Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий Аzospirillum Вrasilense

3.4 Влияние продуктов бактериального метаболизма на социальную подвижность азоспирилл. Получены косвенные данные, что характер и эффективность распространения азоспирилл в полужидких средах обусловлены продуцируемыми бактериями метаболитами. Так между макроколониями азоспирилл остаются незарастающие зоны (демаркационные зоны) (например, рис. 3). В местах сближения границ фронтов движущихся бактерий форма колонии искажается. Образование незарастающих зон происходит независимо от состава среды. Столкновение фронтов движущихся бактерий может быть обусловлено ингибирующим действием метаболитов, выделяемых микроорганизмами, концентрация которых удваивается в зоне сближения колоний (Иваницкий, 1999). Выделяемые азоспириллами какие-либо ингибиторы могут способствовать перемещению клеток из точки инокуляции (как при Swa-, так и при Gri-подвижности), а также препятствовать сближению микроколоний при Gri-распространении. Их действие на медленно движущиеся клетки Gri⁺-мутантов будет мешать сближению бактерий, что может способствовать образованию клеточных агрегатов, состоящих из сохраняющих межклеточные связи потомков изолированных друг от друга особей.

3.5 Влияние модификаций клеточной поверхности, вызванных адсорбцией прижизненного красителя конго красного, на подвижность азоспирилл. Механизмы, обусловливающие вариации в коллективной подвижности бактерий, зависят не только от работы двигательных органелл, но и от межклеточных взаимодействий (Harshey, 2003), которые определяются структурой бактериальной поверхности. По-видимому, изменения в структуре бактериальной поверхности могут быть индуцированы адсорбцией на клетках прижизненных красителей. Так, углеводсодержащие полимеры A. brasilense способны к образованию комплексов с конго красным (Skvortsov, Ignatov, 1998). В результате на плотной среде с красителем колонии азоспирилл приобретают красную окраску (Bastarrachea et al., 1988). Следует отметить, что конго красный может взаимодействовать и с белковыми компонентами поверхности бактерий (Hammar et al., 1995).

При определении способности к адсорбции конго красного штаммом Sp245, его Swa⁺⁺-производными и неспособными к роению мутантами строгой корреляции между интенсивностью адсорбции красителя бактериями, инкубируемыми на плотной среде с красителем, и размером и морфологией колоний, образующихся в полужидкой MSM, нами не выявлено. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в жидких 24-часовых культурах A. brasilense Sp245 в MSM без красителя или с конго красным (37.5 мкг/мл), было практически одинаковым. Выращенные в жидкой MSM, содержащей 37.5 мкг/мл красителя, клетки обладали внешне нормальным Fla. При культивировании в жидкой MSM, содержащей конго красный (но не при добавлении красителя к выросшей культуре), скорость движения клеток, за исключением клонов CRP (см. ниже), снижалась (табл. 2).

Таблица 2. Средняя скорость движения клеток штамма A. brasilense Sp245 и его производных, выращенных в жидкой или полужидкой среде

Примечание: *Концентрация конго красного составляла 37.5 мкг/мл.

На полужидкой MSM, содержащей конго красный, штаммы Sp245, Sp245.Р1-Sp245.P5 и BK570 радикально меняли свое поведение и начинали мигрировать с образованием микроколоний (рис. 4б) через 24 ч после инокуляции (без красителя движение начиналось через 2.5-5 ч). Макроколонии названных штаммов имели светло-красную окраску. В случае мутантов SK048, SK051, SK248 и SK454 конго красный не влиял на продолжительность фазы (~24-42 ч), предшествующей началу Gri-распространения.

Выделены производные Sp245 (Sp245.CRP) и Sp245.Р1 (Sp245.Р1.CRP1-Sp245.Р1.CRP4), способные к роению и в присутствии красителя. При этом зоны роения, в отличие от светло-красных Gri⁺ -макроколоний, приобретали в полужидкой среде оранжевую окраску.

Рис. 4. Колонии, образованные A. brasilense Sp245 в полужидкой MSM: без конго красного (а), с 37.5 мкг/мл конго красного (б); световая микроскопия макроколоний с панели б (в). Содержание агара 0.4%, время инкубации 72 ч. Масштабная линейка соответствует 10 мкм (в).

На плотной MSM CRP-варианты адсорбировали конго красный по-разному: колонии Sp245.CRP и Sp245.P1.CRP1 были светло-розовыми, а Sp245.P1.CRP2 - ярко-красными. Иными словами, изменение плотности среды и/или концентрации кислорода и/или локальной концентрации бактерий влияло на структуру клеточной поверхности азоспирилл, взаимодействующей с красителем. Диаметр колец роения, образуемых штаммами Sp245.P1.CRP(1-4) и Sp245.CRP в полужидкой MSM, был примерно на 32% меньше, чем таковой у Sp245. В присутствии 37.5 мкг/мл конго красного диаметр колец роения Sp245.CRP и Sp245.P1.CRP(1-4) уменьшался. Скорость движения клеток Sp245, Sp245.CRP и Sp245.P1.CRP в жидкой MSM без красителя была практически одинаковой (табл. 2). При выращивании бактерий в жидкой среде с конго красным скорость перемещения клеток Sp245.CRP и Sp245.P1.CRP, в отличие от таковой у штамма дикого типа и его суперроящихся производных, почти не снижалась (табл. 2). По-видимому, варианты Sp245.CRP и Sp245.Р1.CRP способны преодолевать ингибирующее действие конго красного за счет модификации экстраклеточных соединений, образующих комплексы с красителем. Стоит отметить, что модификации экстраклеточных соединений в случае роящихся в присутствии конго красного производных Sp245.P1, возможно, затрагивают структуры, связанные с Fla, поскольку скорость движения клеток Sp245.P1.CRP1 и Sp245.P1.CRP2 ниже, чем у родительского варианта. Это могут быть изменения в гликозильной части флагеллина или в его полисахаридном чехлике.

Было изучено влияние разных концентраций конго красного на коллективную подвижность в полужидкой MSM штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов. Обнаружен переход Sp245 и BK570 от образования концентрических колец роения (при концентрации конго красного, не превышающей 2.3 мкг/мл) через макроколонии смешанного мутно-зернистого фенотипа (в присутствии 2.3-9.3 мкг/мл конго красного) к распространению с образованием микроколоний (при концентрации красителя выше 9.3 мкг/мл). У SK051, SK248 и SK454 на средах с конго красным отмечено замедление коллективной подвижности и сохранение зернистой морфологии макроколоний.

Скорости движения одиночных клеток штамма Sp245, выращенных в жидкой MSM с конго красным или в полужидкой MSM с 0.3-0.4% агара, различались мало (табл. 2). На полужидких средах без конго красного, независимо от содержания агара и степени торможения клеток, культуры Sp245 формировали концентрические кольца роения. Зернистые макроколонии Sp245 образовывались только в присутствии красителя. Вероятно, Sp245 продуцирует, по меньшей мере, два соединения, взаимодействующие с конго красным и способствующие коллективной миграции бактерий. Если конго красный блокирует соединение, необходимое для роения клеток, у бактерий снижается подвижность, обеспечиваемая жгутиками, и индуцируется Gri⁺-фенотип. Второе из соединений, возможно образующее менее прочный или менее специфичный комплекс с красителем, может быть необходимым как для роения, так и для распространения азоспирилл с образованием микроколоний. Слабое взаимодействие конго красного со вторым соединением приводит к небольшому снижению скорости Gri⁺-распространения бактерий. Когда первое соединение заблокировано, другие компоненты клеточной поверхности могут восполнить недостающие функции (например, в результате повышения уровня продукции), помочь клеткам преодолеть ингибирующее действие конго красного и возобновить роение (если жгутиковый аппарат клеток не поврежден в результате мутации).

Описана способность поверхностных полимеров поверхности клеток A. brasilense Sp245 адсорбировать конго красный. Так, смещение длинноволнового максимума поглощения конго красного, свидетельствующее о формировании комплекса (Wood, 1980), в случае добавления к раствору красителя липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК) штамма Sp245 составляло 19 нм, а в случае добавления кислых полисахаридов (ПС), выделенных из полисахарид-липидного комплекса (ПСЛК) этого штамма, - 5 нм (Коннова, 2002). Смещение максимума поглощения можно наблюдать не только при добавлении к раствору красителя препаратов бактериальных полимеров, но и в том случае, если конго красный адсорбирован на поверхности интактных клеток (Weimer et al., 1998). По нашим наблюдениям смещение максимума поглощения конго, накопленного клетками штамма Sp245, составляет 19.4±1.8 нм, что сопоставимо с показателем, свидетельствующим о формировании комплекса красителя с ЛПБК штамма Sp245.

Бактерии рода Azospirillum способны к ассоциативному взаимодействию с чрезвычайно широким кругом растений. При колонизации корней растений часто происходит образование микроколоний азоспирилл посредством неизученных механизмов (Burdman et al., 2000). Формирование зернистых дисков на средах с конго красным наблюдалось у 15 исследованных штаммов A. brasilense (Cd, KR77, S17, S27, Sp7, Sp107, Sp245, SpBr14, SR8, SR15, SR55, SR75, SR80, UQ1794, UQ1796) дикого типа, у 2-х штаммов A. irakense (KA3, KBC1) и 2-х штаммов A. lipoferum (Sp59b, SpRG20a), независимо от их происхождения или различий в скорости роения на среде без красителя. Отсутствие перехода к Gri-распространению отмечалось у штаммов A. halopraeferans AU4 и A. lipoferum SpRG6xx.

3.6 Роль полисахаридов клеточной поверхности в реализации социальной подвижности A. brasilense. Выше показано, что азокраситель конго красный осуществляет роль модулирующего фактора, нарушающего контакты между бактериями. Вероятно, природа взаимодействий, определяющих такие контакты азоспирилл, может определяться поверхностными полисахаридами.

3.6.1 Изменения в подвижности у cal и lps мутантов A. brasilense Sp245. Анализ поведения на полужидких средах нескольких классов cal и lps мутантов Sp245 показал, что наиболее существенно изменилось поведение на агаризованных средах спонтанного мутанта Cal? LpsI? LpsII? Sp245.5. В полужидкой среде клетки Sp245.5 формируют “диффузную” колонию, тогда как бактерии дикого типа образуют четко очерченный диск. В случае мутанта фронт движущихся бактерий в отличие от дикого типа характеризуется несколько меньшей плотностью клеток. Размер колоний, сформированных за 36 ч подвижными клетками Sp245.5 на MSM (0.4% агара), превышает таковой у Sp245 и составляет соответственно штамму 26.1±0.8 и 21.8±0.8 мм. Интересно, что у мутанта скорость движения клеток в жидких средах (обеспечиваемая активностью Fla) ниже, чем у дикого типа (17.1±0.8 и 29.0±1.1 мкм/с, соответственно). В присутствии конго красного распространяющиеся клетки Sp245.5, в отличие от Sp245, сохраняют морфологию колоний, наблюдаемую на среде без красителя. Таким образом, последствиями существенных изменений в свойствах поверхностных полисахаридов могут быть изменения межклеточных контактов, опосредуемых либо полисахарид-полисахаридными взаимодействиями, либо связями полисахаридов с белковыми или липидными компонентами бактериальной поверхности.

Если мутация приводит к изменениям, затрагивающим свойства одного или двух полисахаридов, столь радикальных изменений в поведении клеток, как у Sp245.5, не наблюдается. Клетки омегоновых мутантов штамма Sp245, относящихся к классам Cal? LpsI? (КМ252), LpsI? (КМ127, КМ134, КМ348) и LpsII? (КМ139), распространяются по полужидким средам, формируя колонии, морфология которых характерна для родительского штамма. Однако у КМ127, КМ134, КМ348 и КМ139 диаметры колоний превышают размер колоний Sp245. Скорость плавания клеток у КМ127, КМ134, КМ348 и КМ139 не отличается от скорости движения Sp245. В случае КМ252 отличия в скорости распространения по полужидким средам незначительны. Стоит отметить, что у клеток КМ252 наряду с утратой LpsI произошли изменения в синтезе ПССК.

3.6.2 Подвижность A. brasilense в присутствии поликлональных антител на полисахариды и флагеллин. Антитела можно рассматривать как модулирующий фактор, усиливающий или ингибирующий межклеточные взаимодействия, обусловленные поверхностными структурами бактерий. Проведено исследование подвижности различных штаммов в присутствии штаммоспецифичных антител (Ат) на ЛПС штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7, а также Ат на флагеллин типового штамма Sp7. Диаграмма зависимости процента подвижных клеток и средней скорости подвижных клеток Sp245 от концентрации штаммоспецифичных Ат на ЛПС (рис. 5) показала, что увеличение концентрации Ат приводило к полному прекращению движения бактерий. Снижение скорости движения подвижных клеток в присутствии Ат, а также визуально наблюдаемые при этом резкие остановки свободно плавающих клеток A. brasilense или переход от поступательного движения клеток к кувырканию позволили заключить, что подавление движения вызвано взаимодействием антител с полярным жгутиком бактерий, покрытым чехлом, в состав которого входят ЛПС. Добавление как Ат на флагеллин, так и Ат на ЛПС другого штамма, не приводило к такому эффекту (табл. 3).

Таблица 3. Влияние антител различной специфичности на процентное содержание подвижных клеток A. brasilense и их скорость движения

Примечание: Концентрация всех использованных в экспериментах антител составляла 1 мг/мл.

Последнее послужило отправной точкой для разработки серологического теста, заключающегося в ингибировании подвижности бактерий вида A. brasilense при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител на ЛПС. О специфичности взаимодействия антител с бактерями в данном тесте судили, оценивая подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа и определяя скорость движения у случайно выбранных подвижных клеток. В серии экспериментов по исследованию подвижности клеток 11 штаммов А. brasilense (Sp7, Cd, SR55, SR80, Sp245, S17, S27, SR15, SR75, Sp107 и SR8) в присутствии Ат на ЛПС определены штаммы, показывающие антигенные перекресты с Sp7 или Sp245. Выявлена корреляция между наличием антигенных перекрестов в реакции иммунодиффузии и снижением процента подвижных клеток и их скорости в присутствии Ат на ЛПС Sp7 или Sp245 у штаммов Sp7, Cd, SR55, SR80 или Sp245, S17, S27, SR15, SR75. ЛПС штаммов Sp245 и Sp107 в тесте иммунодиффузии демонстририровали лишь минорные антигенные различия, свидетельствующие о том, что в составе ОПСI штамма Sp107 отсутствуют некие антигенные детерминанты, присутствующие в составе ОПСI штамма Sp245. Вследствие этого Ат на ЛПС Sp245 (в концентрации, ингибирующей подвижность клеток данного штамма) лишь незначительно изменяли подвижность клеток Sp107 в жидкой и полужидкой средах. Ингибирующий эффект достигался увеличением концентрации Ат на ЛПС Sp245, поскольку это приводило к увеличению количества Ат на общие для Sp245 и Sp107 детерминанты. Таким образом, тест на ингибирование подвижности бактериальных клеток в присутствии Ат может быть информативным при исследовании углеводных антигенных детерминант, представленных в составе клеточной поверхности.

Рис. 5. Зависимость средней скорости движения клеток (1) и процента подвижных клеток (2) A. brasilense Sp245 от концентрации Ат на ЛПС данного штамма.

Штаммоспецифические Ат на ЛПС (в отличие от Ат на флагеллин) также снижали скорость распространения Sp245 или Sp7 в полужидких средах. Размер бактериальных колоний в присутствии штаммоспецифических Ат на ЛПС значительно уступал их диаметру в контрольных экспериментах. Мутант Sp245.5 с полностью измененным ЛПС сохранял диаметр колец роения в присутствии Ат на ЛПС Sp245. Таким образом, снижение скорости движения клеток, обусловленное взаимодействием Ат на ЛПС с полярным жгутиком (чехлом) и возникновением на линии фронта движущихся бактерий иммунных агрегатов, тормозящих распространение азоспирилл в полужидком агаре, позволяет рассматривать антитела как модулирующий фактор, усиливающий межклеточные контакты, обусловленные взаимодействиями с участием полисахаридов. Говоря о межклеточных контактах, обусловленных взаимодействиями с участием полисахаридов, необходимо отметить, что агрегацию клеток азоспирилл в жидкой культуре опосредуют взаимодействия полисахаридов и белков-гемагглютининов (Никитина с соавт. 1994, 2001). Возможно, при колонизации полужидких сред аналогичные лектин-углеводные взаимодействия обеспечивают контакты между движущимися клетками.

3.7 Влияние поверхностного гемагглютинина A. brasilense Sp245 на социальную подвижность этих бактерий. Уровень продукции полисахаридов и активность гемагглютининов азоспирилл изменяются в зависимости от наличия в среде связанного азота и его химической природы (Yagoda-Shagam et al., 1988; Никитина с соавт., 2005), что в свою очередь может влиять на формирование межклеточных контактов. Изучение подвижности A. brasilense показало, что в аэробных условиях на полужидких средах без источника связанного азота клетки штамма Sp245 формируют макроколонии, превышающие диаметр колоний, образованных в присутствии аммония, нитрата или нитрита (рис. 6).

Рис.6. Характеристика колоний, формируемых

A. brasilense Sp245 после точечной инокуляции суспензии клеток в полужидкие среды, содержащие разные источники азота (1 г/л). а - на средах с концентрацией агара 0.2, 0.4 или 0.6%. (1 - без связанного азота; (2-4) в присутствии: 2 - NH₄Cl, 3 - KNO₃, 4 - KNO₂). Время инкубации - 36 ч. б - на средах, содержащих 0.4% агара (1 - диаметр колоний на поверхности агара; 2 - диаметр колоний в толще агара). Время инкубации - 36 ч и 72 ч.

На среде без азота через 36 ч после инокуляции бактерии распространяются в 3.7 раза быстрее в толще среды, чем по ее поверхности, а в присутствии аммония, нитрата или нитрита эти различия составляют только 1.4-1.6 раза (рис. 6б). Вероятно, азоспириллы, будучи микроаэрофилами (Tarrand et al., 1978), в отсутствие азота преимущественно формируют колонию в микронише, благоприятной для работы нитрогеназы. Присутствие связанного азота, в том числе, и его накопление при азотфиксации (например, к 72 ч инкубации) способствует развитию колонии на поверхности среды. На средах с 0.2-0.4% агара в ряду “аммоний-нитрат-нитрит” наблюдается уменьшение размера колоний (рис. 6а, б). Максимальный диаметр колоний на полужидкой MSM (0.4% агара), содержащей хлорид аммония или нитрат калия, не зависит от концентрации соли в диапазоне 1-3 г/л. Изменение концентрации аммония или нитрата в среде выращивания не влияет на скорость индивидуального движения клеток штамма Sp245 в жидкой среде. Так, при концентрации солей 1 или 3 г/л скорость индивидуального движения клеток, соответственно, составляет 28.6±1.5 и 28.6±1.4 мкм/с в присутствии аммония и 29.9±1.5 и 29.8±1.4 мкм/с в присутствии нитрата. Скорость движения клеток, выросших на среде с нитритом, несколько уменьшается с увеличением его концентрации. Клетки, выросшие в присутствии 1 г/л или 3 г/л нитрита, двигаются, соответственно, со скоростью 24.4±1.2 или 22.4±1.4 мкм/с. Однако диаметр колоний в сходных условиях не изменяется.

Таким образом, на MSM, содержащей 0.2-0.4 % агара и аммоний, нитрат или нитрит, скорость движения отдельных клеток - не единственный показатель, определяющий размер колоний. Возможно, присутствующий в среде источник азота влияет на взаимодействия, определяющие контакты между перемещающимися бактериями, что сказывается на диаметре колоний. На средах с 0.6% агара роль взаимодействий, модулируемых источником азота, становится не столь существенной, очевидно, в результате того, что клетки на более плотных средах между собой находятся в более тесном контакте.

Агглютинацию трипсинизированных эритроцитов вызывают жидкие бактериальные культуры Sp245, выросшие в стационарных условиях на среде с 1 г/л хлорида аммония, суспензии клеток этих культур в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и культуральная жидкость, освобожденная от бактерий. Во всех случаях титр реакции агглютинации составил 1:4. Обработанные в течение 8 ч трипсином клетки штамма Sp245 утрачивали способность агглютинировать трипсинизированные эритроциты. На проявление агглютинирующей активности бактерий в отношении нативных эритроцитов, несущих белковые рецепторы, чувствительные к трипсину, влияют мутации в синтезе полисахаридов. В суспензиях клеток в ФСБ, выросших в жидкой MSM с аммонием, у мутантов КМ252 (LpsI? Cal?) и КМ348 (LpsI?) титр реакции агглютинации составил, как и у Sp245, 1:16. У мутантов КМ139 (LpsII?) и Sp245.5 (LpsI? LpsII? Cal?) титр реакции гемагглютинации, соответственно, составил 1:4 и 1:32. Не исключено, что у мутантов различия в гемагглютинирующей активности обусловлены не только разной структурой полисахаридов, но и разным влиянием последних на активность гемагглютининов.

Способность культур штамма Sp245 вызывать агглютинацию эритроцитов изменяется в зависимости от источника связанного азота в среде выращивания бактерий. Титр агглютинации трипсинизированных эритроцитов жидкими культурами Sp245, выросшими в стационарных условиях на среде с 1 г/л нитрита или нитрата калия, составил 1:16, а в случае 1 г/л хлорида аммония - 1:4. Изменение содержания хлорида аммония в среде выращивания (1, 3 или 0.05 г/л) не влияло на агглютинирующие свойства культур Sp245.

В случае Sp245 повышение гемагглютинирующей активности бактерий и уменьшение диаметра “колец роения” в средах с нитратом или нитритом позволяют полагать, что размер сформированных подвижными клетками колоний может зависеть от поверхностных структур, опосредующих гемагглютинацию. Не исключено, что существует связь между способностью поверхностных полимеров, участвующих в формировании межклеточных взаимодействий, вызывать агглютинацию эритроцитов и влиять на подвижность бактерий.

Добавление к суспензии клеток Sp245 гемагглютинина (ГА), выделенного с поверхности клеток этого штамма, приводит к заметному снижению скорости движения бактерий в жидких средах (рис. 7). Эффект сохраняется более 30 мин инкубации. Присутствие ЛПС, ЛПБК или ПСЛК не сказывается на подвижности бактерий. Исследование подвижности мутантов Sp245 с нарушениями в продукции полисахаридов в присутствии ГА показало, что он не влияет на подвижность клеток мутанта Sp245.5 с кардинальной перестройкой в структуре полисахаридов. ГА вызывает незначительное снижение скорости движения мутантов КМ252 и КМ348, (ОПСI?), и замедляет движение клеток мутанта КМ139 (ОПСII?) (рис. 7).

Предварительная инкубация ГА с ЛПС, ЛПБК и ОПСI приводит к ингибированию его воздействия на скорость движения клеток. В присутствии ПСЛК или ОПСII действие ГА на скорость движения бактерий на 9.3 или 12.6% менее эффективно в сравнении с незаблокированным белком (рис. 7). У штамма Sp245 в состав ЛПС, ЛПБК и ПСЛК входят сходные моносахариды и антигены, идентичные таковым у ОПСI (Коннова с соавт., 2005). Результаты измерения скорости движения мутантов и данные ингибиторного анализа позволяют говорить о значительном сродстве ГА к ЛПС Sp245. Моносахариды рамноза, глюкоза, галактоза и глюкозамин, входящие в состав ЛПС, ЛПБК или ПСЛК, не блокируют действие ГА на подвижность. Следует отметить, что рамноза находилась в L-форме. В тоже время ОПСI и ОПСII, представляющие собой линейные D-рамнаны (Федоненко с соавт., 2004), подавляют (в разной степени) влияние ГА на скорость движения бактерий Sp245. Степень сродства ГА к ОПС, скорее всего, обусловлена конформацией и зарядом последнего. Так, кислый ОПСI полностью снимает эффект воздействия ГА на подвижность клеток Sp245, а нейтральный ОПСII ингибирует данную активность ГА только на 12.6%. При этом отсутствие ОПСII у мутанта КМ139 не позволяет ГА вызвать снижение скорости движения клеток мутанта с той же эффективностью, что и у штамма дикого типа (рис. 7).

Только в случае мутанта Sp245.5, утратившего ОПС, содержащий D-рамнан, подвижность клеток не изменялась в присутствии ГА. В полужидких средах Sp245.5 формирует “диффузные” колонии, тогда как бактерии дикого типа образуют четко очерченные кольца. Образование “диффузных” колоний происходит, несмотря на то, что в ФСБ гемагглютинирующая активность суспензии клеток Sp245.5 вдвое превышает таковую у Sp245 (1:32 у мутанта и 1:16 у родительского штамма). Необходимо отметить, что результаты определениия специфичности ГА Sp245 (лаборатория микробиологии ИБФРМ РАН) ингибированием углеводами реакции гемагглютинации согласуются с данными влияния ГА на подвижность бактерий.

Рис. 7. Влияние полимеров, выделенных с поверхности клеток штамма Sp245, на подвижность A. brasilense в жидких средах.

а - скорость движения клеток разных штаммов азоспирилл в: 1 - ФСБ; 2 - ФСБ + ГА. Концентрация ГА - 5 мкг/мл. Время инкубации - 1 мин.

б - скорость движения клеток штамма Sp245 в: 1 - ФСБ; 2 - ФСБ + ЛПС, 3 - ФСБ + ЛПБК, 4 - ФСБ + ПСЛК, 5 - ФСБ + ОПСI, 6 - ФСБ + ОПСII. Концентрация полисахаридов - 50 мкг/мл. Время инкубации - 1 мин.

Из литературных данных известно, что контакты бактерий, распространяющихся по агаризованной среде, опосредованы белковыми структурами и ЛПС. Так, у бактерий M. xanthus углевод-белковые взаимодействия необходимы для коллективного, скоординированного скольжения клеток и формирования структур надклеточного уровня (при агрегации и споруляции) (Bowden et al., 1998; Will et al., 1998). Результаты настоящей работы позволили впервые описать роль межклеточных контактов, обусловленных взаимодействиями ГА и ОПС в распространении азоспирилл - бактерий, использующих для движения жгутики. Подобные взаимодействия бактерий модулируются, в частности, в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода, что, в свою очередь, может иметь значение при бактериальной колонизации корневой системы растения.

3.8 Молекулярно-генетическая характеристика мутантов A. brasilense Sp245 по социальной подвижности. В таблице 1 представлена молекулярно-генетическая характеристика Fla, Laf, Mot, Swa и Gri -мутантов A. brasilense Sp245, полученных с помощью Omegon-Km и Tn5-Mob-мутагенеза. Характеристика основана на результатах ECL-гибридизации ДНК мутантов с меченными пероксидазой зондами, содержащими ДНК транспозонов или векторов для мутагенеза и анализа плазмидного состава по методу Eckhardt (1978). Штамм A. brasilense Sp245 содержит плазмиды р85 (с молекулярной массой 85-МДа), р120 (120-МДа) и три плазмиды с молекулярной массой >300 МДа (Кацы, 1992). Поскольку плазмиды составляют весомую долю генома A. brasilense, закономерен интерес к роли этих внехромосомных элементов в обеспечении поведения бактерий (Кацы, 2002а).

Образование коинтегратов векторов для мутагенеза с р85 приводит как к утрате способности клеток синтезировать функционирующие флагеллы, так и к появлению бактерий с ускоренным роением. В случае инсерций омегона в р120 нарушается не только продукция и функционирование жгутиков, но и изменяются свойства поверхностных полисахаридов. Среди этих мутантов с нарушениями синтеза ЛПС ряд клонов демонстрируют Swa⁺⁺-фенотип.

Анализ плазмидного состава штаммов A. brasilense ВК759G (Gri⁺-фенотип) и ВК759Р (Swa⁺⁺-фенотип) показал, что различия в подвижности Gri⁺-мутанта и его Swa⁺⁺-производного согласуются с плазмидной перестройкой. Из плазмидного профиля ВК759Р исчезает р85 и появляется новая плазмида с молекулярной массой 36 МДа. Можно предположить, что новый 36-МДа репликон, обнаруженный в геноме ВК759Р, сохраняет локусы, необходимые для ускоренного роения, а генетические элементы, необходимые для Gri-распространения либо элиминированы, либо их интеграция в другие репликоны клетки затрудняет/блокирует их экспрессию.

Гибридизация ВаmНI- и XhoI-переваров тотальной ДНК Sp245 и его мутантов ВК468, ВК571, ВК759Р и ВК759G с ДНК вектора pJFF350 и различными зондами (табл. 4) позволила более подробно исследовать вышеуказанную перестройку. Результаты гибридизации показали, что переход ВК759G от распространения с образованием микроколоний к ускоренному роению (ВК759Р) сопровождается изменениями длин фрагментов рестрикции тотальной ДНК, гибридизующихся с фрагментами р85 и р120. Эффективность распространения в полужидких средах клеток BK759Р сопоставима со скоростью роения ВК468 и ВК571 (Swa⁺⁺-фенотип). Однако картина гибридизации pJFF350, фрагментов р85 и р120 с ДНК этих трех Swa⁺⁺-штаммов различается (табл. 4). Таким образом, переход от Gri⁺-распространения клеток мутанта BK759G к Swa⁺⁺-подвижности (BK759P) сопровождается перестройкой генома, затрагивающей плазмиды, а возрастание скорости коллективного роения бактерий, по-видимому, обуславливают несколько генетических локусов A. brasilense Sp245.

Таблица 4. Полиморфизм длин фрагментов рестрикции тотальной ДНК A. brasilense Sp245 и его мутантов, гибридизующихся с фрагментами р85 и р120

Примечание: Зонды: 1 - 2.4-т.п.н. EcoRI-фрагмент р85, несущий локусы fla, laf, mot; 2 - 1.1-т.п.н. EcoRI-фрагмент р85, несущий локус swa⁺⁺; 3 - 14-т.п.н. BamHI-фрагмент, несущий локусы p120 lpsI, lpsII и cal; 4 - 8.3-т.п.н. BamHI-фрагмент, несущий локусы p120 fla, swa. Н.о. - не определяли.

Вероятно, для функционирования генов, обеспечивающих подвижность бактерий с образованием микроколоний, присутствие в геноме репликона р85 является существенным. Например, у трех Swa? Gri?-мутантов штамма Sp245 с различными нарушениями в продукции и функционировании жгутиков, KZ019, KZ044 и KZ020, исследование плазмидного профиля показало утрату р85 (табл. 1).

В случае сохранивших р85 мутантов штамма Sp245 с похожими дефектами в продукции и функционировании флагелл (BK759G, SK039, SK237 или SK454) утрата способности к роению компенсируется Gri⁺-распространением. У мутанта Sp245.5 (утрачены р85 и р120) поведение клеток в полужидких средах не изменяется в присутствии конго красного, способствующего переходу азоспирилл к Gri-подвижности. В настоящей работе представлены два мутанта Sp245, содержащие коинтеграт p85::pJFF350, дефектные по жгутикованию или подвижности: SK051 и SK248. Несмотря на интеграцию pJFF350 в плазмиду с молекулярной массой 85 МДа, SK051 и SK248 сохраняют способность к Gri⁺-распространению. Таким образом, прослеживается некоторая зависимость между отсутствием в экстрахромосомном состоянии р85 у клеток мутантов с измененными Fla и/или Laf системами и потерей ими способности к распространению с образованием микроколоний. Стоит отметить, что утрата подвижности наблюдается и в тех случаях, когда транспозон встраивается в хромосомную ДНК (мутанты SK531 (Fla? Laf? Mot?) и SK586 (Fla? leaky Laf?)).

Данные о роли генетических локусов p85 в обеспечении подвижности неоднозначны. Так, подвижность в жидких и полужидких средах у ряда исследованных ранее производных Sp245, утративших р85, не отличаются от таковых у родительского штамма (Кацы с соавт., 1994). Одним из возможных объяснений неоднозначности данных о роли p85 в обеспечении подвижности может быть не истинная элиминация плазмиды из клетки, а интеграция этой плазмиды или локусов fla/laf/swa/gri в другие репликоны. Не исключено, что интеграцию обуславливают мобильные элементы, обнаруженные в составе р85 (Katsy, Prilipov, 2009). Так, в случае мутанта SK248 слияние pJFF350 и p85, опосредованное ISAzba1 и ISAzba2 (Katsy, Prilipov, 2009), приводит к утрате способности клеток двигаться при помощи жгутиков (Mot? Swa?-фенотип). Следует отметить, что динамическая организация района р85, примыкающего к ISAzba1 и ISAzba2, может сказываться на экспрессии генов расположенных вблизи от IS-элементов. Далее мы охарактеризовали ряд обнаруженных в ДНК р85 A. brasilense генов, продукты экспрессии некоторых из которых, по-видимому, могут опосредовать поведенческие реакции бактерий.

Физико-генетическая карта секвенированного сегмента р85 A. brasilense Sp245 из рекомбинантной плазмиды pEK248X приведена на рис. 8.

Рис.8. Физико-генетическая карта сегмента 85-МДа плазмиды A.brasilense Sp245, клонированного в составе pEK248X. Горизонтальными стрелками обозначены кодирующие последовательности и направление их транскрипции. Названия генов приведены под схемой. Сайты рестрикции: X - XhoI; E - EcoRI. Горизонтальной линией выделен EcoRI-фрагмент длиной 2.4 т.п.н., использованный как зонд в реакциях блоттинг-гибридизации ДНК. Двунаправленными стрелками показаны целевые участки ПЦР-амплификации ДНК с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Масштабная линейка над картой соответствует 1 т.п.н.

В результате анализа нуклеотидной последовательности XhoI-фрагмента p85, клонированного в составе плазмиды pEK248X, были идентифицированы гены norCBQD и nirK, важные для осуществления денитрификации.

Рядом с nirK локализованы orf208 и orf181. В ORF181 обнаружены два гемэритриновых домена. Полагают, что бактериальный гемэритрин является регулятором ответа на NO (Strube et al., 2007), играет значимую роль при попадании организмов в условия лимитации по кислороду, будучи его накопителем (Strube et al., 2007), и опосредует анаэротактис бактерий в качестве кислородного сенсора (Isaza et al., 2006).

В секвенированном фрагменте p85 обнаружена также orf293, кодирующая регулятор транскрипции семейства LysR из 293 аминокислотных звеньев. Регуляторы LysR участвуют в контроле транскрипции разнообразных генов, в том числе, в условиях кислородного стресса. ORF293 обладает значимым сходством с HdfR из Paracoccus denitrificans, Erwinia carotovora, E. coli, Shigella flexneri и других бактерий. HdfR известен как репрессор транскрипции мастер-оперона flhDC, продукты которого необходимы для экспрессии остальных флагеллярных генов у E. coli и других бактерий (Ko, Park, 2000).

Многие бактерии адаптируются к микроаэрофильным условиям, благодаря образованию цитохром c оксидазы cbb₃-типа, кодируемой опероном ccoNOQP. Ген ccoN впервые выявлен нами в плазмидной ДНК азоспирилл. Кодируемая p85 каталитическая субъединица I (CcoN) цитохром c оксидазы обладает свойствами, достаточными для работы фермента в качестве протонной помпы. Трансмембранный протонный потенциал, в частности, используется как источник энергии для вращения бактериальных жгутиков (Скулачев, 1989).

В секвенированном сегменте p85 обнаружен ген metC. В случае E. coli metC-мутанты, дефектные по синтезу гомоцистеина, имели более высокий уровень экспрессии гена флавогемоглобина (hmp), индуцируемого NO (Membrillo-Hernбndez et al., 1998). Продукт orf164, по-видимому, не связан с процессами денитрификации или регуляции метаболизма в ответ на оксиды азота и редокс-статус клетки.

Локализация охарактеризованного комплекса генов в р85 Sp245 недалеко от IS-элементов ISAzba1 и ISAzba2 (рис. 8) свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов, что может сказываться на поведении бактерий. Так у спонтанного мутанта Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой исчезновение p85 и одного из двух фрагментов тотальной ДНК, гомологичных 2.4-т.п.н. EcoRI-фрагменту p85, содержащему, как выяснилось, часть гена nirK, а также orf208 и orf181, сопровождалось утратой способности бактерий к нитритредукции (Кацы, 2002б). Скорость движения клеток Sp245.5 в жидкой среде сильно редуцирована.

Не исключено, что появление спонтанных Swa⁺⁺-производных (Sp245.P1-Sp245.P5) обусловлено изменениями в структуре ДНК р85, затрагивающими комплекс генов, расположенный недалеко от IS элементов ISAzba1 и ISAzba2. Использован метод ПЦР-амплификации на ДНК названных штаммов целевых районов р85 с парами специфических прямых и обратных праймеров к генам nirK-orf208, hdfR, hdfR-ccoN, ccoN-metC и orf414 (рис. 8). ПЦР с парой праймеров, специфичных к 3'-концу гена hdfR (у Sp245 продукт амплификации имеет длину 411 п.н.), давали негативные результаты на ДНК из суперроящихся штаммов Sp245.P1 и Sp245.P5. Таким образом, спонтанные перестройки, приводящие к появлению Swa⁺⁺-вариантов, в ряде случаев сопровождаются утратой или существенной модификацией гена hdfR, локализованного в p85.

Известно, что на активность транскрипции генов может влиять общая структура окружающей ДНК, особенно степень ее суперспирализации. Эта структура модулирует, а иногда и определяет силу промоторов (Perez-Martin et al., 1994). Возможно, мы имеем дело именно с таким случаем, а интеграция в p85 вектора pJFF350 является препятствием для осуществления на должном уровне подобной регуляции экспрессии ряда генов p85. В пользу данного предположения говорит тот факт, что у мутанта SK051 вектор pJFF350 интегрировал в тот же сайт p85, что и у мутанта SK248. Различия между двумя коинтегратами p85::pJFF350 заключаются лишь в утрате примерно 1.5 т.п.н. ДНК вектора из коинтеграта, образовавшегося в клетках штамма SK051. Фенотип у мутантов A. brasilense SK051 и SK248 разный.

3.9 Подвижность A. brasilense Sp245 в лабораторных средах разного состава. Возникает вопрос, в каких условиях азоспириллы используют потенциал, предоставляемый тем или иным типом подвижности. Выявление факторов внешней среды, способствующих доминированию одного из способов распространения, интересно с точки зрения изучения механизмов адаптации азоспирилл к обитанию в разнообразных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.

Проведено сравнение скорости плавания и особенностей социальной подвижности в присутствии солей аммония, нитратов или нитритов у A. brasilense Sp245 и его спонтанных Swa⁺⁺-вариантов Sp245.P, у двух из которых утрачен ген hdfR. В жидкой среде для нитратредукции (MPSS) с нитратом калия клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5, выросшие в условиях интенсивной аэрации, как и в случае MSM с аммонием (см. табл. 2), плавали значительно быстрее, чем особи Sp245. При замене нитрата на нитрит у Sp245 и Sp245.P3 подвижность подавлялась, а у Sp245.P1 и Sp245.P5 скорость движения практически не снижалась. У бактерий, выращенных в условиях недостатка кислорода в жидкой MPSS, скорость движения клеток Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 снижается, не зависит от источника азота и близка к показателю, характерному для Sp245 в сходных условиях в присутствии нитрата. Однако у Sp245 при замене нитрата на нитрит при недостатке кислорода клетки плавают медленнее.

Диаметр колоний, формируемых в полужидкой MSM всеми исследованными штаммами, максимален в отсутствие солей азота в среде и снижается при добавлении солей азота (1 г/л) в ряду “NH₄Cl > KNO₃ > KNO₂”. При этом на среде MSM с KNO₂ все исследованные варианты Sp245.P утрачивают способность к Swa⁺⁺-распространению. Однако на полужидкой среде MPSS, отличающейся от MSM более богатым составом (добавлен пептон, 5 г/л) и содержащей сукцинат вместо малата, штамм Sp245.P5 оказывается менее чувствительным к токсическому действию нитрита и сохраняет Swa⁺⁺-фенотип. Измерение скорости движения клеток на полужидкой MPSS показало, что на среде с нитратом клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 двигаются быстрее родительского штамма. На среде с нитритом скорость движения клеток падает у Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245, а межштаммовые различия нивелируются. В случае штамма Sp245.P5 замена нитрата на нитрит не влияет на подвижность клеток.

Таким образом, выявлены различия в поведении спонтанных вариантов Sp245.P с изменениями в структуре p85, имеющих одинаковый Swa⁺⁺-фенотип в присутствии молекулярного азота или хлорида аммония, при замене источников азота в среде на нитрат или нитрит.

Переходы в способах распространения у Sp245 при использовании богатых полужидких сред MPSS или LB выявить не удалось. Возможно, в случае использования среды, насыщенной ростовыми факторами, доля клеток с Gri-распространением мала, поскольку в среде могут находиться факторы, значительно увеличивающие число роящихся бактерий. В результате поток роящихся азоспирилл не позволяет наблюдать особи, формирующие агрегаты. В связи с этим предположением интересны наблюдения за поведением Sp245 на средах, в которых один и тот же субстрат может быть источником углерода и азота, например, аминокислот. В присутствии малата и аммония, или без них диаметры макроколоний не различаются как в случае Sp245, так и BK570, SK048 или SK454. Самые крупные макроколонии выявляются у Sp245, но не у BK570 и SK048, при добавлении в среду аланина или триптофана. Пролин стимулирует роение BK570. В случае SK048 и SK454 ни одна из 18 исследованных аминокислот не способствовала увеличению скорости Gri-подвижности. Снижение скорости распространения происходит в присутствии аспарагина, аспарагиновой кислоты или треонина как в случае Swa-, так и Gri-подвижности (у Sp245, BK570, SK048 и SK454). Гистидин, глутамин, валин, метионин или пролин блокировали подвижность SK048 и SK454. Таким образом, в случае Swa?, Swa⁺⁺ или Gri⁺-подвижности набор аминокислот, влияющих на эффективность распространения бактерий, различен. Вероятно, это имеет определенное значение в процессе адаптации азоспирилл к существованию в симбиозе с растениями, поскольку состав корневых экссудатов (преимущественное содержание в составе той или иной аминокислоты) может определять преобладание того или иного фенотипа подвижности.

В случае Sp245 аспарагиновая кислота, серин или треонин способствовали индукции Gri⁺-подвижности. Интересен тот факт, что аминокислоты, которые влияют на проявление Gri⁺ фенотипа у Sp245, не стимулируют скорость движения Gri⁺-мутантов SK048 или SK454. Более того, на среде с аспарагиновой кислотой и треонином колонии SK048 и SK454 мельче. Вероятно, факторы, способствующие переходу клеток к Gri-подвижности, и факторы, активизирующие скорость мигрирующих подобным образом бактерий, различаются.

3.10 Социальная подвижность A. brasilense в присутствии корневых экссудатов пшеницы. Исследовано влияние корневых экссудатов пшеницы (к/э) на характер/эффективность подвижности азоспирилл. Установлено, что диаметр колоний, сформированных Sp245 на полужидкой MSM (0.4% агара) с добавлением к/э 10-дневных проростков пшеницы, значительно превышает контрольный. У роящегося мутанта KM252 с изменениями в синтезе полисахаридов размер колоний в присутствии к/э возрастает, но различия не столь существенны, как у родительского штамма. В то же время, у Swa⁺⁺-мутантов ВК468, ВК571 и ВК759Р увеличения размера колоний в присутствии к/э не происходит. При этом к/э не оказывают существенного влияния на скорость роста бактериальных культур. Различий в скоростях движения клеток, выросших в жидких средах с к/э, и без них также не наблюдается. Анализ гетерогенности популяции азоспирилл в способах распространения в полужидких средах показал, что присутствие к/э способствует доминированию в популяции Sp245 роящихся клонов. Так, после 48 ч инкубации (MSM + среда для растений) 81% колоний Sp245 имели Swa⁺-фенотип, 18.3% Swa?- и 0.7% Gri⁺-фенотип. На MSM + к/э 100% колоний Sp245 были Swa⁺. В случае мутантов КМ018 и ВК759G добавление к/э способствовало возрастанию частоты перехода к роящимся вариантам.

Вероятно, на полужидких средах в присутствии к/э повышается эффективность коллективного распространения клеток Sp245. При этом к/э не влияют на скорость индивидуального движения клеток за счет активности полярного жгутика, как в случае Sp245, так и в случае Swa⁺⁺-мутантов ВК468, ВК571, BK759P, роение которых не зависит от присутствия к/э. Интересно, что экссудаты способствуют доминированию Swa⁺-клонов или уменьшению числа Swa? и Gri⁺-клонов, встречающихся в популяции Sp245, КМ018 и ВК759G. Вероятно, к/э проростков пшеницы способны оказывать модулирующее действие на механизмы/системы, обеспечивающие скоординированную подвижность A. brasilense Sp245 в полужидких средах. При этом поведение Swa⁺⁺-производных Sp245, клетки которых двигаются со скоростью, близкой к скорости, наблюдаемой у родительского штамма, не зависит от присутствия корневых экссудатов. Возможно, эффект обусловлен тем, что у мутантов системы, обеспечивающие скоординированную подвижность, максимально антивны и дополнительный сигнал, индуцируемый наличием в среде к/э, в этом случае не является столь значимым.

Можно предположить, что в составе к/э присутствуют компоненты, “имитирующие” действие внутрипопуляционных бактериальных факторов (Teplitski et al., 2000), регулирующих социальное поведение азаспирилл. При этом клетки Swa⁺⁺-мутантов не воспринимают сигнал либо из-за высокого уровня продукции собственного регулятора или в результате изменения системы “рецепции”. Добавление к/э пшеницы в среду для роста бактерий приводит к изменению соотношения моносахаридов в составе экзополисахаридов и электрофоретического профиля ЛПС A. brasilense Cd (Fischer et al., 2003). Не исключено, что к/э модифицируют какие-либо поверхностные полимеры Sp245, участвующие в формировании контактов между бактериями, перемещающимися в полужидкой среде, а в случае Swa⁺⁺-мутантов эти изменения не являются существенными. Так, в случае LpsI? Cal?-мутанта KM252 корневые выделения, присутствующие в среде, лишь незначительно стимулируют роение, тогда как клетки родительского штамма перемещаются в два раза быстрее. Таким образом, корневые экссудаты проростков пшеницы стимулируют роение клеток A. brasilense Sp245 по непонятному механизму и способствуют переходу неподвижных или Gri⁺-клонов к роению.

3.11 Подвижность A. brasilense в присутствии растительных лектинов, обладающих разной специфичностью. Известно, что взаимодействие компонентов поверхности азоспирилл, содержащих остатки N-ацетил-в-D-глюкозамина, с агглютинином зародышей пшеницы (WGA) может опосредовать ранние этапы формирования растительно-бактериальных ассоциаций и индуцировать соответствующие изменения в метаболизме бактерий (Антонюк, 2005). Так как двигательная активность бактерий важна для формирования их симбиозов с растениями (Кацы, 2003), интересно выяснить, оказывают ли фитолектины влияние на этот аспект поведения азоспирилл.

3.11.1 Скорость плавания A. brasilense в присутствии лектинов растений. В присутствии WGA, агглютинина клубней картофеля (STA) или лектина из утесника обыкновенного (UEAII), обладающих сродством к N-ацетил-в-D-глюкозамину или его олигомерам, скорость плавания клеток штамма Sp245 снижалась (рис. 9).