Организация биодеградативных путей у родококков

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

специальность 03.00.04. - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

ОРГАНИЗАЦИЯ БИОДЕГРАДАТИВНЫХ ПУТЕЙ У РОДОКОККОВ

СОЛЯНИКОВА Инна Петровна

Пущино, 2007

Работа выполнена в лаборатории энзиматической деградации органических соединений Института биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г.К Скрябина РАН.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Головлева Людмила Алексеевна

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кулаковская Татьяна Валентиновна

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

доктор биологических наук, профессор Мальян Александр Нерсессович

Институт фундаментальных проблем биологии РАН

доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна

Институт микробиологии РАН

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится года в часов мин на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайте http//www.ibpm.ru

Автореферат разослан « » 2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор биологических наук В.М.Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последние десятилетия в окружающую среду попало огромное количество промышленных отходов, сельскохозяйственных химикатов и продуктов их частичной трансформации, не имеющих аналогов или редко встречающихся в природе. Это оказало огромное влияние на все уровни организации живой материи и, без сомнения, нарушило то равновесие, которое создавалось на протяжении миллионов лет.

Учитывая распространенность, токсичность и устойчивость различных классов ксенобиотиков, мы выбрали для изучения процессов деградации галогенированные моноароматические производные фенола и бензоата с одним-тремя заместителями. Эти соединения широко используются при производстве пластика, жидкостей для тушения огня, красителей, гербицидов, фунгицидов, растворителей и др. Так, в Финляндии с 1934 по 1988 г было использовано около 30 000 тонн различных хлорфенолов [Kitunen et al., 1987; Kitunen, 1990], До 300 г хлорированных фенольных соединений (фенолы, катехолы, гваяколы, сиринголы и ванилины) образуется на одну тонну пульпы при ее хлорном отбеливании, что привело к их накоплению порядка микрограмм на литр воды и миллиграмм на один кг (сухой вес) донных отложений в озерах, принимающих обработанные сливы [Salkinoja-Salonen et al., 1981]. Исследования in vitro показали, что хлорфенолы разобщают окислительное фосфорилирование, нарушают микросомальную детоксификацию, влияют на синтез белков и РНК [Lundberg et al., 1980; Erlich et al., 1987; Priston et al., 1987].

Физико-химические методы обезвреживания либо не обеспечивают детоксификацию хлорфенолов, либо чрезвычайно дороги по сравнению с биологическими (электронно-лучевой метод подготовки питьевой воды, считающийся одним из наиболее эффективных и надежных, требует 5 кВт-ч/м3 при производительности 50 м3/ч [Строкин, 2007]). То же касается сжигания хлорфенолов, - при недостаточно высокой температуре неизбежно образуются неизмеримо более токсичные полихлордиоксины, а проведение процесса при необходимо высоких температурах делает весь процесс дорогостоящим.

Составляя основу круговорота углерода в биосфере, бактерии являются перспективными объектами для решения проблем рационального природопользования, а именно: 1) создания технологий эффективного обезвреживания отходов на стадии производства, что будет препятствовать попаданию в окружающую среду вредных соединений, и 2) создания технологий и методов обезвреживания токсикантов, уже попавших в окружающую среду. Только энзиматическое дегалогенирование позволяет получать безопасные продукты разложения галогенированных фенолов.

Вышесказанным обусловлена необходимость всестороннего изучения ферментативных процессов разложения ксенобиотиков. Такой подход позволяет не только интенсифицировать микробную деградацию трудно разлагаемых соединений, но способствует пониманию процессов эволюции путей метаболизма, что, в свою очередь, может служить основой для лабораторного создания биодеградативных путей и отдельных ферментов с заранее заданными свойствами.

Исторически изучение микробного разложения ксенобиотиков начали с грамотрицательных бактерий, преимущественно псевдомонад. Однако более поздние исследования грамположительных бактерий показали, что их метаболический потенциал не ниже, чем у микроорганизмов других групп, а ряд физиологических отличий, в частности, устойчивость к стрессовым воздействиям и способность к длительному периоду метаболической активности, делают их перспективным объектом как для изучения фундаментальных вопросов (например, изучение основ субстратной специфичности ферментов), так и в прикладном аспекте. Все это, плюс широкое распространение бактерий рода Rhodococcus в почве, и, самое главное, - способность разлагать широчайший круг абиотических соединений, определило наш интерес к этой группе бактерий.

Состояние вопроса. К началу настоящей работы было известно, что первые этапы разложения разнообразных ароматических соединений микроорганизмами приводят к образованию ограниченного числа ключевых интермедиатов, дальнейшее превращение которых проходит по нескольким метаболическим путям. Одним из ключевых интермедиатов является пирокатехин [Ornston, 1966], его разложение по орто-пути последовательно катализируют пирокатехин 1,2-диоксигеназа (ПК 1,2-ДО), муконатциклоизомераза (МЦИ), муконолактонизомераза и еноллактонгидролаза. При росте микроорганизмов на галогенированных субстратах помимо пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-пути обнаружен второй фермент, расщепляющий 3-хлорпирокатехин, - хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа (ХПК 1,2-ДО) [Dorn, Knackmuss, 1978a; Schmidt et al., 1980]. Было показано, что трансформацию 3-хлорпирокатехина в в-кетоадипат у Pseudomonas sp. B13 осуществляют ХПК 1,2-ДО, хлормуконатциклоизомераза (ХМЦИ), диенлактонгидролаза (ДЛГ) и малеилацетатредуктаза (МАР). Этот путь назвали модифицированным ортопутем [Schlцmann, 1994]. Данные работы можно считать началом разностороннего изучения ферментов разложения (хлор)пирокатехинов и это было одним из немногих результатов, полученных к началу наших экспериментов. Дальнейшие исследования, относящиеся с девяностым годам, также проводились в основном на грамотрицательных бактериях [Pieper et al., 1985, 1988]. Установлено, что гены, кодирующие ферменты модифицированного орто-пути у грамотрицательных бактерий, организованы в опероны сходной структуры и характеризуются высокой степенью идентичности. Показано, что ферменты, катализирующие аналогичные реакции разложения, характеризуются рядом общих свойств, тем не менее, субстратная специфичность ферментов находится в прямой зависимости от тех субстратов, которые являются ключевыми интермедиатами при разложении ксенобиотиков [van der Meer et al., 1991a,b]. Предпринятая позже попытка методом сайт-направленного мутагенеза изменить субстратную специфичность (хлор)муконатциклоизомераз у грамотрицательных бактерий не дала однозначных результатов. [Vollmer et al., 1998, Kaulmann et al., 2001]. Также ничего не было известно о пространственной структуре хлорпирокатехаз из грамотрицательных бактерий; остался откры-ым вопрос об основах различий субстратной специфичности этих ферментов. На момент начала нашей работы практически ничего не было известно о ферментах разложения хлорпирокатехинов у родококков, но, учитывая их способность проявлять метаболическую активность, можно было предположить, что эта группа микроорганизмов представляет несомненный интерес для исследователей с точки зрения изучения влияния токсикантов на живые системы.

Цель настоящей работы.

В связи с обозначенными предпосылками, целью работы явилось изучение организации биодеградативных путей бактерий рода Rhodococcus для выявления биохимических и молекулярных основ метаболической активности штаммов-деструкторов устойчивых поллютантов.

Для достижения поставленной цели было необходимо выполнение следующих задач:

Оценка способности бактерий рода Rhodococcus разлагать или трансформировать незамещенные и замещенные ароматические соединения.

Установление путей разложения ксенобиотиков наиболее активными штаммами родококков.

Оценка активности, выделение и характеристика ферментов, участвующих в разложении бензоата, 4-метил-, 4-хлорбензоата, фенола, 2-хлор- и 4-хлорфенола у родококков.

Сравнительный анализ структурных и каталитических особенностей ферментов, участвующих в разложении ксенобиотиков у родококков.

Клонирование и секвенирование генов, кодирующих ферменты разложения хлорфенолов у родококков.

Кристаллизация хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ и расшифровка трехмерной структуры ферментов.

Выявление факторов, определяющих различия субстратной специфичности интрадиольных диоксигеназ, раскрывающих кольцо ортодигидроксибензолов.

Научная новизна работы. Проведен широкий поиск среди представителей грамположительных бактерий рода Rhodococcus на способность разлагать галогенированные ароматические соединения и отобраны наиболее активные штаммы-деструкторы.

Изучены процессы разложения 2- и 4-хлорфенолов, бензоата, фенола, 4-метилбензоата штаммами R. opacus 1cp, R. ruber P25, R. rhodnii 135, R. rhodochrous 89. Показано, что при использовании в качестве ростового субстрата каждого из эти соединений у родококков происходила индукция уникального набора ключевых ферментов, в первую очередь диоксигеназ, которые по субстратной специфичности можно разделить на три группы - пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-пути, хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы модифицированных орто-путей, метилпирокатехин 1,2-диокси-геназы. Впервые всесторонне охарактеризованы ферменты разложения 4-хлорпирокатехина: 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатциклоизомераза, диенлактонгидролаза штамма R. opacus 1cp. Показано, что по физико-химическим и каталитическим свойствам они значительно отличаются от аналогичных ферментов из грамотрицательных бактерий. родококк ксенобиотик секвенирование штамм

Исследовано разложение 3-хлорпирокатехина у R. opacus 1cp, что позволило обнаружить новый модифицированный орто-путь, который до сих пор в литературе не описан. Клонирован оперон, кодирующий ферменты 3-хлорпирокатехиновой ветви модифицированного орто-пути у штамма R. opacus 1cp. Сравнение нуклеотидных последовательностей, кодирующих ключевые ферменты, показало, что хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа и хлормуконатциклоизомераза из R. opacus 1cp ближе к аналогичным ферментам обычного орто-пути грамположительных бактерий, чем к хлорпирокатехазам модифицированного орто-пути грамотрицательных бактерий.

Изучены свойства муконатциклоизомеразы обычного орто-пути штамма R. rhodochrous 89 и установлено, что этот фермент отличается по субъединичному составу и свойствам от всех известных муконатциклоизомераз и занимает промежуточное положение между аналогичными ферментами грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Впервые изучено превращение 2-галомуконата (фтор-, хлор-) (хлор)муконатциклоизомеразами грамположительных бактерий - реакция, которую можно считать определяющей при характеристике ферментов этого класса. Обнаружены их существенные отличия от ферментов из грамотрицательных бактерий. Показано, что муконат- и хлормуконатциклоизомеразы из R. opacus 1cp способны выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата, что приводит к образованию 5-галомуконолактона. Реакцию превращения 5-гало-муконолактона в цисдиенлактон у R. opacus 1cp при росте на 2-хлорфеноле катализирует новый фермент, хлормуконолактондегалогеназа, аналог которого отсутствует в модифицированных орто-путях грамотрицательных бактерий. Обнаружена необычная способность муконатциклоизомеразы из штамма R. rhodochrous 89 осуществлять превращение 2-хлормуконата, 2-хлор- и 5-хлормуконолактона в цисдиенлактон, а не в его транс-изомер, что характерно для грамотрицательных бактерий.

Впервые методом рентгеноструктурного анализа расшифрована пространственная структура хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 3-хлор- и 4-хлорпирокатехиновых ветвей модифицированного орто-пути штамма R. opacus 1cp на основании разработанного нами способа получения высокоочищенных препаратов этих ферментов и наличия их полной аминокислотной последовательности. Показано, что каждый фермент состоит из двух каталитических доменов и одного связующего центрального домена, содержащего две молекулы фосфолипидов. Установлено, что структура центральной части каталитических доменов не отличается от таковой других интрадиольных диоксигеназ и содержит атом трехвалентного железа, пятикоординированный двумя остатка-ми гистидина, двумя остатками тирозина и гидроксилом воды. Тем не менее, в структуре активного центра обнаружены дополнительно по молекуле бензоата (у 4-ХПК 1,2-ДО) и бензогидроксамата (у 3-ХПК 1,2-ДО). Проведенное сравнение структур активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО позволило сделать предположение, что разница в субстратной специфичности этих ферментов опосредуется парами измененных аминокислотных остатков в той части, которая отвечает за связывание фермента с субстратом, прежде всего Val53/Ala53, Tyr78/Phe78 и Ala221/Cys224 (3-ХПК 1,2-ДО/4-ХПК 1,2-ДО).

Практическое значение работы. Проведенные нами исследования позволили создать коллекцию наиболее активных штаммов, способных разлагать устойчивые галогенированные поллютанты - хлор- и фторфенолы, хлорбензоаты, хлорбифенилы. При разложении 2- и 4-хлорфенолов получены штаммы, адаптированные к высоким концентрациям токсикантов и характеризующиеся высокой скоростью их разложения. Ряд результатов - изучение особенностей процессов биодеструкции хлорфенолов штаммом R. opacus 1cp; разработка способов интенсификации процесса разложения токсикантов в биореакторе; возможность на основании полученных данных по пространственной структуре молекул методом сайт-направленного мутагенеза получать ферменты с заданной/измененной субстратной специфичностью - позволяет создать высокоэффективные бактериальные или ферментные препараты для очистка загрязненных территорий, а также оптимизировать процессы биоремедиации и очистки промышленных стоков, содержащих галогенированные ксенобиотики.

Материалы диссертационной работы используются в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ и в лекциях для молодых ученых на Всероссийских конференциях, организуемых Пущинским Научным центром.

Связь работы с крупными научными программами. Результаты, представленные в данной работе, были получены в ходе выполнения исследований, проведенных в рамках тем: приоритетные направления АН СССР 0203 «Микробная деградация пестицидов», проектов программы ГНТП СССР/Министерства Науки РФ «Новейшие методы биоинженерии» (основное направление «Биотехнология защиты окружающей среды»); тем ИБФМ РАН «Новые микроорганизмы и ферментные пути для биоремедиации загрязненных сельскохозяйственных угодий» (№ гос. рег. 01.86.0 009.296), «Клеточные механизмы разложения неприродных и высокоустойчивых природных соединений базидиомицетами и коринеподобными бактериями» (№ гос. Рег. 0120.0403401), проектов РФФИ № 98-04-49393-а, № 05-04-49659, РФФИ-Наукоград 04-04-97266, РФФИ-Урал № 07-04-97625, международных грантов: NATO Linkage Grant HT 951032, NWO РФФИ-Нидерланды № 047.007.021; INCO Сopernikus (ERCIC15CT960103, ICA 1999-10046), DAAD (1992-1994, 2004), DFG N436 Rus 113/59/0, РФФИ-Германия ННИО_а № 99-04-04002.

Апробация результатов и публикации. Результаты данной работы были представлены для обсуждения на международном конгрессе по химии пестицидов (Гамбург, Германия, 1990; Вашингтон, США, 1994), на втором всесоюзном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии» (Самарканд, 1991), третьем международном симпозиуме по биологии и биотехнологии псевдоманад (Триест, Италия, 1991), на ежегодных конференциях немецкого микробиологического общества (1993, 1994, 2000гг), на 94-й конференции американского микробиологического общества (Лас Вегас, США, 1994), на конференции «Биотехнология защиты окружающей среды» (Пущино, 1994), на международном рабочем семинаре EERO «Энзиматические и генетические аспекты биотехнологии окружающей среды» (Пущино, 1995), на международном симпозиуме «Современные проблемы микробной биохимии и биотехнологии» (Пущино, 2000), на конференции «Биотехнология-2000» (Пущино, 2000), на конференции «Подготовка специалистов-биотехнологов для пред-приятий и организаций России» (Пущино, 2004), на второй европейской конференции «Оксиферменты» (Неаполь, Италия, 2004), на международных конференциях «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, Россия, 2005), INCOMID-2005 (Пермь, Россия, 2005) и «Сов-ременное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск-Раков, Беларусь, 2006). А также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН (1998-2006).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит 54 таблицы и 67 рисунков. Список литературы включает 494 наименований, из них 474 - публикации в иностранных журналах.

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту д.б.н., профессору, заслуженному деятелю науки РФ Л.А.Головлевой за многолетнюю помощь и поддержку; коллегам, участвовавшим в проведении исследований, чей вклад отражен в совместных публикациях: д.б.н. Е.Л.Головлеву, к.б.н. О.В.Мальцевой , к.б.н. В.М.Травкину, к.б.н. О.В.Моисеевой, к.б.н. М.П.Коломыцевой, асп. О.В.Лисняк, студентке М.М.Суворовой, лаборантам Г.И.Захаровой, Н.Н.Земской; другим сотрудникам института, помогавшим в проведении исследований, а также сотрудникам ИГЭМО (г.Пермь): к.б.н. Е.Г.Плотниковой, к.б.н. Д.О.Рыбкиной, асп. Е.С.Шумковой.



СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В обзоре описаны основные пути разложения ключевых интермедиатов ((галогенированных)пирокатехинов, протокатехоата, гидроксигидрохинона), образующихся при бактериальной деструкции ароматических соединений с упором на (гало)фенолы, 2,4-д, (хлор)бифенилы.

Материалы и методы исследований

Материалы. Реактивы, используемые для приготовления минеральных сред, были аналитической чистоты («Реахим», СССР). Биохимические реактивы были получены от фирм «Sigma» (США) и «Serva» (Германия). 3-Ме-тилпирокатехин - «Koch-Light» (Англия); 4-метилпирокатехин - «Fluka» (Швейцария). Монофторированные фенолы были получены от фирмы Janssen Chimica (Бельгия), ди-, три- и тетрафторфенолы, 2- и 4-хлорфенолы - от фирм Aldrich (Steinheim, Германия) и Fluorochem (Derbyshire, Великобритания). Реактивы для электрофореза в полиакриламидном геле - от «Bio-Rad» (США).

Микроорганизмы. В данной работе использованы следующие микро-организмы: штамм Rhodococcus opacus 1cp, способный использовать бензоат, 4-хлорфенол (4-ХФ) и 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ), был выделен из на-копительной культуры, поддерживаемой в течение нескольких месяцев с 2,4-ДХФ [Горлатов с соав., 1989]. Вариант данного штамма, растущий на 2-хлорфеноле (2-ХФ) и 3-хлорбензоате (3-ХБК), получен после длительной адаптации к указанным субстратам [Моисеева с соавт., 1999]. Штамм R. rhodochrous 89 выделен из песчаной почвы соснового леса в пойме реки Волга; штамм Rhodococcus rhodnii 135 выделен методом накопительных культур из почвы, загрязненной нефтью, дизельным топливом и хлорфенолами, штамм Rhodococcus opacus 1G выделен методом накопительных культур из почв, загрязненных нефтью, в районе Самары; штамм Rhodococcus ruber Р25, выделен из почв, загрязненных галогенированными ароматическими соединениями [Плотникова с соавт., 2006].

Для культивирования родококков использована минеральная среда следующего состава (г/л): Na2HPO4 0.7; KH2PO4 0.5; NH4NO3 0.75; MgSO4 x 7H2O 0.2; MnSO4 0.001; FeSO4 0.02. Для получения биомассы проводили периодическое культивирование штаммов в 10-ти литровом биореакторе с объемом среды 7-7,5 литров. Субстраты вносили дробно по 50-250 мг/л. За ростом культур следили по снижению потребления кислорода, изменению значения рН и изменению оптической плотности клеточной суспензии. рН ростовой среды поддерживали на уровне 7.0-7.2 периодическими внесениями 0.1 М NaOH. Для выделения ДНК R. opacus 1cp выращивали при 30?С в минеральной среде, рН 7.2 [Dorn et al., 1974] c двойной концентрацией фосфатного буфера, содержащей 20 г/л глицина и 2 г/л глюкозы. Штамм P. putida PRS2000 [Ornston, 1966] выращивали в той же среде без глицерина и глюкозы, но с 5 мМ бензоата натрия в качестве источника углерода и энергии. E. coli DH5б выращивали на LB среде [Sambrook et al., 1989] с 100 мг/мл ампицилина при 37?С. Для приготовления бесклеточных экстрактов штамм R. opacus 1cp выращивали на бензоате, пара-толуате, 2-хлорфеноле и 4-хлорфеноле; штаммы R. rhodochrous 89, R. opacus 1G и R. rhodnii 135 - на феноле, R. ruber P25 - на 4-хлорбензоате (4-ХБК), пара-гидроксибензоате и пара-толуате. Биомассу размораживали, к клеточной суспензии добавляли дитиотреитол и MnSO4 до конечной концентрации 0.1 и 2 мМ, соответственно. Разрушение клеток проводили экструзионной дезинтеграцией на ИБФМ-прессе с рабочим давлением 3200 кГ/см2 или на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (США) мощностью 150 Вт при 20 кГц в течение 30 мин.

Активность ферментов определяли на спектрофотометрах Shimadzu UV-160 (Япония) или Kontron Uvikon 810 P (Германия) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см при 25?С. Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующее превращение одного µмоль субстрата или образование одного µмоль продукта в минуту. Относительную активность рассчитывали, принимая за 100 %-ную активность с незамещенным или с лучшим субстратом. Активность ферментов с фторированными субстратами определяли методом фтористого ядерно-магнитного резонанса на приборе Bruker DPX 400. Химические сдвиги соединений рассчитывали, принимая за ноль пик CFCl3. В качестве внутреннего стандарта использовали 4-фторбензоат. Анализ продуктов превращения хлорированных и фторированных соединений методом ВЭЖХ проводили на Waters M600-PDA хроматографе с Waters 996 фотодиодным детектором, используя обращенно-фазовые колонки Alltima C18 размером 4.6 х 150 мм (Alltech, Нидерланды) и Grom SIL 100 C8 («Grom», Германия) размером 4.6 х 125 мм. Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц определяли электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS по модифицированному методу Лэммли [Laemmli, 1970] на пластинах с 10, 12 или 15%-ным акриламидом в разделяющем геле. Гель окрашивали по модифицированному методу Меррила [Merril et al., 1981]. Для калибровки использовали стандартные наборы низко- или высокомолекулярных белков фирмы «Sigma» (США). Молекулярную массу нативных белков определяли электрофорезом в ПААГ и гель-фильтрацией на колонке Superose 6 (HR 10/30). Для электрофореза использовали готовые пластины Mini-Protean II («Bio Rad») с 4-20% полиакриламидным градиентом в 0.375 М Tris-HCl, рН 8.8. N-концевую аминокислотную последовательность белков определяли после нанесения белка на пластину с ПААГ-SDS, проведения электрофореза и электропереноса на мембрану Immobilon P («Millipore», США). Мембрану окрашивали Кумасси R-250, белковую линию вырезали. Определение аминокислотной последова-тельности проводили на приборе Applied Biosystems модель 473 А. Аминокислотный состав белков определяли после гидролиза 6 N HCl (110?С, 24 ч) на аминокислотном анализаторе Waters PICO-TAG [Bidlingmeyer et al., 1984]. Очистку ферментов проводили с использованием носителей и колонок фирм Pharmacia (Швеция) и Toyo-Soda (Япония), используя установки “BioPilot” и “FPLC” фирмы Pharmacia: DEAE-Toyopearl 650M (180-240 мл), Sephacryl S-200 (250 мл), Q-Sepharose FF (20 мл), Q-Sepharose HP (60 мл), Superose 6, Superose 12 (25 мл), Superdex 75 (120 мл), Superdex 200 (120 мл), MonoQ 10/10 (6 мл), Mono Q 5/5 (1 мл), Resource Q (6 мл), Resource Iso (1 мл), Resource Phe (1 мл), Phenyl Superose HR 10/10 (8 мл), Butyl-Sepharose (20 мл), для концентрирования белков использовали ячейки для ультрафильтрации фирмы «Amiсon» объемом 10, 50 и 250 мл, размер пор мембран варьировал от 10000 до 30000. Для кристаллизации 4-ХПК 1,2-ДО использовали фермент, очищенный по обычной схеме из 100 г биомассы. Для первоначальных опытов использовали Hampton Research Crystal Screen и Crystal Screen 2, используя метод сидячей капли. 1 мл белкового раствора (20 мг/мл) в 20 мМ Tris-SO4, pH 7,2, в смеси с 1 мл резервного раствора уравновешивали против 500 мл преципитирующего раствора. Для кристаллизации 3-ХПК 1,2-ДО использова-ли белок, очищенный согласно обычной схеме. Начальную кристаллизацию проводили в Hampton Research Crystal Screen I и II методом сидячей капли. Для этого 1 мл белкового раствора (15 мг/мл) в 20 мМ Tris-SO4, pH 7,2, смешивали с равным объемом резервного раствора и уравновешивали против 50 мл преципитирующего раствора в плашках Chryschem на 96-ячеек. Результаты, позволившие получить кристаллы, в дальнейшем были оптимизированы. Рентгеноструктурный анализ кристаллов 4-ХПК 1,2-ДО проводили на приборе Bruker, используя вращающийся анодный источник, сопряженный с 1К CCD детектором, используя дифракцию при 3.5 Е. Полный набор данных при 100?К были получены в программе EMBL beamline BW7A в DORIS, DESY (Гамбург, Германия). Данные были получены с MAR CCD детектором и длиной волны 1,01 Е. Данные рассчитывали с использованием программы DENZO SCALEPACK [Otwinowski & Minor, 1997]. Рентгено-структурный анализ кристаллов 3-ХПК 1,2-ДО проводили при 100?К на X-ray дифракционном Вeamline Elettra синхротроне (Триест, Италия), используя длину волны 1,01 Е. Данные получали с MAR CCD детектором с максимальным разрешением 2,0 Е.

Геномную ДНК выделяли по стандартной процедуре [Eulberg et al., 1997]. Плазмидную ДНК из E. coli DH5б выделяли с помощью набора Pharmacia Flexiprep. Векторную ДНК, разрезанную одной рестриктазой, дефосфорилировали перед лигированием. Для клонирования продукта ПЦР Т-вектор готовили как описано Марчуком с соавт. [Marchuk et al., 1991]. Фрагменты ДНК для лигирования или метки дигогсигенином выделяли из геля с использованием набора Easy Pure (Biozym). Компетентные клетки готовили из E. coli DH5б, последующую трансформацию проводили по методу Иное с соавт. [Inoue et al., 1990]. Наличие вставки ДНК определяли на чашках с LB, содержащей 0,13 мМ IPTG и 32 мг X-Gal, по цветовому признаку. Для проведения ПЦР использовали олигонуклеотиды, синтезированные на основе определенной N-концевой последовательности ферментов и одного из внутренних пептидов, полученного после обработки трипсином и разделения методом ВЭЖХ. Реакционная смесь (50мл) содержала 50 пмоль каждого праймера, 0,5 мг геномной темплатной ДНК, 25 мМ каждого из дезоксинуклеозидтри-фосфата, 1х ПЦР буфер (MBI Fermentas), 2,0 Ед Таg полимеразы (MBI Fermentas), 3 мМ MgCl2.

Результаты и обсуждение

1. Оценка роста родококков на различных ароматических субстратах

Из почв по признаку роста на 3-ХБК, 2,4-Д и 4-хлорфеноле было выделено около 50 культур, в дальнейшей работе использовали два штамма, идентифицированные по данным 16Sрнк-ДНК анализа как Rhodococcus sp. 1 и Rhodococcus sp. 2.

Из коллекции д.б.н. Е.Л. Головлева (ИБФМ РАН), насчитывающей порядка 500 штаммов нокардиоподобных микроорганизмов, ауксанографически было проверено около 20 наиболее перспективных культур из группы Rhodococcus, растущих на ароматических соединениях, при этом основное внимание уделялось хлорированным фенолам и бензоатам. Определено, что бактерии рода Rhodococcus разлагали широкий спектр ароматических соединений в качестве единственного источника углерода и энергии. Так, практически все штаммы росли на твердой минеральной среде с бензоатом, фенолом. Два штамма росли на агаризованной среде с толуолом. Поддерживали рост большинства из проверенных штаммов метилированные субстраты - пара-крезол и пара-толуат. В скобках - оценка роста по пятибальной шкале. Штамм Rhodococcus minimus 1а рос на бензоате (4), п-гидроксибензоате (5), п-толуате (4), анисовой (5), феруловой (5) кислотах, 2-хлорфеноле (2), 2,4-Д (3). Для штамма R. opacus 1G показана вариабельность роста на феноле, бензоате (2-4), п-оксибензоате (ПОБК) (2-3), п-крезоле (0-4). Штамм R. opacus 6a в качестве единстенного источника углерода использовал 3-хлорбензоат (3-ХБК) (3), 2,4,6-трихлорфенол (2), феруловую кислоту (5). Широкий спектр ароматических субстратов окисляли штаммы Rhodococcus rhodochrous 172 (фенол (5), бензоат (5), п-гидроксибензоат (4), фталат (5), терефталат (3), п-толуат (4), ацетофенон (5), анисовая к-та (5), нафталин (5), п-крезол (3), 2-хлорфенол (2), 4-хлорфенол (3), 2,4-Д (3), 3-ХБК (4)); Rhodococcus opacus 557 (фенол (5), бензоат (4), м-гидроксибензоат (3), ПОБК (4), анисовая (4), феруловая (4) к-ты, п-крезол (2), фталат (4), вцетофенон (3), 2,4-Д (3), 3-ХБК (4)), Rhodococcus ruber P25 (бифенил (5), 2-хлорбифенил (3), 4-хлорбифенил (4), 4-ХБК (3), п-толуат (5), п-гидроксибензоат (5), фенантрен (1), антрацен (1)). Штаммы родококков 172 и 412 росли на нафталине.

В жидкой минеральной среде с ароматическими субстратами в качестве единственного источника углерода и энергии не все культуры были способны давать значительное увеличение плотности без добавления легко усваиваемых источников питания. В первую очередь это относится к таким соединениям, как 2-ХФ, 2,4-Д и 3-ХБК.

На рисунке 1 показаны кривые роста некоторых из проверенных родококков на бензоате, пара-толуате, феноле. Рост на бензоате сопровождался самой короткой лаг-фазой. Практически у всех культур, растущих на п-толуате, была продолжительная лаг-фаза. Наиболее быстро росли на этом субстрате штаммы 172, 400, 6а - оптическая плотность достигала максимума менее, чем за 48 часов.

Штамм Rhodococcus opacus 1cp использовал в качестве единственного источника углерода и энергии широкий набор ароматических соединений, в том числе 2,4-дихлорфенол, фенол, бензоат, п-крезол, 4-хлорфенол (4ХФ). Изначально R. opacus 1cp не был способен к росту на 2-хлорфеноле (2ХФ), рост на 4ХФ рост сопровождался увеличением оптической плотности до 0,2-0,25 ед при 560 нм, если концентрация токсиканта не превышала 100 мг/л, увеличение концентрации вносимого 4ХФ приводило к ингибированию роста культуры. В результате проведенной адаптации к 4ХФ штамм R. opacus 1cp не проявлял признаков ингибирования роста при концентрации субстрата 200 мг/л, суммарная концентрация потребленного субстрата в условиях периодического культивирования в биореакторе составила порядка 4 г/л за 48-52 ч (Рис. 2).

Рисунок 1. Кривые роста неадаптированного (1) и адаптированного (2) штамма R. opacus 1cp при культивировании в колбах. Увеличение оптической плотности при периодическом культивировании штамма 1ср в биореакторе (3).



Адаптация R. opacus 1cp привела к появлению 2ХФ+ фенотипа. В процессе культивирования на хлорированных фенолах была обнаружена морфологическая неоднородность состава популяции - выявлено две морфологически и физиологически отличающиеся формы с лабильным переходом между ними под действием токсических факторов.

Рисунок 2. Рост родококков: R. opacus 557 (1), Rhodococcus sp. 400 (2), R. rhodochrous 172 (3), R. opacus 6a (4), R. minimus 1a (5), R. opacus 1G (6) на ароматических субстратах.



Клетки R. opacus 1cp, поддерживаемые на 2-ХФ в качестве единственного источника углерода, при высеве на МПА образовывали колонии одинаковой гладкой формы (S1), имеющие розовую окраску с ровной и слегка блестящей поверхностью. Через 10-15 пересевов при культивировании исходного штамма на МПА происходило появление шероховатых форм (R) такого же розового цвета. При культивировании S-форм на хлорфенолах дальнейшей диссоциации не происходило.

Шероховатая форма, выращиваемая на хлорфенолах, давала расщепление на шероховатую R и гладкую S1 формы на 8-10 сутки культивирования. S-формы оказались наиболее приспособленными к росту на хлорфенолах, более интенсивно осуществляя их разложение, а R-форма - к росту на среде, содержащей легко усваиваемые источники углерода. В литературе описана гетерогенность популяции и R-S диссоциации у корине- и нокардиоподобных бактерий [Ames et al., 1968; Милько Е.С., Егоров, 1991]. Показана зависимость способности родококков утилизировать ароматическую фракцию арабской сырой нефти от морфотипа колоний [Iwabuchi et al., 2000, 2002, Iwabuchi et al., 1997].

Мы показали, что длительный рост на хлорфенолах привел к адаптации штамма к токсичному субстрату, при этом изменялись как физиологические, так и морфологические характеристики клеток.

2. Конверсия фторфенолов родококками

Процессы разложения галогенированных соединений изучали, используя различные методы физико-химического анализа образующихся метаболитов. Одним из наглядных и удобных является метод спектроскопии фтористого ЯМР, который позволяет использовать целые клетки родококков для анализа метаболизма орто-фторированных ди- и трифторфенолов. Субстраты и характер их превращения родококками представлены в таблицах 1, 2.



Таблица 1 - Разложение фенолов, выход фториона и накопление фторированных интермедиатов при инкубации родококков с различными орто-фторированными фенолами. Время инкубации - 2 часа. Абиотическое окисление фторфенолов отсутствовало.

Субстрат и его производные	R. opacus 1G, %	R. rhodnii 135, %	R. rhodochrous 89, %	R. opacus 1cp, %
2,3-дифторфенол Остаток фенола Выделенный F- F в интермедиатах	55 26 19	26 38 36	74 9 17	74 16 10
2,4-дифторфенол Остаток фенола Выделенный F- F в интермедиатах	49 42 9	46 53 1	75 11 14	66 32 2
2,5-дифторфенол Остаток фенола Выделенный F- F в интермедиатах	30 57 13	0 90 10	82 3 15	61 35 4
2,3,4-трифторфенол Остаток фенола Выделенный F- F в интермедиатах	43 31 26	12 35 53	90 3 7	80 13 7
2,3,5-трифторфенол Остаток фенола Выделенный F- F в интермедиатах	63 23 14	59 38 3	94 4 2	66 34 0
2,4,5-трифторфенол Остаток фенола Выделенный F- F в интермедиатах	65 28 7	19 79 2	94 5 1	79 21 0



Таблица 2 - Состав метаболитов при инкубации штаммов родококков с орто-фторированными ди- и трифторфенолами. За 100% принято общее количество фторированных продуктов (за исключением фторфенола и фтор-иона). «-», фторированных метаболитов было менее 2% от их общего количества.

Фторированные метаболиты	R. opacus 1G, %	R. rhodnii 135, %	R. rhodochrous 89, %	R. opacus 1cp, %
2,3-дифторфенол 3-фторпирокатехин 3,4-дифторпирокатехин 2-фтормуконат 2,3-дифтормуконат неизвестные	81±2 16±1 1±1 0 2±1	50±3 23±5 24±2 1±1 2±1	5±3 87±6 0 5±3 3±2	11±3 0 58±4 0 31±2*
2,4-дифторфенол 4-фторпирокатехин 3,5-дифторпирокатехин 3-фтормуконат 2,4-дифтормуконат неизвестные	47±30 16±8 0 0 37±37*	- - - - -	5±3 94±3 0 1±1 0	- - - - -
2,5-дифторфенол 4-фторпирокатехин 3,6-дифторпирокатехин 3-фтормуконат 2,5-дифтормуконат неизвестные	64±9 0 0 0 36±9*	9±9 12±12 0 74±17 5±5	0 47±5 0 53±5 0	1±1 2±1 0 17±6 80±7*
2,3,4-трифторфенол 3,4-дифторпирокатехин 3,4,5-трифторпирокатехин 2,3-дифтормуконат 2,3,4-трифтормуконат неизвестные	81±1 19±1 0 0 0	79±1 21±2 1±1 0 0	0 100±0 0 0 0	7±4 3±2 0 39±8 51±2*
2,3,5-трифторфенол 3,5-дифторпирокатехин 3,4,6-трифторпирокатехин 2,4-дифтормуконат 2,3,5-трифтормуконат неизвестные	98±1 0 0 0 2±1	78±5 2±2 1±1 5±5 14±9	- - - - -	- - - - -
2,4,5-трифторфенол 4,5-дифторпирокатехин 3,4,6-трифторпирокатехин 3,4-дифтормуконат 2,3,5-трифтормуконат неизвестные	95±2 0 0 0 5±2	- - - - -	- - - - -	- - - - -

Примечание. * Превращение 2,3-дифтор- и 2,3,4-трифторфенола приводило к образованию основного метаболита, дающего сигнал при сдвиге -189.9 ppm и минорного при -196.6 ppm, для 2,4- и 2,5-дифторфенолов - основной метаболит регистрировался при сдвиге -90.3 ppm и минорные при сдвигах -100.3 и -113.2 ppm (2,4-дифторфенол) и -126.1 и -113.2 ppm (2,5-дифторфенол).

Выявленные существенные различия в превращении фторфенолов родококками заключаются как в количестве образующихся интермедиатов, так и в их природе. Так, у штамма R. opacus 1G фенолгидроксилаза (ФГ) преимущественно осуществляла гидроксилирование фенолов во втором положении, что, сопровождаясь дефторированием, приводило к образованию соответствующих фторпирокатехинов, доля которых преобладала среди других интермедиатов. Это указывало на лимитирующую роль ПК 1,2-ДО.

Для штамма R. rhodnii 135 закономерностей в природе и уровне накапливающихся интермедиатов выявлено не было. Разложение 2,3-дифтор-фенола приводило к накоплению пирокатехинов и муконатов (Рис. 3). Разложение 2,3,4- и 2,3,5-трифторфенолов происходило с преимущественным накоплением фторпирокатехинов, утилизация 2,5-дифторфенола сопровождалась накоплением фтормуконатов. В то же время, при разложении 2,4-дифтор- и 2,4,5-трифторфенолов значительного накопления фторированных интермедиатов не наблюдалось. Окислительное дефторированное в С2 преобладало над гидроксилированием в С6 положении. Отмечена закономерность - если на первом этапе разложения окислительное дефторирование преобладает над гидроксилированием в С6 положении (2,3,4- и 2,3,5-трифторфенолы), наблюдалось накопление пирокатехинов. В случае преимущественного гидроксилирования в С6 положении (2,5-дифторфенол) происходила аккумуляция муконатов. Таким образом, разложение фторфенолов R. rhodnii 135 определялось активностью ФГ и ПК-ДО, а лимитирующий этап в их превращении был связан с активностью ферментов, превращающих муконаты.

Штамм R. rhodochrous 89 весь спектр фторфенолов разлагал с накоплением разнообразных метаболитов. Региоселективность ФГ обуславливала преимущественное гидроксилирование в С6 по сравнению с С2 положением.

Обнаруженные отличия штамма R. opacus 1cp по метаболитному профилю выражались в накоплении большого количества неидентифицированных фторированных метаболитов. Отличие от других штаммов выражалось также в более высоком уровне накопления муконатов по сравнению с пирокатехинами. Лимитирование в данном случае происходило на более поздних этапах. Региоселективность ФГ зависела от заместителей в ароматическом кольце. Как и ФГ из R rhodnii 135 и R. opacus 1G, фермент из R. opacus 1cp был способен катализировать окислительное дефторирование, например, 2,3-дифторфенола (табл. 1, 2).

Анализ динамики разложения фторфенолов штаммами родококков показал, что только после полного исчезновения исходного субстрата количество накопленных интермедиатов начинало снижаться, сопровождаясь элиминацией фтор-иона (табл. 2, рис. 3).

Таким образом, полученные данные свидетельствовали о достаточно широкой специфичности ферментов начальной атаки у родококков.

Активность ферментов в бесклеточных экстрактах

Определена активность ключевых ферментов превращения (галогенированных) пирокатехинов. В таблице 3 приведена активность ПК 1,2-ДО в бесклеточных экстрактах, полученных при выращивании штамма R. opacus 1cp на различных ароматических субстратах. Нами показано, что скорость разложения 3-ХПК у R. rhodochrous 89, R. rhodnii 135, R. opacus 1cp, выращенного на 2-ХФ и 4-метилбензоате, а также, взятого для сравнения

Рисунок 3. 19F ЯМР спектры превращения 2,3-дифторфенола (a) R. opacus 1G, (b) R. rhodnii 135, (c) R. opacus 1cp.



Таблица 3 - Удельная (относительная) активности ПК 1,2-ДО в бесклеточных экстрактах штамма R.opacus 1cp, выращенного на разных субстратах

Субстрат для ПК-ДО	Ростовой субстрат
	Бензоат	2-ХФ	4-ХФ	4-МБК
ПК 3-ХПК 4-ХПК 3,5-ДХПК	0.079 (100%) 0.002 (2.5%) 0.0025 (3.15) 0.0015 (1.9%)	0.0227(100%) 0.0139(50.6%) 0.007 (26%)	0.066 (100%) 0.010 (15%) 0.060 (91%) 0.011 (17%)	0.53(100%) 0.15(29%)

штамма P. pitida 87, выращенного на 3-ХБК, примерно одинаковы, однако, было непонятно, является ли это результатом индукции нескольких диоксигеназ или определяется специфичностью одного фермента. Выделение и очистка ферментов позволили выяснить количество диоксигеназ в каждом случае.

4. Ферменты обычного орто-пути, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus 1cp на бензоате

Было проведено изучение ключевых ферментов обычного орто-пути разложения пирокатехина (рис. 4), индуцирующихся при росте штамма на нетоксичном субстрате, в данном случае - на бензоате. Эти исследования послужили отправной точкой и одновременно «контролем» для изучения свойств ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus 1cp на галогенированной ароматике. Была обнаружена активность ПК 1,2-ДО и муконатцикло-изомеразы (МЦИ). Определение относительной активности ПК 1,2-ДО с пирокатехином и замещенными пирокатехинами показало, что хлорированные субстраты расщепляются на уровне, не превышающем 3,2% от уровня превращения пирокатехина (табл. 3). Относительные скорости превращения 3- и 4-метилпирокатехинов по отношению к пирокатехину составили, соответственно, 99 и 88%.

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа в результате очистки разделялась на два пика, обозначенных как ПК ДОI-1 и ПК ДОI-2. Удельная активность ПК ДО I-1 составила 12 ед/мг белка, степень очистки - 151 раз. Удельная активность ПК ДО I-2 составила 11 ед/мг белка, степень очистки - 136 раз. Для всех дальнейших экспериментов использовали препарат ПК ДОI-1 с более высокой удельной активностью. ПК ДОI была охарактеризована как гетеродимер, с молекулярной массой 67 кДа и субъединичной молекулярной массой 35 и 33 кДа.

Определение субстратной специфичности ПК ДО показало, что активность с ПК:3-МПК:4-МПК составляла, соответственно, 100:98,7:87,5%. Активность с хлорированными пирокатехинами не превышала 2% по сравнению с активностью с пирокатехином. Км для пирокатехина была 3,3·10-6 М, для 4-ХПК - 17,6·10-6 М. рН оптимум ПК-ДО равнялся 7,8, температурный оптимум - 35°С.

Муконатциклоизомераза характеризовалась высокой термостабильностью при 60єС. Субъединичная молекулярная масса равнялась 40 кДа. Лучшим субстратом для нее был незамещенный цис, цис-муконат (Табл. 4). Скорость превращения других субстратов была минимум в три раза ниже. И хотя значения КМ для всех проверенных субстратов, за исключением 3-хлормуконата, были одного порядка, наивысшее значение константы специфичности было рассчитано для цис, цис-муконата.

МЦИ осуществляла превращение 2-хлормуконата с образованием единственного продукта - 5-хлормуконолактона (5-ХМЛ). Не было обнаружено транс-диенлактона ни спектрофотометрически, ни методом ВЭЖХ. (+)-5-ХМЛ, используемый в качестве субстрата для МЦИ, превращался в 2-хлормуконат. (+)-2-Хлормуконолактон (2-ХМЛ) не являлся субстратом для МЦИ.

Таким образом, изучение особенностей роста штамма R. opacus 1cp на бензоате показало, что утилизация данного субстрата сопровождается индукцией ферментов, относящихся к обычному орто-пути - двух ПК 1,2-ДО и МЦИ.



Рисунок 4. Пути орто-расщепления (хлор)пирокатехинов. (A) - обычный орто-путь; (В) - 4-хлорпирокатехиновая ветвь модифицированного орто-пути.

У грамотрицательных бактерий при росте на бензоате может индуцироваться несколько изоферментных ПК 1,2-ДО: три у Pseudomonas arvilla C-1 [Nakai et al., 1990], по две у Acinetobacter lwoffii K24 [Kim et al., 1997], Frateuria sp. ANA-18 [Aoki et al., 1984; Murakami et al., 1999], Acinetobacter radioresistens [Briganti et al., 2000] и две муконатциклоизомеразы у Frateuria sp. ANA-18 [Murakami et al., 1998], а при росте на 3-хлоранилине Pseudomonas acidovorans CA28 и на 3-хлорбензоате P. putida 87 и Pseudomonas sp. B13 были обнаружены ПК 1,2-ДО и ХПК 1,2-ДО [Hinterregger et al., 1992; Dorn & Knackmuss, 1978a].

Таблица 4 - Субстратная специфичность МЦИ из R. opacus 1cp, выращенного на бензоате

Субстрат	Км (мМ)	Vmax (Ед/мг белка)	Kcat (мин-1)а	kcat /Км (мМ-1•мин-1)
цис,цис-муконат 2-хлор-муконат 3-хлормуконат 2-метилмуконат 3-метилмуконат 2,4-дифтормуконат	81,3±14 55,9±0,1 1240±694 66,7±23,6 48,7±10,7	36,9±3,9 5,4±0,1 13,2±6,8 3,0±0,5 4,8±0,5 <0,01б	1480 216 528 120 192	18,2 3,9 0,4 1,8 3,9

а Значение kcat рассчитывали на основании молекулярной массы равной 40 кДа;

б по данным ВЭЖХ 2-фтормуконат при концентрации 0,5 мМ не ингибирует активность ХМЦИ с 3-хлормуконатом в концентрации 0,2 мМ.

Охарактеризованные нами ферменты штамма R. opacus 1cp на первый взгляд по каталитическим свойствам были типичными представителями обычного орто-пути, однако их существенным отличием от аналогичных ферментов грамотрицательных бактерий была способность МЦИ выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата.

5. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus 1cp на 4-ХФ

Определение активности ферментов в бесклеточном экстракте R. opacus 1cp, выращенного на 4-хлорфеноле, показало наличие всех ферментов модифицированного орто-пути, ранее описанного для грамотрицательных бактерий, - диоксигеназы, проявляющей высокую активность не только с пирокатехином, но и с хлорированными субстратами, ХМЦИ, активной только с хлорированными муконатами (Табл. 5). Необычной была активность ДЛГ - транс-диенлактон почти не гидролизовался данным ферментом.

Таблица 5 - Активность ферментов модифицированного орто-пути у штамма R. opacus 1cp, выращенного на 4-хлорфеноле (4-ХФ) и 2-хлорфеноле (2-ХФ)

Фермент	Субстрат для определения активности	Активность удельная (ед/мг белка) и относительная при росте штамма на
		4-ХФ	2-ХФ
ПК-ДО	Пирокатехин 3-ХПК 4-ХПК 3,5-ДХПК	0,066 (100%) 0,010 (15%) 0,060 (91%) 0,011 (17%)	0,0227 (100%) 0,0139 (50.6%) 0,007 (26%) 0
МЦИ	Муконат 2-ХМ 3-ХМ	0,004 (4,3%) 0,068 (73,1%) 0,093 (100%)	0 0,046 (100%) 0
ДЛГ	транс-диенлактон цис-диенлактон	0,016 (3,4%) 0,471 (100%)	0,0019 (1%) 0,194 (100%)
МАР	Малеилацетат (NADH) Малеилацетат (NADPH)	0,643 (59,8%) 1,076 (100%)

Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, индуцирующаяся при росте R. opacus 1cp на 4-хлорфеноле (4ХПК 1,2-ДО) была адаптирована к разложению субстратов, несущих заместители в пара-положении, что подтверждается значениями константы специфичности, которые на порядок выше для пара-замещенных пирокатехинов по сравнению с мета-замещенными субстратами (Табл. 6). Данный факт указывает на высокую адаптацию ХПК 1,2-ДО к расщеплению именно 4-ХПК - интермедиата разложения 4-ХФ. 3-ХПК - интермедиат разложения 2-ХФ - расщеплялся данным ферментом не очень эффективно, хотя, скорее всего, этот этап не являлся бы “узким местом” деградации 2-ХФ вариантом штамма R. opacus 1cp, выращенным на 4-ХФ.

Таблица 6 - Субстратная специфичность 4-ХПК-ДО из R. opacus 1ср. Значения kcat были рассчитаны, исходя из субъединичной массы 26,5 кДа.

Субстрат	Kм или Ki*, мM	Vmax, %	kcat, min-1	kcat/Kм min-1 мM -1
пирокатехин	22,3	100	268	12
3-хлорпирокатехин	2	14	36	18
4-хлорпирокатехин	1,2	95	253	211
3-метилпирокатехин	27	208	557	21
4-метилпирокатехин	4,2	242	648	154
3-фторпирокатехин	5,7	12	33	6
4-фторпирокатехин	9,5	212	269	28,3
3-метоксипирокатехин	22,2	19	51	2,3
3,5-дихлорпирокатехин	1,2	18	49	41
3,6-дихлорпирокатехин	6,8	5	14	2
4,5-дихлорпирокатехин	1,9	5	14	7
3,4,5-ТХПК	0,7 *	-	-	-
3,4,5,6-ТетХПК	0,6 *	-	-	-

Ингибиторный анализ показал, что пирокатехины, содержащие в своем составе три или четыре атома хлора, являются конкурентными ингибиторами 4-ХПК 1,2-ДО, при этом их отличает высокое сродство к данному ферменту.

Хлор- и метилпроизводные фенола, аналоги пирокатехинов, также оказывали ингибирующее действие на изучаемый фермент (Табл. 7). Тип ингибирования был определен как конкурентный. Самыми сильными ингибиторами были трихлорфенолы. Замена галогена на метильную группу снижает сродство соединения к ферменту.

Хлормуконатциклоизомераза, выделенная из биомассы R. opacus 1cp, выращенного на 4-ХФ (ХМЦИ), не превращала 2-хлормуконата в транс-диен-лактон - реакцию, обычную в метаболизме 3-ХПК ферментами модифицированного орто-пути грамотрицательных бактерий, однако эффективно циклоизомеризовала ряд муконатов, отдавая предпочтение 2,4-дихлор- и 3-хлор-муко-натам (Табл. 8). 3-Хлор-цис,цис-муконат, как показано, превращался ХМЦИ в цисдиенлактон.



Таблица 7 - Константы ингибирования 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1ср. н.о. - не определено

Ингибитор	Ki, мкM
	4-ХПК-1,2-ДО	3-ХПК-1,2-ДО
	Пирокатехин	4-ХПК	Пирокатехин
фенол	1800	2000	91
2-хлорфенол	38	35	0.55
3-хлорфенол	70	80	1.02
4-хлорфенол	150	150	30.7
2,4-дихлорфенол	6	11	0.23
2,5-дихлорфенол	6	н.о.	0.127
2,6-дихлорфенол	11	н.о.	1.43
3,4-дихлорфенол	15	н.о.	0.44
3,5-дихлорфенол	41	н.о.	0.026
2,4,5-трихлорфенол	1.1	5	0.297
2,4,6-трихлорфенол	0.9	н.о.	34
2-метилфенол	1566	1750	535
3-метилфенол	943	720	4.6
4-метилфенол	878	600	65.4

Таблица 8 - Субстратная специфичность ХМЦИ из R. opacus 1cp, выращенного на 4-хлорфеноле

Субстрат	Км (мМ)	Vmax (Ед/мг белка)	kcat (мин-1)а	kcat /Км (мМ-1•мин-1)
цис,цис-муконат 2-хлор-муконат 3-хлормуконат 2,4-дихлормуконат 2-метилмуконат 3-метилмуконат 3-фтормуконат 2-фтормуконат	6997±134 312±35 173±12 119±26 47±11 66±0,1 52±10 -б	6,5±0,1 3,3±0,3 90,9±3,3 33,5±5,6 0,084±0,007 1,2±0,01 9,1±0,7 <0,03	260 132 3640 1340 3,4 48 364	0,037 0,42 21,0 11,3 0,072 0,73 7,0

а Значение kcat рассчитывали на основании молекулярной массы равной 40 кДа;

б по данным ВЭЖХ 2-фтормуконат при концентрации 0.5 мМ не ингибирует активность ХМЦИ с 3-хлормуконатом в концентрации 0.2 мМ.



Диенлактонгидролаза из R. opacus 1ср, выращенного на 4ХФ (ДЛГ), была очищена за 4 этапа в 93 раза. Конечный препарат имел удельную активность 30 ед/мг белка, выход по активности составил 19%. ДЛГ представляла собой мономер с массой 30кДа и была активна с цисдиенлактоном (Км = 28 мМ, kcat = 923 мин-1) и 2-хлор-цис-диенлактоном (Км = 2,2 мМ, kcat = 1190 мин-1). Константа специфичности ДЛГ для 2-хлордиенлактона, который является интермедиатом разложения 4ХФ, была почти в 17 раз выше, чем для незамещенного аналога и в 564 раза выше, чем для 2-метил-цис-диенлактона. Активность ДЛГ с трансдиенлактоном была меньше 0,5% от активности с цисизомером. По предложенной классификации, эта ДЛГ относилась ко второй группе ферментов [Schlцmann, 1994].

Превращение 2-хлормуконата ХМЦИ, выделенной из 4ХФ биомассы.

ХМЦИ превращала 3-хлор- и 2,4-дихлормуконаты в соответствующие диенлактоны без накопления интермедиатов. В случае с 2-хлормуконатом происходило образование и накопление в качестве интермедиата 5-хлормуко-но...