Организация биодеградативных путей у родококков

Таким образом, характер превращения 2-хлор-цис,цис-муконата (2-ХМ) (хлор)муконатциклоизомеразами можно рассматривать как один из важных критериев при сравнительном изучении данных ферментов. Известно, что ХМЦИ из грамотрицательных бактерий катализируют превращение 2-ХМ в трансдиенлактон, сопровождающееся выделением хлор-иона [Kuhm et al., 1990; Schmidt & Knackmuss, 1980; Vollmer & Schlцmann, 1995] (Рис. 6). Это превращение осуществляется в два этапа, катализируемых одним и тем же ферментом: на первом этапе происходит образование 2-ХМЛ и 5-ХМЛ; на втором этапе дегалогенирование 5-ХМЛ приводит к образованию транс-диенлактона. Напротив, МЦИ обычного орто-пути из Pseudomonas sp B13, Pseudomonas putida PRS2000, Acinetobacter calcoaceticus ADP1 способны осуществлять превращение 2-ХМ в 2-ХМЛ и 5-ХМ, но не могут катализировать второй этап реакции - дехлорирование 5-ХМЛ [Vollmer et al., 1994]. МЦИ обычного орто-пути и ХМЦИ, индуцирующаяся при росте R. opacus 1cp на 4-ХФ, отличаются способностью выбирать между двумя возможными направлениями циклоизомеризации 2-ХМ, при этом образуется только один продукт - 5-ХМЛ, однако, ни один из этих ферментов не способен проводить его дальнейшего дегалогенирования. В случае с ХМЦИ 4-хлорпирокатехиновой ветви данное обстоятельство не играет никакой физиологически значимой роли, так как разложение 4-ХФ идет с образованием 4-ХПК и, соответственно, 3-хлормуконата. А способность этого фермента циклоизомеризовать 3-хлормуконат и осуществлять реакцию дегалогенирования с образованием цисдиенлактона оправдывает ее статус хлормуконатциклоизомеразы.

Рисунок 6. Превращение 2-хлормуконата МЦИ и ХМЦИ из различных штаммов. 1 - МЦИ грамотрицательных бактерий; 2 - ХМЦИ штамма P. putida рАС27 и R. eutropha pJP4; 3 - МЦИ штамма R. opacus 1CP; 4 - ХМЦИ обеих ветвей модифицированного орто-пути штамма R. opacus 1CP; 5 - МЦИ штамма R. rhodochrous 89

В результате изучения ферментов, участвующих в разложении 4-ХФ, нами было выявлено несколько принципиальных моментов.

Показано, что при росте R. opacus 1cp на 4-ХФ происходила индукция всех ферментов, описанного нами модифицированного орто-пути, что позволяет определить этот модифицированный орто-путь как “стандартный”, позволяющий сравнивать его с модифицированными орто-путями грамотрицательных бактерий.

Сравнительный анализ каталитических свойств выделенных ферментов выявил ряд существенных отличий от аналогичных ферментов из грамотрицательных бактерий:

хлорпирокатехаза отличалась необычной региоселекттивностью. Константы специфичности для субстратов с замесителями в пара-положении были на порядок выше, чем константы специфичности для субстратов с заместителями в мета-положении.

ХМЦИ была способна выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата. Образуюшийся 5-хлормуконолактон не подвергался дехлорированию данным ферментом.

ДЛГ в отличие от ферментов из грамотрицательных бактерий не активна с транс-диенлактоном.

Определение структуры метаболитов и изучение каталитических свойств выделенных и очищенных ферментов позволило нам установить путь разложения 4-ХПК, образующегося при росте штамма R. opacus 1cp на 4-ХФ (Рис. 4).

6. Новый модифицированный орто-путь у Rhodococcus opacus 1CР

Особенности субстратной специфичности ферментов 4-хлорпирокатехи-новой ветви не позволяли штамму R. opacus 1CP разлагать 2-хлорфенол (2-ХФ). Однако, после продолжительной адаптации был получен вариант штамма, использующий 2-ХФ в качестве единственного источника углерода и энергии [Моисеева с соавт., 1999]. Мы показали, что разложение 2-ХФ новым вариантом штамма опосредуется необычным набором ферментов и происходит с образованием 3-ХПК по новому модифицированному орто-пути.

В бесклеточном экстракте штамма R. opacus 1cp, выращенного на 2-ХФ, была определена активность ферментов: ПК 1,2-ДО, МЦИ, ДЛГ с различными субстратами (Табл. 5). ПК 1,2-ДО проявляла относительно невысокую активность с хлорированными субстратами, что могло объясняться присутствием фермента обычного орто-пути. Активность с 3-ХПК была вдвое выше, чем с 4-ХПК. Не выявилось активности ХМЦИ с 3-хлормуконатом. Субстратная специфичность ДЛГ в экстрактах, полученных из 2-ХФ и 4-ХФ биомассы, была похожа, хотя известно, что разложение 2-ХФ проходит с образованием транс-иенлактона, а 4-ХФ - цисизомера.

Наиболее интересным был вопрос, способна ли ХМЦИ из биомассы, выращенной на 2-ХФ, осуществлять циклоизомеризацию и дехлорирование 2-хлормуконата с образованием трансдиенлактона, как это происходит при превращении 2-хлормуконата ХМЦИ грамотрицательных бактерий.

3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа (3-ХПК 1,2-ДО) была очищена в два этапа с выходом по активности 66%. Удельная активность фермента была 9,6 ед/мг белка. 3-ХПК 1,2-ДО была гомодимером с молекулярной массой 66 кДа, масса субъединицы равнялась 28 кДа.

Мы установили, что наибольшее сродство фермента наблюдалось к его непосредственному субстрату, 3-хлорпирокатехину, и 3-метилпирокатехину (табл. 9). В целом фермент не проявлял ярко выраженной избирательности к какому-либо субстрату. Субстратами являлись пирокатехин и его монозамещенные производные, в то время как дихлор- и тетрахлорпирокатехины оказывали конкурентное ингибирующее действие на фермент (Табл. 7).



Таблица 9 - Субстратная специфичность 3-ХПК-ДО. Для расчета kcat использовали значение молекулярной массы субъединицы, равное 28,5 кДа, которая была рассчитана по сиквенсу гена, кодирующего 3-ХПК-ДО

Субстрат	Km или Ki*, мкM	Vmax, Ед/мг	kcat, мин-1	kcat/Km, мин-1 мкM-1
Пирокатехин	2,1	16,1	458,8	218,5
3-хлорпирокатехин	1,4	11,5	327,7	234,1
4-хлорпирокатехин	3,5	10,0	285	81,4
3-метилпирокатехин	1,9	45,5	1295,3	681,7
4-метилпирокатехин	3,4	43,5	1239	364,4
3,5-дихлорпирокатехин	3,04 *	-	-	-
4,5-дихлорпирокатехин	0,0102 *	-	-	-
3,4,5,6-ТетХПК	0,059 *	-	-	-

Хлормуконатциклоизомераза, индуцирующаяся при росте на 2-ХФ, была очищена в 251 раз в три этапа, выход по активности составил 89%, удельная активность равнялась 11,6 ед/мг белка. ХМЦИ представляла собой гомооктамер с молекулярной массой нативного фермента, равной 340 кДа, и субъединичной массой 40 кДа. Фермент был активен в борат-фосфат-ацетатном буфере (рН оптимум 5,7). Температурный оптимум равнялся 65єС. NH2-концевая аминокислотная последовательность определена до 18-го остатка: TXXITEMSATIVDLPSRR.

ХМЦИ характеризовалась высокой субстратной избирательностью: цис, цис-муконат, 3-хлор-, 3-метил- и 2,4-дихлормуконаты не являлись субстратами для данного фермента. ХМЦИ была активна с 2-хлор- и 2-фтормуконатами. Км для 2-хлормуконата равнялась 142,9 мМ, Vmax =71,43 ед/мг белка, kcat = 2850 мин-1, kcat/Kм = 19,95 min-1· мM -1.

Хлормуконолактондегалогеназа (ХМЛДГ), новый фермент, обнаруженный в биомассе R. opacus 1cр, была очищена в три этапа, удельная активность составила 250 ед/мг белка. Масса субъединицы равнялась 12 кДа. Масса нативного фермента определена как 66 кДа. Таким образом, фермент состоял из 5-6 субъединиц. Определена NH2-концевая аминокислотная последовательность ХМЛДГ: MLYLVRMTVNLPRNLDPREEEE(?)LKASS(?).

ХМЛДГ осуществляла превращение 5-ХМЛ в цисдиенлактон, однако она не была способна к трансформации незамещенного муконолактона. Именно из-за особенностей субстратной специфичности она и получила такое название, в остальном же ХМЛДГ напоминала классические муконолактонизомеразы, ферменты обычного орто-пути разложения пирокатехина, не имеющие аналогов в 3- и 4-хлорпирокатехиновых ветвях модифицированного орто-пути [Katti et al., 1989; Prucha et al., 1996]. ХМЛДГ была термостабильна, в то время как МЛИ из штамма Pseudomonas putida быстро инактивировалась при 65. МЛИ штамма Alcaligenes eutrophus JMP134 осуществляла дехлорирование 5-хлор-3-метилмуконолактона в 3-метилдиенлактон и 5-хлормуконолактона в цис-диенлактон [Prucha et al., 1996].

Диенлактонгидролаза (ДЛГ) была очищена из 2-ХФ биомассы за 4 этапа, с выходом по активности 12%, удельная активность - 60 ед/мг белка. ДЛГ представляла собой мономер с молекулярной массой 30 кДа, имела рН оптимум около 8,6, температурный оптимум - 40°С. Км для цис-диенлактона составила 200 мМ, Vmax =167 Ед/мг белка, kcat = 4633 мин-1, kcat/Kм = 23 min-1· мM -1.

Превращение 2-фтормуконатов

Субстратную специфичность ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus 1cp на 2-ХФ, изучали методом 19F ЯМР используя ряд фторпирокатехи-нов. Энзиматически были получены 3-хлор-5-фторпирокатехин (с резонансом -126.7 ppm, рисунок 7а), 3-фторпирокатехин (-140.5 ppm, рисунок 7а), 3-хлор-6-фторпирокатехин (-142.6 ppm), 5-хлор-3-фторпирокатехин (-139.5 ppm).



Рисунок 7. 19F ЯМР анализ продуктов инкубации 2-хлор-4-фторфенола (слева) с: 1,6 мкМ 2-гидроксибифенил монооксигеназы (а); 1,4 мкМ 3-ХПК 1,2-ДО (СlcA2) (b); 0,5мкМ ХМЦИ (clcB2) (c) и 1,3 мкМ ХМЛДГ (ClcF) (d) и инкубации 3-фторпирокатехина (справа) (a) с: 1,4 мкМ ClcA2 (B); 0,5 мкМ ClcB2 (c) и 1,3 мкМ ClcF (d). В рамках приведены спектры, полученные в результате проведения сопряженного фтористо-протонного ЯМР.

После добавления 3-ХПК 1,2-ДО к полученным фторпирокатехинам происходило их превращение в соответствующие фтормуконаты. Лучшим субстратом для диоксигеназы (50% от активности с 3-ХПК) являлся 3-фторпирокатехин, 3-хлор-6-фтор-, 3-хлор-5-фтор- и 5-хлор-3-фторпирокатехины расщеплялись гораздо медленнее, с относительной скоростью, составляющей, соответственно, 25, 10 и 5% по сравнению с 3-ХПК.

На рисунке 7б представлены 19F ЯМР спектры превращения 3-хлор-5-фторпирокатехина. Образующийся муконат (-109.2 ppm) был идентифицирован на основе значений констант сопряжения 3J(4F,3H) и 3J(4F,5H), равных 30.7 и 21.5 Гц, соответственно, как 2-хлор-4-фтормуконат. В таблице 10 представлены 19F ЯМР характеристики вновь идентифицированных 2-галомуконатов.

Таблица 10 - Величины 19F ЯМР химических сдвигов и идентификация фтор-муконатов и фтормуконолактонов

Соединение	Химический сдвиг (ppm)	Константы сопряжения, Гц	Превращение ХМЦИ
4-хлор-2-фтормуконат	-111.1	3J(2F,3H)(20.9)	Нет
2-хлор-4-фтормуконат	-109.2	3J(4F,3H)(30.7) 3J(4F,5H)(21.5)	Да
2-хлор-5-фтормуконат	-112.0	3J(2F,3H)(20.1)	даа)
2-фтормуконатб)	-112.0	3J(2F,3H)(20.7)	Да
2-хлор-4-фтор- муконолактон	-111.7	3J(4F,5H)(19.9) 3J(4F,5H)(13.8)	продукт конверсии 2-хлор-4-фтормуконата
5-фтор-муконолактон	-201.0	2J(5F,5H)(47.4) 3J(5F,4H)(25.2)	продукт конверсии 2-фтормуконата

а) очень низкий уровень конверсии не позволил идентифицировать соответствующий муконолактон.

б) 19F ЯМР значения по Боэрсме с соавт. [Boersma et al., 1998].

Исследование превращения образующихся 2-фтормуконатов ХМЦИ показало, что в контрольной реакции без добавления ХМЦИ 2-галомуконаты теряли только около 10% сигнала за 10 часов инкубации, что свидетельствовало об их относительной устойчивости при рН 7,2. Известно, что муконаты, имеющие галозаместители во втором положении, особенно 2-фтор-муконат, наиболее устойчивы к действию циклоизомераз [Vollmer et al., 1998; Schmidt, Knackmuss, 1980]. Мы показали, что ХМЦИ нового модифицированного орто-пути R. opacus 1CP катализирует превращение этого субстрата в 5-фтормуконолактон. Инкубация ХМЦИ с 2-хлор-4-фтор- (Рис. 7в) и 4-хлор-2-фтормуконатами приводила к значительной убыли первого соединения.

Продукт реакции ХМЦИ с 2-хлор-4-фтормуконатом был идентифицирован как 2-хлор-4-фтормуконолактон на основании данных сопряженного протонно-фтористого ЯМР резонанса (3J(4F,5H) константы, равные 19.9 и 13.8 Гц на -111.7 ppm) и фактов, что 1) из-за существенно удаленного положения атома фтора по отношению к лактоновому кольцу местное сопряжение C3-H, C4_F у 4-фтормуконолактона в основном не определяется и 2) анизохрония в диастереотипичных метильных протонах приводит к неравным значениям 3JF-H констант сопряжения [Boersma et al., 2001; Schlцmann et al., 1990a] (Табл. 10). По аналогии с более стабильным 4-фтормуконолактоном [Boersma et al., 2001; Schlцmann et al., 1990], это соединение может подвергаться дефторированию с образованием, что наиболее вероятно, 2-хлормалеилацетата.

На рисунке 7в (справа) представлены результаты 19F ЯМР анализа инкубации 2-фтормуконата с ХМЦИ. 64%-ное снижение сигнала 2-фтормуконата при -112.0 ppm сопровождается появлением нового пика при -201.0 ppm, при этом интенсивность появляющегося пика соответствует убыли пика 2-фтормуконата. Проведенный сопряженный протонно-фтористый ЯМР (Рис. 7в, вставка) показал, что резонанс при -201.0 ppm характеризуется величиной 2J(5F,5H), равной 47.4, и 3J(5F,4H), равной 25.2 Гц, что можно отнести к 5-фтормуконолактону (Табл. 10) и находится в соответствии с литературными данными [Boersma et al., 2001; Wray, 1983].

Превращение фтормуконолактонов ХМЛДГ (ClcF).

В процессе работы были идентифицированы два новых муконолактона - 2-хлор-4-фтормуконолактон и 5-фтормуконолактон. 2-Хлор-4-фтор-муконолак-тон оказался крайне нестабильным, его дальнейшее превращение было неэнзиматическим. 5-Фтормуконолактон был стабилен и превращался в цисдиенлактон с участием ClcF (Рис. 7с,d), что спектрально выражалось увеличением резонанса при -123.0 ppm, соответствующим фториону. Добавление ДЛГ к препарату приводило к исчезновению цисдиенлактона (данные ВЭЖХ).

7. Клонирование генов, кодирующих превращение 3-ХПК у R. opacus 1cp

Проведенное нами секвенирование 9.5-кб вставки pROP1 выявило наличие 9-ти открытых рамок считывания (ORF) (Рис. 8): ORF1 (позиции 599-1) и ORF 2 (позиции 1229-648) имели высокую степень сходства (57 и 59%) с, соответственно, 3-гексулозо-6-фосфат синтазой и 6-фосфо-3-гексулоизомеразой из Mycobacterium gastri MB19 [Mitsui et al., 2000]. ORF3 имела сходство с несколькими регуляторами транскрипции LuxR семейства. ORF4 (позиции 4085-2802) имела 55-56% идентичности с глюкозо-6-фосфат 1-дегидрогеназами из Mycobacterium tuberculosis H37RV [Cole et al., 1998] и Streptomyces coelicolor. ORF5 (позиции 4818-5582, рассчитанная молекулярная масса 28.105 Да) показала значительное сходство с известными (хлор)пирокатехин 1,2-диоксигеназами. ORF6 (позиции 5608-6372, масса 27.400 Да) имела сходство с ДЛГ, особенно с ДЛГ из этого же штамма - 40% идентичных позиций [Eulberg et al., 1998], что позволило обозначить его как clcD2. ORF7 (позиции 6369-7484) кодирует белок (рассчитанная молекулярная масса 39.539 Да), сходный с (хлор)муконатциклоизомеразами: 46% идентичных позиций с МЦИ CatB P. putida PRS2000 [Houghton et al., 1995] и 35% с ClcB R. opacus 1cp [Eulberg et al., 1998]. NH2-концевая последовательность данного белка была идентична определенной ранее NH2-концевой последовательности ХМЦИ, выделенной из биомассы R. opacus 1cp, выращенного на 2-ХФ. Таким образом, ORF7 была определена как clcB2. ORF8 (позиции 7520-7804, рассчитанная молекулярная масса 11.193 Да), показал сходство с несколькими



Рисунок 8. (А) Рестрикционная карта вставки pROP1, несущей 9,510 бп фрагмент ДНК R. opacus 1cp (светлая полоса) в множественный сайт клонирования pBluescript II SK(+) (черная полоса). Указаны локализация и направление ORF на pROP1. Для сравнения приведены генные кластеры R. opacus 1cp для катаболизма 4-ХПК и 3,5-ДХПК (В) и незамещенного ПК (С). Гомологичные гены обозначены одинаковым цветом.

муконолактонизомеразами, особенно с метилмуконолактон изомеразой из R. eutropha JMP134 [Erb et al., 1998] - 55% идентичных позиций. Аминокислотная последовательность этого белка была идентична NH2-концевой последовательности ХМЛДГ, выделенной из биомассы штамма R. opacus 1cp, выращенной на 2-ХФ. На основании этого ген для нового в хлорпирокатехиновом пути белка был обозначен clcF.

Cравнение аминокислотных последовательностей 3-ХПК 1,2ДО и 4-ХПК 1,2-ДО штамма R opacus 1cp показало, что 3-ХПК 1,2-ДО была более близка к ферментам обычного орто-пути, чем к 4-ХПК 1,2-ДО (Рис. 9).



Рисунок 9. Дендрограмма, показывающая родство 3ХПК 1,2-ДО нового модифицированного орто-пути R. opacus 1cp с аналогичными ферментами.

Таким образом, изучение ферментов, участвующих в разложении 2-ХФ штаммом R. opacus 1cp, позволило выяснить следующие наиболее интересные моменты:

Изначально выделенный из накопительной культуры штамм не был способен расти на ряде соединений (2-хлорфенол, 3-хлорфенол) из-за отсутствия специфических ферментов.

Внесение в среду 2-ХФ привело к появлению способности штамма утилизировать токсикант. Адаптация происходила благодаря появлению набора ферментов, имеющих аналоги в модифицированном орто-пути разложения (хлор)пирокатехинов и обычном пути разложения пирокатехина (Рис. 10).

Факт, что выделенные ферменты характеризуются высокой специфичностью к интермедиатам превращения нового субстрата, указывает на неслучайность возникновения (или активизации) данного пути.



Рисунок 10. Модифицированные орто-пути разложения хлорпирокатехинов. А - у грамотрицательных бактерий; Б и В - у R. opacus 1cp: Б - новый модифицированный орто-путь, В - 4-хлорпирокатехиновый орто-путь.

8. Ферменты штаммов R. rhodochrous 89 и R. rhodnii 135, R. opacus 1G, выращенных на феноле

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа штамма R. rhodochrous 89 (ПК 1,2-ДО_89) была очищена за 5 этапов с выходом по активности 15%. Фермент был гомодимером с молекулярной массой 69-70 кДа и субъединичной молекулярной массой 37 кДа. Наиболее высокой активность ПК 1,2-ДО_89 была с метилзамещенными пирокатехинами. Необычно высокой была активность с 3-ХПК (Табл. 11).

Таблица 11 - Окисление замещенных пирокатехинов ПК 1,2-ДО из родококков

Субстрат для определения активности ПК-ДО	Относительная активность, %
	R. rhodochrous 89	R. rhodnii 135	R. opacus 1G
Пирокатехин 3-Метилпирокатехин 4-Метилпирокатехин 3-Метоксипирокатехин 3-Хлорпирокатехин 4-Хлорпирокатехин 3,4-Дихлорпирокатехин 3,5-Дихлорпирокатехин 3,5-Дибромпирокатехин	100 161 130 2 22 5 0 0 0	100 157 134 3 20 9 0 0 0	100 16 34 н.о. н.о. 6 0 0 0

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа штамма R.rhodnii 135 (ПК 1,2-ДО_135) была очищена за семь этапов в 103 раза, удельная активность составила 20,5 ед/мг белка, что соответствовало выходу по активности в 24%. Молекулярная масса ПК 1,2-ДО_135, как и ПК 1,2-ДО_89, составила 69-70 кДа. Субъединичная молекулярная масса равнялась 37 кДа. Таким образом, фермент являлся гомодимером. Оба фермента были похожи между собой и по способности окислять различные пирокатехины (Табл. 11).

Очистка пирокатехин 1,2-диоксигеназы штамма R. opacus 1G приводила к разделению пирокатехазной активности на два пика. Фермент из первого пика был крайне нестабилен и быстро инактивировался. Фермент из второго пика (ПК 1,2-ДО2_1G) был очищен за 4 этапа в 41 раз, с выходом по активности 14%. Удельная активность этой изоформы была выше, чем у других пирокатехин 1,2-диоксигеназ (29 ед/мг белка). Фермент был активен с пирокатехином, 3-МПК и 4-МПК (Табл. 11). Значения Kм для этих субстратов были 1,3 мМ (ПК), 1 мМ (3-МПК) и 1,3 мМ (4-МПК). Ингибиторами конкурентного типа для ПК 1,2-ДО2_1G являлись следующие соединения: 3,5-ди-хлорпирокатехин (Ki = 0,25 мM), 3,6-дихлорпирокатехин (Ki = 12,5 мM), 4,5-дихлорпирокатехин (Ki = 0,5 мM), 2-ХФ (Ki = 6,5 мM) и 4-ХФ (Ki = 125 мM).

Муконатциклоизомераза штамма R.rhodochrous 89 (МЦИ_89) была очищена за семь этапов в 186 раз, конечный препарат имел удельную активность 16 ед/мг белка. МЦИ_89 состояла из двух типов субъединиц с молекулярной массой 35,5 и 37 кДа. NH2-Концевая аминокислотная последовательность большей субъединицы определена до 27-го остатка MYKTI(K)ETLLMEIPQIRPxIIHMQQxS. NH2-Концевая аминокислотная последовательность меньшей субъединицы определена до 32-го остатка AVATMQTQTLVMVKI(K)STDDGFIGxxEATTIGG.

Превращение 2-хлормуконата МЦИ_89 сопровождалось образованием цис-диенлактона. Изучена динамика превращения метаболитов. Наиболее интенсивно конверсия 2-ХМ проходила в первые 30 мин после добавления МЦИ. Через 4 часа инкубации в смеси оставалось только 8% внесенного субстрата. В процессе трансформации образовывались 2-ХМЛ и 5-ХМЛ в качестве интермедиатов. цис-Диенлактон был единственным продуктом реакции (Рис. 11).

Рисунок 11. Динамика продуктов трансформации 2-хлормуконата МЦИ из R. rhodochrous 89, определенная ВЭЖХ. За 100% принято: 0.1 мМ для муконата, 0.09 мМ для цис-диенлактона и наибольшая площадь пиков для муконолактонов. 2-хлормуконат (1), 5-хлормуконолактон (2), 2-хлормуконо-лактон (3), цис-диенлактон (4).

Мы обнаружили, что у родококков присутствовали различные наборы ключевых ферментов при росте на различных субстратах. У R. opacus 1G при росте на феноле происходила индукция двух ПК 1,2-ДО, различающихся по стабильности. При росте штамма R. opacus 1сp на бензоате было обнаружено две ПК 1,2-ДО, различающихся по значениям Km для пирокатехина и константы ингибирования фенолом и 4-ХФ. При росте на 4-хлор- и 2-хлорфенолах у R. opacus 1сp обнаружено по одному ферменту модифицированного орто-пути.

Изоферменты ПК 1,2-ДО из P. arvilla [Nakai et al., 1988; 1990, 1995] и A. radioresistent [Briganti et al., 2000] не различались между собой по каталитическим свойствам, в то время как для изоферментов из Frateuria [Aoki et al., 1984b] и A. lwoffii [Kim et al., 1997] показаны различия в молекулярном весе и каталитических свойствах. Причины необычного набора ферментов обсуждаются в литературе. Орнстон и Парке [Ornston & Parke, 1976] подчеркивали биологическую значимость изофункциональности белков: так как часто индукция является моментом узкоспецифичным, то возможность индукции одного из ферментов позволяет клеткам адаптироваться к условиям, существующим в данный момент или к постоянному окружению, что увеличивает широту ответа. Кроме того, гены разложения таких соединений, как бензоат, фенол, толуол, 2,4-Д, располагаются в различных оперонах плазмидного и хромосомального происхождения и имеют различные активаторы [Ehrt et al., 1995; Eulberg et al., 1997; Winstanley et al., 1987]. Таким образом, способность синтезировать несколько ключевых изоферментов в ответ на воздействие ксенобиотика может или повышать биодеградативный потенциал штамма и обеспечивать ему выживаемость в меняющихся условиях окружающей среды или отражает неспецифический ответ микроорганизмов на действие токсиканта.

9. Ферменты разложения ароматических субстратов штамма R. ruber P25

Ферменты разложения 4-ХБК

В плане сравнительного изучения хлорированных ароматических соединений родококками нами был использован штамм R. ruber P25, характеризующийся широким биодеградативным потенциалом и способный полностью разлагать ряд устойчивых токсикантов, в том числе хлорбифенилы. Поскольку промежуточным метаболитом при разложении полихлорированных бифенилов является 4-хлорбензоат (4-ХБК), были изучены ферменты, участвующие в деструкции этого соединения.

Путь разложения 4-ХБК схематично можно представить следующим образом (Рис. 12):

Рисунок 12. Путь разложения 4-ХБК и возможные сайты расщепления протокатеховой кислоты (ПКК). ПОБК - пара-гидроксибензоат, ПКК ДО - протокатехоат диоксигеназа.

В бесклеточном экстракте R. ruber P25 были определены активности пара-гидроксибензоат гидроксилазы (ПОБГ) и ПКК-ДО.

пара-Гидроксибензоат гидроксилаза (ПОБГ) была очищена в 71 раз, выход по активности составил 15.4%. ПОБГ содержала две субъединицы с молекулярной массой 43 кДа и 45кДа. Удельная активность ПOБГ равнялась 11,67 ед/мг белка, КмПОБК = 9,85 мкМ, КмNADH = 14,2 мкМ. Удельная активность ПОБГ при внесении NAD(P)H составила 14,25% от удельной активности ПОБГ при внесении NADH.

Протокатехоат диоксигеназа (ПКК ДО). Раскрытии ароматического кольца4-ХБК, как правило, катализирует протокатехоат 3,4-диоксигеназа - интрадиольная диоксигеназа, хорошо изученная у грамотрицательных бактерий. В литературе также описаны две экстрадиольные ПКК диоксигеназы - ПКК 4,5-ДО и ПКК 2,3-ДО. ПКК ДО была очищена в 18,7 раз, выход по активности составил 47,2%. Удельная активность ПКК-ДО равнялась 15 ед/мг белка, Км = 5,26 мкМ, фермент был термолабилен, расщепление протокатехоата происходило по С4-С5 с образованием полуальдегида 2-окси-4-карбокси-цис, цис-муконовой кислоты.

Ферменты разложения пара-гидроксибензоата штаммом R. ruber P25

Рост R. ruber P25 на среде с ПОБК, одним из ключевых интермедиатов разложения ПХБ, сопровождался индукцией ПОБГ и ПКК ДО. ПКК расщеплялась между C3-C4 атомами, что свидетельствовало о различии свойств ПКК ДО, индуцирующейся при росте Р25 на 4-ХБК и ПОБК. Очистка ПКК 3,4-ДО сопровождалась разделением фермента на две активные фракции. Очищенные ПКК 3,4-ДО различались по каталитическим характеристикам. Так, значение Км ПКК 3,4-ДОI для ПКК равнялось 7.7 мМ, Км ПКК 3,4-ДОII для ПКК было 83 мМ. ПКК 3,4-ДО II окисляла ПКК со скоростью, вдвое превосходящей скорость окисления этого субстрата ПКК 3,4-ДОI. Дальнейшая очистка приводила к значительной инактивации ПКК 3,4-ДОII, ПКК 3,4-ДО I была стабильна. Удельная активность конечных препаратов ПКК 3,4-ДОI и ПКК 3,4-ДОII составила, соответственно, 143 и 85 Ед/мг белка.

10. Ферменты разложения пара-толуата (4-метилбензоата) у родококков

Ферменты орто-пути у R.opacus 1cp

В бесклеточном экстракте R. opacus 1cp скорость окисления 4-ХПК и 4-МПК составляла, соответственно, 29% и 250% от скорости окисления пирокатехина. В результате очистки получены две ПК 1,2-ДО, различающихся по субстратной специфичности.

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа I была очищена в 14 раз с удельной активностью 7,48 ед/мг белка, выход соответствовал 1,53 %. SDS-электрофорез показал наличие в препарате двух полос с молекулярной массой 33 и 35 кДа. NH2-концевая последовательность субъединицы массой 33 кДа определена до 15 остатка (KAERATANTSPERLA). Фермент имел выраженный температурный оптимум при 40-50°С.

ПК 1,2-ДОI катализировала окисление с наиболее высокой скоростью пирокатехина, 3МПК и 4-МПК (табл. 12) Активность с 4-ХПК составляла всего 2,09% от максимальной, а с 3,5- и 4,5-дихлорпирокатехинами активность отсутствовала.

Таблица 12 - Кинетические характеристики пирокатехин 1,2-диоксигеназы I. При расчете kcat брали усредненную субъединичную массу 34 кДа.

Субстрат	Km, мM	Vmax, ед/мг	kcat, мин-1	kcat/Km, мин-1·мM-1
Пирокатехин 3-метилпирокатехин 4-метилпирокатехин	6,5 20,0 9,1	9,1 25 10	309,1 850,0 340,0	47,9 42,5 37,4

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа II была очищена в 18 раз за пять этапов, выход составил 37%, удельная активность составила 9,7 ед/мг белка. Субъединичная молекулярная масса ПК 1,2-ДО II равнялась 26-27 кДа. Определена NH2-концевая аминокислотная последовательность исследуемого фермента, АNTRVIELFDEFTDLIRDFIVRHEITTPEYETI, которая полностью соответствовало NH2-концевой последовательности ХПК 1,2-ДО, индуцирующейся при росте R.opacus 1cp на 4-ХФ [Eulberg et al., 1998].

Каталитические свойства ПК 1,2-ДОII. Фермент был способен катализировать окисление широкого круга замещённых пирокатехинов. Относительная активность ПК 1,2-ДО II с ПК : 4ХПК : 3МПК : 4МПК : 3,5-ДХПК составила, соответственно 100 : 113 : 191 : 253 : 22%, что было похоже на результаты, полученные для 4-ХПК 1,2-ДО.

Муконатциклоизомераза (МЦИ) была очищена в четыре этапа, удельная активность МЦИ с муконатом возросла с 0,02 ед/мг белка до 1,92 ед/мг белка, что соответствовало очистке в 96 раз. Выход по активности составил 37,3 %. Субъединичная молекулярная масса МЦИ была 40 кДа. МЦИ катализировала превращение ряда замещённых (3-хлор-, 2- и 3-метил-) муконатов с относительной активностью 14, 6 и 28% по отношению с муконату, соответственно, по этим свойствам была похожа на фермент того же штамма, индуцирующийся при росте на бензоате.

Набор ферментов, индуцирующихся у R. opacus 1cp при росте на пара-толуате, является необычным. Известно, что индукторами для пирокатехаз и муконатциклоизомераз могут служить бензоат и сам муконат, поэтому оправданной является индукция МЦИ и ПК 1,2-ДО обычного орто-пути. Присутствие еще одной диоксигеназы, а именно 4-ХПК 1,2-ДО, при отсутствии параллельной индукции ХМЦИ свидетельствуют о более сложном ответе на новый для штамма субстрат, что, с одной стороны, позволяет ему эффективно разлагать данное соединение, избегая непродуктивной индукции фермента (ХМЦИ), малоэффективного в отношении образующегося 3-метилмуконата, а, с другой, возможно, может служить примером возникновения нового метаболического пути.

Ферменты разложения пара-толуата у штамма R. ruber P25

В бесклеточном экстракте, полученном из биомассы, выращенной на пара-толуате, обнаружена активность ПК 1,2-ДО и МЦИ.

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа (ПК 1,2-ДО) была очищена в 3 этапа, удельная активность составила 5,4 ед/мг белка, температурный оптимум 30єС, рН оптимум - 7.2-7.4; фермент был активен с пирокатехином, 3-метил-пирокатехином, 4-метилпирокатехином: удельная активность равнялась 5,7, 11,1 и 6,7 ед/мг белка, соответственно, активность с 3-ХПК и 4-ХПК была 2% от активности с пирокатехином. Ряд соединений конкурентно ингибировал активность ПК 1,2-ДО с пирокатехином со значениями константы ингибирования 0,3 мМ (3,5-ДХПК), 05 мМ (4,5-ДХПК), 0,4 мМ (3,6-ДХПК), 1 мМ (тетра-хлорпирокатехин), 27 мМ (2-ХФ). 4-МБК, 4-ХБК, взятые в концентрации до 200 мкМ, не ингибировали активность этой ПК 1,2-ДО.

Муконатциклоизомераза была очищена в 36 раз, удельная активность равнялась 2.2 ед/мг белка. МЦИ была стабильна при 60єС; Км для муконата равнялась 6,67 мкМ; отсутствовала активность с 2-хлормуконатом.

Наши данные по субстратной специфичности пирокатехин 1,2-диокси-геназ родококков находятся в соответствии с данными, полученными другими авторами, и позволяют выделить в первую очередь два типа ферментов:

Первый - пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-пути, проявляющие узкую субстратную специфичность;

Второй - хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы модифицированных орто-путей (можно сказать, что их количество/специфичность зависит от того, сколь-ко различных хлопирокатехинов может образоваться в качестве ключевых интермедиатов разложения хлорированных ароматических соединений), характеризующиеся высоким сродством к хлорированным субстратам и широкой субстратной специфичностью.

Однако, нельзя обойти вниманием еще один тип интермедиатов, а именно метилпирокатехинов, образующихся при разложении ряда ароматических со-единений, например, метилбензоатов (толуатов) или метилфенолов (крезолов). Микробная деградация метилзамещённой ароматики обычно проходит через мета-путь расщепления метилпирокатехинов, так как их орто-расщепление приводит к образованию «dead-end» продуктов - метилзамещенных 4-карбок-симетилбут-2-ен-4-олидов (метилмуконолактонов) [Catelani et al., 1971; Knackmuss et al., 1976]. Особый интерес представляет разложение 4-метилмуко-нолактона, поскольку наличие алкильного заместителя при С-4 атоме препятствует дальнейшему разложению этого соединения по классическому 3-оксо-адипатному пути [Erb et al., 1998]. Тем не менее, обнаружено несколько исключений: у штаммов R. eutropha JMP134, Rhodococcus sp. и Rhodococcus rhodochrous N75 описаны модифицированные орто-пути для разложения метилпирокатехинов, причем у наиболее изученных R. eutropha и R. rhodochrous N75 эти пути различались [Bruce, Cain, 1988; Pieper et al., 1985; Cha et al., 1998].

Проведенное нами изучение процессов разложения метилбензоата родококками показало, что они используют орто-путь расщепления метилпирокатехина. Мы обнаружили наличие фермента с широкой субстратной специфичностью у штамма R. opacus 1cp. Хотя, согласно литературным данным, ПК 1,2-ДО-зы считались ферментами с узкой субстратной специфичностью, это не противоречит полученным нами результатам, так как в большинстве случаев о широте субстратной специфичности судили на основании сравнения скоростей окисления пирокатехина и галогензамещенных субстратов, с которыми и в наших исследованиях была показана низкая активность фермента.

ПК 1,2-ДО из R. ruber P25, выращенного на 4МБК, отличается от известных диоксигеназ: ПК 1,2-ДО обычного орто-пути у описанных ранее штаммов окисляют 3-МПК и 4-МПК со скоростью, не превышающей скорость окисления пирокатехина (Таблица 13), скорость окисления хлорпиро-катехинов, как правило, незначительна.

ХПК 1,2-ДО модифицированного орто-пути окисляют 3-МПК и 4-МПК со скоростью, составляющей 200-300% от скорости окисления пирокатехина, вместе с тем, ферменты активны с хлорированными субстратами.

ПК 1,2-ДО из R. ruber P25 окисляет метилпирокатехины со скоростью, превышающей скорость окисления пирокатехина, но этот фермент характеризуется низкой активностью с хлорированными субстратами (Таблица 13).

Полученные нами данные, касающиеся особенности индукции ферментов, участвующих в разложении 4-МПК, и их субстратной специфичности у R. opacus и 1cp и R. ruber P25, указывают на особенности метаболизма пара-толуата исследованными бактериями и свидетельствуют о наличии еще одного типа пирокатехин 1,2-диоксигеназ - метилпирокатехаз (МПК 1,2-ДО).

Таблица 13 - Скорости окисления пирокатехина (ПК), 3-метилпирокатехина (3МПК) и 4-метилпирокатехина (4МПК) пирокатехин диоксигеназами (ПК 1,2-ДО) и хлорпирокатехин диоксигеназами (ХПК 1,2-ДО) из различных бактерий

Бактерия	Ростовой субстрат	Фермент	Отн. активность, %
			Субстрат ПК 1,2-ДО
			ПК	3-МПК	4-МПК
P.arvilla C1	бензоат	ПК 1,2-ДО	100	5,4	94,6
Pseudomonas sp B13	бензоат	ПК 1,2-ДО	100	11	Но
Alcalig. eutrophus CH3	бензоат	ПК 1,2-ДО	100		20
Pseudomonas sp PS12	бензол	ПК 1,2-ДО	100	68	82
R. eutropha JMP 134	2,4-Д	ПК 1,2-ДО	100	41	Но
Acinetobacter lwoffii	анилин	ПК 1,2-ДОI	100	3	39
		ПК 1,2-ДОII	100	22	51
Acinet. calcoaceticus	бензоат	ПК 1,2-ДО	100	12	18
Acinet. radioresistens	фенол	ПК 1,2-ДО	100	14,4	16,5
Rhod. rhodochrous В259	бензоат	ПК 1,2-ДО	100	79	68
Rhod. Rhodochrous N75	п-толуат	ПК 1,2-ДО	100	64	83
R. opacus 1cp	бензоат	ПК 1,2-ДО	100	99	88
	п-толуат	ПК 1,2-ДО	100	73	89
		ХПК 1,2-ДО	100	208	242
Rhodococcus ruber P25	п-толуат	МПК 1,2-ДО	100	195	117
Pseudomonas sp B13	3-ХБК	ХПК 1,2-ДО	100	337	Но
Pseudomonas sp PAC 27	3-ХБК	ХПК 1,2-ДО	100	Но	300
R. eutropha JMP 134	2,4-Д	ХПК 1,2-ДО	100	167
Pseudomonas sp PS12	1,2,4-ТХБен-л	ХПК 1,2-ДО	100	319	230
Pseudomonas putida 87	3-ХБК	ХПК 1,2-ДО	100	235	187
Pseudomonas sp P51	хлорбензол	ХПК 1,2-ДО	100	202	189
Xantobacter phlavus	дихлорбен-л	ХПК 1,2-ДО	100	239	168
Pseudomonas acidovorans	2-хлоранилин	ХПК 1,2-ДО	100	307	205
Rhodococcus opacus 1cp	2-хлорфенол	ХПК 1,2-ДО	100	283	270
	4-хлорфенол	ХПК 1,2-ДО	100	208	242

Но - не определяли, 1,2,4-ТХБен-л - 1,2,4-трихлорбензол.

11. Пространственная структура хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ

Сравнение гомологичных ферментов обычного и модифицированных орто-путей, участвующих в разложении ароматических соединений, из ряда бактерий, выращенных на разных субстратах, показало, что физико-химические и каталитические свойства таких ферментов различаются, хотя ферменты катализируют одинаковые реакции. Наиболее наглядно это наблюдение проявляется в случае раскрытия ароматического кольца пирокатехинов (хлор)пирокатехазами. Так, у штамма R. opacus 1ср при росте на 2-ХФ и 4-ХФ индуцируются два фермента, значительно различающихся по субстратной специфичности. Вместе с тем, полученные нами данные, касающиеся структуры центральной части активного центра этих ферментов (железо (III), пятикоординированное остатками двух молекул гистидина, двух молекул тирозина и воды), указывают на то, что эта часть фермента не отличается по структуре от других интрадиольных диоксигеназ, таких как протокатехоат 3,4-диоксигеназы, пирокатехин 1,2-диоксигеназы и гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы. Таким образом, необходимо было сравнить пространственную структуру этих ферментов с тем, чтобы выявить факторы, опосредующие различия в субстратной специфичности изучаемых диоксигеназ.

Механизм реакции и пространственную структуру активного центра и молекул нативного белка диоксигеназ в основном изучали на примере протокатехоат 3,4-диоксигеназ, ПК 1,2-ДО были изучены незначительно [Funabiki et al., 1990; Ohlendorf et al., 1988; 1994]. Показано, что атом железа активного центра ферментов координирован двумя тирозиновыми, двумя гистидиновыми аминокислотными остатками и гидроксилом воды. На всех стадиях реакции железо не изменяет заряда. Долгое время все попытки получить ПК 1,2-ДО в кристаллическом виде были неудачны.

Нами были получены 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp в кристаллическом виде, пригодном для рентгено-структурного анализа и расшифрована пространственная структура этих ферментов.

Кристаллы 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы, полученные в растворе, содержащем 1,6 М (NH4)2SO4, 0,1 M NaCl, 100 мМ Tris/HCl, pH 9,0, 5-15% глицерин, имели размер 0.4 х 0.4 х 1.0 мм (Рис. 13), их хранили в жидком азоте в присутствии 30% глицерина как криопротектора. Кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО принадлежат к первичной гексагональной пространственной группе Р6322, с размерами элементарной ячейки а = b = 90.4, с = 307.5 Е. Исходя из присутствия одной молекулы на одну ассиметрическую единицу, раствор составляет около 61% ячейки (Vм = 3.13 Е3 Да-1 [Mattews, 1968].

Рисунок 13. Кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО (слева) и 3-ХПК 1,2-ДО (справа)

Кристаллы 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы, полученные в буфере, содержащем 0,3 М Mg(CH3CO2)2, 0,1 М HEPES, pH 7,5, 15% ПЭГ 8000, 5% глицерин, достигали максимальных размеров 0.2 х 0.5 х 0.5 мм (Рис. 13) и были заморожены в жидком азоте, 25% ПЭГ 400 добавляли к маточному раствору как криопротектор. Они принадлежат к первичной триклинной пространственной группе P1 Рассчитано, что на ассиметрическую единицу приходится четыре димера (бFeIII)2 (молекулярная масса мономера 29 кДа).

До сих пор, помимо проводимых нами исследований, получены в кристаллическом виде еще две ПК 1,2-ДО - из штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13259 [Strachan et al., 1998] и из A. calcoaceticus ADP1 [Vetting & Ohlendorf, 2000]. Однако, структура ПК 1,2-ДО из R. rhodochrous расшифрована не была. В настоящее же время основное сравнение полученных нами структур проводится с ПК 1,2-ДО из A. calcoaceticus ADP1.

Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ

4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

Изучение пространственной структуры 4-ХПК 1,2-ДО показало, что конечная модель содержала 2-257 аминокислот каждого мономера, два атома Fe(III), две молекулы бензоата, две молекулы фосфолипида, 284 молекулы воды и молекулу Tris буфера. На рисунке 14 схематически представлена вторичная структура фермента, полученная на основании его аминокислотной последовательности, на рисунке 15 - его третичная структура. Установлено, что молекула фермента состоит из двух каталитических доменов, связанных линкерным доменом. Общая структура каталитических доменов образована рядом в-слоев и несколькими редкими спиралями, соединенных неупорядоченной структурой. Линкерный домен образован б-спиралями обоих мономеров и находится в центре молекулы. Линкерный домен образован двумя длинными (H1 и H2) и тремя короткими (H3-H5) б-спиралями каждой субъединицы: четыре спирали с NH2-конца каждого мономера образуют петлю, которая взаимодействует с подобным мотивом другой субъединицы, и с пятой петлей, вытянутой из каталитического домена.



Рисунок 14. Вторичная структура 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp

Центральная часть каталитического домена образована рядом в-слоев, собранных в в-сэндвичи, и нескольких редких колец, расположенных между линкерным доменом и в-сэндвичем. Металл активного центра расположен в участке редких колец, ограничен с одной стороны системой в-сэндвича каждого мономера, с другой - б-цепями линкерного домена. Гидрофобный вход в активный центр образован остатками Leu-49, Pro-77, Phe-78, Ile-171 (Pro-172) и скелетом лигандов железа Tyr-134 и Tyr169.



Рисунок 15. Модель третичной структуры 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp (вверху) и она же, повернутая на 90° вдоль горизонтальной оси (внизу).

Молекула 4-ХПК 1,2-ДО содержит два связанных фосфолипида, что, вероятно, характерно для ферментов этого класса [Vetting and Ohlendorf, 2000]. Точной идентификации этого соединения проведено не было из-за отсутствия электронной плотности головной части. В данном случае эти молекулы были смоделированы на основе молекулы фосфатидилхолина с двумя С14/С15 гидрофобными хвостами. Обе фосфолипидные структуры локализованы в пространстве между двумя субъединицами, каждая - в конце большого гидрофобного канала, образованного петлями Н1 и Н2 обоих мономеров, с головными группами, направленными наружу в раствор, и с хвостовыми частями, направленными внутрь друг к другу. Функциональной роли фосфолипидов в молекуле ферментов пока не дано какого-либо объяснения.

3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

Конечная модель включала 2-257 аминокислотный остаток каждой субъединицы, два атома Fe(III), два бензогидроксамата, два фосфолипида, 284 молекул воды и одну молекулу Tris буфера. Вторичная структура этого фермента представлена на рисунке 16.

Усредненная модель димера содержит два каталитических домена, образованных четырьмя -слоями и несколькими редкими кольцами, и линкерным доменом, образованным несколькими -спиралями обоих мономеров и расположенных в центре молекулы. Каждая субъединица содержит каталитический пакет с атомом железа(III), доступный для субстрата с наружной стороны молекулы. Таким образом, пространственная структура 3-ХПК 1,2-ДО в целом была сходна со структурой 4-ХПК 1,2-ДО.

Сравнение активных центров диоксигеназ

Идентифицируя аминокислотный состав активного центра фермента, мы установили, что в центре содержится мононуклеарный ион Fe(III), связанный с остатками Tyr-134, Tyr-169, His-194 и His-196. His2Tyr2 координация является

Рисунок 16. Вторичная структура 3-ХПК 1,2-ДО.

типичной для интрадиольных диоксигеназ расщепления кольца [Lange & Que, Jr. 1998; Briganti et al., 2000]. Данные рентгено-структурной абсорбционной спектроскопии показали, что нативный фермент является пятикоординированным с двумя сферами атомов: или два 1.9 Е и три 2.1 Е или три 1.9 Е и два 2.1 Е [Benvenuti et al., 1999].

Каталитический карман 4-ХПК 1,2-ДО (Рисунок 17) образован несколькими аминокислотными остатками: Leu-49, Asp-52, Ala-53 H3 петли; Ile-74, Gln-75, Gly-76, Pro-77, Phe-78, Phe-79 участка отдельных петель; Trp-126 cлоя S3; лиганд железа Tyr-134 второй редкой петли; Tyr-169 S6 слоя; Ile-171 третьей редкой петли; Arg-191 слоя S7; His-194 и His-196 слоя S8; Gln-210 слоя S9; Cys-224 редкой петли.

Рисунок 17. Наложение структуры активного центра 4-ХПК 1,2-ДО и ПК 1,2-ДО из A. calcoaceticus (номера аминокислотных остатков указаны в скобках).

Каталитический карман 3-ХПК 1,2-ДО образован несколькими аминокислотными остатками: Leu49, Asp52, Val53 петли H3, Ile74, Gln75, Gly76, Pro77, Tyr78, Phe79 одиночной редкой петли, Trp125 из слоя S3, лигандов железа Tyr133 из второй редкой петли, Tyr167 слоя S6, Ile169 третьей редкой петли, Arg188 слоя S7, His191 и His193 из слоя S8, Gln207 из слоя S9 и Ala221 редкой петли. Остатки Leu49, Pro77, Tyr78, Ile169 и скелетные цепи лигандов железа Tyr133 и Tyr167 образуют гидрофобный вход в активный центр. Каталитический центр 3-ХПК 1,2-ДО содержит атом (III), связанный с остатками четырех аминокислот: Tyr 133, Tyr 167, His 191 и His193.

Дополнительные плотности, определенные как молекулы бензогидро-ксамата в координационной сфере железа 3-ХПК 1,2-ДО и бензоата - у 4-ХПК 1,2-ДО, были также обнаружены в структуре гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы из Nocardiodes simplex 3E (Ferraroni et al., 2006). Их присутствие можно объяснить, если допустить, что эта плотность является фрагментом сидерофора. Фактически, бактерии и грибы обладают сложной системой, основанной на сидерофорах, для приобретения, транспортировки и использования атомов железа. Грамположительные бактерии, в том числе и родококки, обладающие толстой липоидной клеточной оболочкой, действующей как барьер для различных материалов, разработали более сложные системы переноса, чем у других бактерий [Ratledge & Dover, 2000]. Среди нескольких структурно-различных молекул, которые, как предполагается, участвуют у микобактерий в получении железа, есть сложные сидерофоры, чья способность хелатировать железо определяется орнитин-производными гидроксаматами [Carrano et al., 2001; De Voss et al., 1999], что позволяет объяснить присутствие их фрагментов в активном центре диоксигеназ.

Таким образом, пространственная структура одной субъединицы 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО модифицированных орто-путей штамма R. opacus 1cp в целом обладает рядом сходных черт. Но сравнение аминокислотных последовательностей 4-ХПК 1,2-ДО с 3-ХПК 1,2-ДО показывает (Рис. 18), что несколько участков, аминокислотные остатки которых составляют активный центр, имеют значительные замены. Особенно это заметно в выровненных последовательностях ХПК 1,2-ДО штаммов P. putida pAC27, R. eutropha pJP4, P. chlororaphis RW71 и 3-ХПК 1,2-ДО R. opacus 1cp, которые более специфичны к 3-ХПК [Pieper et al., 1988; Broderick & O'Halloran, 1991; Maltseva et al., 1994; Potrawfke et al., 1998]. Мы предполагаем, что возможной причиной наблюдаемых различий в субстратной специфичности диоксигеназ может быть замена остатка Val и Tyr (последний взаимодействует с заместителем субстрата в положении 3), у 3-ХПК 1,2-ДО(з) на Ala-53 и Phe-78, соответственно, у 4-ХПК 1,2-ДО. Кроме того, из Cys-223 и 224, которые являются консервативными у всех хлорпирокатехиндиоксигеназ и, как предполагается, важны для связывания хлорированных заместителей, у 4-ХПК 1,2-ДО присутствует только Cys-224, а 223 заменен на Ser [Vetting & Ohlendorf, 2000]. Более того, эти два остатка цистеина полностью отсутствуют у 3-ХПК 1,2-ДО, таким образом, сводя на “нет” приписываемую им функцию выбора субстрата.

Рисунок 18. Сравнение аминокислотных последовательностей 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp.

Arg188 и Gln207 консервативны во всех ПК 1,2-ДО и ПКК 3,4-ДО, и, как показано, определяют расположение субстрата, его депротонирование путем ван-дер-ваальсового взаимодействия с кольцом, что предотвращает его вращение в двух экваториальных плоскостях и/или обеспечивая электростатический противозаряд для создания электронной плотности на углеродных атомах кольца.

Наложение активных центров диоксигеназ по четырем лигандам железа (Tyr 133/134, Tyr 167/169, His 191/194 и His193/196 у 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО, соответственно) (Рис. 19) ясно показывает, что только несколько аминокислотных замен наблюдается в каталитической полости, из них наиболее видимые Val53/Ala53, Tyr78/Phe78 и Ala221/Cys224 (3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО, соответственно), в то время как другие остатки, за исключением некоторых незначительных сдвигов в скелетных и боковых цепях, остаются одинаковыми.

Таким образом, сравнение активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus cp позволило выявить аминокислотные остатки, участвующие в связывании субстратов, и на этой основе определить те аминокислоты, замена которых может определять различия в субстратной специфичности данных ферментов.



Заключение

Родококки, являясь представителями большой таксономической группы нокардиоподобных микроорганизмов, до недавнего времени оставались

Рисунок 19. Сравнение активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1cp.



довольно слабо изученными в отношении их биодеградативного потенциала, в частности, практически не были изучены ферменты, участвующие в разложении ароматических соединений и их галогенированных и метилзамещенных аналогов. Проведенный нами скрининг среди бактерий рода Rhodococcus выявил активные штаммы-деструкторы ароматических соединений. Для изучения их метаболческого потенциала были использованы субстраты, различающиеся по степени влияния на клетку: токсичные галофенолы, менее токсичные фенол и бензоат, которые, тем не менее, служат консервантами, и метилбензоат.

Проведенные нами исследования показали, что ответ клетки на внесение ароматических соединений носит многосторонний характер, который мы отмечали на всех уровнях ее организации, начиная от аминокислотного состава ферментов и заканчивая ростовыми характеристиками. В таблице 14 суммированы данные, полученные в настоящей работе с акцентом на выявленные особенности ферментов и путей разложения ароматических соединений родококками.

Таблица 14 - Ферменты и биодеградативные пути у родококков, описанные в данной работе

Ростовой субстрат	Тип пути	Ферменты	Особенности	Примечание
Rhodococcus rhodochrous 89
фенол	обычный орто-путь	ПК 1,2-ДО	высокая активность с 3-ХПК
		МЦИ	активна с 2ХМ, два интермедиата (2ХМЛ, 5ХМЛ), образуется цис-диенлактон	отличается от всех известных (Х)МЦИ
Rhodococcus rhodnii 135
фенол	обычный орто-путь	ПК 1,2-ДО	высокая активность с 3-ХПК
Rhodococcus opacus 1G
фенол	обычный орто-путь	ПК 1,2-ДО	два изофермента, различающиеся по стабильности
Rhodococcus opacus 1cp
бензоат	обычный орто-путь	МЦИ	способность выбирать направление циклоизомеризации 2-ХМ
пара-толуат	обычный орто-путь	ПК 1,2-ДО	широкая субстратная специфичность
		ХПК 1,2-ДО	присутствие дополнительного фермента из 4-ХПК ветви модифицированного орто-пути
4-ХФ	модифицированный орто-путь			у родококков охарактеризован впервые
		4-ХПК 1,2-ДО	специфичность к субстратам с заместителями в пара-положении	впервые расшифрована пространственная структура фермента, размещена в RCSB базе данных под номером 1S9A
		ХМЦИ	способность выбирать направление циклоизомеризации 2-ХМ
		ДЛГ	специфична к цис-диенлактонам
2-ХФ	новый модифицированный орто-путь			описан впервые, аналогов нет
		3-ХПК 1,2-ДО	активна с 3-хлорпирокатехином	впервые расшифрована пространственная структура фермента, размещена в RCSB базе данных под номером 2BOY; нуклеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером O67987
		ХМЦИ	Высокая специфичность; способность выбирать направление циклоизомеризации 2-ХМ	нуклеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером CAD 28144
		ХМЛДГ	Активна с 5-хлормуконолактоном	нуклеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером CAD28145
		ДЛГ	специфична к цис-диенлактонам	нуклеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером CAD28143
Rhodococcus ruber P25
4-ХБК		ПОБГ	специфичность к NADH
		ПКК 4,5-ДО	экстрадиольное раскрытие ароматического кольца
ПОБК		ПКК 3,4-ДО	два изофермента, различающихся по скорости раскрытия кольца ПКК
пара-толуат	обычный орто-путь	ПК 1,2-ДО	активность с метилпирокатехинами выше, че...

Подобные документы

• Идентификация генов – основная задача нового этапа развития генетики

  Эволюция представлений о гене. Основные методы идентификации генов растений. Позиционное клонирование (выделение) генов, маркированных мутациями. Выделение генов, маркированных делециями методом геномного вычитания и с помощью метода Delet-a-gen.
  
  контрольная работа [937,4 K], добавлен 25.03.2016
  

• Технология рекомбинантных ДНК

  Сшивка фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты по одноименным и разноименным "липким концам" и коннекторным методом. Организация генов про- и эукариот. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Подходы к клонированию ДНК.
  
  реферат [33,4 K], добавлен 01.12.2016
  

• Определение способности почвенных бактерий к разложению синтетических моющих средств

  Поверхностно-активные вещества как компоненты синтетических моющих средств, их химические свойства и применение, негативное действие на экосистемы и здоровье человека. Исследование способности микроорганизмов разлагать ПАВ, определение их активности.
  
  курсовая работа [114,0 K], добавлен 26.05.2009
  

• Частная микробиология бактерий рода Listeria

  Изучение частной микробиологии, систематики и методов идентификации бактерий рода Listeria, возбудителей острой инфекционной болезни, особенности морфологии и физиологии. Экология и распространение данных бактерий, медицинское и ветеринарное значение.
  
  курсовая работа [577,3 K], добавлен 23.01.2011
  

• Конструирование, клонирование и отбор рекомбинантных молекул ДНК

  Виды вставок при конструировании рекомбинантных молекул ДНК, лигирование вектора со вставкой. Инфекция, трансфекция и клонирование. Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул. Виды ДНК-библиотек, стратегии клонирования генов и кДНК.
  
  реферат [42,0 K], добавлен 27.07.2009
  

• Прикладные вопросы экологической генетики

  Основы и техника клонирования ДНК. Этапы генной инженерии бактерий. Развитие генетической инженерии растений. Генетическая трансформация и улучшение растений с помощью агробактерий, источники генов. Безопасность генетически модифицированных растений.
  
  реферат [26,3 K], добавлен 11.11.2010
  

• Клонирование

  Объекты, полученные в результате клонирования. Метод "переноса ядра" как наиболее успешный из методов клонирования высших животных. Получение стволовых клеток, генетически совместимых с донорским организмом. Репродуктивное клонирование человека.
  
  презентация [657,4 K], добавлен 21.04.2013
  

• Клонирование

  Определение термина "клонирование" и его применение в биологии. Технология молекулярного клонирования. Клонирование многоклеточных организмов (полное (репродуктивное) и частичное). Тема клонирования в культуре и искусстве (кино, литература, игры).
  
  презентация [2,3 M], добавлен 06.04.2016
  

• Рекомбинантные(химерные) ДНК

  Сущность химерных ДНК, их назначение. Особенности методов конструирования рекомбинантных ДНК. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Методы его клонирования, контроль над исследованиями и использованием полученных результатов.
  
  реферат [44,8 K], добавлен 04.12.2010
  

• Важнейшие открытия в биологии в XX веке

  Ч. Дарвин - основатель теории биологической эволюции. Преемственность в психической организации животных. Установление структуры молекулы ДНК и расшифровка генома человека. Стволовые клетки: популяция клеток-предшественников. Прионы и клонирование.
  
  контрольная работа [36,2 K], добавлен 14.06.2009
  

• Клонирование. Биоэтические проблемы

  Клонирование органов и тканей - задача номер один в области трансплантологии, травматологии и в других областях медицины и биологии. Преимущества и предполагаемые отрицательные последствия клонирования человека. Правительственное регулирование процесса.
  
  реферат [33,9 K], добавлен 24.03.2014
  

• Процесс фотосинтеза

  История открытия фотосинтеза - превращения углекислого газа и воды в углеводы и кислород под действием энергии солнечного света. Описание способности хлорофилла поглощать и трансформировать солнечную энергию. Световая и темновая фазы фотосинтеза.
  
  презентация [533,1 K], добавлен 18.03.2012
  

• Бактерии рода Salmonella как возбудители бактериальных болезней

  Принципы классификации бактерий, их разновидности и общая характеристика. Научная классификация рода Salmonellа. Краткое описание семейства Enterobacteriaceae. Рост и развитие патогенов in vivo и in vitro. Сальмонеллезная инфекция, распространение.
  
  курсовая работа [64,8 K], добавлен 03.06.2014
  

• Отличия бактерий и вирусов

  Микроорганизмы, имеющие более простое строение по сравнению с клетками животных и растений. Размеры, внутренние и поверхностные структуры бактерий и вирусов. Соединения белка и нуклеиновой кислоты, способные размножаться только в пораженной клетке.
  
  презентация [2,0 M], добавлен 26.09.2011
  

• Проблема клонирования животных

  Термины "Клон" и "Клонирование". Клонирование животных. Метод получения генетически однородных особей путем бесполого размножения. Терапевтическое клонирование, "запасные" ткани для трансплантологии. Искусственное изменение ДНК, шаг к бессмертию.
  
  контрольная работа [28,2 K], добавлен 01.10.2008
  

• Основы процесса клонирования

  Клонирование – это процесс, в ходе которого живое существо производится от единственной клетки, взятой от другого живого существа. Понятие "клонирование", его история, биологическая сущность. Примеры проведения клонирования, его недостатки и преимущества.
  
  реферат [37,3 K], добавлен 09.12.2010
  

• Секвенирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)

  Первоначальные способы не автоматизированного секвенирования ДНК, его недостатки. Сущность и принцип автоматического секвенирования, механизм проведения, особенности и проблемы, синтез праймера для начала реакции, использование бактериофага М13.
  
  реферат [24,3 K], добавлен 11.12.2009
  

• Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina

  Галофильные микроорганизмы. Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина. Осмоадаптация аэробных метилотрофных бактерий. Получение бесклеточных экстрактов, определение концентрации белка. Идентификация генов биосинтеза эктоина у бактерии Methylarcula marina.
  
  диссертация [1,0 M], добавлен 24.11.2010
  

• Частная микробиология, систематика и методы идентификации бактерий рода Mycobacterium

  История изучения рода Mycobacterium, особенности морфологии и физиологии. Антигенная структура микобактерий. Классификация и таксономия, виды микобактерий и их дифференциация. Внутривидовая и межвидовая идентификация, ветеринарное и медицинское значение.
  
  курсовая работа [478,0 K], добавлен 11.01.2011
  

• Бактерии

  Слоистые каменные структуры (строматолиты) - результат жизнедеятельности бактерий как древнейшей группы организмов. Изучение бактерий, форма и строение бактерий, их размеры и распространение. Классификация бактерий по способу питания, размножение.
  
  презентация [661,9 K], добавлен 14.10.2011
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам