размеров, позволяющих поглощать количества крови, необходимые для морфофункциональных перестроек самого кишечника, доразвития и функционирования слюнных желез и для развития яиц.

2.2.3 Морфофункциональные изменения средней кишки самок клещей рода Ixodes (Acarina; Ixodidae) во время иммунизирующих кормлений на лабораторных животных

Резистентность хозяина влияет на питание и последующее развитие клеща и вызывает значительные отклонения основных экологических количественных показателей. Происходит уменьшение количества напитавшихся клещей вследствие гибели некоторых из них при прикреплении и на более поздних сроках питания, удлиннение времени питания, уменьшение массы крови, поглощенной напитавшимися особями, снижение процента перелинявших личинок и нимф, а также уменьшение числа отложенных яиц и вылупившихся из них личинок (Таежный ..., 1985; Балашов, 1998; Agbede, Kemp, 1986; Wikel, 1996). Естественно предположить, что все эти отклонения являются следствием нарушений питания клеща, чему должно свидетельствовать проявление не только внешних признаков, но и глубоких морфологических изменений пищеварительной системы.