Морфофизиологические изменения в организме питающихся клещей иксодин (ixodinae), взаимодействие клещей с организмом хозяина и патогенами

Поглощений значительных количеств пищи у самок за период иммунизирующих кормлений не происходит. У самок клещей I. persulcatus за время первого неиммунизирующего кормления масса тела увеличивается в 200-240, а у самок I. ricinus - в 130-150 раз. (Григорьева, 2003), а при иммунизирующих кормлениях эти показатели резко сокращаются до 25.5-27 и 16-17 раз, соответственно. При иммунизирующих кормлениях (2-е или 3-е кормление на одном и том же животном) на лабораторных кроликах питание клеща прерывается на второй фазе. Наблюдается смена пищеварительных клеток нимфальной фазы и двух морфофункциональных пластов пищеварительных клеток имагинальной фазы, секреторные клетки отсутствуют. Клещ завершает питание и отпадает, когда последний пласт пищеварительных клеток находится на начальных этапах активности. Потребляемые количества крови не достаточны для ритмичного функционирования кишечника, вследствие чего питание прерывается на второй фазе и полного насыщения не происходит. Мы считаем, что это связано с нарушением поступления крови в полость кишки питающегося клеща, что, возможно, является результатом воздействия какого-либо фактора противоклещевого иммунитета неспецифических хозяев-прокормителей.

2.3 Перитрофический матрикс: особенности образования и функционирования

В пищеварительном тракте большинства насекомых имеется неклеточный слой, отделяющий эпителиальные клетки кишки от поглощаемой пищи. Этот слой принято называть перитрофической мембраной (Jacobs-Lorena, Oo, 1996). Термин “перитрофическая мембрана” ввел Бальбиани (Balbiani) в 1890 г. Для иксодовых клещей понятие “перитрофическая мембрана” впервые применили Радзинска с соавторами (Rudzinska e.a., 1982) в связи с описанием проникновения Babesia microti через эту структуру при питании Ixodes scapularis на хомячках.

Перитрофический матрикс (ПМ) принято рассматривать в качестве физиологического и механического барьера, отделяющего область полостного пищеварения, обладающего избирательной проницаемостью, а также предохраняющего кишечный эпителий от повреждений частицами пищи (Zhu e.a., 1991; Eisemann et Binnington, 1994; Tellam e.a., 1999; Tellam et Eisemann, 2000; Wang et Granados, 2001).

Нами установлено, что ПМ отсутствует у голодных самок клещей рода Ixodes и начинает образовываться на поверхности клеток в средней кишке через 9-12 ч после прикрепления и через 24 ч в дивертикулах. Нами подтверждено предположение (Diehl e.a., 1996) о том, что в образовании ПМ участвуют микроворсинки клеток. Первые отложения пузырьков с электронноплотным содержимым, аналогичным веществу ПМ начинают появляться именно в области микроворсинок щеточной каймы, так что последние оказываются окруженными этим веществом.

Образование ПМ на поверхности каждой клетки кишечника происходит автономно. ПМ не является перманентной структурой, он образуется и функционирует на поверхности каждой новой клетки. Образование ПМ происходит на протяжении всего периода питания на поверхности пищеварительных клеток нимфальной фазы, секреторных клеток, пищеварительных клеток. Наибольший период функционирования ПМ наблюдался у пищеварительных клеток последнего, 4-ого морфофункционального пласта. Вещество ПМ идентифицировали через 30 сут после отпадения самок клещей. ПМ имеет в основном гомогенную тонкогранулярную структуру, хотя в его состав входят и немногочисленные микрофибриллы, Отмечен значительный полиморфизм в ультраструктуре ПМ на разных сроках кровососания. Возможно, изменения в ультраструктуре ПМ связаны изменением функциональной роли этого образования в разные периоды переваривания крови. В течение первой половины питания переваривание за счет ферментов, образующихся в секреторных клетках и выделяющихся в полость кишки (Балашов, 1998), в то время как на более поздних этапах питания и после отпадения преобладает внутриклеточное пищеварение. Можно предположить, что в период преобладания полостного пищеварения ПМ играет в основном роль защитного образования, предохраняющего поверхность кишечного эпителия от действия гидролитических ферментов. ПМ, имеющий пористую структуру, разделяет пространство средней кишки на эндоперитрофическое пространство, в котором продолжается деятельность пищеварительных ферментов и экзоперитрофическое пространство, куда через пористый ПМ проникают фрагменты частично расщепленных компонентов крови, переваривание которых завершается внутриклеточно.

2.4 Сравнительная характеристика особенностей морфофункциональных преобразований кишечника у клещей подсемейств Ixodinae и Amblyommynae на протяжении питания

У клещей подсемейства Ixodinae и Amblyomminae существует значительное сходство общей схемы питания. Собственно питание (1-2 недели) подразделяется на период роста (практически весь период питания) и период растяжения (последние 12-24 ч питания). Переваривание поступающей пищи осуществляют несколько генераций кишечных клеток - пищеварительных и секреторных, преобладание первых способствует внутриклеточному пищеварению, а вторых - полостному (Балашов, 1967, 1998; Атлас.., 1979; Akov,1982; Sonenshine, 1991).

Однако при сходстве общей схемы у клещей подсемейства Ixodinae и Amblyomminae выявлены значительные различия. Иксодины поглощают частично гемолизированную кровь, следовательно, внекишечное пищеварение у них выражено незначительно. Переваривание крови начинается в полости кишки при помощи ферментов секреторных клеток. Зону полостного пищеварения отделяет перитрофический матрикс, регулирующий размеры компонентов, поступающих для внутриклеточного пищеварения. Наличие перитрофического матрикса, возможно, свидетельствует о пристеночном пищеварении. У них не обнаружен фагоцитоз форменных элементов крови (Григорьева, 2003, 2004, 2005; Григорьева, Амосова, 2004).

Амблиоммины поглощают гемолизированную ферментами слюны кровь. Для них характерны все три типа пищеварения: внекишечное, полостное и внутриклеточное. Их кишечные клетки не имеют перитрофического матрикса, а внутриклеточное пищеварение возможно при помощи фагоцитоза (Балашов, 1967; Атлас.., 1979; Agbede, Kemp, 1985).

Глава 3. РОЛЬ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ В ПИТАНИИ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ

Секреты слюнных желез на протяжении питания клеща, оказывают антикоагулирующее, иммунорегулирующее и противовоспалительное действие на хозяина, чем обеспечивают насыщение кровососа, таким образом, в регуляции паразито-хозяинных отношений на период питания слюнные железы имеют главенствующее значение.

Морфология и функионирование слюнных желез клещей, а также компоненты слюны, секретируемые клещами во время питания детально изучены и описаны в нескольких обзорах, причем большинство исследователей указывает на неидентичность основных типов альвеол, образующих структуру железы у представителей двух подсемейств (Binnington, Kemp, 1980; Ribeiro, 1987, 1995; Sauer e.a., 1995, 2000; Bowman e.a. 1997). Обнаружено участие секретов слюнных желез в сохранении, активизации и передаче возбудителей трансмиссивных инфекции (Stark, James, 1996; Titus, Ribeiro, 1990; Nuttall, 1999; Kuthejlova e.a., 2001). Большинство исследователей указывает на 4-5 функций слюнных желез: образование цементного вещества, обеспечивающего приклеивание клеща в месте питания; регуляция состава и свойств получаемой пищи, или осморегуляция; подавление воспалительной реакции хозяина прокормителя; иммуномодулирующее действие.

Слюнные железы представляют собой парный гроздевидный орган, занимающий латеральные части идиосомы. Каждая железа имеет альвеолярное строение.

Всем иксодовым клещам свойственны альвеолы 1 типа, названные пирамидальными. Их главная функция состоит в поддержании водного баланса в организме клеща и секреции гипертоничной слюны на протяжении всего периода питания.

Гранулосекретирующие альвеолы составляют каудальную часть слюнных желез, занимают орган более чем на 2/3. Названы так из-за накапливания в цитоплазме их клеток крупных гранул секрета, видимых в световой микроскоп. У самок иксодовых клещей различают два типа гранулосекретирующих альвеол: альвеолы 2-го и альвеолы 3-го типа, а у самцов подсемейства Amblyomminae обнаружены альвеолы 4 типа. Входящие в состав этих альвеол секреторные и интерстициальные клетки принято обозначать строчными латинскими буквами (a,b,c,d,e,f). У самок клещей подсемейства Amblyomminae альвеолы 2 типа в базальной части состоят из нескольких крупных клеток а, апикальную часть образуют клетки типа b и с (Атлас..., 1979; Chinery, 1973; Binnington, 1978; Walker, e.a., 1985). Известно, что у голодных самок амблиоммин базальную часть альвеол 2 типа занимают крупные клетки а, заполненные секреторными гранулами (Балашов, 1994,1998), а с началом питания эти клетки освобождаются от секрета и спадаются. В свою очередь клетки b и с начинают увеличиваться в размерах с начала питания, и их цитоплазма заполняется секретами. До конца питания эти клетки становятся основными гранулосекретирующими элементами альвеол 2 типа.

Наиболее многочисленны в слюнных железах альвеолы 3 типа. В базальной части альвеолы располагается несколько крупных клеток d, заполненных секретом у голодных клещей. Эти клетки заполнены сложными гранулами, состоящими из субъединиц, им отводят основную роль в формировании прикрепительного цемента амблиоммин (Binnington, 1978; Walker, et al., 1985; Sonenshine, 1991). Центральное и апикальное положение занимают клетки e и f. С началом питания альвеолы 3 типа быстро увеличиваются в размерах и на 3-4 сут достигают своей окончательной величины, превращаясь в тонкостенные пузырьки. У питающихся особей клетки d и e освобождаются от секреторных гранул, а главной функцией альвеол 3 типа становится регуляция водно-солевого баланса, которую осуществляют клетки f, цитоплазма которых образует лабиринт из переплетающихся цитоплазматических тяжей и межклеточных полостей (Атлас.., 1979, Sonenshine, 1991).

Из клещей подсемейства Ixodinae наиболее изучены Ixodes persulcatus (Балашов, 1979; Таежный.., 1985) и I. holocyclus (Binnington, Stone, 1981). В альвеолах 2 и 3 типов обнаружено по 2 типа гранулосекретирующих клеток, а, b и d, e , соответственно. Считается, что клетки а, b и d содержат секрет уже у голодных самок. В первые дни питания полностью освобождаются от секрета клетки а, клетки b приступают к накоплению и выделению секрета (Таежный.., 1985). Клетки d и e освобождаются от секрета в течение первых 2-3 сут, клетки d дегенерируют, а e выполняют впоследствии функцию осморегуляции (Таежный.., 1985).

Исходя из факта различного строения слюнных желез у представителей подсемейств Amblyomminae и Ixodinae, следует ожидать, что структурные компоненты слюнных желез отличаются по секреторной активности и функциональному назначению на протяжении всего периода кровососания клеща.

3.1 Изменения состояния слюнных желез на протяжении питания

На исследованном материале мы установили, что у голодных самок клещей рода Ixodes слюнные железы представляют собой компактный парный орган, с мелкими альвеолами, визуально в структуре органа преобладают трахейные трубки и выводные протоки. Крупные секреторные гранулы обнаруживаются в базальных клетках (d) альвеол 3-го типа, причем при проводке через спирты и окрашивании стандартными гистологическими красителями гранулы не воспринимают или слабо воспринимают окраску, что возможно свидетельствует об их липоидной природе. Клетки альвеол 2-го типа имеют интенсивно окрашиваемую основными красителями цитоплазму и крупные ядра, в базальной и апикальной частях альвеол удавалось идентифицировать слабую грануляцию цитоплазмы клеток. В клетках а, как у голодных клещей, так и в течение всего периода питания, основным типом гранул являются гомогенные электронно-плотные гранулы диаметром 3.0-3.5 мкм. Второй тип секреторных продуктов представлен гранулами большего размера (4.0-6.0 мкм) с тонкогранулярным содержимым низкой электронной плотности. Гранулы обоих типов заполняют цитоплазму клеток а еще до начала кровососания и выводятся в первые его часы, на что указывает присутствие через 6-8 ч после прикрепления клеток, содержащих лишь единичные гранулы. Клетки b отличаются присутствием электронно-плотных гранул меньшего диаметра. Таким образом, в течение кровососания секреторные продукты этих клеток меняются, по крайней мере, дважды. В период голодания в них накапливаются гранулы диаметром 2.0-2.5 мкм, которые выводятся сразу после прикрепления клеща к хозяину. В первые часы питания в клетках b наблюдаются плотные гранулы диаметром 1.0-1.2 мкм, а начиная с 15-18 ч после прикрепления и до окончания питания - плотные гранулы 0.7-0.9 мкм.

Пик секреторной активности альвеол 3 типа приходится на первые сут питания. Через 4 ч после присасывания большинство d клеток альвеол 3 типа освободилось от секрета, либо этот процесс заканчивается уже в первые сутки после прикрепления клеща. Для клеток d характерны крупные электроннопрозрачные гранулы, которые образуются еще до начала кровососания и выводятся в просвет альвеол в конце первых сут после прикрепления, что сопровождается разрушением клеток. В цитоплазме клеток e голодных клещей содержатся гомогенные электронно-плотные гранулы диаметром 2.0-2.5 мкм, которые через 6 ч после начала питания заменяются плотными гранулами диаметром 1.2-1.5 мкм, исчезающими из клеток в первые часы вторых сут питания. Таким образом, секреторная активность альвеол 3 типа заканчивается в конце первых - начале вторых сут кровососания, при этом клетки d дегенерируют, а клетки e, по-видимому, меняют функцию, формируя в конце питания классический базальный лабиринт, характерный для осморегуляторных эпителиев. На вторые сутки отмечается истончение стенок альвеол 3 типа, а на 3 сутки они представляют собой тонкостенные пузырьки.

Таким образом, динамика гранулосекреторной активности по данным световой микроскопии складывается из двух этапов: 1 - активность альвеол 3 типа, продолжающаяся от начала присасывания (особенно на 3-4 ч после присасывания) на протяжении последующих 2-3 сут; 2 - активность альвеол 2 типа, проявляется началом секретирования в первые часы после присасывания, а интенсивное выделение секретов наблюдается со2-х сут до конца питания клеща (Табл. 3).

Таблица 3. Изменение секреторной активности гранулосодержащих клеток альвеол слюнных желез самок клещей рода Ixodes.

3.2 Особенности функционирования слюнных желез у клещей подсемейств Ixodinae в сравнении с клещами подсемейства Amblyommynae на протяжении питания

Голодные и питающиеся самки клещей подсемейства Amblyomminae также содержат в слюнных альвеолах гранулы секрета, однако, разнообразие клеток, участвующих в образовании секрета, а также более богатый по сравнению с иксодинами полипептидный состав. Это позволяет предполагать, что слюнные железы амблиоммин не только сложнее устроены, но их функциональная реализация шире.

Основным отличием является способность амблиоммин образовывать цементный футляр (Cyinery, 1973; Needham e.a., 1989; Jaworski e.a., 1991,1992) при питании и его отсутствие у иксодин, что подтверждает более бедный по протеинам секрет их слюнных желез. Отсутствие цементного футляра у иксодин было обнаружено еще Павловским и Алфеевой (1941) на I. ricinus. В дальнейшем это было установлено для I. holocyclus (Binnington, Stone, 1981), а так же для I. pacificus, I. persulcatus, I. plumbeus, I. ricinus, I. scapularis, I. trianguliceps (Григорьева, 2001а, 2001б, 2002).

Кроме того, предполагается (Атлас.., 1979; Binningtone, 1978; Megaw, Beadle, 1979; Krolak et.al., 1982; Walker et al., 1985), что формирование цементного футляра у клещей подсемейства Amblyomminae обусловлено состоящими из субъединиц сложными гранулами, образующимися в клетках, локализованных в альвеолах 2 типа и в альвеолах 3 типа. Отсутствие таких гранул в клетках слюнных желез самок I. persulcatus, так же как и данные, полученные на лишенном цементного футляра I. holocyclus (Stone, Binnington, 1989), так же подтверждают, что клещи подсемейства Ixodinae не способны образовывать цементный футляр.

Сопоставление наших данных с результатами других электронномикроскопических исследований показало значительное разнообразие секреторного материала и клеточного состава гранулосодержащих альвеол у амблиоммин. Каждый тип секреторных продуктов приурочен к определенному типу клеток. Клеточный состав альвеол 2 и 3 типов разнообразен, причем для его описания не существует единой номенклатуры, что затрудняет сравнение результатов, полученных разными авторами. Так, альвеолы 2 типа включают от 3-х видов содержащих гранулы клеток у Н. asiaticum (Атлас..,1979) и A. americanum (Krolak et.al., 1982) до 4-х у R. appendiculatus (Walker et al., 1985) и R. sanguineus (Megaw, Beadle, 1979), пяти - у D. variabilis (Coons, Roshdy, 1973), или даже шести - у B. microplus (Binnington, 1978). Наибольшее число видов клеток характерно для короткохоботковых клещей (Dermacentor, Rhipicephalus, Boophilus, Haemaphysalis по классификации Moorhouse, 1969 (Kemp, Stone, Binnington, 1982)), ротовые части которых в период кровососания проникают в ткани хозяина, не выходя за пределы эпидермиса. У длиннохоботковых (Ixodes, Amblyomma, Aponomma, Hyalomma), чьи ротовые части достигают дермы, разнообразие секретирующих клеток меньше. Это, возможно, отражает более сложное взаимодействие короткохоботковых амблиоммин с хозяином. Полученные нами данные о смене продуктов секреции в a и b клетках альвеол 2 типа и в е клетках альвеол 3 типа в течение питания у иксодин позволяют предположить, что в процессе становления паразито-хозяинных отношений между иксодидами и позвоночными проблема секретирования разных компонентов слюны у разных групп иксодид решалась по-разному. У длиннохоботковых иксодин и амблиоммин, для которых характерно небольшое число видов клеток в гранулосекретирующих альвеолах (Атлас.., 1979; Binnington, Stone, 1981; Krolak et.al., 1982), смена секреторных продуктов с течением времени происходит по типу стимулируемой секреции за счет функционирования одной и той же клетки, а у короткохоботковых амблиоммин проблема решается путем возникновения большого числа видов клеток, каждый из которых секретирует особый продукт в ответ на внешние стимулы.

3.3 Значение секретов слюнных желез иксодид в регуляции защитных механизмов прокормителей

Динамика выделения клещем различных белков еще остается нерасшифрованной. Поэтому основной информацией, на которую приходится полагаться, является срок питания самок, из слюнных желез которых выделено то или иное вещество. Так, например, большинство белков, обладающих иммунорегулирующим действием, накапливается в слюнных альвеолах II типа на 3 сут питания и содержатся в изобилии на 5 сут питания. К таким белкам относится иммуносупрессор из I. ricinus - Iris, 43 kDa (Leboulee et al., 2002), который подавляет активность Т-лимфоцитов и макрофагов, иммуносупрессор из слюны I. scapularis, 5kDa (Urioste et al., 1994), супрессор лимфоцитов из слюнных желез D. andersoni, 36-43 kDa (Bergman et al., 1995) и интерлейкины и интерферон из слюны I. ricinus (Kopecky et al., 1999), однако есть сведения о иммуносупрессивном действии слюны голодных самок I. ricinus (Rolnikova et al., 2003).

Исходя из периодизации заживления естественных ран, характерных для позвоночных, принято выделять 2 стадии раневого процесса. На 1-4 сут после ранения (1 стадия) активизируются факторы внутрисосудистой свертываемости крови и противовоспалительные процессы, что соответствует фазам альтерации и экссудации воспалительного процесса и входит в систему гемостаза. На 4-10 сут (2 стадия) активизируются процессы регенерации тканей ( Хем, Кормак, 1983; Краткая.., 1989). Для того чтобы проигнорировать защитную систему прокормителей клещ для успешного завершения насыщения должен выделять со слюной вещества, препятствующие заживлению и усиливающие кровотечение, причем на первых этапах естественный ход раневого процесса “устраивает” паразита, что соответствует, вероятно, первым 2 сут питания. Далее клещ должен активно влиять на продолжение процесса, изменить его естественный ход, приостановить регенерацию тканей. В этот период увеличивается содержание белков в слюне. Белки, являясь антигенами, вызывают активизацию иммунной системы хозяина, что может вызвать отторжение питающегося клеща. Начиная с 3-х сут питания, клещ должен вводить в рану хозяина не только вазодилятаторы, обеспечивающие существование пищевой полости и получение им крови, но и иммуномодуляторы, сдерживающие развитие антител и подавляющие иммунитет хозяина. Это подтверждают иммунохимические исследования, в ходе которых были выделены из слюны клещей, питающихся на 3-5 сут, факторы, обладающие сосудорасширяющим и иммуносупрессивным действием.

Разобщенность иммунохимических и морфологических исследований не позволяет нам с точностью судить о месте локализации или синтеза тех или иных факторов слюны в альвеолах слюнных желез иксодовых клещей. Однако существование двух типов секреторных альвеол и временное разделение их секреторной и выделительной активности позволяют предположить, что активность секретов клеток a и b альвеол 2 типа и клеток d альвеол3 типа у клещей рода Ixodes в первые часы и сутки питания направлена на предотвращение гемостаза, усиление вазодилятации, а у амблиоммин и на образование материала цементного футляра. Секреторная активность альвеол II типа в большей степени проявляется, начиная с 3 сут питания, когда в организме хозяина-прокормителя начинают активизироваться факторы иммунитета, и продолжается до конца питания клеща, обеспечивая его полное насыщение благодаря содержанию в слюне в этот период иммуномодулирующих протеинов. Эти процессы, вероятно, обеспечиваются веществами, входящими в состав электронно-плотных гранул a и b клеток, которые содержатся в их цитоплазме, начиная со 2-х сут кровососания.

Какова причина длительных процессов питания и связанной с его обеспечением сложной активностью слюнных желез, формирование которых в процессе эволюции иксодовых клещей, вероятно, не было случайным явлением? Продолжительный период питания иксодовых клещей является лишь внешним основанием для их выделения в группу временных паразитов с длительным питанием по классификации Балашова (1982). Глубинная причина длительного питания кроется в онтогенезе: развитие по типу неосомии, свойственное иксодовым клещам, позволяет особям приступать к питанию с органами, не завершившими свое развитие. За этот период масса тела клещей увеличивается в 100-250 раз, значительным преобразованиям и росту подвергаются многие органы, в том числе, слюнные железы и кишечник. То есть в течение стадии медленного питания происходит рост кишечника и подготовка к заполнению его тем количеством крови, которое будет необходимо и достаточно для развития яиц. Возможность длительного питания и роста обеспечивается сложной секреторной активностью слюнных желез, сдерживающей поэтапно защитные механизмы хозяина-прокормителя, что указывает на согласованность и синхронизацию морфо-функциональных изменений в организме питающихся самок иксодовых клещей.

Глава 4. ПРОЦЕСС ПРИКРЕПЛЕНИЯ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ И ОСОБЕННОСТЕЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ У ХОЗЯЕВ-ПРОКОРМИТЕЛЕЙ

Иксодины - временные эктопаразиты с длительным питанием. Это особый тип паразитизма, требующий от паразита специальных адаптаций, поскольку средой его обитания на время питания служит кожа, обладающая комплексом защитных реакций. Средние сроки питания на млекопитающих и птицах личинок и нимф иксодин составляют 3-7 сут, самок 5-10 сут (Балашов, 1998). За это время происходят параллельные изменения, как в организме паразита, так и в организме хозяина, в частности в местах прикрепления.

Патогенное воздействие иксодового клеща при многодневном питании стимулирует развитие у прокормителя комплекса последовательных реакций. Он включает местное воспаление в очаге проникновения ротовых органов в кожу, а также иммунный ответ хозяина по типу аллергической реакции замедленного типа (Балашов, 1982).

Гистопатологические изменения в коже прокормителей при питании клещей рода Ixodes из группы Prostriata были исследованы на примере млекопитающих и птиц (Наумов, 1959, 1963; Калягин и др., 1976; Moorhouse, 1969; Eveleigh et al., 1974; Binnington, Stone, 1981; Brossard, Fivaz, 1982; Kemp e.a., 1982). В отношении рептилий подобные исследования не проводились. Однако, единодушия в отношении клещей рода Ixodes у авторов, исследовавших эту проблему нет. До последнего времени эти вопросы оставались спорными, и о способах прикрепления клещей рода Ixodes при питании и их способности к образованию цементного футляра не было единого мнения. Из-за неоднозначной трактовки гистопатологических изменений в местах питания клещей преувеличивается роль цементного футляра и др. структур в процессах передачи и сохранения возбудителей трансмиссивных инфекций. Эти обстоятельства позволяют нам рассмотреть вопросы питания клещей на природных прокормителях более детально.

4.1 Особенности воспаления у млекопитающих из природы и лабораторных животных

В местах прикрепления и питания клещей всех фаз трех видов рода Ixodes (I. trianguliceps, I. ricinus, I. persulcatus) установлено сходство в положении ротовых частей и гистопатологических изменениях в тканях хозяев. Ротовые части глубоко погружаются в кожу прокормителя, пронизывая эпидермис, сосочковый слой дермы, так что апикальные концы гипостома и хелицер в зависимости от длины ротовых частей располагаются на разной глубине в сетчатом слое дермы. Ротовые части оказываются полностью заключенными в тканях хозяина. Гнатосома прикрепляющегося клеща располагается к поверхности кожи прокормителя под углом 40-45%. Процесс погружения ротовых частей в кожу продолжается не более 60 мин. Защитная реакция хозяина начинается с экссудативного воспаления в ответ на перфорацию. Из разорванных тканей и капилляров кожи выделяются внутриклеточная и внутритканевая жидкости и кровь. Примерно через час после начала присасывания образуется фибрин, и смесь сворачивается, а каудально направленные зубцы гипостома и хоботка оказываются заключенными в застывшей массе. Тонкий (3.9 мкм) и хрупкий слой фибрина представляет практически слепок с ротовых частей клеща.

Возникший в коже очаг воспаления стимулирует прилив крови и отек, что внешне проявляется припухлостью и покраснением места присасывания клеща. Поступающая к ротовым частям кровь пока не потребляется клещём, а вытекает по микропространствам между ротовыми частями и конусом из выпавшего фибрина на поверхность кожи, окружая свободную часть гнатосомы и пальпы, так что за 40-48 ч с начала прикрепления они оказываются окруженными многослойным струпом в «воронке», образовавшейся в результате отека кожи. В дерме увеличивается количество клеточного инфильтрата из молодых мезенхимальных клеток, моноцитов, лимфоцитов и нейтрофилов. Уже через 10-12 ч после перфорации в сетчатом слое дермы увеличивается количество фибробластов. Через сутки появляются зрелые элементы - фиброциты, и начинает образовываться зрелая соединительная ткань. Через 24-30 ч из молодых коллагеновых волокон формируются разнонаправленные пучки вокруг очага воспаления, а через 1.5-2 сут они сливаются в капсулообразную структуру, толщиной 7.7-24.8 мкм при питании нимф. Коллагеновая капсула окружает ротовые части клеща, плотно прилегая к слою фибрина, на протяжении всей основы кожи и, особенно, ее сетчатого слоя. Формирование пищевой полости происходит примерно через 40-48 ч у личинок и нимф и 60-72 ч у самок после прикрепления. При формировании пищевой полости происходит разрушение внутренних слоев коллагеновой капсулы и глубоких слоев дермы, окружающих верхушку ротовых частей. С началом образования пищевой полости заметно увеличивается количество нейтрофилов в тканях, окружающих ротовые части клеща.

Такие структуры характерны для мелких млекопитающих, природных прокормителей иксодид. У лабораторных мышей отмечали обильное выделение фибринозного экссудата, который, свернувшись, формирует толстостенный конус (до 11.3 мкм толщиной при питании самок I. trianguliceps) вокруг ротовых частей. Коллагеновая капсула у мышей не образуется, а вокруг фибринового конуса формируются нерегулярные пучки коллагеновых волокон. У кроликов образуется рыхлая капсула, она состоит из не плотно упакованных разнонаправленных пучков коллагеновых волокон.

Проведенная реакция иммунофлуоресценции на срезах кожи кроликов, белых мышей и рыжих полевок в местах прикрепления клещей показала, что экссудат и ткани, окружающие ротовые органы клеща, принадлежат организму прокормителя. Слой фибрина вокруг ротовых частей клеща, свернувшаяся кровь - струп вокруг основания гнатосомы и пальп, а также кровь в предротовой полости между гипостомом и стволом хелицер в период кровососания обнаруживали ярко-голубую флуоресценцию после контакта и положительной реакции с ФИТЦ-меченой видоспецифичной сывороткой в люминисцентном микроскопе. Коллагеновая капсула демонстрировала интенсивно-бордовую аутофлуоресценцию. Сопоставление результатов гистологических и иммунофлуоресцентных исследований подтверждает отсутствие цементного футляра у клещей трех видов рода Ixodes, рассмотренных в нашей работе.

В результате проведенных исследований установлено, что в местах прикрепления и питания клещей I. trianguliceps, I. persulcatus и I. ricinus происходят сходные гистопатологические изменения. В основе их лежат последовательно развивающиеся стадии воспаления кожи. Ткани, окружающие ротовые части клеща, принадлежат прокормителю и являются фибриновым конусом и коллагеновой капсулой. Клещи перечисленных видов цементного футляра не образуют, и их ротовые органы находятся в непосредственном контакте с тканями хозяина. Образование пищевой полости связано с массовой инфильтрацией нейтрофилов. В основе кожной гиперчувствительности природных прокормителей, рыжих полевок, лежит дегрануляция тучных клеток при единичных базофилах и эозинофилах. При этом в периферической крови отмечены нейтрофильный лейкоцитоз и при повторных кормления 2-8-и кратное увеличение количества эозинофилов.

4.2 Особенности воспаления у птиц

В коже птиц в течение всего периода питания клеща развивается местный воспалительный процесс. У воробьиных он проходит по одной схеме. Воспаление инициируется альтерацией в результате погружения ротовых органов глубоко в кожу прокормителя, в сетчатый слой дермы. К концу 1-х сут питания в месте прикрепления клеща отмечаем слабое утолщение эпидермиса у краев раны, незначительный отек соединительнотканной основы кожи, заполнение раневого дефекта фибрином и образование фибринового конуса вокруг ротовых органов паразита, появление клеточного воспалительного инфильтрата, состоящего из мононуклеарных лейкоцитов и клеток соединительной ткани, а так же первые признаки начала организации раны - увеличение количества фибробластов. На 2-е сут усиливаются пролиферативные процессы с тенденцией к образованию из пучков коллагеновых волокон коллагеновой капсулы. Коллагеновые волокна вплотную прилегают к фибриновому слою, окружающему ротовые органы, оплетают зубцы гипостома. В клеточном экссудате увеличивается доля полиморфноядерных лейкоцитов за счет эозинофилов и нейтрофилов. Начало образования пищевой полости приходится на конец 2-х сут питания клеща, что совпадает с увеличением количества нейтрофилов и их дегрануляцией вокруг капсулы, особенно в области апикальных концов ротовых органов. Образование коллагеновой капсулы полностью завершается на 3-и сут, она поддерживается до конца питания клеща, а после его отпадения участвует в заживлении раны под струпом.

Таким образом, у воробьиных, естественных прокормителей иксодовых клещей в природе, воспаление кожи в месте присасывания клеща носит продуктивный характер, стенки коллагеновой капсулы в 2 раза толще образуемых мелкими млекопитающими и примерно в 2-2.5 раза (22.5-45 мкм) толще ротовых органов. Экссудативная фаза сведена до минимума, толщина фибринового слоя вокруг ротовых органов 3.0-4.5 мкм при питании личинок и нимф и 10-11.25 мкм - самок I. lividus. В результате проведенных исследований кожи птиц в местах прикрепления и питания личинок и нимф I. persulcatus и личинок, нимф и самок I. lividus и сопоставления полученных данных с более ранними установлено, что гистопатологические изменения в очаге проходят в последовательности, характерной для раневого воспаления кожи. В результате экссудативной фазы закрывается раневой дефект, пролиферативная фаза приводит к организации (инкапсуляция) дефекта. Антигенное воздействие слюны клеща препятствует полной инкапсуляции ротовых органов, стимулирует образование обильного клеточного инфильтрата в зоне апикальных концов ротовых органов.

4.3 Особенности воспаления у ящериц

Ротовые органы клеща, перфорируя кожу ящерицы между чешуйками, проникают глубоко в дерму. Они располагаются под углом в 40-45 к поверхности кожи, так что апикальный конец ротовых органов оказывается в основании впереди лежащей чешуйки. При альтерации кожи происходит вытекание тканевого транссудата и крови, которая сворачивается при образовании фибрина. Это приводит к формированию вокруг ротовых органов фибринового конуса, толщиной 2.5 мкм.

Часть транссудата и крови вытекает на поверхность кожи и застывает вокруг основания гнатосомы, формируя струп. Ротовые органы клеща при проникновении в кожу повреждают коллагеновые волокна, стимулируя пролиферативную стадию воспалительного процесса. Об этом свидетельствует увеличение количества фибробластов и фиброцитов в зоне альтерации. Плотные ткани дермы рептилий обладают исключительными регенеративными возможностями, так как представлены в основном пластами коллагеновых волокон. Вокруг фибринового конуса, окружающего ротовые органы, уже в конце 1-х сут после прикрепления образуется коллагеновая капсула, а к концу 2-х сут толстый слой коллагеновых волокон, расположенных циркулярно и оплетающих зубцы гипостома, достигает наибольшей толщины - 100-150 мкм. Соотношение толщины фибринового слоя и коллагеновой капсулы составляет у ящериц 1:40 -1:60. Клеточный воспалительный инфильтрат представлен лимфоцитами, нейтрофилами и эозинофилами, причем, последние при быстром развитии воспаления оказываются в очаге уже на 2-е сут после прикрепления.

Гистопатологические изменения кожи рептилий в местах питания клещей рода Ixodes, аналогичны наблюдаемым у птиц и млекопитающих. Воспалительный процесс охватывает все слои кожи и в большей степени проявляется в дерме, в которой формируется толстая коллагеновая капсула. Ткани прокормителя окружают и плотно прилегают к ротовым органам клеща. Клещи рода Ixodes при питании не образуют цементного футляра.

4.4 Сравнительный анализ особенностей прикрепления и питания клещей подсемейств Ixodinae и Amblyommynae

Успешное питание клеща в случае нахождения им хозяина-прокормителя возможно, если ему удается прорезать хелицерами эпидермис и закрепиться в образовавшейся ране. Прорезывание кожи хозяина и последующее удерживание в течение нескольких суток в ране обеспечивается в первую очередь высокоспециализированным ротовым аппаратом и во вторую - способностью “приклеиваться” к коже при помощи секрета слюнных желез.

Все клещи из группы Metastriata (подсемейство Amblyomminae) образуют цементный футляр. Его формирование у клещей подсемейства Amblyomminae: Hyalomma asiaticum (Атлас.., 1979), Boophilus microplus (Binningtone, 1978), Rhipicephalus sanguineus (Megaw, Beadle, 1979), Amblyomma americanum (Krolak et al., 1982) и Rhipicephalus appendiculatus (Walker et al., 1985) связывают с секретом сложных гранул, состоящих из субъединиц и образующихся в а,d,e клетках, локализованных в альвеолах 2 и 3 типов (Jaworski et al., 1991,1992). По химическому составу вещество цемента представляет собой смесь иммуногенных и неиммуногенных белков с включениями липидов и углеводов. Выделен главный компонент цемента, белок с молекулярным весом 90 kDa, который обнаруживался как в d и e клетках альвеол 3 типа, так и в цементном конусе, выделяемом Amblyomma americanum, Dermacentor variabilis, Rhipicephalus appendiculatus.

В отношении способности клещей из группы Prostriata (подсемейство Ixodinae) к образованию цементного футляра единого мнения не было (Moorhouse, 1969, 1973; Kemp et al., 1982),.

В результате наших исследований установлено, что клещи рода Ixodes, проникая хелицерами и гипостомом глубоко в дерму, вызывают обильное истечение тканевой жидкости и крови, которые, сворачиваясь, обеспечивают закрытие раневого дефекта фибриновой пробкой. В ней клещи оказываются заключенными благодаря сложной структурированной поверхности ротовых частей. Образующаяся позже коллагеновая капсула еще больше закрепляет клеща, т.к. зубцы гипостома оказываются практически переплетенными коллагеновыми волокнами прокормителя. Клещи рода Ixodes при питании не образуют цементного футляра.

4.5 Особенности гистопатологии кожи амниот при питании клещей рода Ixodes

У представителей трех классов амниот (Reptilia, Aves, Mammalia) гистопатологические изменения в местах прикрепления и питания клещей подсемейства Ixodinae происходят по одной схеме, в последовательности, характерной для раневого воспаления кожи. В результате экссудативной фазы закрывается раневой дефект, пролиферативная фаза приводит к частичной инкапсуляции дефекта. Антигенное воздействие слюны клеща препятствует полной инкапсуляции ротовых органов, стимулирует образование обильного клеточного инфильтрата. Потребление его клещём приводит к формированию пищевой полости. Ткани, окружающие ротовые органы клеща, принадлежат прокормителю и являются фибриновым конусом и коллагеновой капсулой (Табл. 4). Воспаление инициируется проникновением ротовых органов клеща в кожу. Поступающие из раны кровь и тканевая жидкость, смешиваясь, застывают в струп после образования фибрина. Фибрин в ране начинает откладываться уже в течение первого часа после перфорации, в нем оказываются заключенными хелицеры и зубцы гипостома.

Таблица 4. Структуры, образующиеся в местах прикрепления и питания клещей подсемейства Ixodinae на амниотах.

К концу 1-х сут питания отмечается слабое утолщение эпидермиса у краев раны, незначительный отек соединительно-тканной основы кожи, формирование струпа из крови, заполнение раневого дефекта фибрином и образование фибринового конуса вокруг ротовых органов паразита, появление клеточного воспалительного инфильтрата, состоящего из мононуклеарных лейкоцитов, гистиоцитов и фибробластов. Пролиферативные процессы усиливаются на 2-е сут, из пучков коллагеновых волокон образуется коллагеновая капсула за 2-3 сут после перфорации у птиц и млекопитающих и в течение первых сут у ящериц. У прокормителей иксодин в природе воспаление кожи в месте присасывания клеща носит продуктивный характер. Соотношение толщины фибринового слоя и коллагеновой капсулы составляет у мелких млекопитающих 1:1.9 - 1:6.4, у воробьиных 1:7.5 - 1:10 и у ящериц 1:40 - 1:60. Формирование пищевой полости происходит примерно через 40-48 ч после прикрепления личинок и нимф и 60-72 ч самок, что связано с увеличением количества нейтрофилов и их дегрануляцией.

Для птиц и млекопитающих, природных прокормителей иксодовых клещей характерно усиление пролиферативной фазы воспаления с частичной инкапсуляцией паразита. У лабораторных и домашних животных преобладает экссудативная реакция, в результате которой ротовые органы клеща оказываются заключенными в толстостенный фибриновый конус. В окружающей его соединительной ткани накапливается обильный воспалительный клеточный инфильтрат, состоящий в начале преимущественно из клеток соединительной ткани и лимфоцитов, доля которых впоследствии уменьшается на фоне увеличения полиморфноядерных лейкоцитов, таких как эозинофилы и особенно нейтрофилы. Нейтрофильный лейкоцитоз приводит часто к гнойному воспалению в очаге питания клеща на лабораторных или домашних животных.

Клещи подсемейства Ixodinae не образуют структур, подобных цементному футляру амблиоммин, и их ротовые органы находятся в непосредственном контакте с тканями хозяина. Несмотря на дезорганизующее влияние паразита и хозяина друг на друга устойчивость системы обеспечивается благодаря синхронизации развития паразита с особенностями хозяев, в частности со стереотипными защитными реакциями.

Глава 5. ОСОБЕННОСТИ ПРОТИВОКЛЕЩЕВОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ И ИММУННОГО СТАТУСА У ПРИРОДНЫХ И ЛАБОРАТОРНЫХ ПРОКОРМИТЕЛЕЙ ИКСОДИН

Взаимоотношения иксодового клеща и прокормителя как участников системы ”паразит - хозяин” включают реакцию прокормителя в виде противоклещевой резистентности. Явление специфической противоклещевой резистентности, как способности хозяев-прокормителей сопротивляться и противодействовать питающимся на них клещам, обеспечивается реакциями иммунитета. Впервые явление противоклещевой резистентности было описано Трегером (Trager, 1939). Установлена противоклещевая резистентность у многих видов лабораторных и сельскохозяйственных животных (Wikel, 1996).

Резистентность хозяина влияет на питание и последующее развитие клеща и вызывает значительные отклонения основных экологических количественных показателей, уменьшение количества напитавшихся клещей вследствие гибели некоторых из них при прикреплении и на более поздних сроках питания, удлинение времени питания, уменьшение массы крови, поглощенной напитавшимися особями, снижение процента перелинявших личинок и нимф, а также уменьшение числа отложенных яиц и вылупившихся из них личинок (Таежный ..., 1985; Балашов, 1998; Agbede, Kemp, 1986; Wikel, 1996).

Противоклещевая резистентность формируется с участием реакций гуморального и клеточного иммунитета (Лабецкая,1990; Wikel, 1996). Общей реакцией млекопитающих, птиц и рептилий на паразитирование иксодовых клещей является образование антител В-лимфоцитами на специфические антигены, выделяемые клещем при питании.

Тема развития противоклещевого иммунитета у прокормителей за последние годы получила широкое освещение в литературе. Большинство исследований посвящено молекулярным и иммунологическим характеристикам слюнных (Jaworski et al., 1992; Kovar et al., 2002; Lawrie et Nuttall, 2001; Leboulle et al.,2002; Needham et al., 1989; Valenzuela et al., 2002) и кишечных (Agbede, Kemp, 1986; Willadsen, Kemp, 1988) антигенов, выделяемых клещaми при питании. Действие этих белков распространяется на все этапы воспалительной реакции хозяина, а также на врожденный и приобретенный иммунитет хозяина (Kopecky et al.,1998,1999). Однако большинство исследований проведено на лабораторных (белые мыши, морские свинки, кролики) и сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот), которые проявляют устойчивое развитие противоклещевой резистентности при повторных кормлениях клещей.

В природных экосистемах контакты иксодовых клещей с их естественными прокормителями осуществляются многократно на протяжении сезона активности клещей, но при небольшой численности одновременно нападающих паразитов, что не вызывают нарушения паразитарных систем. О наличии резистентности у хозяев-прокормителей говорит присутствие у них в крови определенного количества антител (АТ), выработанных организмом на специфический белок слюнных желез паразита.

Нами проведено иммуноферментное исследование проб крови рыжих полевок из природной экосистемы на северо-западе России в период наибольшей активности преимагинальных фаз таежного клеща. Так же исследованы пробы крови рыжих полевок из лабораторной культуры после однократных и повторных опытных кормлений на них личинок и нимф таежного клеща. Количество прокармливаемых в лабораторном опыте личинок и нимф было приближено к средним показателям в природной системе. В результате первичного иммунизирующего кормления на 6-и трехмесячных рыжих полевках напиталось 12 (по 2) нимф из 36 посаженных для кормления, на 5 рыжих полевках - напиталось 25 (по 5) личинок из 75. Показатели оптической плотности содержания АТ в крови опытных особей колебались в пределах 0.409-0.515 OD. В результате повторного иммунизирующего кормления клещей в таких же количествах и на тех же особях рыжих полевок через 4 недели значения оптической плотности содержания АТ составило 0.412-0.517. Негативный контроль, сыворотка крови неиммунных рыжих полевок (3 особи 3-месячного возраста) имел показатель оптической плотности 0.360-0.387. Содержание АТ в крови рыжих полевок из природы имел больший разброс. Из 115 исследованных проб крови содержание АТ в пределах негативного контроля имели 25 особей (21%), содержание АТ в пределах опытных значений - 50 особей (44%), выше опытных значений (0.520-0.677) - 40 особей (35%). Содержание АТ на белки слюны таежного клеща в крови рыжих полевок указывает на формирование у них иммунитета при повторных кормлениях паразитов в природе. Конкретные цифровые выражения содержания АТ в виде его оптической плотности показывают, что у пятой части особей в природной популяции паразитарная нагрузка низкая, не вызывающая существенных изменений в образовании АТ. Около половины особей природных популяций имеет среднюю нагрузку, приближенную к выбранной нами для опыта, которая не вызывает негативных для внешнего состояния и здоровья прокормителей последствий и не формирует базовый уровень АТ, нейтрализующих АГ (антигены) слюны паразитов. И только 35% особей в популяции проявляют уровень АТ выше отмеченного в опыте, а значит? имеют большую паразитарную нагрузку, которая способствовала выработке устойчивого иммунитета и считается по результатам метода положительным.

Таким образом, полного отсутствия резистентности у природных прокормителей иксодовых клещей нет, а особи из природных популяций прокормителей неоднородны по своему иммунному статусу, формирование которого связано с различной интенсивностью и величиной паразитарного груза. Сложная система взаимоотношений сочленов паразитарной системы прокормитель - иксодовый клещ, регулируемая на стадии питания клеща, остается устойчивой вследствие распределения паразитарной нагрузки между особями популяции прокормителя в соответствии с особенностями их индивидуальной и половозрастной активности на протяжении суток и сезона. Средняя паразитарная нагрузка на отдельную особь прокормителя незначительна, а перманентный контакт большинства прокормителей с разным количеством питающихся клещей из-за разной иммунизирующей дозы может привести или только к сенсибилизации или вызвать развитие иммунитета, проявляющегося стойким присутствием АТ в крови. Однако доля таких особей в популяции составляет лишь третью часть, что вероятно является фактором, регулирующим численность клещей в природных биогеоценозах.

Глава 6. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ИКСОДИН С ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ИНФЕКЦИЙ

Иксодовые клещи группы Ixodes ricinus-persulcatus являются переносчиками, и резервуарами возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов (Филиппова, 1990; Коренберг, 1993). В настоящее время (Eisen, Lane, 2002) специфическими переносчиками боррелий группы Borrelia burgdorfery senso lato признаны клещи 12 видов рода Ixodes, 6 из них входят в комплекс I. ricinus - I. persulcatus (I. affinis, I. jellisoni, I. pacificus, I. persulcatus, I. ricinus, I. scapularis) и 6 видов не являются членами этого комплекса.