Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий Аzospirillum Вrasilense

Рис. 9. Подвижность клеток

A. brasilense Sp245 в жидких средах в присутствии 0.0005-50 мкг/мл WGA (1), STA (2), UEAII (3), ConA (4) и PHA-P (5).

Конканавалин А (ConA) или фитогемагглютинин-P (PHA-P), обладающие иной углеводной специфичностью, на подвижность Sp245 не влияли.

Более подробно изучение специфичности ингибирования движения бактерий осуществляли на примере WGA. В результате блокировки активных центров WGA глюкозамином или его олигомером, N,N',N''-триацетилхитотриозой (хитотриозой), ингибирующая активность WGA элиминировалась. Рамноза или глюкоза, входящие в состав полисахаридов клеточной поверхности штамма Sp245, но не являющиеся гаптенами для данного лектина (Коннова с соавт., 1992), не влияли на способность WGA снижать подвижность азоспирилл. Напротив, добавление препарата ЛПБК, содержащего остатки глюкозамина, приводило к практически полному восстановлению скорости плавания бактерий, характерной для клеток в отсутствие WGA. Контрольные эксперименты показали, что ни одно из используемых для блокирования веществ само по себе не вызывало снижения скорости плавания бактерий. По-видимому, снижение скорости плавания азоспирилл в присутствии WGA происходило в основном вследствие специфического связывания этого лектина с полимерами поверхности бактерий, содержащими глюкозамин. Скорость плавания клеток штамма A. brasilense Sp107 в присутствии WGA уменьшалась в меньшей степени, чем у Sp245. При этом для обоих штаммов характерен близкий моносахаридный состав полисахаридной части экзополимеров, но у Sp107 выявлен более низкий процент содержания глюкозамина в составе полимеров клеточной поверхности по сравнению с Sp245 (Коннова с соавт., 1992).

3.11.2 Влияние фитолектинов на поведение A. brasilense в полужидких средах. В полужидкой MSM с WGA или STA образовывались колонии Sp245 смешанного мутно-зернистого фенотипа (рис. 10), что может свидетельствовать о переходе части популяции от роения к распространению с образованием микроколоний. BSA или ConA такого эффекта не вызывали (рис. 10). При блокировке активных центров WGA хитотриозой не удалось полностью ингибировать влияние фитолектина на поведение Sp245. В пределах колонии, сформированной бактериями в присутствии WGA и хитотриозы, встречаются агрегаты, хотя и не в таком количестве, как в случае среды, содержащей только лектин (рис. 10). WGA обладает способностью связываться с нейраминовой кислотой. Это может частично объяснить образование клеточных агрегатов в присутствии WGA с заблокированными центрами связывания хитотриозой. Только хитотриоза не способствует распространению клеток Sp245 с образованием агрегатов, но влияет на форму формируемых колоний (рис. 10).

Возможно, на полужидкой MSM с малатом хитотриоза является дополнительным источником углерода, и, как следствие этого, бактерии, скорее всего, перемещаются как по градиенту малата, так и хитотриозы.

Замена малата в полужидкой MSM, содержащей WGA или STA, на такие источники углерода, как сукцинат, арабиноза или фруктоза, не влияла на морфологию макроколоний, формируемых штаммом Sp245.

Рис.10. Колонии, сформированные

A. brasilense Sp245 (а-з) и Sp107 (и) после точечной инокуляции суспензии клеток в полужидкую MSM. На среде без добавок (а); в присутствии: 50 мкг/мл BSA (б), 0.5 мкг/мл ConA (в), 0.5 мкг/мл WGA (г, и), 5 мкг/мл WGA (д), 0.5 мкг/мл STA (е), 50 мкг/мл хитотриозы (ж) и 0.5 мкг/мл WGA + 50 мкг/мл хитотриозы (з). Время инкубации 48 ч. Масштабная линейка соответствует 10 мм.

Вероятно, переход азоспирилл от Swa-подвижности к Gri-распространению, в присутствии лектинов со сродством к остаткам N-ацетил-в-D-глюкозамина является следствием снижения подвижности бактерий при помощи жгутиков (см. пункт 3.11.1) и возможных изменений межклеточных взаимодействий, необходимых для роения.

3.12 Формирование биопленок A. brasilense на абиотических поверхностях. Методом солевой агрегации проведена оценка суммарной относительной гидрофобности планктонных клеток A. brasilense Sp245 и его мутантов по синтезу полисахаридов и подвижности: KM018, KM127, KM134, KM139, KM252, KM348, SK048, SK051, SK248 и SK454, инкубированных ~20 ч в жидкой LB. Гидрофобность выращенных клеток всех исследованных штаммов существенно не различается. У мутанта A. brasilense Sp245.5 радикальное изменение структуры ЛПС и утрата ПССК (Кацы с соавт., 2002; Федоненко с соавт., 2010) сопровождается небольшим, но статистически достоверным, увеличением гидрофобности клеточной поверхности. Не исключено, что в случае Sp245.5 начальный этап взаимодействия с гидрофобной средой протекает быстрее, чем у других штаммов. У остальных штаммов, по-видимому, гидрофобные силы вносят примерно одинаковый вклад в прикрепление клеток к твердой поверхности.

В первые 24-48 ч инкубации бактерий в жидкой среде LB на поверхности пробирок или лунок планшетов формировались тонкие пленки, при микроскопии которых просматривались разрозненные клеточные агрегаты (микроколонии), легко смываемые при аспирации суспензий и промывании планшета или пробирки водой. Через 72-96 ч инкубации микроколонии сливались в достаточно прочную и плотную пленку с более ровной поверхностью.

С использованием окрашивания бактерий кристаллическим фиолетовым осуществлено сравнение биомассы в пленках (рис. 11), формируемых Sp245 и его мутантами за 96 ч на границе раздела фаз “жидкость (LB) - твердая гидрофильная поверхность (стекло)” и “жидкость (LB) - твердая гидрофобная поверхность (полистирол)”. На гидрофильной поверхности примерно равноценные биопленки КМ127, КМ134 и КМ348 (LpsI?) и КМ252 (Cal? LpsI?) лучше выражены, чем у штамма дикого типа. Возможно, это объясняется изменением заряда клеток названных мутантов вследствие утраты кислого ЛПСI. Толщина пленок, формируемых Sp245, KM124, KM134, KM139 и KM348 на гидрофобной среде, не имеет существенных различий, что согласуется с примерно одинаковой гидрофобностью их клеток. На поверхности полистирола Cal? LpsII? Mot? Swa?-мутант КМ018 и Cal? LpsI?-мутант КМ252 образуют более тонкие пленки. Общей характеристикой КМ018 и КМ252 является утрата ПССК. Биопленки, образуемые на гидрофобной и гидрофильной среде Cal? LpsI? LpsII?-мутантом Sp245.5, обладающим радикально измененной структурой клеточной поверхности, толще, чем у штамма Sp245 и его омегоновых мутантов (рис. 11).

Рис. 11. Относительное количество биомассы в пленках штаммов A. brasilense, формируемых на границе раздела: 1 - “жидкая LB - полистирол” (A₅₇₀) и 2 - “жидкая LB - стекло” (A₅₉₀), определенное в результате окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым.

У SK051 (leaky Fla? Laf? Mot? Gri⁺ Cal?) толщина пленок, формируемых как на стекле, так и на полистироле, была менее выраженной. Пример мутантов KM018 и SK051 показывает, что одновременное нарушение в продукции и функционировании жгутиков и синтезе полисахаридов приводит к тому, что клетки значительно хуже формируют биопленки как на гидрофильной, так и на гидрофобной поверхности. У Mot? Gri⁺-мутанта SK248 биопленки окрашиваются на уровне Sp245 как на стекле, так и на полистироле. Вероятно, в стационарной культуре полярный жгутик в большей степени определяет прикрепление бактерий к поверхности, а не подвижность клеток в составе пленки. У мутантов SK048 (Fla? Mot? Gri⁺) и SK454 (Fla? leaky Laf? Gri⁺) на стекле биопленки образуются хуже, чем у дикого типа. Однако на полистироле они, как и SK248, формируют биопленку на уровне Sp245.

Общий уровень выявления полисахаридных антигенных детерминант в биопленках (для сравнения количества антигенов использовали иммуноферментный анализ (ИФА), используя Ат на ЛПС Sp245), образуемых на гидрофобной поверхности Sp245 и мутантов KM127, KM134 и KM348, и KM252, различается несущественно. В то же время планктонные клетки этих LpsI?-мутантов взаимодействуют с антителами менее эффективно, чем Sp245. С учетом примерно равного количества биомассы (см. рис. 11) в биопленках Sp245 и KM127, KM134, KM348 можно предположить, что при взаимодействии с твердой поверхностью в клетках перечисленных мутантов активируется синтез полисахаридов. В случае штамма KM252 уровень продукции полисахаридов, очевидно, повышается в еще большей степени. Общее количество полисахаридных антигенов, продуцируемых LpsII?-мутантом KM139 в бульонной культуре и биопленках, значительно выше, чем у других штаммов. Различия в уровне продукции белковых антигенов, выявляемых в биопленках Sp245, KM127, KM139, KM252, KM348 и Sp245.5, не существенны. У мутантов KM018 и KM134 количество экспонированных белковых антигенов снижено по сравнению с другими штаммами; однако в случае KM018 это снижение коррелирует с меньшей толщиной биопленки.

В результате проделанной работы установлено, что сохраняющие жгутиковую подвижность LpsI?-штаммы образуют более толстые биопленки на гидрофильной поверхности. Мутанты с нарушениями в продукции ПССК формируют менее выраженные биопленки на твердой гидрофобной поверхности. Дефекты в продукции ПССК в совокупности с утратой жгутиковой подвижности негативно сказываются на способности азоспирилл к закреплению на гидрофобной и гидрофильной поверхности. Утрата LpsII при сохранении ПССК не приводит к изменениям в поведении мутантов на гидрофобной поверхности - по-видимому, за счет повышения уровня продукции других полисахаридов. Радикальная перестройка в структуре полисахаридных антигенов коррелирует с активизацией процесса формирования биопленок соответствующего мутанта (Sp245.5) на разнообразных поверхностях. Таким образом, липополисахариды и полисахариды, связывающие калькофлуор, участвуют в структурной организации биопленок азоспирилл на границе раздела фаз “водная среда - твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда - твердая гидрофобная поверхность”. Для формирования азоспириллами устойчивой биопленки продукция латеральных жгутиков, скорее всего, не является существенной. Мутанты Sp245, образующие биопленку со сходной биомассой, различаются по продукции Laf, например, KM018 (Cal? LpsII? Mot?) и SK051 (leaky Fla? Laf? Mot?) или SK048 (Fla? Mot?) и SK454 (Fla? leaky Laf?). В тоже время отсутствие полноценного полярного жгутика может существенно влиять на образование биопленок.

Как оказалось, спонтанные (как у мутанта Sp245.5) или индуцированные (как у штаммов KM018, KM127, KM134, KM139, KM252, KM348, SK048, SK248 и SK051) изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок.

3.13 Изменения в подвижности бактериальных клеток при их первичном контакте с потенциальным партнером на примере взаимодействия A. brasilense и базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray. При изучении свойств лектина, выделенного с поверхности мицелия базидиального ксилотрофа G. frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917, авторами была установлена его необычная углеводная специфичность к ОПС ЛПС A. brasilense Sp245 (Степанова с соавт., 2007), представляющему собой линейный D-рамнан (Fedonenko et al., 2002). Совместное культивирование G. frondosa 0917 с бактериями штамма A. brasilense Sp245 дикого типа или его мутантами по синтезу полисахаридов показало, что присутствие азоспирилл в кокультуре сказывалось на росте мицелия в целом положительно. Однако в случае совместной культуры со штаммами КМ018 и КМ139 зона первичного контакта по периметру подсева представлена характерным кольцом воздушного редкого мицелия. В случае штаммов КМ252 и КМ348 во всех опытах такая зона была более выраженной, что можно трактовать как более резкое проявление антагонизма. Это еще очевиднее, если сравнить указанные смешанные культуры с чистой (контрольной), морфологически однородной культурой гриба, а также с совместной культурой гриба с диким штаммом Sp245, которая по морфологии практически ничем не отличается от контрольной. Заметные различия в морфологии кокультур наблюдали в опытах с предобработкой растущих гиф препаратом ОПСI перед подсевом бактериальных культур, по сравнению с опытами по их совмещению без предобработки. Возможным объяснением наблюдаемых эффектов является блокировка лектина ОПСI, что в конечном итоге привело к временному затруднению в контакте гиф с бактериями. Но в процессе дальнейшего роста выработка лектина растущими гифами привела к распознаванию и более скорой “идентификации” штаммов Sp245, КМ018 и КМ139 по сравнению со штаммом КМ252 и КМ348, у которых зона противостояния гораздо ярче выражена, чем в остальных случаях.

Мицелиальный лектин G. frondosa 0917 замедляет индивидуальную подвижность клеток A. brasilense Sp245 (рис. 12). Исследование подвижности бактерий мутантов КМ139, КМ252 и КМ348 до и после их инкубации с лектином в концентрации 10 мкг/мл показало, что под влиянием лектина подвижность КМ139 замедляется. В случае КМ252 и КМ348 этого не происходит. Вероятно, лектин G. frondosa 0917 вызывает замедление индивидуальной подвижности азоспирилл только у тех штаммов, в ЛПС которых экспонирован ОПСI, являющийся гаптеном лектину.

Таким образом, штаммы A. brasilense Sp245, КМ018 и КМ139, в клеточной стенке которых экспонирован ОПСI, являющийся гаптеном грибного лектина, распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма. При этом лектин влияет на подвижность бактерий, что свидетельствует об участии специфических лектин-углеводных взаимодействий в первичном контакте мицелия G. frondosa и A. brasilense в процессе совместного культивирования. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина G. frondosa, “распознаются” грибом с наименьшим проявлением антагонизма.

3.14 Колонизация корней пшеницы A. brasilense с различиями в социальной подвижности. Исследована динамика колонизации корней пшеницы штаммом A. brasilense Sp245 и его Swa? Gri⁺-мутантами. Начальные этапы колонизации азоспириллами корневой системы растений зависят от способности бактерий перемещаться по направлению к корням растения (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000). Данное обстоятельство обусловило наш выбор условий инокуляции (с покачиванием инкубационных сосудов), обеспечивающих штамму дикого типа и его мутантам по жгутикованию и подвижности равные шансы на контакт с поверхностью корня. Через сутки после инокуляции определяли количество бактерий, “заякоривающихся” на корнях проростков. На седьмые сутки после инокуляции в корневой системе пшеницы увеличивается количество разветвленных корней, по сравнению с контрольными образцами, что служит индикатором позитивного влияния бактерий.

Рис. 12. Сравнительная характеристика подвижности разных штаммов A. brasilense в отсутствие лектина (1) и в присутствии 10 мкг/мл лектина G. frondosa 0917 (2).

В выбранных условиях после 3 ч инкубации суспензии бактерий с трехсуточными проростками количество бактерий, прикрепившихся к корням, стабилизировалось. Мутанты SK048, SK051 и SK454 имели сниженную по сравнению с Sp245 способность к адсорбции на корнях (рис. 13). Мы не обнаружили у штамма Sp245 и использованных мутантов различия в продукции или антигенной структуре поверхностных углеводных полимеров. Исключение представляет SK051, в отличие от других штаммов имеющий Cal? фенотип. Гидрофобность клеток дикого и мутантных штаммов существенно не различается. Таким образом, на этапе прикрепления к корням пшеницы клеток всех исследованных штаммов гидрофобные силы и полисахаридные компоненты клеточной поверхности, по-видимому, вносят примерно одинаковый вклад. Сниженная по сравнению со штаммом Sp245 способность клеток мутантов к адсорбции на корнях может быть обусловлена отсутствием у них Fla.

Рис.13. Динамика колонизации корней проростков пшеницы штаммами A. brasilense. а - количество КОЕ в гомогенатах корней в пересчете на одно растение. б - уровень связывания с гомогенатами корней антител на полисахаридные антигены Sp245 (Ат 1) и антител на белковые антигены (Ат 2), выявляемый ИФА. 1 - трехдневные проростки после 3 ч инкубации в суспензии бактерий; 2 - проростки через 24 ч после инокуляции; 3 - проростки через 7 суток после инокуляции.

Через сутки на корнях “заякоривалось” ~30% адсорбировавшихся клеток Sp245. В случае мутантов SK048, SK051 и SK454 на корнях остается, соответственно, ~59, 44 и 21% клеток (рис. 13). Высевы с 10-дневных проростков показали, что после “заякоривания” бактерий на растении численность популяций штамма Sp245 и его мутантов возрастает примерно в одинаковой степени (рис. 13). Наблюдаемое снижение численности азоспирилл на корнях растущих проростков можно объяснить миграцией в среду для выращивания растений части адсорбировавшихся клеток. Это предположение было подтверждено результатами высевов бактерий из сред после извлечения растений.

Таким образом, динамика колонизации проростков пшеницы мутантами и родительским штаммом свидетельствует о том, что после “заякоривания” клеток механизм распространения с образованием микроколоний (Gri⁺-фенотип) может достаточно эффективно обеспечить заселение бактериями растущих корней. Стоит отметить, что увеличение количества разветвленных корней у 10-дневных проростков, инокулированных клетками Sp245 или его мутантов, не зависит от количества бактерий, изначально адсорбировавшихся на растении.

Предположение о реализации у азоспирилл, заселяющих корни проростков пшеницы, механизма распространения с образованием микроколоний подтверждают микроскопические наблюдения. На этапе инокуляции в случае штамма Sp245 адсорбировавшиеся на корневых волосках бактерии располагались равномерно, без предпочтительного группирования в какой-либо зоне. В случае инокуляции штаммами SK048, SK051 и SK454 встречались корневые волоски, заселенные бактериями, располагающимися вдоль волоска в виде агрегатов. Уже через 24-48 ч после инокуляции растений клетки штамма Sp245 обнаруживались на корнях в виде агрегатов наряду с равномерно распределенными особями. На седьмые сутки агрегаты клеток, оставшихся на поверхности корня, образовывали скопления в случае проростков, заселенных как штаммом Sp245, так и мутантами SK048, SK051 и SK454.

Формирование азоспириллами агрегатов в процессе их распространения по корневой системе растения, вероятно, является следствием воздействия на бактериальную популяцию определенных внешних факторов. Например, в полужидких средах с агглютинином зародышей пшеницы часть популяции Sp245 переходит от роения к распространению с образованием микроколоний. Дополнительным стимулом, обеспечивающим переход бактерий к Gri-распространению in planta, может стать недостаток кислорода, поскольку в опытах in vitro предварительное культивирование в условиях дефицита кислорода приводило к увеличению количества Swa? Gri⁺-клонов в популяции клеток штамма Sp245.

Через неделю после инокуляции проростков пшеницы скопления клеток штамма Sp245 или его мутантов выявляли на поверхности корня и корневых волосков и при иммунофлуоресцентной микроскопии (рис. 14). Флуоресценция комплекса ФИТЦ-меченных Ат (ослиные антикроличьи Ат, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом) с антителами к полисахаридам штамма Sp245 (Ат 1) или антителами, выявляющими белковые структуры (Ат 2), наблюдалась на корнях отдельными светящимися участками. Комплекс Ат 1 или Ат 2 с ФИТЦ-меченными антителами позволил выявить бактерии, находящиеся в корневых волосках 10-дневных проростков, инокулированных как клетками штамма Sp245, так и SK048, SK051 или SK454 (рис. 14). На трехдневных проростках с только что адсорбированными клетками значительные скопления бактерий удалось визуализировать лишь при использовании антител к полисахаридам. При применении антител на бактериальные белковые антигены сигнал флуоресценции наблюдали только у редких групп бактерий среди большого количества клеток, адсорбировавшихся на поверхности корней трехдневных проростков. Таким образом, в случае прикрепившихся азоспирилл белковые структуры выявляются Ат 2 в меньшей степени, чем у бактерий, адаптировавшихся к существованию на растении. Необходимо отметить, что сигнала в контролях не наблюдали.

Рис.14. Иммунофлуоресцентная микроскопия корней проростков пшеницы через 7 суток после инокуляции культурами A. brasilense Sp245 и SK048. а, б, г, е - Sp245; в, д - SK048; ж - без инокуляции (контроль). а, б, в, ж - с антителами на полисахариды Sp245 (Ат 1); г, д - с антителами на белки (Ат 2); е - с антителами на полисахариды A. brasilense Sp7 (Ат 3) (контроль). 1 - проходящий свет. 2 - возбуждающий свет (494 нм). Стрелка указывает на скопление бактерий на одном из корневых волосков. Масштабные линейки соответствуют 10 мкм.

Таким образом, результаты иммунофлуоресцентной микроскопии свидетельствуют, что полисахаридные и белковые детерминанты могут участвовать в организации биопленок на корнях пшеницы, как и в случае образования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз “водная среда - твердая гидрофильная или гидрофобная поверхности”. По-видимому, бактериальные гликополимеры и белки обеспечивают не только прикрепление бактериальной биопленки к поверхности корня (Rodriguez-Navarro et al., 2007), но и участвуют в организации ее строения, вовлекая в этот процесс факторы растительного происхождения, в том числе, и способствующие переходу азоспирилл к микроколониальному распространению. Одной из стадий формирования биопленки и на стекле или полистироле также является образование клеточных агрегатов, но в дальнейшем микроколонии сливаются в единый слой клеток. Напротив, на поверхности корня после “заякоривания” бактерий их расположение в составе микроколоний преобладает.

Иммунофлуоресцентная микроскопия с антителами на антигены клеточной поверхности бактерий позволила выявить экспонированные полисахаридные или белковые детерминанты у азоспирилл, находящихся непосредственно на корне проростков пшеницы. Иммуноферментный анализ и параллельный подсчет КОЕ использовались для обнаружения возможных изменений в содержании полисахаридных и белковых антигенов при адаптации азоспирилл к существованию на корнях растений.

В ИФА с Ат 1 на клетках штаммов A. brasilense Sp245, SK048, SK051 и SK454 из культур, использованных для инокуляции растений, выявляется сходное количество полисахаридных детерминант. Какие-либо различия в иммунохимических характеристиках ЛПС исследованных штаммов азоспирилл также не были обнаружены. Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии инокулированных корней проростков пшеницы, подсчета КОЕ в гомогенатах инокулированных корней (рис. 13а) и ИФА этих же гомогенатов (рис. 13б) свидетельствуют о том, что в течение недели вариации в содержании полисахаридов, узнаваемых Ат 1, соответствуют изменениям в количестве заселивших корни клеток дикого и мутантных штаммов

Иммунохимический анализ белков, выделенных с поверхности клеток штамма Sp245 и его Fla? Swa? Gri⁺-мутанта SK048, распространяющихся в полужидком агаре, выявил один и тот же мажорный антиген в составе данных препаратов. При этом, в отличие от препарата Sp245, на иммуноэлектрофореграмме препарата SK048 наблюдается двойной пик, сформированный линиями преципитации, что может быть следствием существования двух изоформ соответствующего антигена. В ИФА с Ат 2 ночных культур бактерий, использованных для инокуляции растений, у штаммов Sp245 и SK051 выявляется примерно одинаковое, а у SK048 и SK454 незначимо меньшее количество экспонированных белковых детерминант. Незначительное увеличение количества белковых детерминант, экспонированных на клетках штаммов Sp245, SK048, SK051 и SK454 через 7 суток после инокуляции проростков пшеницы, статистически недостоверно (рис. 13б). Численность клеток штамма Sp245 на корнях за это же время снижается практически на порядок, а в случае мутантов SK048, SK051 и SK454 данный показатель сохраняется примерно на исходном уровне. Эти результаты являются косвенным свидетельством того, что при адаптации к корням растений в клетках штамма A. brasilense Sp245 заметно активизируется синтез белковых детерминант, узнаваемых Ат 2.

Таким образом, в настоящей работе нами подтверждены данные других авторов (Croes et al., 1993) о том, что у Fla?-мутантов A. brasilense, утративших филамент полярного жгутика, снижается способность к адсорбции на корнях пшеницы. Впервые показано, что после “заякоривания” на корнях клетки штамма A. brasilense Sp245 дикого типа и его Fla? Swa? Gri⁺-мутантов заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью. При этом образование микроколоний (клеточных агрегатов) на поверхности корней характерно как для штамма дикого типа, так и для его Fla? Swa? Gri⁺-мутантов. Установлено, что в процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Азоспириллы привлекают внимание исследователей коллективного поведения микроорганизмов в основном в качестве модели для изучения механизмов изменения характера жгутикования при переходе бактерий от свободного плавания к роению (Merino et al., 2006). Однако разнообразные проявления коллективного поведения микроорганизмов зависят не только от бактериальных систем, функционирование которых напрямую связано с поведенческим процессом (“ощущение кворума”, формирование биопленок, плодовых тел, роение, скольжение, тянущая подвижность и пр.), но и от факторов, способствующих наиболее успешной адаптации микроорганизмов к условиям их обитания (Олескин, 2000). Так, способность азоспирилл перемещаться в почве по направлению к корням растения и наличие у них чувствительной системы хемотаксиса обусловливают заселение бактериями растений (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000). Первые этапы взаимодействия бактерий с поверхностью корня опосредуют полисахариды, белки и полярный жгутик. Однако механизмы подвижности, позволяющие клеткам A. brasilense после закрепления на поверхности корня сформировать биопленку, и относительный вклад в этот процесс разнообразных полимеров клеточной поверхности у A. brasilense не известны.

Анализ генетических причин и физиологических последствий изменений в способах коллективного подвижности бактерий, архитектуре их клеточной поверхности оказался весьма интересной задачей и позволил расширить существующие представления о поведении азоспирилл. В своих исследованиях мы использовали созданную в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН уникальную коллекцию мутантов и спонтанных производных A. brasilense по признакам, связанным с продукцией поверхностных структур и функционированием систем, обеспечивающих бактериальную подвижность. Мы исследовали роль тех структур, которые первыми вступают во взаимодействие с окружающей средой и во многом определяют поведение микроорганизма: аппарат подвижности, полисахаридсодержащие полимеры и белки бактериальной поверхности.

Результаты настоящей работы позволили нам расширить существующие представления о роении азоспирилл. Так, нами показано, что, по крайней мере, у двух штаммов A. brasilense, Sp245 и S27, роение бактерий по полужидким средам, помимо латеральных флагелл, обеспечивает полярный жгутик. Получены новые экспериментальные подтверждения существенной роли межклеточных контактов в реализации роения азоспирилл. В случае роения 15 исследованных штаммов A. brasilense, двух штаммов A. irakense и двух штаммов A. lipoferum формирование межклеточных контактов обусловлено поверхностными структурами, взаимодействующими с конго красным.

Азоспириллы обладают потенциалом, повышающим скорость роения бактерий по агаризованным средам (Swa⁺⁺-фенотип). Ускоренное роение азоспирилл на полужидких средах может быть следствием изменений, затрагивающих механизмы, обеспечивающие вращение флагелл (получены мутанты и спонтанные производные A. brasilense Sp245, клетки которых двигаются быстрее особей родительского штамма) или изменений в продукции поверхностных полисахаридов (ряд мутантов A. brasilense Sp245 с изменениями в продукции полисахаридов имеет Swa⁺⁺-фенотип). Также возможно, что Swa⁺⁺-фенотип обусловлен снижением или возрастанием уровня продукции бактериальных факторов, регулирующих социальное поведение азоспирилл или изменением систем “рецепции”, воспринимающих эти факторы.

Наблюдения за поведением ряда Swa?-мутантов штамма A. brasilense Sp245 позволили нам выявить скрытый потенциал, обеспечивающий распространение азоспирилл по полужидким средам. Клетки мутантов длительное время остаются в точке инокуляции (Swa?-фенотип), а затем начинают перемещаться, формируя диски, состоящие из клеточных агрегатов - Gri⁺-распространение. Способ распространения с образованием микроколоний не связан с какими-либо общими дефектами в продукции полисахаридов, локализованных на клеточной поверхности. Более того, межклеточные взаимодействия, обусловленные поверхностными структурами бактериальной клетки, важны для реализации Gri⁺-распространения.

Изучение морфологии клеток Gri⁺-мутантов и их подвижности в полужидком агаре позволяет полагать, что, реализуя механизм распространения с образованием микроколоний, бактерии не используют жгутики. При этом на одном из полюсов клеток Gri⁺-мутантов обнаружен пучок пилей. Необходимо отметить, что пучок пилей был также обнаружен на полюсе клеток и у штамма Sp245. Вероятно, продукция на полюсе клетки либо вращающегося Fla, либо пилей являются альтернативными состояниями вегетативных клеток азоспирилл.

В популяции клеток A. brasilense Sp245 с низкой частотой появляются клоны, распространяющиеся с образованием Gri⁺-колоний (3Ч10?³), и неподвижные клоны (5Ч10?²). Частота появления Gri⁺-клонов слегка возрастает (до 1Ч10?²) в результате преинкубации Sp245 без аэрации. Клоны Sp245 со спонтанным Gri⁺- или Swa? Gri?-фенотипом оказались нестабильными, а Swa⁺-фенотип доминировал в популяции. Охарактеризованная нами впервые фенотипическая диссоциация азоспирилл по признаку подвижности клеток в гелеобразных средах подтверждена результатами анализа диссоциативного спектра популяций, вырастающих после рассева цистоподобных покоящихся клеток на плотных средах (работы сотрудников Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва). Авторами (Погорелова с соавт., 2009) показано, что диссоцианты A. brasilense Sp7 или Sp245 помимо колониально-морфологических признаков различались в способах распространения в полужидких средах (отмечены Swa⁺-, Swa?Gri?- и Swa⁺ Gri⁺-фенотипы).

Подавление роения бактерий рода Azospirillum (показано для 15 исследованных штаммов A. brasilense дикого типа, 2-х штаммов A. irakense и 2-х штаммов A. lipoferum) и стабильное проявление у них способности к распространению с образованием микроколоний может быть индуцировано адсорбцией на клетках “прижизненного” красителя конго красного. Модификации экстраклеточных соединений, которые бактерии используют для реализации социальной подвижности, могут способствовать переходу от Gri-распространения к роению в присутствии конго красного.

Появление среди клеток Gri⁺-мутанта, формирующих агрегаты на полужидком агаре, субпопуляции бактерий с восстановленной способностью к роению сопровождается возобновлением продукции полярного жгутика. Такие производные приобретают устойчивый фенотип Swa⁺⁺. Субпопуляция особей, обладающих повышенной скоростью миграции, возникает и в популяции роящихся клеток. Вероятно, у A. brasilense существует либо механизм запуска экспрессии систем, необходимых для ускоренного движения бактерий, либо быстро двигающиеся особи, изначально присутствующие в популяции, формируют Swa⁺⁺-субпопуляцию в ответ на внешние или внутрипопуляционные стимулы.

Нами показано, что скорость перемещения азоспирилл снижается в присутствии специфических антител на липополисахариды. Снижение скорости движения клеток, обусловленное взаимодействием антител на ЛПС с полярным жгутиком (чехлом) и возникновением на линии фронта движущихся бактерий иммунных агрегатов, тормозящих распространение азоспирилл в полужидком агаре, позволяет рассматривать антитела как модулирующий фактор, усиливающий межклеточные контакты, обусловленные взаимодействиями с участием полисахаридов.

Результаты настоящей работы позволили впервые описать роль межклеточных контактов, обусловленных взаимодействиями гемагглютинина и О-специфического полисахарида в распространении азоспирилл, использующих для движения жгутики. Подобные взаимодействия бактерий модулируются, в частности, в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода.

Штамм A. brasilense Sp245, являющийся модельным объектом наших исследований, содержит плазмиды р85, р120 и три плазмиды с молекулярной массой >300 МДа (Кацы, 1992). Поскольку плазмиды составляют весомую долю генома A. brasilense, закономерен интерес к выяснению роли этих ДНК в обеспечении поведения бактерий (Кацы, 2002а). Ранее нами было продемонстрировано, что в плазмидах р85 и р120 находятся локусы, инсерционный мутагенез которых приводит к Fla?, Mot? и Laf?-фенотипу мутантов (Shelud'ko et al., 1998; Шелудько, 2000; Кацы, 2002б). Результаты, представленные в настоящей работе, свидетельствуют, что интеграция вектора pJFF350 в плазмиду р85 приводит к разным фенотипическим проявлениям: к утрате способности клеток синтезировать функционирующие флагеллы и, как следствие, к Swa?-фенотипу или к появлению бактерий с ускоренным роением. Стоит отметить, что при включении pJFF350 в ДНК p85 отсутствует строгая сайт-специфичность. В случае вставки Omegon-Km в плазмиду р120 нарушается не только продукция и функционирование жгутиков (Swa?-фенотип), но и изменяются свойства поверхностных полисахаридов. При этом у ряда мутантов изменения в синтезе полисахаридов сопровождаются повышением скорости роения. Необходимо отметить, что, утратив способность к роению, мутанты с инсерциями, локализованными в р85 или р120, сохраняют способность к распространению с образованием микроколоний.

Переход от Gri⁺-распространения (BK759G) к Swa⁺⁺-подвижности (BK759P) сопровождается исчезновением р85 и появлением новой плазмиды с молекулярной массой 36 МДа. Вероятно, для функционирования генов, обеспечивающих Gri-распространение, присутствие в геноме репликона р85 является существенным. Так, ряд Swa? Gri?-мутантов штамма Sp245 утратили р85, а у мутанта Sp245.5 (утрачены 85- и 120-МДа репликоны) поведение клеток в полужидких средах не изменяется в присутствии конго красного, способствующего переходу азоспирилл к Gri⁺-подвижности. Swa? Gri?-фенотип наблюдается и в тех случаях, когда транспозон встраивается в хромосомную ДНК.

Интересным оказалось то, что эффективность распространения в полужидких средах клеток A. brasilense BK759Р (Swa⁺⁺-производного мутанта BK759G) сопоставима со скоростью роения ВК468 и ВК571. Однако молекулярно-генетический анализ показал, что за проявление Swa⁺⁺-фенотипа у мутантов, по-видимому, отвечают множество локусов, гомологичные фрагментам ДНК р85 или р120, несущим информацию о продукции флагелл или полисахаридов Sp245. Таким образом, переход от Gri⁺-распространения клеток мутанта BK759G к Swa⁺⁺-подвижности (BK759P) сопровождается перестройкой генома, затрагивающей плазмиды, а возрастание скорости коллективного роения бактерий, по-видимому, обуславливают несколько генетических локусов A. brasilense Sp245.

Одним из возможных объяснений неоднозначности данных о роли p85 в обеспечении подвижности может быть не истинная элиминация плазмиды из клетки, а интеграция этой плазмиды или локусов fla/laf/swa/gri в другие репликоны. Не исключено, что интеграцию обуславливают мобильные элементы, обнаруженные в составе р85 (Katsy, Prilipov, 2009). В секвенированном фрагменте ДНК p85 A. brasilense нами обнаружены гены, продукты экспрессии некоторых из которых, по-видимому, могут опосредовать поведенческие реакции бактерий. Так, продукт orf293 обладает значимым сходством с HdfR. HdfR известен как репрессор транскрипции мастер-оперона flhDC, продукты которого необходимы для экспрессии остальных флагеллярных генов у E. coli и других бактерий (Ko, Park, 2000). Рядом с hdfR в р85 выявлен ccoN - ген каталитической субъединицы I цитохромоксидазы, являющейся интегральным белком цитоплазматической мембраны. Эта кодируемая p85 56-кДа субъединица содержит участки и каталитические центры, достаточные для работы фермента в качестве протонной помпы. Трансмембранный протонный потенциал, в частности, используется как источник энергии для вращения бактериальных флагелл.

Локализация охарактеризованного комплекса генов в р85 A. brasilense Sp245 недалеко от IS-элементов ISAzba1 и ISAzba2 свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов, что может сказываться на поведении бактерий. Оказалось, что у двух спонтанных Swa⁺⁺-производных (Sp245.P1 и Sp245.P5) ПЦР с парой праймеров, специфичных к 3'-концу гена hdfR, давали негативные результаты. Таким образом, спонтанные перестройки, приводящие к появлению Swa⁺⁺-вариантов, в ряде случаев сопровождаются утратой или модификацией гена hdfR, локализованного в p85. Стоит еще раз отметить, что рядом с hdfR в р85 локализован ccoN. Таким образом, выявленное нами спонтанное изменение первичной структуры исследуемого района 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245 может влиять на экспрессию генов hdfR и ccoN и, как следствие, на появление субпопуляций азоспирилл с ускоренным роением.

Результаты проделанной работы свидетельствуют, что на полужидких средах подвижные клетки бактерий рода Azospirillum способны переходить от плавания или роения к неподвижному состоянию, распространению с образованием микроколоний или ускоренному роению. Подобное многообразие способов коллективной подвижности бактерий описано только у P. aeruginosa (Kohler et al., 2000). Возникает вопрос, в каких условиях азоспириллы используют потенциал, предоставляемый тем или иным типом подвижности.

Такие аминокислоты, как аспарагиновая кислота, серин или треонин, способствовали индукции Gri⁺-подвижности у A. brasilense Sp245. В случае роения, Swa⁺-, Swa⁺⁺- или Gri⁺-подвижности спектр аминокислот, влияющих на эффективность распространения бактерий, различен. Вероятно, это имеет определенное значение в процессе адаптации азоспирилл к существованию в симбиозе с растениями, поскольку состав корневых экссудатов (преимущественное содержание в экссудатах той или иной аминокислоты) может определять преобладание того или иного фенотипа подвижности. По нашим наблюдениям, корневые экссудаты проростков пшеницы стимулируют роение клеток A. brasilense Sp245 по пока непонятному механизму и способствуют переходу неподвижных или Gri⁺-клонов к роению.

В настоящей работе нами впервые показано, что лектины со сродством к остаткам N-ацетил-в-D-глюкозамина (WGA или STA) наиболее заметно влияют и на коллективную подвижность Sp245, стимулируя переход части популяции к распространению в полужидких средах с образованием микроколоний. Мы предполагаем, что в присутствии лектинов со сродством к остаткам N-ацетил-в-D-глюкозамина переход азоспирилл от Swa⁺-подвижности к Gri⁺-распространению является следствием снижения подвижности бактерий при помощи жгутиков и возможных изменений межклеточных взаимодействий, необходимых для роения.

Интересными оказались результаты, свидетельствующие, что специфические взаимодействия лектинов различного происхождения с клетками A. brasilense влияют на скорость движения бактерий. В конечном итоге это сказывается на контакте бактерий с целостным организмом, продуцирующим лектин. В настоящей работе с использованием мутантов Sp245 по образованию ЛПС установлено, что лектин G. frondosa, как и фитолектины, оказывает тормозящее влияние на движение A. brasilense, но при условии сохранения на поверхности азоспирилл специфического гаптена - ОПСI. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина G. frondosa (в природе A. brasilense и G. frondosa занимают разные экологические ниши), “распознаются” грибом с наименьшим проявлением антагонизма. Данная находка, на наш взгляд, позволяет использовать результаты влияния лектинов на скорость движения бактерий для прогнозирования развития взаимодействий между организмами.

Изучение такого проявления социального поведения микробов как формирование биопленок позволило нам впервые охарактеризовать некоторые структуры, участвующие в данном процессе у азоспирилл. Показано, что в структурной организации биопленок азоспирилл на границе раздела фаз “водная среда - твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда - твердая гидрофобная поверхность” участвуют липополисахариды и полисахариды, связывающие калькофлуор. Как оказалось, спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок. Организация биопленок на корнях пшеницы происходит при участии полисахаридных и белковых детерминант бактериальной поверхности. По-видимому, бактериальные гликополимеры и белки обеспечивают не только прикрепление бактериальной биопленки к поверхности корня, но и участвуют в организации ее строения, вовлекая в этот процесс факторы растительного происхождения. Одной из стадий формирования биопленки и на стекле или полистироле является образование клеточных агрегатов, но в дальнейшем микроколонии сливаются в единый слой клеток. Напротив, на поверхности корня после “заякоривания” бактерий их расположение в составе микроколоний преобладает. В настоящей работе нами впервые показано, что после “заякоривания” на корнях клетки штамма A. brasilense Sp245 дикого типа и его Fla? Swa? Gri⁺-мутантов заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью. Установлено, что в процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

Разработанные в рамках настоящего исследования методические приемы позволили предложить тест, основанный на ингибировании подвижности азоспирилл антителами на поверхностные бактериальные структуры или лектинами различного происхождения. Тест может быть использован для определения серологического родства бактерий и исследования экспонированных углеводных и белковых детерминант в составе поверхности интактных клеток.

В ходе выполнения работы открылись новые перспективы для дальнейших исследований. Так, обнаружение таких фактов, как модулирующее действие корневых экссудатов и фитолектинов на социальную подвижность азоспирилл, активация синтеза белковых детерминант у бактерий, формирующих биопленку на корнях пшеницы, дает возможность для развития исследований, направленных на выяснение механизмов обмена сигналами между партнерами ассоциативного симбиоза.

Автор надеется, что выполненная работа послужит основой для продолжения изучения механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Данное исследование может найти дальнейшее практическое применение при конструировании бактерий, перспективных для использования в биотехнологии.

ВЫВОДЫ

1. В полужидких средах микроколониальное распространение A. brasilense Sp245 не зависит от работы жгутиков и происходит при участии поверхностных структур бактериальной клетки, способных адсорбирировать “прижизненный” краситель конго красный. Адсорбция на клетках конго красного приводит к подавлению роения азоспирилл и стабильному проявлению у них способности к распространению с образованием микроколоний.

2. Эффективность зависящего от работы жгутиков роения A. brasilense Sp245 определяется не только скоростью движения клеток, но и свойствами и составом поверхностных полисахаридов этих бактерий.

3. Межклеточные контакты бактерий A. brasilense Sp245, распространяющихся по полужидким средам, опосредованы взаимодействиями белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Подобные взаимодействия бактерий модулируются в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода.

4. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил-в-D-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток A. brasilense к распространению с образованием микроколоний. Источники азота, недостаток кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы оказывают модулирующее действие на зависящие от работы жгутиков скорость движения клеток и роение бактерий.

5. Определенные генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма A. brasilense Sp245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и социальной подвижности азоспирилл. На подвижность клеток могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в р85 генов hdfR - негативного регулятора транскрипции жгутикового мастер-оперона flhDC и ccoN - каталитической субъединицы I цитохромоксидазы.

6. Спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245, приводящие к дефектам в образовании липополисахаридов, полисахаридов, связывающих калькофлуор, и полярного жгутика, оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Перечисленные компоненты клеток азоспирилл участвуют в организации биопленок A. brasilense на границе раздела фаз “водная среда - твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда - твердая гидрофобная поверхность”.

7. После “заякоривания” на корнях пшеницы клетки штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов, распространяющихся с образованием микроколоний, заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью, формируя клеточные агрегаты. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

8. Специфические взаимодействия чужеродных лектинов с клетками A. brasilense влияют на скорость движения бактерий, что сказывается на контакте с организмом, продуцирующим лектин. Так, бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина базидиомицета Grifola frondosa, “распознаются” грибом с наименьшим проявлением антагонизма.

9. Ингибирование подвижности азоспирилл антителами на поверхностные бактериальные структуры или лектинами различного происхождения может быть использовано в качестве теста, позволяющего оценивать серологическое родство бактерий и исследовать степень экспонированности углеводных и белковых компонентов в составе поверхности интактных клеток.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ:

orf - открытая рамка считывания; ORF - белковый продукт orf; p85 - 85-МДа плазмида штамма A. brasilense Sp245; p120 - 120-МДа плазмида штамма A. brasilense Sp245; ЛПС, LPS - липополисахарид; ОПС - О-специфический полисахарид; ПССК - полисахариды, связывающие калькофлуор; ЛПБК - липополисахарид-белковый комплекс; ПСЛК - полисахарид-липидный комплекс; Cal⁺/Cal? - адсорбция/отсутствие адсорбции калькофлуора; Fla - полярный жгутик; Fla⁺/Fla? - наличие/отсутствие полярного жгутика; Mot⁺/Mot? - подвижность/отсутствие подвижности в жидких средах; Laf - латеральные жгутики; Laf⁺/Laf? - наличие/отсутствие латеральных жгутиков; Bfp - пучок пилей; Swa⁺/Swa? - наличие/отсутствие роения бактерий; Swa⁺⁺ - ускоренное роение; Gri⁺ - распространение бактерий в полужидкой среде с образованием микроколоний; LB - среда Luria-Bertani; MSM - малатно-солевая среда; MPSS - среда для нитратредукции; ФСБ - фосфатно-солевой буфер; ИФА - твердофазный непрямой иммуноферментный анализ; КОЕ - колониеобразующие еденицы; BSA - бычий сывороточный альбумин; ConA - конканавалин А (Canavalia ensiformis); PHA-P - фитогемагглютинин-P (Phaseolus vulgaris); STA - агглютинин клубней картофеля (Solanum tuberosum); UEAII - лектин из утесника обыкновенного (Ulex europaeus); WGA - агглютинин зародышей пшеницы (Triticum vulgaris).