Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий Аzospirillum Вrasilense

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Шелудько Андрей Вячеславович

ГЕНЕТИКО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЦИАЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Саратов - 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научный консультант: доктор биологических наук Елена Ильинична Кацы

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лидия Владимировна Карпунина

доктор биологических наук, доцент Маргарита Юрьевна Грабович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Галина Александровна Ерошенко

Ведущая организация:

Всероссийский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Защита диссертации состоится « 8 » декабря 2010 г. в 13⁰⁰ ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

Тел. / факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК.

Автореферат разослан « __ » октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

штамм мутант brasilense микроорганизм

Актуальность проблемы. Бактерии рода Azospirillum являются модельным объектом в исследованиях молекулярных механизмов ассоциативного взаимодействия растений и микроорганизмов. Азоспириллы - ризобактерии, стимулирующие рост и развитие растений (PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), благодаря своей способности к фиксации атмосферного азота, продукции фитогормонов, контролю фитопатогенов и др. (Berg, 2009; Lugtenberg, Kamilova, 2009). Существование в гетерогенных условиях почвы, смена экологических ниш (почва - ризосфера - растение) требуют от бактерий богатого набора адаптивных способностей.

Наличие специализированных двигательных органелл, наряду со способностью реагировать на постоянно изменяющиеся условия окружающей среды посредством тактических реакций, существенно расширяет адаптационные возможности бактерий, живущих в разнообразных местах обитания (Armitage 1992; Кацы, 1996; Дебабов, 1999; Vladimirov, Sourjik, 2009). Эффективность экспансии микроорганизмов повышается в результате перехода индивидуально движущихся клеток к коллективной миграции (Henrichsen, 1972; Дебабов, 1999; Олескин с соавт., 2000; Verstraeten et al., 2008). В настоящее время описано значительное количество типов индивидуальной и коллективной подвижности микроорганизмов (плавание, роение, скольжение, тянущая подвижность и др.). Особенности совместного перемещения микроорганизмов определяются механизмами, обеспечивающими движение; межклеточными контактами, обусловленными мажорными компонентами клеточной поверхности; а в некоторых случаях зависят от продукции сурфактантов и ряда других факторов (Harshey, 2003). Генетико-физиологический анализ изменений в подвижности бактерий и архитектуре их клеточной поверхности необходим для выяснения механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.

Исследование подвижности и хемотаксиса бактерий является одной из динамично развивающихся областей современной микробиологии. Столь пристальное внимание к проблеме во многом вызвано тем обстоятельством, что на сравнительно простой биологической системе, каковой является бактериальная клетка, можно установить закономерности, лежащие в основе поведенческих реакций, которые можно экстраполировать на более сложные системы (Adler, 1987; Иваницкий, 1999; Олескин, 2009). Наряду с классическими объектами Escherichia coli и Salmonella typhimurium внимание исследователей привлекают и почвенные бактерии. Именно у них обнаружены более сложные, чем у Enterobacteriaceae, хемосенсорные системы, большее разнообразие двигательных органелл и механизмов, приводящих клетки в движение. Усложнение организации систем подвижности и хемотаксиса у почвенных бактерий считают отражением высокой пластичности их метаболизма (Manson et al., 1998; Кацы, 2003).

В природных экосистемах большинство бактерий существуют в виде прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет собой сложный строго регулируемый биологический процесс. Формирование микроорганизмами биопленочных сообществ является одной из стратегий выживания бактерий не только в окружающей среде, но и в инфицируемых макроорганизмах. В составе биопленок бактерии объединены сложными межклеточными связями и во многом функционально сходны с многоклеточными организмами (Shapiro, 1998; Ильина с соавт., 2004; Dobretsov et al., 2009). Учитывая то обстоятельство, что в случае ассоциативного взаимодействия не происходит образования каких-либо специфических структур, наподобие клубеньков, характерных для бобово-ризобиального симбиоза (Pedrosa, 1988), формирование азоспириллами биопленок может играть существенную роль в успешном функционировании ассоциации.

В последнее десятилетие интенсивное изучение разнообразных процессов, реализуемых при наличии достаточной плотности популяции микроорганизмов (“ощущение кворума”, формирование биопленок или плодовых тел, различные способы коллективной подвижности, синтез экзоферментов, конъюгативный перенос плазмид и пр.), вышло на качественно новый теоретический и методический уровень. В 2005 г. для данной области исследований предложено название “социомикробиология” (Parsek, Greenberg, 2005). В обзоре А.В. Олескина (2009) отмечено, что бактерии проявляют различные формы коллективного поведения (кооперацию, координированную агрессию и избегание); бактериальные системы характеризуются контактной и дистантной коммуникацией; микроорганизмы формируют надклеточные системы, которые можно рассматривать как бактериальные биосоциальные системы, по аналогии с сообществами животных. Бактериальные биосоциальные системы характеризуются целостностью, единым жизненным циклом и иерархической или сетевой организацией (Олескин, 2009). Таким образом, выбор популяцией микроорганизмов оптимального варианта взаимодействия с внешней средой и клетками высших организмов, осуществляемый в результате обмена информацией между отдельными особями, можно считать социальным поведением.

Новые знания о генетических и внешних факторах, влияющих на социальное поведение ассоциативных бактерий, стимулирующих рост и развитие растений, будут полезны при разработке аграрных биотехнологий, методов мониторинга состояния окружающей среды (создание биосенсоров) и фиторемедиации загрязненных почв.

В качестве основного объекта данного исследования выбраны бактерии штамма Azospirillum brasilense Sp245, обладающие всеми характеристиками, которые могут влиять на их ассоциативное взаимодействие с растениями (диазотрофность, хемотаксис, подвижность, образование фитогормонов, полисахаридов клеточной поверхности и др.). Кроме того, бактерии данного штамма, наряду с бактериями штаммов A. brasilense Sp242, Sp107 и Sp108 (Baldani et al., 1983) и A. irakense KBC1 (Faure et al., 1999), способны не только колонизировать ризосферу, но и проникать внутрь корней и существовать в них в метаболически активном состоянии (Dцbereiner, De-Polli, 1981; Jain, Patriquin, 1984). Все перечисленное выше делает бактерии A. brasilense Sp245 крайне интересным объектом для изучения молекулярных основ адаптационного потенциала почвенных микроорганизмов. В работе были использованы и другие штаммы азоспирилл - представители видов A. brasilense, A. halopraeferans, A. irakense и A. lipoferum.

Бактерии рода Azospirillum способны к ассоциативному взаимодействию с чрезвычайно широким кругом растений, распространены практически во всех климатических зонах и экологических нишах (в почве, в корнях растений, на поверхности подземной и надземной частей растений, в воде и др.) (Umali-Garcia et al., 1980; Басилашвили, Нуцубидзе, 1984; Федорова с соавт., 1985; Assmus et al., 1995; Bashan, Holguin, 1997). В данном контексте интересно сравнение поведения A. brasilense Sp245 и других штаммов для выявления универсальных механизмов, обеспечивающих разнообразные проявления социальной активности азоспирилл.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в комплексном генетико-физиологическом анализе социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense.

В связи с поставленной целью в наши задачи входило следующее:

1. Охарактеризовать социальную подвижность штаммов A. brasilense дикого типа и мутантов штамма A. brasilense Sp245 c изменениями в жгутиковании и составе углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности.

2. Оценить роль полисахаридов и белка-гемагглютинина, локализованных на клеточной поверхности, в реализации социальной подвижности бактерий штамма A. brasilense Sp245.

3. Изучить возможное влияние на подвижность азоспирилл ряда внешних факторов (состав среды культивирования; присутствие прижизненного красителя конго красного, корневых экссудатов проростков пшеницы, растительных и грибного лектинов, поликлональных антител на поверхностные полимеры бактериальных клеток).

4. Охарактеризовать нуклеотидную последовательность сегмента резидентной 85-МДа плазмиды штамма A. brasilense Sp245, мутагенез которого приводит к дефектам в жгутиковании и/или подвижности азоспирилл.

5. Провести анализ изменений в структуре генома A. brasilense Sp245, сопровождающихся вариациями в социальной подвижности этих бактерий.

6. Исследовать процесс формирования биопленок культурами штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов с изменениями в структуре клеточной поверхности и подвижности на абиотических плотных средах и на корнях проростков пшеницы.

Научная новизна работы. Дана характеристика новых проявлений социальной подвижности азоспирилл: ускоренное роение, зависящее от работы жгутиков, и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний, реализуемое и в отсутствие жгутиков. Описаны новые экстраклеточные органеллы бактерий штамма A. brasilense Sp245 - полярный пучок пилей, продукция которых, возможно, альтернативна сборке полярного жгутика.

Установлено, что социальная подвижность азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбировать прижизненный краситель конго красный.

Показано, что межклеточные контакты бактерий A. brasilense Sp245, двигающихся в полужидких средах, опосредуются взаимодействиями белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида этих бактерий.

Определены некоторые факторы (сниженная концентрация кислорода, аминокислоты аспарагиновая кислота, серин и треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил-в-D-глюкозамина, соли аммония, нитраты и нитриты), способствующие переходу части популяции клеток A. brasilense от плавания и роения к распространению с образованием микроколоний или оказывающие модулирующее действие на скорость движения клеток.

Обнаружено, что спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальное поведение бактерий. В ДНК 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245 идентифицированы гены hdfR и ccoN, предсказанные белковые продукты которых могут влиять на поведенческие реакции бактерий.

Выявлены поверхностные структуры бактерий и типы подвижности, участвующие в процессе формирования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз “водная среда - твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда - твердая гидрофобная поверхность” или на корнях проростков пшеницы.

Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены оригинальные мутанты штамма A. brasilense Sp245 с изменениями в индивидуальной и социальной подвижности, продукции жгутиков и поверхностных полисахаридов, которые могут быть полезны при изучении механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Разработанные методические приемы и теоретические положения нашли применение в исследованиях, выполняемых в пяти лабораториях ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, биохимии, микробиологии, иммунохимии и экологической биотехнологии), объектами которых были не только бактерии рода Azospirillum, но и бактерии других родов (что частично отражено в публикациях, представленных в списке основных публикаций по теме диссертации).

Предложенная биотест-система, основанная на ингибировании подвижности разных штаммов азоспирилл поликлональными антителами на поверхностные бактериальные структуры, может быть использована для первичной оценки серологического родства этих бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности интактных клеток.

Результаты работы использованы при подготовке учебно-методического пособия “Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам” / Составители: Шелудько А.В., Кацы Е.И., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Широков А.А., Щеголев С.Ю. / Под ред. Игнатова В.В. Саратов: Научная книга, 2007. 56 с. Данное пособие, рекомендованное к печати кафедрой органической и биоорганической химии и кафедрой биохимии и биофизики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), предназначено для студентов и аспирантов химического и биологического факультетов СГУ.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Ускоренное роение и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний представляют собой новые проявления социальной подвижности азоспирилл. Коллективное движение азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбирировать прижизненный краситель конго красный.

2. Распространение бактерий A. brasilense Sp245 по полужидким средам опосредуется взаимодействием белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Источники азота в окружающей среде и кислород модулируют гемагглютинирующие свойства бактериальных клеток и, как следствие, подобные взаимодействия.

3. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил-в-D-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток A. brasilense от плавания или роения к распространению с образованием микроколоний. На эффективность роения азоспирилл влияют природа источника азота в среде, концентрация кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы.

4. Генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма A. brasilense Sp245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и подвижности азоспирилл. На социальное поведение азоспирилл могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в p85 генов hdfR и ccoN - негативный регулятор транскрипции жгутикового мастер-оперона flhDC и каталитическая субъединица I цитохромоксидазы, соответственно.

5. Изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Липополисахариды, полисахариды, связывающие калькофлуор, и полярный жгутик участвуют в организации биопленок A. brasilense на границе раздела фаз “водная среда - твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда - твердая гидрофобная поверхность”.

6. После “заякоривания” на корнях пшеницы формирование биопленки клетками штамма A. brasilense Sp245 и его нероящихся мутантов опосредовано распространением с образованием микроколоний. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

7. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии чужеродного лектина, “распознаются” организмом, продуцирующим лектин, с наименьшим проявлением антагонизма.

8. Эффект ингибирования подвижности азоспирилл антителами на поверхностные структуры или лектинами различного происхождения может быть использован для оценки серологического родства бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности клеток.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН в рамках трех плановых тем НИР: “Изучение генов почвенных азотфиксирующих бактерий, определяющих их взаимодействие со злаками” (№ госрегистрации 01960001676); “Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образование мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense” (№ госрегистрации 01200606181); “Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями” (№ госрегистрации 01200904390). Работа частично поддержана грантом Президента РФ МК-235.2003.04 для молодых кандидатов наук (канд. биол. наук А.В. Шелудько) и их научных руководителей (д-р биол. наук Е.И. Кацы); грантами Президента РФ НШ-1529.2003.4, НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 для ведущей научной школы засл. деятеля науки РФ, д-ра биол. наук, проф. В.В. Игнатова; грантом Роснауки № 2005-РИ-112/001 (рук. - д-р биол. наук, проф. В.В. Игнатов); грантом Фонда содействия отечественной науке для канд. биол. наук А.В. Шелудько и грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 06-04-48204-а (рук. - д-р биол. наук Е.И. Кацы).

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в планировании и осуществлении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. Автор выражает искреннюю признательность своему научному консультанту - заведующей ЛГМ ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Е.И. Кацы за многолетнюю помощь и всестороннюю поддержку работы. Автор признателен участвовавшим в проведении исследований сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.П. Петровой, канд. биол. наук И.В. Борисову, канд. биол. наук О.В. Кулибякиной и О.Э. Варшаломидзе; сотрудникам лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.Ю. Матора, канд. биол. наук Г.Л. Бурыгину и канд. биол. наук А.А. Широкову; сотрудникам лаборатории биохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.П. Антонюк, канд. биол. наук А.В. Тугаровой и В.А. Крестиненко; сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.В. Степановой, канд. биол. наук Е.Г. Пономаревой и канд. биол. наук Е.П. Ветчинкиной; сотруднику лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН канд. биол. наук М.К. Соколовой; чей вклад отражен в совместных публикациях; а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН, способствовавшим успешному выполнению работы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-й Школе-конференции молодых ученых “Горизонты физико-химической биологии” (Пущино, 2000), 10-м Международном конгрессе IUMS The “World of Microbes” (Париж, 2002), 1-й и 2-й Региональных конференциях молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой” (Саратов, 2002, 2004), 6-й, 9-й и 10-й Школах-конференциях молодых ученых “Биология - наука XXI века” (Пущино, 2000, 2005, 2006), международной конференции “Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants” (Саратов, 2003), 3-й Всероссийской школе-конференции “Химия и биохимия углеводов” (Саратов, 2004), 30-м конгрессе FEBS (Будапешт, 2005), Всероссийской конференции “Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты” (Саратов, 2005), Международной научной конференции “Мiкробнi бiотехнологiп” (Одесса, 2006), Международной школе-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология” (Москва-Пущино, 2006), 3-й и 4-й Межрегиональных конференциях молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 2006, 2008), Всероссийской конференции с международным участием “Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем” (Саратов, 2007), Международной научной конференции “Микроорганизмы и биосфера” (Москва, 2007), 5-м Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии “Успехи медицинской микологии” (Москва, 2007), Международном рабочем совещании “Azospirillum VII and related PGPR: Genomics, molecular ecology, plant responses and agronomic significance” (Монпелье, 2007), Международной конференции “Вавиловские чтения-2007”, посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Саратов, 2007), Международной научно-практической конференции “Вавиловские чтения-2008”, посвященной 95-летию Саратовского госагроуниверситета (Саратов, 2008), 5-м Московском междунар. конгр. “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2009), отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН (Саратов, 2003, 2004, 2008).

Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 09.06.2010, протокол № 175.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ, в том числе, 18 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 321 странице машинописного текста, содержит 24 таблицы и 54 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 14 подразделов), а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 510 литературных источников, из них 80 на русском и 430 на английском языках. В приложении приведены аннотированные нуклеотидные последовательности обсуждаемых в работе генов 85-МДа плазмиды бактерий штамма A. brasilense Sp245, депонированные в международную базу данных GenBank (NCBI, США) (GenBank accession no. EU194339, EU784144, EU595702, EU595701 и EU595706).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает подразделы: 1.1 Общая характеристика ассоциативных бактерий рода Azospirillum; 1.2 Мажорные углеводсодержащие полимеры бактериальной поверхности; 1.3 Межклеточная коммуникация бактерий; 1.4 Двигательные органеллы бактерий; 1.5 Поведение бактерий, обусловленное подвижностью; 1.6 Формирование бактериями биопленок.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы бактерии штаммов дикого типа A. brasilense Cd, KR77, S17, S27, Sp7, Sp107, Sp245, SpBr14, SR8, SR15, SR55, SR75, SR80, UQ1794 и UQ1796, A. halopraeferans AU4, A. irakense KA3 и KBC1, A. lipoferum Sp59b, SpRG20a и SpRG6xx; 36 мутантов (табл. 1) и спонтанных производных A. brasilense Sp245; три мутанта A. brasilense S27 (KS107, KS109 и KS122); три штамма Escherichia coli; 11 рекомбинантных плазмид; а также растительный и грибной объекты - мягкая яровая пшеница Triticum aestivum cv. Саратовская 29 и базидиальный ксилотроф Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917.

Таблица 1. Характеристика мутантов A. brasilense Sp245

Примечание: * - диффузная колония.

В главе 2 описаны: питательные среды и условия выращивания бактерий, гриба и проростков пшеницы; методы изучения ряда биохимических, физиологических и морфологических характеристик бактериальных культур; иммунохимические методы анализа различий в продукции бактериями полисахаридов и белков; методы анализа ДНК и свойств, предсказанных белковых продуктов кодирующих последовательностей. Все количественные результаты подвергали статистической обработке с использованием пакета Microsoft Office Excel 2003 (11.6355.6360) SP1. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Индивидуальная и социальная подвижность азоспирилл, зависящая от работы жгутиков. Выросшие в жидкой среде азоспириллы синтезируют длинный жгутик (Fla), располагающийся на одном из полюсов клетки. Активность Fla обеспечивает возможность клеткам штамма Sp245 плавать прямолинейно вдоль их длинной оси со средней скоростью 29.0±1.1 мкм/с. После точечного посева в агаризованную питательную среду клетки Sp245 переходят к роению при помощи жгутиков и формируют макроколонию, имеющую вид концентрической структуры (Swa⁺-фенотип, от англ. swarming) (рис. 1).

Рис. 1. Колонии, сформированные

A. brasilense Sp245 (а), его Swa⁺⁺-мутантом BK570 (б) и Swa?-мутантами SK051 (в), SK248 (г). Концентрация агара в среде 0.3%, время инкубации 72 ч. Масштабная линейка соответствует 10 мм.

Внимание к поведению азоспирилл на полужидких агаризованных средах обусловлено возможностью в данных условиях смоделировать физико-химические свойства муцигеля (Скворцов, 1994), окружающего бактерии на корнях растения. Стоит отметить, что использование агаризованных сред позволяет выявить у бактерий способность к различным типам коллективной подвижности, опосредуемым не только жгутиками, но и обусловленными другими механизмами (Henrichsen, 1972). Формирование роящимися клетками на средах, содержащих от 0.4-0.6% агара, концентрических макроколоний у штамма Sp245 происходит после 2.5-5-часового латентного периода и сопровождается увеличением на 15-20% продольного размера клеток и, как и у других штаммов A. brasilense (Moens et al., 1995), синтезом дополнительных латеральных жгутиков (Laf). Концентрические макроколонии образуют роящиеся бактерии всех штаммов, исследованных нами, - представителей A. brasilense, A. halopraeferans, A. irakense и A. lipoferum, что позволяет определить описанную морфологию колоний как характерную для рода Azospirillum. Отчасти это может быть обусловлено формой клеток азоспирилл и характером расположения на них жгутиков.

Получены производные штамма A. brasilense Sp245, распространяющиеся по полужидким средам со скоростью коллективной миграции клеток, превышающей подвижность родительского штамма (Swa⁺⁺-фенотип), а также мутанты, утратившие способность к жгутиковой подвижности (Swa?-фенотип) (табл. 1, рис. 1). Например, штамм BK570, клетки которого распространяются в малатно-солевой среде (MSM) с 0.3 или 0.4% агара примерно в 2 раза быстрее, чем у штамма Sp245 (рис. 1). Клетки BK570 движутся активнее Sp245 также и в жидкой среде (34.8±1.0 и 29.0±1.1 мкм/с, соответственно). Различия в поведении Swa⁺⁺-, Swa?-мутантов не зависели от использованного источника углерода или азота в среде.

Считается, что именно активность Laf обеспечивает роение азоспирилл на агаризованных средах. Однако в отличие от сохраняющего подвижность на полужидких средах Fla? Laf⁺-мутанта A.brasilense Sp7 (Hall, Krieg, 1983), полученные нами Fla? Laf⁺, Fla?/Mot? Laf⁺ и Mot? Laf⁺ Omegon-Km-мутанты (SK039, SK048 и SK248) штамма Sp245, а также Fla? leaky Laf? мутант SK454, синтезирующий Laf в меньшем количестве, не способны к роению с образованием концентрических макроколоний. Fla? leaky Laf? (KZ019 и KZ044) и Mot? leaky Fla? Laf⁺ (KZ020) Tn5-Mob -мутанты мутанты Sp245, а также TnphoA Fla? Laf⁺ (KS107 и KS122) и Fla? leaky Laf? (KS109) мутанты A. brasilense S27 тоже не способны к роению. Результаты изучения поведения в полужидких средах Fla? Laf⁺/Fla? leaky Laf? производных A. brasilense Sp245 и S27 и данные по подвижности аналогичных мутантов штамма Sp7 (Hall, Krieg, 1983) свидетельствуют о том, что мы наблюдаем некоторые внутривидовые различия, характеризующие роль Laf в обеспечении подвижности азоспирилл на агаризованных средах. По крайней мере, у двух штаммов, A. brasilense Sp245 и S27, и Fla обеспечивает распространение бактерий по полужидким средам.

3.2 Миграция A. brasilense с образованием микроколоний, не зависящая от жгутиков. Наблюдения за поведением одного из Swa?-мутантов штамма Sp245, SK048 (Fla? Mot?) позволили нам выявить скрытый потенциал, обеспечивающий распространение азоспирилл по полужидким средам. Бактерии дикого типа за 18 ч инкубации образуют концентрические колонии. Клетки мутанта более 18 ч остаются в точке инокуляции (Swa?-фенотип), а затем начинают перемещаться, формируя небольшие диски, состоящие из клеточных агрегатов - Gri-распространение (от англ. granular inclusions) (рис. 2).

Рис. 2. Колонии, сформированные A. brasilense Sp245 (а) и его Swa? мутантом SK048 (б) в полужидкой MSM. Концентрация агара 0.4%, время инкубации 72 ч.

Как правило, морфология макроколоний соответствует определенному способу социальной подвижности микроорганизмов (Henrichsen, 1972). Возможно, изменение морфологии макроколоний у SK048 обусловлено использованием клетками способа коллективной миграции, скрытытого у дикого типа в лабораторных условиях, но ставшего единственным способом распространения мутанта.

Способность к Gri-распространению удалось обнаружить не только у мутанта SK048, но и у ряда других Swa?-производных штамма Sp245. Инокулированные с плотной MSM в среды, содержащие от 0.2 до 0.9% агара, клетки омегоновых Swa?-мутантов (SK005, SK039, SK048, SK051, SK237, SK248, SK454, SK531, SK586, KM018, BK759G), в отличие от роящихся штаммов Sp245 и BK570, либо остаются в месте укола, либо образуют зернистые зоны распространения. В случае SK248 бактерии остаются в точке инокуляции в полужидкий агар, но иногда образуют зернистые или смешанные мутно-зернистые колонии. В полужидкой MSM мутанты SK005 (Fla? Laf? Mot?), SK039 (leaky Fla? Mot?), SK048 (Fla? Mot?), SK051 (leaky Fla? Laf? Mot?), SK237 (Fla?), SK248 (Mot?), SK454 (Fla? leaky Laf?) и KM018 (Cal? LpsII? Mot?) демонстрировали фенотипическую вариацию (либо Swa? Gri?, либо Swa? Gri⁺-фенотип) при одной и той же температуре независимо от концентрации (от 0.2 до 0.6%) агара и используемого источника углерода. В случае SK531 (Fla? Laf? Mot?) и SK586 (Fla? Laf?) клетки преимущественно оставались в точке инокуляции - Swa? Gri?-фенотип колоний. При концентрации агара в среде выше 0.6% все использованные в эксперименте штаммы к 48 ч инкубации либо остаются в месте инокуляции, либо начинают распространяться, но не в толще и не по поверхности агара, а по дну чашки Петри, если там имеется немного влаги. Стоит отметить, что клетки штамма дикого типа, мигрирующие по дну чашки Петри, также иногда распространяются с образованием микроколоний. Не исключено, что дефицит кислорода, который будет возникать под толщей агара, может способствовать переходу клеток Sp245 к Gri-подвижности. Причина такого перехода может быть обусловлена подавлением подвижности при помощи жгутиков в условиях недостатка кислорода. Так, у A. brasilense вращение полярного жгутика обеспечивается трансмембранной разностью потенциалов Na⁺ (Дµ_Na+), в создании которой существенную роль играет активируемая дыханием натриевая помпа (Wood et al., 1998).

Период, предшествующий Gri-распространению, например, у штаммов A. brasilense SK048, SK039, SK051, SK248 и SK454 длится около 24-42 ч. Мутанты не отличаются от дикого типа в скорости роста. По-видимому, у Gri⁺-мутантов, активация генов, обеспечивающих Gri-распространение, происходит при достижении определенной плотности популяции бактерий через стадию неподвижных особей. На средах с концентрацией агара от 0.4% и выше на клетках штаммов Sp245, SK039, SK048 и SK248 синтезируются многочисленные Laf. У SK454 Laf образуются в меньшем количестве, а у SK051 Laf отсутствуют. Однако диаметр Gri⁺-колоний, образуемых мутантами, не зависел от присутствия Laf или от их количества. Так, у SK039, SK048, SK248, SK454 и SK051 через 48 ч инкубации на полужидкой MSM с 0.4% агара размер колоний составлял 7.1±0.8, 10.7±1.3, 7.3±0.9, 10.4±1.0 и 8.0±0.7 мм, соответственно. Таким образом, на способность к Gri⁺-распространению и эффективность такого способа миграции бактерий не влияет присутствие на клетках Laf. В пользу данного предположения свидетельствует поведение в полужидких средах клеток KZ019, KZ020 и KZ044 - Tn5-Mob-мутантов A. brasilense Sp245. Сохраняя способность к синтезу Laf, клетки мутантов KZ019, KZ044 (Fla? leaky Laf?) и KZ020 (Mot? leaky Fla?) на полужидких средах неподвижны (Swa? Gri?-фенотип), как и омегоновые мутанты SK531 (Fla? Laf? Mot?) и SK586 (Fla? Laf?), лишенные Laf.

Мы не наблюдали заметных различий в морфологии колоний у Sp245 и его Gri⁺-мутантов, выращенных на плотных средах MSM или LB. Большинство мутантов не отличались от штамма Sp245 дикого типа по продукции О-специфических полисахаридов (ОПС) и полисахаридов, связывающих калькофлюор (ПССК) (Cal⁺-фенотип). Исключением являлись SK051 имеющий Cal?-фенотип, а также Cal?-штамм KM018, утративший один из липополисахаридов (ЛПСII). Однако ряд других мутантов (KM127, KM139, KM252 и KM139) с изменениями в продукции ОПС и ПССК сохраняли способность к плаванию и роению. Таким образом, у Gri⁺-мутантов способ распространения с образованием микроколоний не связан с какими-либо общими дефектами в продукции полисахаридов, локализованных на клеточной поверхности.

Анализ поведения A. brasilense Sp245 и его Swa?-мутантов на полужидких средах свидетельствует, что утрата способности к роению мутантами Sp245 с нарушениями продукции и функционирования жгутиков позволила обнаружить у A. brasilense способ распространения с образованием микроколоний, который скрыт у штамма дикого типа. Вероятно, для реализации механизма Gri-распространения бактерии не используют жгутики. Интересно, какие же клеточные структуры могут способствовать миграции бактерий и формированию агрегатов. Просвечивающая электронная микроскопия клеток SK048, выращенных на плотной среде, показала наличие пучка пилей на одном из полюсов клетки. Необходимо отметить, что хотя в жидких аэрируемых культурах около 10% клеток SK048 все еще продуцировали длинный или укороченный Fla (Шелудько, 2000), мы никогда не наблюдали Fla у бактерий SK048, выросших на плотной среде. Пучок пилей был также обнаружен на полюсе клеток других омегоновых мутантов и самого штамма Sp245, выращенных в жидкой или на плотной среде. Необходимо отметить, что визуализировать пили было довольно сложно, возможно, из-за их хрупкости. Расположение обнаруженных на клетках азоспирилл пилей соответствует локализации образующих полярный пучок пилей Bfp (от англ. bundle-forming pilus). Bfp обеспечивают тянущую подвижность Pseudomonas aeruginosa и ряда других грам-отрицательных бактерий, скольжение почвенных бактерий Myxococcus xantus и требуются для агрегации клеток (Henrichsen et al., 1972; Harshey, 2003). При световой микроскопии мы наблюдали характерные для тянущей подвижности подергивания клеток у SK048 в капельке жидкости, выдавленной из плотной среды, на которой рос мутант, после наложения на колонии покровного стекла. Подергивания клеток, сопровождающиеся изменением их положения в пространстве, отмечены нами и при микроскопии Gri-колоний, например, SK048, SK051, SK248 или SK454, сформированных бактериями в полужидкой среде.

Мы ни разу не наблюдали Fla и полярные пили на одной и той же клетке при просмотре препаратов для просвечивающей электронной микроскопии клеток, выращенных на плотной среде или в жидкой культуре. Вероятно, продукция на полюсе клетки либо вращающегося Fla, либо пилей являются альтернативными состояниями вегетативных клеток азоспирилл. Необходимо отметить, что распространение с образованием микроколоний наблюдалось в случае мутантов A. brasilense Sp245 (SK005, SK039, SK048, SK051, SK237, SK248, SK454, KM018, BK759G), у которых Fla либо не продуцировался, либо был парализован. Кроме того, при предварительном культивировании родительского штамма в статичных условиях, неблагоприятных для работы Fla, наблюдается пусть незначительное, но увеличение частоты перехода азоспирилл к Gri⁺-распространению (см. ниже). Возможно, собственно вращающийся Fla или иные компоненты функционирующей Fla-системы каким-то образом вовлечены в регуляцию частоты фенотипической вариации у A. brasilense. Также не исключено, что у систем, обеспечивающих Swa- или Gri-подвижность, существуют общие контролирующие элементы, поскольку среди мутантов A. brasilense Sp245 с различными нарушениями в продукции и функционировании жгутиков встречаются Swa? Gri?-штаммы (SK531, SK586, KZ019, KZ020 и KZ044). К настоящему времени в литературе появились сообщения, свидетельствующие о том, что у азоспирилл в геноме присутствуют локусы, обуславливающие синтез пилей (Кацы, 2002а; Valverde et al., 2006).

Наблюдения за поведением Sp245 и его Swa?-мутантов на полужидких средах позволили обнаружить у азоспирилл способ распространения с образованием микроколоний, скрытый у штамма дикого типа, что может быть обусловлено как большей скоростью миграции Swa⁺-клеток (рис. 2), так и доминированием в популяции Sp245 роящихся особей. Возможно, тестирование подвижности в полужидких средах отдельных бактериальных клонов позволит охарактеризовать фенотипические вариации в способах распространения Sp245. Оказалось, что после инокуляции в полужидкую MSM (0.4% агара) отдельных колоний Sp245 с плотной MSM через 48 ч шесть (3Ч10?³) из 1814 клонов демонстрируют Gri⁺-фенотип. Необходимо отметить, что мы наблюдали синтез Bfp не только у Swa?-мутантов, но и у клеток дикого типа. Восемьдесят одна колония (5Ч10?²) вообще не распространилась в агаре (Swa? Gri?), а другие клоны образовали кольца роения. Проверка стабильности выявленных производных Sp245 показала, что в использованных нами лабораторных условиях клоны этого штамма со спонтанным Gri⁺ или Swa?-фенотипом оказались нестабильными (бактерии восстанавливали способность к роению). По описанной выше экспериментальной схеме было изучено поведение мутанта SK048 и отмечено появление Swa? колоний с частотой 1Ч10?¹. Эти Swa?-колонии впоследствии дали начало Gri⁺ и Swa?-потомкам. Остальные колонии, образованные отдельными клонами SK048, были Gri⁺.

Образование клеточных агрегатов на корнях растений характерно для азоспирилл (Murthy, Ladha, 1987), но природа клеточных структур и механизмов, определяющих агрегацию бактерий, остается не выясненной. Не исключено, что в случае клонов, выделенных после колонизации штаммом Sp245 корней пшеницы (бактерии находились 7 суток или 21 день на растениях, росших в жидкой среде), Gri⁺-распространение станет преобладать. Однако анализ подвижности на полужидкой MSM клонов Sp245, выделенных после колонизации этим штаммом корней пшеницы, не подтвердил данное предположение - увеличивалось лишь число Swa? Gri?-колоний, высеянных с корней 24-дневных растений (10?¹ клонов). Не исключено, что способ распространения A. brasilense в форме микроколоний, или клеточных агрегатов, является предпочтительным лишь при определенных условиях окружающей среды, например, в слизи, выделяемой корнями растений.

Для A. brasilense было показано (Wood et al., 1998), что связанная с дыханием активность Na⁺-помпы, по-видимому, служит движущей силой для вращения Fla. Интересно было определить, стимулируют ли условия недостатка кислорода появление Gri⁺ или Swa?-колоний. Серийные разведения 24-ч статичных культур Sp245 смешивали с расплавленной MSM, содержащей 0.4% агара и выливали смесь на чашки Петри. После застывания агара инкубировали при 32єC. Через 48 ч колонии формировали нераспространяющиеся Swa?-клоны (259 клонов) (размер колоний не изменялся через 72 или 144 ч), колонии с мутноватым Gri⁺-фенотипом (34 клона) или колонии с Swa⁺-фенотипом (остальные из 3235 клонов). Таким образом, частота появления Swa? (8Ч10?²) или Gri⁺ (1Ч10?²)-фенотипа слегка возрастала в результате преинкубации Sp245 без аэрации с последующей инокуляцией бактерий непосредственно в полужидкую среду, в которой возможно формирование области с пониженным содержанием кислорода, неблагоприятно влияющей на работу Fla. Стоит отметить, что Swa? или Gri⁺-фенотип оказался нестабильным и в этой серии экспериментов. Клетки SK048, выращенные в жидкой среде в условиях недостатка кислорода, протестировали так же, как и Sp245. Четыре из 680 колоний (6Ч10?³), появившихся через 72 ч, показали смешанный фенотип. У двух колоний наблюдались небольшие кольца роения, а в случае двух других клонов Swa-сектора распространялись из Gri⁺-зон. После одного пассажа этих 4-х колоний на плотной MSM и последующей инокуляции уколом в полужидкую среду все клеточные линии демонстрировали Swa?-фенотип в течение 48 ч и стали зернистыми через 72 ч. Тридцать пять (~5Ч10?²) из 680 колоний, появившихся в полужидкой среде через 72 ч, были Swa?, а оставшаяся 641 колония - Gri⁺.

3.3 Особенности продукции и работы флагелл у роящихся дериватов Gri⁺-штаммов A. brasilense и у производных A. brasilense с ускоренным роением. Интересен BK759.G - Fla? Gri⁺-мутант Sp245, клетки которого из сектора зоны роения, выходящей из Gri⁺-колонии, сохраняют способность к роению, в отличие от особей с подобным поведением у SK048. Так, часто на полужидкой среде у BK759.G из произвольной точки зоны распространения микроколониями возникает фронт роения (рис. 3).

Рис. 3. Макроколонии, сформированные клетками штамма A. brasilense Sp245 (а, в) и его мутанта BK759.G (б) в MSM, содержащей 0.4% агара. Время инкубации 72 ч. Масштабная линейка соответствует 10 мм. Стрелки указывают на концентрические выбросы (протуберанцы).

Клоны, отсеянные из образовавшихся фронтов роения (ВК759.Р), приобретали устойчивый фенотип Swa⁺⁺. Способность к Swa⁺⁺-распространению сохранялась у них после многократных пассажей на плотной среде. Важно отметить, что переходы ВК759.G к роению происходили только в полужидкой среде. Инокулированные в такую среду бактерии, выращенные в бульонной культуре, или отдельные колонии с плотной среды, всегда давали Gri⁺-фенотип. Электронная микроскопия ВК759.Р показала, что клетки восстанавливали способность к синтезу Fla, отсутствующего у ВК759.G, как в жидких, так и на агаризованных средах. Количество Laf у ВК759.Р сохранялось на уровне штаммов Sp245, ВК759.G и BK571 (Swa⁺⁺). Таким образом, результаты изучения морфологии клеток Gri⁺-мутанта ВК759.G и его Swa⁺⁺-производного ВК759.Р показывают, что переход от Gri-распространения к роению сопровождается восстановлением Fla.

Довольно часто на 3-4-е сутки после посева культуры клеток штамма A. brasilense Sp245 уколом в полужидкую MSM от внешней границы колец роения начинают отходить так называемые “протуберанцы” (или выпячивания), имеющие бьльшую скорость роения (рис. 3в). В результате рассева бактерий из протуберанцев до отдельных колоний и перепроверки скорости их роения были отобраны пять спонтанных производных Sp245 со стабильным фенотипом Swa⁺⁺ (Sp245.P1-Sp245.P5). На полужидкой среде диаметр колец роения, формируемых штаммами Sp245.P1-Sp245.P5, превышал таковой у Sp245 примерно в 1.8-2.5 раза. При этом еще более быстро роящиеся клоны в популяции Swa⁺⁺-производных Sp245 не появлялись. Скорость роста в жидкой и на плотной MSM у Sp245 и Sp245.P1-Sp245.P5 была практически одинаковой. На плотной MSM морфология колоний Swa⁺⁺-вариантов была такой же, как у родительского штамма. В жидких культурах характер движения клеток Swa⁺⁺-производных Sp245 не отличался от такового у штамма дикого типа, а в средах, содержащих 0.3-0.4% агара, они перемещались, как и у BK570, на более протяженные отрезки, чем клетки дикого типа. В жидкой или содержащей 0.3% агара MSM (на клетках есть только Fla) скорость движения отдельных клеток Swa⁺⁺-производных Sp245 (Sp245.P1-Sp245.P5), как и у BK570, была выше, чем у Sp245, а при большей концентрации агара (на клетках есть Fla и Laf) эти различия исчезали. По-видимому, удлинение траектории прямолинейного движения и увеличение скорости движения клеток Swa⁺⁺-штаммов зависели от активности именно Fla.

Можно сделать несколько предположений о причине Swa⁺⁺-фенотипа азоспирилл. Например, ускоренная миграция в полужидких средах может быть следствием каких-то изменений в клеточной энергетике, обеспечивающей вращение Fla (Wood et al., 1998). Взаимосвязь между высокими скоростями миграции в полужидких средах и подвижностью при помощи Fla прослеживается в случае омегонового Swa⁺⁺-мутанта BK570 и спонтанных Swa⁺⁺ -производных Sp245.P1-Sp245.P5.

Появление среди клеток BK759.G, формирующих агрегаты при колонизации полужидких сред, субпопуляции бактерий c восстановленной способностью не просто к роению, а к роению, эффективность которого гораздо выше, чем у родительского штамма, наводит на мысль, что Swa⁺⁺-фенотип BK759.P связан с активностью Fla. Однако у Swa⁺⁺-мутантов BK759.P, BK468 и BK571 клетки движутся при помощи Fla в жидких средах с той же скоростью, что и бактерии родительского штамма (у BK759.P, BK468 и BK571 скорость составляла 29.2 ± 2.5, 33.2 ± 1.5 и 31.9 ± 2.0 мкм/с, соответственно, а у Sp245 - 30.3 ± 1.5 мкм/с). Таким образом, ускоренная миграция в полужидких средах может быть не только следствием каких-то изменений в клеточной энергетике, обеспечивающей вращение Fla (Wood et al., 1998), но и обусловлена другими причинами. Возможно, у каких-то Swa⁺⁺-производных структура полярного жгутика, обеспечивающего активность роящихся клеток, модифицирована таким образом, что Fla способен эффективнее вращаться в полужидком агаре. Например, показано, что флагеллин Fla у A. brasilense Sp7 гликозилирован (Moens et al., 1995). Также показано, что филамент Fla у A. brasilense покрыт полисахаридным чехлом (Бурыгин, 2003). Можно предположить, что модификация в гликозильной части флагеллина или в его полисахаридном чехлике приводит к облегчению вращения Fla в полужидких средах. Нельзя исключать, что Swa⁺⁺-производные сверхпродуцируют позитивный гипотетический регулятор коллективного распространения бактерий в полужидких средах (или у них снижен уровень синтеза негативного регулятора). Причина быстрого распространения также может быть приписана более интенсивному потреблению питательных соединений и, в результате, ускоренному образованию градиентов последних, по которым двигались бактерии. Однако стоит отметить, что скорость роста в жидкой и на плотной MSM у всех омегоновых мутантов не отличается от таковой у штамма Sp245.