Разработка и усовершенствование технологий получения микробиологических питательных основ и сред

Из данных таб.6 видно, что разработанный гидролизат обладал высокой чувствительностью по отношению к штаммам, относящимся к различным таксономическим группам и не уступал по качеству соевому гидролизату фирмы "Merck".

Разработка защищена патентом №2295249. Промышленный выпуск сухого гидролизата сои позволит расширить ассортимент коммерческих питательных сред на его основе.

При внедрении технологии получения экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) по способу, предложенному рядом авторов (Л.Б. Бендас, Б.М. Раскин, А.К. Баранова, 1974; А.К. Баранова, 1978) выявлены следующие недостатки: длительность процесса фильтрации и невысокая степень прозрачности растворов препаратов. С целью их устранения проведен комплекс исследований по усовершенствованию технологии получения экстракта кормовых дрожжей.

Таблица 6. Сравнительные показатели чувствительности жидкой среды на основе созданного гидролизата сои при культивировании различных тест-штаммов

Тест-штаммы	Разработанный гидролизат сои	Соевый гидролизат фирмы "Merck" (контроль)
	чувствитель-ность	время инкубации посевов (ч)	чувствитель-ность	время инкубации посевов (ч)
S. pyogenes Dick 1	10-4	36-40	10-4	36-40
E. faecalis 775	10-6	20-22	10-6	20-22
S. epidermidis ATCC 14990	10-6	20-22	10-6	20-22
S. entericaTyphi H901	10-6	20-22	10-6	20-22
S. flexneri 1a 8516	10-6	18-20	10-6	18-20
S. aureus Wood-46	10-6	20-22	10-6	20-22
S. enterica Typhimurium 79	10-6	18-20	10-6	18-20
C. albicans 885	10-6	40-48	10-6	40-48
B. cereus 2010	10-6	18-20	10-6	18-20
C. xerosis 1911	10-6	36-48	10-6	36-40
S. sonnei S-form	10-6	18-20	10-6	18-20
L. monocytogenes 56	10-6	20-24	10-6	20-24
P. aeruginosa 27/99	10-7	18-20	10-7	18-20
E. coli 3912/41 (O55: K59)	10-7	18-20	10-7	18-20
K. pneumoniae 3534	10-7	18-20	10-7	18-20
E. aerogenes 1006	10-7	18-20	10-7	18-20

Для удаления основной массы взвешенных частиц использовали метод отстаивания, который обычно применяют в качестве первичного процесса разделения неоднородных систем. Установлено, что в течение 18-24 ч происходило полное расслоение экстракта на уплотненный осадок и осветленную жидкость, которая представляла собой тонкодисперсную систему. Для очистки экстракта от мелкодисперсных частиц использовали гель фосфата кальция. Известно, что он снимает заряд коллоидных частиц, в результате чего между частицами возникают силы сцепления, приводящие к образованию крупных пористых частиц и процесс разделения существенно ускоряется (Я.Я. Шкоп, Н.В. Фомченко, 1981). Нами определены оптимальные концентрации хлористого кальция и фосфорнокислого натрия, обеспечивающие образование геля фосфата кальция в количестве достаточном для коагуляции частиц дисперсной фазы (3-4г Na₂HPO₄ и 2,1-2,8г CaCl₂ на 1 л экстракта).

Испытания разработанного способа предварительной очистки экстракта в производственных условиях показали его высокую эффективность, что выражалось в увеличении скорости фильтрации от 80 до 200 л/час с м² фильтрующей поверхности и в получении продукта высокой степени прозрачности.

Сухой экстракт содержал 1,6±0,3% аминного азота, 6,0±0,2% общего азота, 8,0±1,5% углеводов, 7,2±1,2 % хлоридов, 5,2±1,2 % влаги, рН-0,5% раствора 6,5±0,3.

Экстракт кормовых дрожжей, полученный по разработанному способу, обладал ростстимулирующей активностью в отношении микроорганизмов ауксотрофных по витаминам В₁, В₃, В₅, В₆ и не уступал по данному показателю экстракту, полученному по традиционному способу (табл.7). В настоящее время препарат выпускается в НПО "Питательные среды" согласно регламенту производства №1937-00. Разработка защищена патентом РФ №227158.

Таблица 7. Сравнительные данные по ростстимулирующей активности экстрактов кормовых дрожжей в отношении тест-штаммов ауксотрофных по витаминам группы В

Тест-штаммы	Оптическая плотность культуральной жидкости через 48 ч инкубации посевов при 280С
	Экстракт дрожжей, полученный по разработанному способу	Экстракт дрожжей, полученный традиционным способом	Контрольная среда Ридер с сахарозой
Saccharomyces cerevisiae 1168 (В1)	0,28±0,02	0,26±0,02	0,02
Debaryomyces disporus 1575 (В6)	0,14±0,01	0,15±0,01	0,02
Kluyveromyces marxianus 1148 (В3)	0,32±0,03	0,34±0,3	0,02
Pichia fermentans 1375 (В5)	0,13±0,02	0,12±0,02	0,02

Зарубежные фирмы Oxoid, Merck для определения лецитиназной активности микроорганизмов выпускают желточную эмульсию в виде коммерческого препарата - Egg-Yolk Emulsion Sterile. В РФ аналогичный препарат не выпускается, что вынуждает бактериологов использовать желточную эмульсию, изготовляемую непосредственно в условиях лаборатории. При этом она не контролируется на микробиологическую чистоту и имеет ограниченный срок хранения.

В связи с этим проведена разработка технологии получения стерильной желточной эмульсии в готовом к употреблению виде с длительным сроком хранения.

Первый этап работы включал подбор оптимальных соотношений желтка и физиологического раствора для получения гомогенной эмульсии. Выявлено, что соотношения желтка и физиологического раствора равное - 1: 2,0-2,5 обеспечивало получение желточной эмульсии заданного свойства. При других соотношениях получались сильно разбавленные эмульсии, в результате чего происходило ее расслоение, либо концентрированные, затрудняющие технологический процесс на стадии фильтрации.

Следующий этап включал разработку способа стерилизации препарата, основываясь на методе химической стерилизации с помощью хлороформа, который обычно используется для консервирования биологических жидкостей, содержащих белки (М.О. Биргер, 1982; Л.Я. Телишевская, 2000).

Суть разработанного способа заключалась в следующем: эмульсию яичного желтка фильтровали через 4 слоя стерильной марли, фильтрат разливали в стерильные флаконы, добавляли 1,0% хлороформа, оставляли на сутки при температуре окружающей среды, затем прогревали при 56-58⁰С в течение 2 ч для удаления хлороформа. Флаконы закрывали стерильными пробками, герметизировали металлическими колпачками и повторяли режим прогрева.

В табл.8 представлены результаты определения лецитиназной активности микроорганизмов на питательном агаре, содержащем желточную эмульсию, после 6-ти месячного хранения.

Таблица 8. Определение лецитиназной активности микроорганизмов на питательном агаре, содержащем желточную эмульсию после 6-ти месячного хранения

Тест-штаммы	Наличие зон лецитиназной активности
S. aureus Wood-46	+
S. aureus FDA 209 P	+
S. aureus 25 923	+
B. cereus 8035	+
B. cereus 2010	+
B. cereus 96	+
Cl. perfringens TAB6K28	+
S. epidermidis 14 990 (отрицательный контроль)	-
B. subtilis 6051 (отрицательный контроль)	-

Из данных табл.8 видно, что желточная эмульсия, полученная по разработанной технологии, способствует проявлению лецитиназной активности тест-штаммами, которые продуцируют этот фермент. Вокруг колоний микроорганизмов, не обладающих лецитиназой, зоны ее активности отсутствовали.

Таким образом, разработанная технология обеспечивает получение желточной эмульсии с длительным сроком хранения. Использование ее в готовом к употреблению виде позволит сократить сроки предварительной подготовки к анализу. Разработка защищена патентом №2203958.

Разработка сухих питательных сред на электролит-дефицитной питательной основе

Зарубежные фирмы Oxoid, Merck, bioMerieux для бактериологического анализа мочи выпускают цистин-лактоза электролит-дефицитный агар (CLED-агар), который выявляет рост основных возбудителей уроинфекций и подавляет роение протеев, что позволяет определить степень бактериурии.

До настоящей разработки в РФ среду аналогичного назначения не выпускали. Это послужило основанием к проведению исследований по созданию электролит-дефицитной среды для бактериологического анализа мочи.

В качестве питательной основы разрабатываемой среды использовали электролит-дефицитную основу, полученную по оригинальной технологии. В качестве дифференцирующего маркера в состав среды включена лактоза, обеспечивающая в сочетании с индикатором бромтимоловым синим дифференцирующие свойства среде. Для стабилизации рН в состав среды включен трис-буфер, а качестве стимулятора роста микроорганизмов использовали L-цистеин (Manual of BBL Products and Laboratory Procedures. Sixth Edition).

На основании изучения биологических свойств более чем 100 образцов среды был определен оптимальный состав электролит-дефицитного питательного агара (ЭДПА) для выделения, дифференциации и количественного определения микроорганизмов в моче, содержащего в г\л: электролит-дефицитная питательная основа - 8,3; L-цистин - 0,128; лактоза - 10,0; трис-буфер - 0,2; агар - 12,0; бромтимоловый синий - 0,03.

Сравнительная характеристика роста тест-штаммов основных возбудителей уроинфекций на ЭДПА, CLED-агаре и питательном агаре показала, что разработанная среда полностью обеспечивала ростовые потребности основных возбудителей уроинфекций и ингибировала роение протеев, что позволяло провести количественный учет микроорганизмов и определить степень бактериурии, являющейся показателем наличия патологического процесса. Среда обеспечивала четкую дифференциацию микроорганизмов по признаку ферментации лактозы: микроорганизмы, ферментирующие лактозу, образовывали колонии желтого цвета, не ферментирующие - колонии голубого цвета (табл.9).

Испытания разработанной среды в практических условиях в лаборатории микробиологии НИИ урологии МЗ РФ г. Москвы, в бактериологическом отделе Центра санэпиднадзора №736 МО РФ и Дагестанском урологическом центре также подтвердили ее преимущества перед контрольной средой - питательным агаром (И.В. Гавристова, Г.А. Беляева, Ю.И. Обухова и др., 2001).

Разработанная среда по сравнению с CLED-агаром более проста по составу, не содержит дополнительных факторов роста в виде дрожжевого и мясного экстрактов. Данная разработка внедрена в практику здравоохранения и защищена патентом РФ№2145352.

Для выделения высокопатогенного штамма E. coli O157: H7 в нашей стране рекомендована модифицированная среда Эндо-Сорбитол E. coli O157: H7 агар (Т.С. Шобухова, И.А. Гавристова, Н.М. Ландсман, М.В. Храмов, 1997). Ее недостатком является низкая селективность, и в случае наличия в клиническом материале роящихся форм протеев, выделение возбудителя инфекции в чистой культуре весьма затруднительно. За рубежом для выделения штамма E. coli O157: H7 используют селективные среды, содержащие дорогостоящие компоненты (Среды бактериоселективные, сухие "Гем", М., - 1997). Аналогичные среды в РФ не выпускают, что обусловило целесообразность разработки сухой селективной среды для выделения и идентификации штамма E. coli O157: H7, которая являясь более простой по составу, не уступала бы по качеству зарубежным аналогам.

При разработке среды исходили из способности электролит-дефицитной питательной основы подавлять роение протеев. Для решения вопроса о возможности использования этой основы в качестве питательного субстрата, в составе разрабатываемой среды, изучено влияние ее на рост 14 штаммов E. coli O157: H7.

Установлено, что электролит-дефицитная основа обеспечивала рост всех штаммов E. coli O157: H7 и по чувствительности, размеру и форме колоний не уступала сухому питательному агару, являющемуся питательной основой большинства питательных сред для энтеробактерий. Это послужило основанием для использования ее в составе разрабатываемой среды.

Одним из основных дифференцирующих признаков тест-штаммов серотипа E. coli O157: H7 от других серотипов E. coli является отношение к сорбиту: первые - сорбит отрицательны, вторые - сорбит положительны (Ю.А. Ратинер, В.М. Бондаренко, A. Siitonen, 1998). Поэтому данный углевод введен в состав разрабатываемой среды в качестве дифференциального маркера. Экспериментально оттитрована оптимальная концентрация сорбита (1,2%), обеспечивающая в сочетании с рН-индикатором бромтимоловым синим четкую дифференциацию тест-штаммов E. coli O157: H7 от других серотипов E. coli. Тест-штаммы E. coli O157: H7 образовывали голубые колонии, колонии других серотипов - желтые.

Таблица 9. Сравнительная характеристика роста тест-штаммов основных возбудителей уроинфекций из разведений 10^-6 на ЭДПА, CLED агаре и питательном агаре (СПА)

Тест-штаммы	Рост тест-штаммов на ЭДПА	Рост тест-штаммов на CLED-агаре фирмы "Serva"	Рост тест-штаммов на СПА
	КОЕ М±m	форма колоний	цвет колоний	КОЕ М±m	форма колоний	цвет колоний	КОЕ М±m	форма колоний	цвет колоний
E. coli 3912/41 (O55: K59)	40,0±4,0	S	желтый	42,0±4,0	S	желтый	43,0±5,0	S	бесцветные
K. pneumoniae 4140	45,0±4,0	S	желтый	49,0±5,0	S	желтый	46,0±5,0	S	бесцветные
S. aureus FDA 209 Р	32,0±3,0	S	желтый	29,0±3,0	S	желтый	32,0±3,0	S	бесцветные
E. faecalis 775	22,0±2,0	S	желтый	24,0±2,0	S	желтый	28,0±3,0	S	бесцветные
E. aerogenes 418	28,0±3,0	S	желтый	30,0±3,0	S	желтый	32,0±3,0	S	бесцветные
P. vulgaris HX19	45,0±5,0	O	голубой	46,0±5,0	O	голубой	48,0±5,0	Н- (роение)	бесцветные
P. vulgaris 4636	42,0±3,0	O	голубой	44,0±3,0	O	голубой	43,0±2,0	Н- (роение)	бесцветные
P. vulgaris 3307	44,0±5,0	O	голубой	42,0±4,0	O	голубой	46,0±5,0	Н- (роение)	бесцветные
P. mirabilis 3177	39,0±5,0	O	голубой	44,0±5,0	O	голубой	46,0±5,0	Н- (роение)	бесцветные
P. mirabilis 71/2	42,0±5,0	O	голубой	38,0±4,0	O	голубой	35,0±4,0	Н- (роение)	бесцветные
S. marcescens 1	25,0±2,0	S	голубой	26,0±3,0	S	голубой	28,0±3,0	S	бесцветные
P. aeruginosa 27/99	28,0±3,0	S	светло-голубой	25,0±3,0	S	светло-голубой	22,0±3,0	S	бесцветные

При создании селективных сред основной задачей является подавление ассоциативной микрофлоры. Данная задача была решена путем включения в состав разрабатываемой среды кристаллического фиолетового, обладающего избирательным бактериостатическим действием на грамположительные микроорганизмы (Microbiology Manual "Merck", 1990). Внесение в среду 0,0001% кристаллического фиолетового ингибировало рост тест-штаммов S. aureus Wood-46, S. aureus АТСС 25923, S. aureus FDA 209Р, S. epidermidis 14990 из разведения 10^-1.

На основании полученных результатов определен оптимальный состав среды для выделения и предварительной идентификации E. coli 0157: Н7 - электролит-дефицитный кристаллвиолет сорбитол агар (ЭДКС-агар), содержащий следующие компоненты в г/л: электролит-дефицитная питательная основа - 7,8, Д- (+) - сорбит - 12,0, бромтимоловый синий - 0,04, кристаллический фиолетовый - 0,001, трис-буфер - 0,36, агар - 11,5.

В табл.10 представлены сравнительные данные роста тест-штаммов на ЭДКС-агаре и известных средах. По числу выросших колоний, селективным и дифференцирующим свойствам ЭДКС-агар не уступал МасСоnkеy-сорбитол агару, а по селективным свойствам, в частности, по способности подавлять роение протеев превосходил сорбитол E. coli 0157: Н7 агар отечественного производства.

Среда проста по составу и не содержит дорогостоящих компонентов. Она внедрена в производство и защищена патентом РФ №2157837.

Существующая схема выделения энтеробактерий предусматривает посев клинического материала на дифференциально-диагностическую среду с эозин-метиленовым синим - среду Левина. Однако среда не подавляет роение протея и не позволяет дифференцировать патогенные микроорганизмы от некоторых условно патогенных, не разлагающих лактозу.

С целью повышения селективных свойств в качестве основы разрабатываемой среды использовали электролит-дефицитную основу, а для улучшения дифференцирующих свойств в состав внесена дополнительно сахароза, что позволило дифференцировать лактозонегативные, но сахарозопозитивные условно патогенные энтеробактерии от патогенных, не ферментирующих эти углеводы. Однако при посеве смешанных культур микроорганизмов (E. coli 3912/41 и S. enterica TyphiH901; E. coli3912/41 и S. flexneri 1a 8516; E. coli3912/41 и S. sonnei S form), образующиеся в процессе ферментации лактозы и сахарозы органические кислоты диффундировали в соседние участки среды поэтому не ферментирующие эти углеводы патогенные энтеробактерии изменяли свою окраску, что не позволяло отличить их от условно патогенных микроорганизмов. С целью устранения указанного недостатка в состав разрабатываемой среды был включен трис-буфер в 0,04% концентрации. Это способствовало нейтрализации части кислот, образующихся в результате сбраживания углеводов, и они не диффундировали в соседние участки среды, в результате чего патогенные микроорганизмы не изменяли свою окраску. Они были бесцветны, прозрачны и легко отличались от окрашенных в темно-фиолетовый цвет колоний условно патогенных энтеробактерий.

Таблица 10. Сравнительная характеристика роста тест-штаммов из разведений 10^-6 на ЭДКС-агаре и известных средах

Наименование тест-штаммов	Разработанная среда-ЭДКС-агар (М±m)	МасСоnkеy-сорбитол агар фирмы "Oxoid" (М±m)	Сорбитол E. coli 0157: Н7 агар ГНЦ ПМ (М±m)
	КОЕ	размер (d) и форма колоний	цвет колоний	КОЕ	размер (d) и форма колоний	цвет колоний	КОЕ	размер (d) и форма колоний	цвет колоний
E. coli 0157: Н7 № 4	38,0±3,0	2,2±0,2 S	голубые	35,0±3,0	2,1±0,18 S	бесцветные	35,0±3,0	2,2±0,2 S	бесцветные
E. coli 0157: Н 7 №12	39,0±4,0	2,4±0,2 S	голубые	40,0±4,0	2,5±0,2 S	бесцветные	37,0±4,0	2,3±0,18 S	бесцветные
E. coli 0157: Н 7 № 9	45,0±4,0	2,3±0,18 S	голубые	42,0±4,0	2,2±0,18 S	бесцветные	46,0±4,0	2,2±0,2 S	бесцветные
E. coli 0157: Н 7 № 63	36,0±3,0	2,0±0,15 S	голубые	36,0±3,0	1,9±0,15 S	бесцветные	38,0±3,0	2,0±0,15 S	бесцветные
E. coli 168\59 (0111: К58)	40,0±4,0	2,4±0,19 S	желтые	42,0±4,0	2,5±0,2 S	розовые	39,0±4,0	2,4±0,2 S	красные
E. coli №3912/41 (055: К59)	32,0±3,0	2,3±0,15 S	желтые	28,0±3,0	2,2±0,16 S	розовые	34,0±3,0	2,2±0,16 S	красные
S. enterica Typhimurium №79	52,0±6,0	2,2±0,2 S	желтые	50,0±5,0	2,3±0,18 S	розовые	50,0±5,0	2,2±0,18 S	красные
P. mirabilis 71 (2)	48,0±5,0	2,5±0,25 О	голубые	49,0±5,0	2,4±0,2 О	бесцветные	роение	Н	бесцветные
P. vulgaris HX19	54,0±5,0	1,3±0,1 О	голубые	55,0±5,0	1,5±0,12 О	бесцветные	роение	Н	бесцветные
S. aureus Wood 46	нет роста	-	-	нет роста	-	-	нет роста	-	-
S. epidermidis АТСС 14990	нет роста	-	-	нет роста	-	-	нет роста	-	-

Примечание: посев тест-штаммов S. aureus Wood-46,S. epidermidis АТСС 14990 осуществляли из разведений 10^-1.

В результате полученных данных и на основании изучения более чем 150 образцов среды отработана оптимальная рецептура электролит-дефицитного агара с эозинметиленовым синим (ЭДЭМС-агара) для выделения и дифференциации энтеробактерий, включающая следующие компоненты, в г/л: электролит-дефицитная питательная основа - 11,0, лактоза - 7,5, сахароза - 7,5, эозин - 0,6, метиленовый синий - 0,065, трис-буфер - 0,4, агар - 11,0.

Сравнительные данные роста тест-штаммов на разработанной среде и на среде Левина, показали, что созданная среда имела существенное преимущество перед своим аналогом, поскольку обеспечивала рост бактерий протея в виде изолированных О-форм колоний, что в значительной мере облегчало выделение из микробной ассоциации энтеробактерий в чистой культуре. Кроме того, среда обеспечивала четкую дифференциацию патогенных энтеробактерий от условно патогенных, не ферментирующих лактозу, но ферментирующих сахарозу. Так, тест-штаммы P. vulgaris НХ19 и S. marcescens 1 на ЭДЭМС-агаре образовывали колонии темно-фиолетового цвета, тогда как на контрольной среде, они были бесцветны, как и патогенные энтеробактерии.

Таким образом, разработанный ЭДЭМС-агар по селективным и дифференцирующим свойствам превосходит известную среду Левина. Указанные преимущества позволяют рекомендовать разработанную среду для бактериологического анализа клинического материала на энтеробактерии. На разработанную среду составлена НД. Разработка защищена патентом РФ №2179582.

Разработка питательных сред для диагностики уроинфекций

В мировой практике для ускорения и предварительной идентификации уроинфекций рекомендуется производить посев мочи одновременно на две среды: электролит-дефицитную, поддерживающую рост всех основных возбудителей уроинфекций, и селективный MacConkey агар, используемый для роста только грамотрицательных микроорганизмов (Culture Media Manual bio Merieux, 1994).

В РФ отсутствует промышленный выпуск селективной среды для бактериологического анализа мочи, поэтому нами предприняты исследования по разработке отечественной сухой среды типа МасСоnkеy.

В качестве питательных основ разрабатываемой среды использовали сухой питательный агар, панкреатический и кислотный гидролизаты казеина производства НПО "Питательные среды". Из испытанных основ только питательный агар полностью обеспечивал питательные потребности всех тест-штаммов, рекомендованных European Pharmacopoeia II, Chapter VIII.10. (1980), USP, National Formulary 16th. ed., Washington, D. C., (1985) для контроля Maс Conkey агара. На среде с кислотным гидролизатом казеина отсутствовал рост тест-штаммов,, S. enterica Typhi Н901, S. entericaТyphimurium 79, S. sonnei S form, S. flexneri 1a 8516, а на среде с панкреатическим гидролизатом казеина указанные штаммы образовывали мелкие колонии d-0,4-0,6 мм.

Испытания желчных солей производства НПО "Питательные среды" в качестве селективного компонента разрабатываемой среды показали, что они в концентрации 0,4-0,5% полностью подавляли роение протеев и не оказывали ингибирующего действия на рост других энтеробактерий.

Для подавления роста грамположительных микробов-ассоциантов в состав среды был включен кристаллический фиолетовый, а в качестве дифференцирующего маркера - лактоза и индикатор нейтральный красный.

На основании изучения биологических свойств 85 образцов определена рецептура сухой среды аналога МасСоnkеy агара, включающая следующие компоненты в г/л: питательный агар - 38,5, лактоза - 10,0, желчные соли - 4,5, нейтральный красный - 0,04, кристаллический фиолетовый - 0,001.

В табл.11 представлены сравнительные данные роста тест-штаммов на полученной среде и МасСоnkеy агаре фирмы "Merck", свидетельствующие, что разработанная среда по селективным и дифференцирующим свойствам не уступала МасСоnkеy агару фирмы "Merck". Она ингибировала рост грамположительной микрофлоры и подавляла роение протеев, поддерживая при этом рост условно патогенных и патогенных энтеробактерий. Среда обладала дифференцирующими свойствами, основанными на способности микроорганизмов разлагать лактозу: лактозоположительные микроорганизмы образовывали на среде ярко-розовые колонии, лактозоотрицательные - бесцветные колонии.

Полученная среда проста по составу и содержит компоненты только отечественного производства. Среда внедрена в практику здравоохранения - "Питательная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий селективная сухая" (типа Макконки агара). ФСП 42-0504-3427-04, ПР №58944705-01-06.

Бактериологическая диагностика уроинфекций включает постановку теста на наличие в моче антибактериальных субстанций (АБС).

В РФ препараты указанного назначения не выпускают. В связи с этим, были предприняты исследования по разработке сухой среды для определения АБС в моче. Для решения указанной задачи, прежде всего, необходимо было выбрать тест-культуру, которая обладала бы высокой чувствительностью к антибактериальным препаратам, используемым при лечении уроинфекций. Исходя из того, что в этиологии инфекций мочевыводящих путей основную роль играют E. coli, Klebsiella, Proteus, Staphylococcus, Enterococcus и Pseudomonas (Л.З. Скала, С.В. Сидоренко, А.Г. Нехорошева, 1997; G. G. Zhanel, T. L. Hisanada, 2005) в набор антибактериальных препаратов для определения чувствительности были включены беталактамы, аминоглюкозиды, хинолоны. В качестве тест-культур использовали спорообразующие микроорганизмы B. cereus 5832, B. subtilis ATCC 6051. Установлено, что наибольшей чувствительностью к испытанным препаратам обладала, тест-культура B. subtilis ATCC 6051, что явилось основанием для использования ее в составе разрабатываемой среды.

Таблица 11. Сравнительные данные роста тест-штаммов из разведений 10^-6 на разработанной среде и МасСоnkеy агаре

Тест-штаммы	Разработанная среда	МасСоnkеy агар фирмы "Merck"
	количество колоний (M±m)	диаметр колоний, мм (M±m)	цвет колоний	форма колоний	количество колоний (M±m)	диаметр колоний, мм (M±m)	цвет колоний	форма колоний
E. coli 3912/41 (055: К 59)	35,0±4,0	2,2±0,2	ярко-розовые	S	38,0±4,0	2,1±0,15	ярко-розовые	S
P. mirabilis 71/2	30,0±3,0	2,5±0,2	бесцветные	О	25,0±3,0	2,4±0,2	бесцветные	О
P. vulgaris HX19	32,0±4,0	2,2±0,18	бесцветные	О	28,0±4,0	2,0±0,16	бесцветные	О
K. pneumoniae №4140	36,0±4,0	2,4±0,25	розовые	S	40,0±5,0	1,5±0,3	розовые	S
P. aeruginosa 27/99	28,0±6,0	1,5±0,15	бесцветные	S	30,0±5,0	1,5±0,12	бесцветные	S
S. enterica Typhimurium 79	44,0±5,0	2,5±0,2	бесцветные	S	42,0±3,0	2,3±0,2	бесцветные	S
S. sonnei S form	32,0±4,0	2,2±0,16	бесцветные	S	34,0±3,0	2,2±0,18	бесцветные	S
S. aureus FDA 209Р	нет роста	-	-	-	нет роста	-	-	-
S. aureus Wood-46	нет роста	-	-	-	нет роста	-	-	-
S. epidermidis 14990	нет роста	-	-	-	нет роста	-	-	-
S. flexneri Iа 8516	30,0±3,0	1,1±0,1	бесцветные	S	32,0±4,0	1,3±0,1	бесцветные	S
B. cereus 2010	нет роста	-	-	-	нет роста	-	-	-
S enterica Typhi H901	38,0±4,0	2,0±0,15	бесцветные	S	34,0±5,0	2,1±0,15	бесцветные	S

Примечание: посев тест-штаммов S. aureus FDA 209Р, S. aureus Wood-46, B. cereus 2010, S. epidermidis 14990 осуществляли из разведений 10^-1.

Дальнейшей задачей являлась разработка способа получения сухих спор указанной тест-культуры. Для ее решения использовали способность предварительно высушенного гигроскопического материала, например крахмала, поглощать большое количество влаги. При этом подобраны соотношения крахмала и споровой суспензии (14-15:

1), которые обеспечивали получение спорового материала c влажностью не более 5%.

Следующий этап исследований включал подбор питательной основы, способствующей прорастанию спор. В качестве питательных основ испытаны питательный бульон, дрожжевой экстракт, панкреатический и кислотный гидролизаты казеина. Установлено, что сухой питательный бульон и экстракт кормовых дрожжей обеспечивали прорастание спор B. subtilis 6051 в течение 16-18 ч при 37⁰С. Использование других основ лимитировалось удлинением сроков прорастания спор до 36-48 ч. Однако при испытании питательного бульона в составе среды, включающей споры B. subtilis на крахмальном носителе, глюкозу и индикатор феноловый красный, не наблюдали четкого перехода окраски индикатора из красной в желтую при прорастании спор. Очевидно, это объяснялось тем, что основным продуктом расщепления глюкозы тест-штаммом B. subtilis 6051 в присутствии пептонов является нейтральное соединение ацетилметилкарбинол (ацетоин), что было подтверждено при постановке реакции Фогеса-Проскауэра. При использовании дрожжевого экстракта, не содержащего пептонов, наблюдали четкое изменение цвета индикатора в результате образования кислых продуктов, что было подтверждено при постановке теста с метиловым красным (MR-тест).

Изучение влияния различных концентраций глюкозы в среде (от 0,5 до 2,0%) показало, что наиболее оптимальным количеством является содержание в среде 1,0-1,5% углевода, обеспечивающим наиболее интенсивную окраску среды при прорастании спор. Учитывая, что рН мочи может варьировать в широких пределах от кислой до основной, что может привести к искажению цветных реакций при посеве мочи, для стабилизации рН в состав среды в качестве буферной системы включили натрий фосфорнокислый и натрий углекислый.

На основании испытания 250 образцов экспериментальной среды, содержащих различные концентрации дрожжевого экстракта, глюкозы, спор на крахмальном носителе, индикатора и буферной системы определен оптимальный состав среды для определения АБС в моче, содержащей в г/л: дрожжевой экстракт - 4,5, глюкоза - 15,0, споры В. subtilis на крахмальном носителе - 1,2, феноловый красный - 0,045, натрий фосфорнокислый - 0,7, натрий углекислый - 0,045.

Сравнительные исследования чувствительности разработанной среды для определения АБС в моче и Urotest АВ фирмы "Merck" представлены в табл.12.

Таблица 12. Сравнительные исследования чувствительности созданной среды для определения АБС в моче и Urotest АВ "Merck"

Концентрация бензилпенициллина в моче (ЕД/мл)	Оценка изменения окраски среды
	Созданная среда	Urotest АВ
64,0	-	-
32,0	-	-
16,0	-	+
8,0	-	+
4,0	+	+
2,0	+	+
1,0	+	+
0,5	+	+
Контрольные пробы без антибиотика	+	+

Обозначения: "+" - изменение окраски среды - отсутствие антибиотика "-" - отсутствие изменения окраски среды - наличие антибиотика.

Из данных табл.12 видно, что разработанная среда обладала высокой чувствительностью, выявляла низкие концентрации антибиотика в моче (8,0 ед/мл), в то время как Urotest АВ позволял регистрировать только высокие концентрации антибиотика (32,0 ед/мл).

Созданная среда удобна при рутинных исследованиях в клинической практике, поскольку не требует особых условий проведения теста. Использование данной среды будет способствовать улучшению бактериологических исследований при диагностике уроинфекций. На разработанную среду составлена НД. Разработка защищена патентом РФ №2164946.

Разработка питательных сред для накопления и выделения гемокультур

В настоящее время для выделения гемокультур сальмонелл используют среды лабораторного приготовления, которые не могут быть стандартными. Для устранения этого недостатка необходимо использовать коммерческие сухие питательные среды.

При разработке сухой среды для накопления и выделения гемокультур сальмонелл в качестве исходной использована рецептура среды Рапопорта, содержащая в качестве питательной основы мясопептонный бульон или бульон Хоттингера. Однако в виду того, что они не выпускаются в виде сухих препаратов, были испытаны коммерческие препараты - сухой питательный бульон и панкреатический гидролизат казеина. Исследования показали, что сухой питательный бульон по накопительному эффекту превосходил бульон Хоттингера и мясопептонный бульон в 2,0-2,5 раза, а панкреатический гидролизат казеина - более чем в 10 раз (р<0,05). Исходя из полученных данных, при разработке сухой среды в качестве основы использовали сухой питательный бульон.

Одним из важных компонентов питательной среды для выделения гемокультур сальмонелл является желчь, которая подавляет бактерицидные свойства крови и препятствует ее свертыванию, тем самым, создавая благоприятные условия для размножения брюшнотифозных и паратифозных бактерий (С.А. Блинкин, 1963). В разрабатываемой среде мы заменили нативную желчь эквивалентным количеством сухой желчи (1,0-1,2%). Установлено, что образцы сред с сухой желчью по накопительному эффекту в отношении сальмонелл не отличались от сред, приготовленных с использованием нативной желчи. Так, показатель эффективности на среде, содержащей питательный бульон и сухую желчь, составлял при посеве тест-штаммов S. enterica Typhi H901 - 10,2±1,2·10⁵, S. enterica Paratyphi A 525 - 11,5±1,3·10⁵, S. enterica Paratyphi B 506 - 12,0·10⁵, на среде с нативной желчью, соответственно - 9,9±1,4·10⁵, 11,2±1,4·10⁵, 12,2±1,5·10⁵.

Для обеспечения в среде четких дифференцирующих свойств, определяемых по изменению ее окраски и газообразованию в процессе роста тест-штаммов, проведены исследования по изучению влияния различных индикаторов и углеводов на дифференциацию сальмонелл.

Установлено, что образцы сред с маннитом (2%) и феноловым красным (0,004%) по сравнению с образцами, содержащими глюкозу (2%) и тот же индикатор, обладали более четкими дифференцирующими свойствами по признаку кислотообразования и по интенсивности газообразования, что объяснялось большим количеством кислых продуктов, образующихся при ферментации маннита. Так, при наличии глюкозы рН среды после инкубации посевов в течение 18-20 ч составлял 6,3-6,5, а при внесении маннита - 5,5-5,8, что и обеспечивало более четкий переход окраски из красной в желтую.

На основании проведенных исследований определен оптимальный состав сухой среды для накопления, выделения и дифференциации гемокультур сальмонелл, содержащей в г/л: сухой питательный бульон-15,0, агар-1,5, желчь сухая-12,0, маннит-20,0, феноловый красный-0,04, натрий углекислый-0,3.

Характеристика биологических свойств разработанной среды, свидетельствовала (табл.13), что она обладала значительным накопительным эффектом и по данному показателю превосходила жидкую среду Рапопорта в 2,5-3,0 раза (р<0,05).

Полученные результаты подтверждены в модельных опытах при посеве крови, предварительно зараженной тест-штаммами сальмонелл.

Таким образом, разработанная среда благодаря высокому накопительному эффекту делает возможным выявление сальмонелл при минимальном содержании их в крови, а также позволяет одновременно с обнаружением культур провести их дифференциацию по тесту газообразования.

Таблица 13. Сравнительная характеристика биологических свойств разработанной среды для накопления и выделения гемокультур сальмонелл при посеве тест-штаммов из разведений 10^-7

Тест-штаммы	Разработанная среда	Среда Рапопорта
	показатель эффектив-ности (M±m)	газообразо-вание	кислото-образование (изменение цвета среды)	эффектив-ность (M±m)	газообразо-вание	кислото-образование (изменение цвета среды)
S. enterica Typhi Н901	14,4±1,4·105	-	+	5,2±1,2·105	-	+
S. enterica Paratyphi А525	17,0±1,5·105	+	+	5,6±1,5·105	+	+
S. enterica Paratyphi В506	18,0±1,5·105	+	+	7,0±1,2·105	+	+

Обозначения: (-) - отсутствие газа

(+) - наличие газа или изменение цвета среды

Использование сконструированной сухой среды в клинической практике будет способствовать повышению эффективности диагностики тифо-паратифозной инфекции, позволит стандартизировать метод выделения гемокультур сальмонелл и получать сравнимые результаты в различных лабораториях страны. Разработка защищена патентом РФ №2175671.

Микробиологические исследования крови являются обязательными при подозрении на возможность развития бактериемии и сепсиса. Эффективность этих исследований во многом зависит от качества питательных сред.

Ранее нами совместно с В.Г. Гореловой (2005; патент №2265654; патент №2267537) разработаны готовые к употреблению питательные среды для накопления и выделения гемокультуры, содержащие в качестве инактиватора сульфаниламидных препаратов пара-аминобензойную кислоту.

В настоящее время, одним из препаратов выбора при этиотропной терапии бактериемии и сепсиса являются бета-лактамные антибиотики (В.С. Савельев, Б.Р. Гельфанд, 2006; В.А. Руднов, С.Н. Ложкин, Ф.С. Галеев и др., 2003). Поэтому для устранения антимикробного действия бета-лактамных антибиотиков, которые могут присутствовать в крови при проведении антибактериальной терапии, среды для гемокультур должны содержать специфические инактиваторы, нейтрализующие антибактериальное действие указанных препаратов.

В качестве инактиватора бета-лактамных антибиотиков использовали бета-лактамазу (Penicillinase, Cephalosporinase) производства фирмы "Sigma" (Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук, 2002-2003).

Для установления ее оптимальной инактивирующей концентрации исходили из данных литературы о содержании бета-лактамных антибиотиков в крови после введения препаратов (П.Р. Марри, И.Р. Шей, 2006).

В разработанную среду для накопления и выделения гемокультур (патент №2265654) вводили бета-лактамные антибиотики в максимальных концентрациях, согласно данным вышеуказанных авторов, и бета-лактамазу в диапазоне от 0,003 до 0,015 г/л среды.

Установлено, что фермент в концентрации 0,015 г/л полностью инактивировал в среде 160 ед/мл цефоперазона, 185 ед/мл цефазолина, 70 ед/мл цефтазидима, 45 ед/мл цефотаксима, что выражалось в наличии визуально видимого роста тест-штаммов E. coli3912/41, K. pneumoniae 51, P. mirabilis 71/2, S. aureus FDA 209 P, S. epidermidis 14990, S. pyogenes Dick 1. На контрольной среде, содержащей только антибиотики, рост указанных тест-штаммов не наблюдался.

На основании полученных данных в состав известной среды для накопления и выделения гемокультур дополнительно была введена бета-лактамаза в концентрации 0,015 г/л.

В табл.14 представлены сравнительные данные по чувствительности и эффективности среды с бета-лактамазой и контрольных сред в отношении основных возбудителей бактериемии и сепсиса.

По чувствительности и эффективности новая среда не уступала контрольной и превосходила триптиказо-соевый бульон, рекомендованный ВОЗ для выделения гемокультуры (J. Vanderpitte, K. Engback, P. Piot, 1994).

Особенно высокий показатель эффективности среды отмечен в отношении условно патогенных микроорганизмов (E. coli 3912/41, S. aureus FDA 209P, K. pneumoniae 51, S. epidermidis ATCC 14990, E. faecalis 775, P. aeruginosa 27/99), являющихся основными возбудителями бактериемии и сепсиса.

Полученные показатели по эффективности среды подтверждены в модельных опытах при посеве крови, предварительно зараженной тест-штаммами E. coli 3912/41, K. pneumoniae 51, S. aureus FDA 209 P, S. pyogenes Dick 1, S. epidermidis 14990, E. faecalis 775.

Таблица 14. Сравнительные данные по чувствительности и эффективности разработанной среды, содержащий бета-лактамазу и контрольных сред через 18-20 ч культивирования при 37⁰С

Наименование тест-штаммов	Показатель чувствительности	Показатель эффективности
	разработанная среда, содержащая бета-лактамазу	контрольная среда по патенту №2265654	контрольная среда-триптиказо-соевый бульон фирмы "Merck"	разработанная среда, содержащая бета-лактамазу	контрольная среда по патенту №2265654	контрольная среда-триптиказо-соевый бульон фирмы "Merck" (M±m)
S. pyogenes Dick1	10-6	10-6	10<...

Подобные документы

• Роль медицинского лабораторного техника в приготовлении питательных сред в современной микробиологической лаборатории

  Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов. Физиологические функции элементов, используемых для их приготовления. Качественное преимущество промышленных питательных сред. Технология и многостадийный контроль качества их производства.
  
  контрольная работа [27,8 K], добавлен 12.02.2015
  

• Исследование микрофлоры тела сомов Clarias batrachus и антибиотических свойств их кожной слизи

  Состав и направления деятельности кафедры микробиологии и иммунологии. Принципы работы в микробиологической лаборатории. Подготовка посуды и инструментов. Техника отбора проб, посева и приготовления питательных сред. Методы идентификации микроорганизмов.
  
  отчет по практике [28,8 K], добавлен 19.10.2015
  

• Исследование ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов из недревесного растительного сырья

  Характеристика целлюлозы и ее производных. Ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов в ацетатном буфере и в водной среде. Зависимость эффективности ферментативного гидролиза от условий перемешивания, от концентрации субстрата, от сырья.
  
  дипломная работа [993,2 K], добавлен 19.01.2016
  

• Химическая структура, биохимические свойства и ферменты бактерий

  Химические элементы, входящие в состав живой материи. Синтез микроорганизмами различных ферментов. Физиология и принципы культивирования микроорганизмов. Метаболизмы, дыхание микроогранизмов, краткая характеристика питательных сред, рост и размножение.
  
  реферат [26,1 K], добавлен 21.01.2010
  

• Выделение, изучение свойств микроорганизмов и их использование для выполнения подготовительных процессов переработки овчинно-мехового сырья

  Механизм воздействия прокариотических микроорганизмов на спав и липазу. Щелочные протеиназы рода Bacillus. Методика выделения, изучение свойств концентрированного ферментного препарата и порядок его применения в процессе обезжиривания меховой овчины.
  
  дипломная работа [169,7 K], добавлен 27.11.2010
  

• Кометаболизм ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4

  Хелатирующие соединения. Строение и комплексообразование ЭДТА. Бактериальная деградация ЭДТА. Кометаболизм. Периодическое культивирование и его условия. Методика приготовления питательных сред. Вычисление энергетического выхода роста штамма LPM-4.
  
  дипломная работа [77,4 K], добавлен 15.12.2008
  

• Исследование роста микромицетов на различных источниках углеродного питания

  Исследование использования углерода и различных природных веществ микроскопическими грибами. Методы выделения и идентификации плесневых грибов, принципы составления питательных сред для них. Рост микромицетов на различных источниках углеродного питания.
  
  дипломная работа [778,3 K], добавлен 11.09.2010
  

• Получение белка пищевого и кормового назначения при помощи высших базидиомицетов

  История получения белка с помощью микроорганизмов. использование высших базидиальных грибов для получения белка кормового, пищевого назначения. Получение белка путем глубинного культивирования на питательных средах. Сохранение и усиление грибного аромата.
  
  реферат [28,9 K], добавлен 13.03.2019
  

• Получение моноклональных антител

  Изучение метода получения моноклональных антител путем слияния клеток мышиной миеломы с В-лимфоцитами. Основные среды, употребляемые при получении гибридов. Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования. Процесс клонирования гибридом.
  
  контрольная работа [40,6 K], добавлен 22.01.2015
  

• Биологическая роль витаминов, липидов, процессов брожения

  Обзор классификации, свойств и биологической роли витаминов, анализ их основных природных источников и антагонистов. Изучение липидов, процесса брожения и его типов. Характеристика физико-химических свойств белков и уровней организации белковых молекул.
  
  шпаргалка [53,8 K], добавлен 16.05.2010
  

• Уксуснокислое и лимоннокислое брожение

  Обзор анаэробного метаболического распада молекул питательных веществ без окисления. Возбудитель уксуснокислого брожения. Развитие уксуснокислых бактерий в напитках. Способ получения столового уксуса. Промышленное получение и применение лимонной кислоты.
  
  реферат [110,3 K], добавлен 01.03.2014
  

• Функциональная система, поддерживающая постоянный уровень питательных веществ в крови

  Принцип саморегуляции функциональной системы. Формирование пищевой мотивации. Роль процессов, протекающих в полости рта во время приема пищи в поддержании оптимального для метаболизма уровня питательных веществ в крови. Механизм сенсорного насыщения.
  
  презентация [2,8 M], добавлен 24.02.2015
  

• Изучение потребностей прокариот в питательных веществах

  Минеральные соли, соединения углерода, азота, кислорода, водорода, серы, фосфора, как источники основных биогенных химических элементов, необходимых для построения, функционирования и метаболизма прокариотической клетки. Факторы роста микроорганизма.
  
  курсовая работа [298,4 K], добавлен 23.01.2015
  

• Механизм питания и дыхания микроорганизмов

  Типы дыхания микроорганизмов. Транспорт электронов при дыхании и различных типах анаэробного способа получения энергии. Наиболее доступные источники углерода для бактерий. Механизм поступления питательных веществ. Использование неорганического азота.
  
  реферат [799,3 K], добавлен 26.12.2013
  

• Болезни растений, вызываемые недостатком питательных веществ

  Нарушение определенных функций растений, болезненные явления и симптомы, вызываемые недостатком питательных веществ. Причины голодания растений. Признаки азотного, фосфорного, марганцевого и калийного голодания. Подкормка растений недостающим элементом.
  
  презентация [2,9 M], добавлен 06.01.2016
  

• Практикум по методам биохимических исследований

  Методы исследования физико-химических свойств, тканевой и субклеточной локализации основных представителей биологических молекул, методы их выделения и очистки. Квалификационная характеристика специалиста-биохимика. Область профессиональной деятельности.
  
  учебное пособие [24,8 K], добавлен 19.07.2009
  

• Представители семейства бобовых как источники биофлавоноидов

  Изучение отдельных представителей семейства бобовых, выявление содержания в них флавоноидов, установление диапозона лечебных свойств лекарственного растительного сырья, богатого флавоноидами. Лекарственные растения, травы и растительные препараты.
  
  курсовая работа [40,9 K], добавлен 19.06.2008
  

• Механизм действия ферментов

  Изучение ферментов, их свойств и механизма биологического действия. Проведение исследования современных представлений о механизме ферментативного трансаминирования. Разработка общей теории пиридоксалевого катализа. Строение фермент-субстратного комплекса.
  
  реферат [189,0 K], добавлен 14.03.2015
  

• Биохимия ферментов

  Ускорение химических реакций с помощью катализаторов. Особенности ферментов (энзимов) как высокоспецифичных белков, выполняющих функции биологических катализаторов. Строение ферментов, их специфичность и классификация. Этапы ферментативного катализа.
  
  презентация [3,4 M], добавлен 20.11.2014
  

• Магнитные наночастицы, как средство влияния на релаксационные свойства водородосодержащих биологических сред

  Наночастицы магнетита, возможности их использования в фармакологии и медицине. Суперпарамагнетизм и ферримагнетизм. Применение наночастиц магнетита в качестве контрастного средства при диагностике. Классификация магнитно-резонансных контрастных средств.
  
  дипломная работа [6,3 M], добавлен 12.02.2015
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам