Роль адреномедуллина и его рецепторов в функционировании эндотелиальной клетки человека (в норме и при некоторых патологиях)

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Роль адреномедуллина и его рецепторов в функционировании эндотелиальной клетки человека ( в норме и при некоторых патологиях)

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Никитенко Леонид Леонидович

Иркутск 2007

Работа выполнена в ГУ "Научный центр медицинской экологии" Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения РАМН, Оксфордском Университете (г. Оксфорд, Великобритания) и Лондонском Университете (г. Лондон, Великобритания)

Научный консультант Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Колесников Сергей Иванович

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Гутник Игорь Нэрисович

доктор медицинских наук, профессор Семинский Игорь Жанович

доктор биологических наук Попкова София Марковна

Ведущая организация ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова»

Защита состоится 26 октября 2007 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.054.01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского Отделения Российской академии медицинских наук» по адресу: 664003, г Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского Отделения Российской академии медицинских наук»

Автореферат разослан « » 2007г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук Шолохов Л.Ф.

адреномедуллин рецептор эндотелиальный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время исследованию процессов развития и функционирования кровеносной и лимфатической сосудистых систем в норме и при патологии уделяется большое внимание. Эндотелиальные клетки микроциркуляторного русла (ЭКМР) играют ключевую роль в развитии и функции кровеносных и лимфатических сосудов. Избыточная пролиферация и трансформация, либо нарушение функции ЭКМР приводит к патологическому ангиогенезу/ лимфангиогенезу или дисфункции сосудистой системы - являющимся показателями злокачественных опухолей и многих других заболеваний [Carmeliet, 2003 и 2005].

Существенный прогресс был достигнут за несколько последних лет в исследовании молекулярных механизмов развития и функционирования сосудистой системы, и в выявлении ключевых ангиогенных и лимфангиогенных факторов, а также в использовании данных знаний для ингибирования ангиогенеза и лимфангиогенеза при опухолевых процессах и неоплазмах/новообразованиях различной этиологии, а также для терапии сердечно-сосудистых заболеваний у экспериментальных животных [Alitalo et al., 2005; Ferrara and Kerbel, 2005].

Одной из современных задач в “транслировании” (применении в практике для терапии человека) данных открытий в области исследования механизмов ангиогенеза и лимфангиогенеза на животных является проверка роли известных и новых факторов в биологии эндотелиальных клеток человека и выявление механизмов регулирующих экспрессию и функцию их рецепторов, а также определение их потенциальной роли в патогенезе опухолевых и сердечно-сосудистых заболеваний [Nikitenko et al., 2006].

В связи с этим разработка методов получения и культивирования эндотелиальных клеток кровеносного и лимфатического микроциркуляторного русла человека, а также исследование роли новых ангиогенных и лимфангиогенных факторов в биологии данного типа клеток представляет собой актуальную задачу в области биомедицины.

Несмотря на то, что эксперименты, проведенные на животных, указывали на роль нового ангиогенного фактора адреномедуллина (АМ) при развитии сосудистой системы у животных в эмбриогенезе и при опухолевых процессах, существовал ощутимый недостаток подобного рода исследований с использованием клеток человека. Кроме того, информация о распределении и функционировании эндогенных адреномедуллиновых рецепторов экспрессированных в клетках и тканях человека также оставалась неизученной до настоящего времени. В связи с этим неизвестными оставались как роль АМ и его рецепторов в тканях человека, так и возможности их использования для лечения раковых и других заболеваний [Nikitenko et al., 2006]. Данная проблема существует и для других ангиогенных факторов. Так, несмотря на несомненную роль одной из ключевых ангиогенных молекул - фактора роста эндотелия (vascular endothelial growth factor, VEGF) в развитии раковых опухолей в экспериментальных исследованиях на животных, применение ингибиторов данного ангиогенного фактора не всегда приводит к положительным результатам [Ferrara and Kerbel, 2005].

Трудности в данной области обусловлены отсутствием системного подхода в анализе экспрессии и функции факторов ангиогенеза и их рецепторов in vitro и in vivo в клетках и тканях человека. Под системным подходом подразумевается проведение исследований не только роли данных факторов на эндотелиальные клетки человека, но и исследование транскрипции и трансляции генов кодирующих данные рецепторы в органах и клетках, изучение механизмов регулирующих экспрессию рецептора на поверхности клетки,специфичности его взаимодействия с потенциальными лигандами (фармакология рецептора), а также механизмов десенситизации и ресенситизации.

Данный подход позволяет рассматривать не только механизм действия определенного ангиогенного фактора на молекулярном и клеточном уровнях, но и потенциал использования данных знаний в теоретической биологии а также при разработке методов диагностики, интервенции и терапий для прогнозирования эффективности применения ингибиторов и активаторов данных механизмов, выявления типов раковых опухолей (а также индивидуальных пациентов), в которых действие данных препаратов может быть наиболее результативным, и потенциального использования в клинике для лечения широкого спектра сердечно-сосудистых, раковых, инфекционных и других заболеваний связанных с патологическим (лимф)ангиогенезом или дисфункции сосудистой системы

Исходя из этого, целью данного исследования являлось оценка роли пептида адреномедуллина (АМ) в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека и механизмов регулирующих экспрессию и функцию его рецепторов в норме и при некоторых патологиях на основе комплексного морфо-функционального и молекулярно-генетического исследования.

Изучение роли адреномедуллина и его рецепторной системы путем комплексно-систематического подхода

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы получения и культивирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) из тех тканей человека, в которых происходят процессы физиологического ангиогенеза;

2. исследовать роль АМ в первичных культурах ЭКМР человека;

3. исследовать экспрессию адреномедуллинового рецептора - рецептора подобного кальцитониновому рецептору (calcitonin receptor-like receptor, CL, кодируемого CALCRL геном) в клетках и тканях человека;

4. исследовать механизмы, регулирующие экспрессию CALCRL гена человека в ЭКМР в норме и при патологии путем клонирования и описания промотера, изучения субхромосомной организации данного гена и влияния онкогенных вирусов (на примере вируса саркомы Капоши) на его транскрипцию;

5. произвести и охарактеризовать антитела против CL рецептора;

6. исследовать специфичность к различными лигандам, а также механизмы сенситизации и десенситизации, CL рецептора в эндотелии человека;

7. исследовать роль адреномедуллина и его рецепторов в ангиогенезе при развитии раковых опухолей и патологических заболеваний органов репродукции, путем изучения экспрессии пептида и локализации функциональной формы CL рецептора в тканях человека в норме и при патологии (в опухолях почек и яичников и тканях саркомы Капоши).

8. исследовать возможность использования разработанных реактивов и методов для диагностики неоплазм, раковых опухолей и других заболеваний;

9. исследовать возможность модулирования функционирования адреномедуллиновых рецепторов с целью коррекции их функции при патологиях развития и функции сосудистой системы.

Основные положения выносимые на защиту.

АМ является новым ангиогенным фактором в тканях человека за счет своей способности активировать пролиферацию и миграцию, а также ингибировать апоптоз эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла.

Экспрессия CALCRL гена человека зависит прежде всего от клеточно- и ткане-специфического фона. При этом ключевым фактором в транскрипции CALCRL гена является его трехмерная субхромосомная структура, в то время как активность промотера играет вторичную роль.

Десенситизация CL рецептора в эндотелиальных клетках человека при избыточной экспрессии лиганда отражается на его функции и может играть роль при развитии сердечно-сосудистых заболеваний различной этиологии.

Разработанные реактивы и методы могут применяться для диагностики и коррекции патологий связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, например патологического ангиогенеза и гиперпроницаемости эндотелия.

Разработана и применена концепция системного анализа механизмов комплексной многоуровнево-селективной регуляции экспрессии и функции адреномедуллиновых рецепторов, а также их роли в полноценном функционировании эндотелиальной клетки в норме и при патологии.

Научная новизна работы.

Разработаны и усовершенствованы методы получения и культивирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) человека.

Впервые продемонстрирована роль пептида АМ в биологии ЭКМР и ангиогенезе в тканях человека.

Впервые описаны механизмы регулирующие экспрессию CALCRL гена человека и функцию CL рецептора в тканях и эндотелии человека. Впервые продемонстрирована роль CL рецептора как рецептора для АМ и пептида относящегося к гену кальцитонина (CGRP) в ЭКМР человека, а также выявлены механизмы его десенситизации.

Впервые разработан метод определения трехмерной субхромосомной структуры генов. Сконструированы плазмидные векторы, позволяющие эффективно оценивать экспрессию CALCRL гена человека, активность его промотера и осуществлять экспрессию CL рецептора в клетках млекопитающих. Впервые клонированы новые, ранее неохарактеризованные транскрипты CALCRL гена человека и лентивирусная «библиотека», включающая 27 генов, кодирующих различные вирусные белки вируса саркомы Капоши.

Впервые получены уникальные реактивы - поликлональные антитела против человеческого CL рецептора и блокирующие моноклональные антитела против гетеродимера CL/RAMP, экспрессированого на поверхности клетки. Показана специфичность данных антител и возможность оценки функционального статуса CL рецептора, а также регуляции его функции в клетках и тканях человека.

Впервые продемонстрирована экспрессия CL рецептора в клетках и тканях человека в норме и при патологиях (на примере опухолевых тканей почек, яичников, лейомиомы и саркомы Капоши).

Разработана и применена концепция системного анализа механизмов комплексной многоуровнево-селективной регуляции экспрессии и функции адреномедуллиновых рецепторов, а также их роли в полноценном функционировании эндотелиальной клетки в норме и при патологии.

Практическая значимость исследования.

Разработанные реактивы и методы могут быть использованы для дальнейших исследований биологии эндотелиальных и стволовых клеток человека, экспрессии и функции CL рецептора в нормальных и опухолевых клетках и тканях человека, а также для диагностики раковых, сердечно-сосудистых и других заболеваний.

Полученные плазмидные векторы могут быть использованы в области биотехнологии, а полученные поликлональные антитела против CL рецептора человека - как для научно-исследовательских работ, так и для применения в области диагностики и практической медицины.

Разработанные моноклональные антитела против гетеродимеров CL/RAMP могут являться эффективным методом коррекции патологий, связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, как например патологический ангиогенеза и гиперпроницаемость эндотелия.

Изученная роль АМ в биологии ЭКМР человека и полученные данные о механизмах регулирующих, экспрессию и функцию адреномедуллиновых рецепторов, представляют собой большой интерес при поиске эффективных методов противоопухолевой терапии и сердечно-сосудистых заболеваний связанных с ангиогенезом и функцией эндотелия в тканях человека.

Полученные результаты расширяют понимание комплексной регуляции адреномедуллиновых рецепторов и позволяют оценить возможность применения ингибиторов/активаторов действия АМ для трансляционных исследований и терапии заболеваний, связанных с избыточной или недостаточной экспрессией самого пептида, либо его рецепторов, а также проводить предварительные исследования по воздействию различных веществ на экспрессию, транспорт и функцию CL в эндотелиальных клетках, как источнике его локализации in vivo в тканях человека.

Полученные данные свидетельствуют о необходимости продолжения исследований фармакологии адреномедуллиновых рецепторов как в эндотелиальных клетках опухолей так и в самих опухолевых клетках, а также выявления различий рецептора, экспрессированного в нормальном и опухолевом эндотелии.

На основе разработанных технологий получения поликлональных и моноклональных антител против CL рецептора человека, определения трехмерной субхромосомной структуры генов и векторных плазмид, содержащих промотер CALCRL гена человека, разработаны методы их использования для диагностики раковых и других заболеваний, а также оформлено и получено два патента на изобретение.

Апробация диссертационной работы. Результаты исследований доложены на конференциях: Xth Hamburg Symposium on Tumor Markers, Hamburg, Germany, 1999; XIth International Congress of Histochemistry and Cytochemistry, York, United Kingdom, 2000; Annual ICRF Colloquium, Warwick, United Kingdom, 2000; Introduction to Molecular and Cellular Research, San-Diego, USA, 2000; 8th IFPA Meeting, Melbourne, Australia, 2002; “Angiogenesis: basic mechanisms and therapeutic implications”, Ascona, Switzerland, 2002; 5th Imperial College School of Medicine Symposium “Vascular endothelium: Role in disease pathogenesis and as a therapeutic target”, London, United Kingdom, 2002; 676th Biochemical Society Meeting, Edinburgh, United Kingdom, 2002; 6th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Mосква и Санкт-Петербург, Российская Федерация, 2003; Special FEBS 2003 Meeting on Signal Transduction, Brussels, Belgium, 2003; The 40th American Association for Cancer Research Annual Meeting, New Orleans, USA, 2003; Joint International Symposium on CGRP, Amylin and Calcitonin 4^th Symposium on Adrenomedullin and Proadrenomedullin N-20 Peptide, Zurich, Switzerland, 2004; XXXIV Congress of Nordic Federation of Obstetrics of Obstetrics and Gynaecology, Helsinki, Finland, 2004; XI European Placenta Group Meeting, Glasgow, United Kingdom, 2005; XIth Biennial International Gynecologic cancer Society Meeting, Santa Monica, USA, 2006; The 24^th European Conference on Microcirculation. From Vascular Biology to Clinical Microcirculation, Amsterdam, Netherlands, 2006; The 9^th International Workshop on Kaposi's Sarcoma Associated Herpesvirus (KSHV) and Related Agents, Cape Cod, USA, 2006; The Physiological Society 2006 Main Meeting, London, United Kingdom; The 21st Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (ISH2006), Fukuoka, Japan, 2006.

Публикации: основные материалы работы изложены в одной монографии, руководстве по эмбриологии, двух главах книг, 13 статьях в международных журналах, 21 материалах международных научных конференций, двух оформленных патентах на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, общие выводы и указатель цитируемой литературы (325 источников). Работа иллюстрирована 65 рисунками и 12 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Для реализации поставленных задач были использованы следующие методы исследования:

клеточно-биологические (выделение и описание первичных культур эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека, исследование ангиогенной активности пептидов с применением моделей ангиогенеза in vitro);

гистологические (иммуногистохимия, иммунофлюоресценция, микрочипы тканей, гибридизация in situ; световая, флуоресцентная и конфокальная микроскопия);

молекулярно-биологические (Northern блоттинг, Western блоттинг, метод полуколичественной и количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), ДНК микрочипы, 3'- и 5'-RACE, метод определения субхромосомной структуры генов, клонирование);

биотехнологические и биохимические (получение, очистка и характеризация поликлональных и моноклональных антител, дегликозилирование, ELISA);

вирусологические (получение препаратов вируса саркомы Капоши, конструкция и использование лентивирусной «библиотеки», кодирующей индивидуальные гены данного онкогенного вируса).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Задачей первого этапа исследований являлось определение возможной роли АМ в ангиогенезе в тканях человека. Для практического выполнения поставленной задачи было необходимо получение эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) органов и тканей, в которых происходят процессы физиологического или патологического ангиогенеза. Нами были выбраны эндометрий и миометрий человека для разработки методов получения ЭКМР и изучения роли адреномедуллина, поскольку физиологический ангиогенез характерен для тканей матки и предварительные данные экспериментов проведенных в нашей лаборатории указывали на возможную роль данного пептида в этих тканях [Hague et al., 2000]. Необходимость получения ЭКМР из органов в которых происходит ангиогенез для изучения роли новых ангиогенных факторов обусловлено тем, что именно пролиферация и миграция эндотелия микроциркуляторного русла, а не основных сосудов, необходимы для возникновения новых сосудов при ангиогенезе в тканях. Кроме того, эндотелий микроциркуляторного русла разных органов гетерогенен, т.е. может отличаться по своим функциональным свойствам, морфологии и экспрессии рецепторов, а потому и различной способностью отвечать на стимуляцию данными факторами.

Разработка методов изолирования, характеризации и культивирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека.

Для получения ЭКМР нами были использованы лектин Ulex Europeus Agglutinin 1 (UEA1), связанный с магнитными шариками (Рисунок 2). UEA1 селективно распознает эндотелиальные клетки непосредственно в тканях (Рисунок 2), путем связывания с фукозой на поверхности этих клеток.

Получение и характеристика эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) из эндометрия человека

Эндотелиальные клетки были получены из эндометриальной ткани матки (А) после гистерэктомии. (А) Радиограмма среза матки (спиральные артерии эндометрия наполнены суспензией сульфата бария и желатина). Эндотелиальные клетки микроциркуляторного русла экспрессируют фукозу, распознаваемую лектином Ulex Europeus Agglutinin-1 (UEA-1) выявленого путем (Б) использования метода иммунофлуоресценции (ФИТЦ - зеленый цвет; белые стрелки; DAPI - окраска ядер). Магнитные шарики покрытые лектином UEA-1 были использованы для получения чистых культур ЭКМР, формирующих (В) характерный монослой в культуре (магнитные шарики в первом пассаже еще прикреплены к поверхности клеток; красные стрелки) и (Г) капиллярную сеть на матриксе Матригель. Иммунофлуоресцентная характеризация ЭКМР матки с использованием антител против специфических маркеров (Д) фактора вон Виллебранда (vWF) и (Е) CD31. ЭКМР активно растут в культуре, что продемонстрировано иммунофлуоресцентной окраской на присутствие (Ж) маркера пролиферирующих клеток Ki67.

Первоначально ткани эндометрия были собраны в среду МакКоя (McCoy's 5A medium), содержащую 10% телячьей сыворотки (ТС) и антибиотики, и сохранены на 12-16 часов при 4⁰С. На следующий день ткань была разрезана скальпелем на кусочки размерами 1 мм², которые впоследствии были инкубированы в течении 2 часов в среду МакКоя содержащей 2 мг/мл коллагеназы и 10% телячьей сыворотки при постоянном размешивании. Данная процедура приводит к распаду тканевых структур и получению клеточной суспензии, которая затем фильтруется через стерильное сито с порами размером 100 мкм для удаления нерастворенных тканей. Затем клеточная суспензия центрифугируется и промывается несколько раз средой. Обобщенная схема получения и оценки ЭКМР человека показана на Рисунке 2.

После этого первоначально клеточная суспензия может быть обогащена на содержание ЭКМР может путем центрифугирования полученной клеточной суспензии в “непродолжительном” градиенте “Percoll”. При этом клеточная масса ресуспендируется в 20% растворе “Percoll” в физрастворе с содержанием бычьего сывороточного альбумина (БСА) и помещается на поверхность двух слоев раствора “Percoll” - 40%-ного и 60%-ного. После этого трехслойный “непродолжительный” градиент (20%-40%-60%) “Percoll” центрифугируется при 670 g в течении 30 минут и обогащенная эндотелиальными клетками популяция формируется между слоями 40%-ного и 60%-ного растворов “Percoll”. Клетки собираются с помощью Пастеровской пипетки и ресуспендируются в среде МакКоя содержащей 10% ТС.

Магнитные шарики готовятся предварительно, за день до проведения изолирования эндотелиальных клеток. Лектин Ulex europeus agglutinin был связан ковалентно к тозилактивированным магнитным шарикам “Dynabeads” M-450 в соответствии с предварительно опубликованными работами [Jackson et al., 1990]. Одинаковые объемы лектина (0.2 мг/мл в боратном буфере, рН 9.6) и шариков (2х10⁷ шариков/мл) и проинкубированы в течение 12-16 часов при 4⁰С и постоянном перемешивании. На следующий день шарики были промыты три раза в физиологическом растворе при помощи магнитного концентратора и ресуспендированы в физиологическом растворе с содержанием БСА до концентрации 2х10⁷ шариков/мл, после чего сохранены при 4⁰С до использования.

Селекция эндотелиальных клеток была проведена при помощи магнитных шариков покрытых лектином Ulex europeus agglutinin путем инкубирования при 4⁰С в течении 10 минут и постоянном перемешивании. Клетки были инкубированы с шариками в пропорции 1:3 в общем объеме 0.5 мл. После этого прикрепленные клетки были собраны при помощи концентратора магнитных частиц, с удалением супернатанта, не содержащего магнитных шариков, но содержащего клетки других типов (не-эндотелиальные). Данная процедура проводится три раза, с промежуточной промывкой частиц в среде МакКоя содержащей 1% телячьей сыворотки в течение 1 минуты.

Очищенные популяции ЭКМР эндометрия, полученные из индивидуальных препаратов (количество клеток варьировало от 5000 до 17000) были посажены в чашки Петри (35мм²; при плотности клеток 6000 на ячейку) предварительно покрытые коллагеном IV типа (5мg/см²). Культуры клеток были инкубированы при 37⁰С в инкубаторе во влажной атмосфере с содержанием 5% СО². Среда менялась через каждые 48 часов. При достижении конфлюенции клетки были пересажены путем использования раствора содержащего трипсин и ЭДТА, с последующим разведением в среде для культивирования в пропорции 1:2.

Полученные данным методом клетки первоначально содержат магнитные шарики прикрепленные к их поверхности (Рисунок 2). Клетки образуют специфические колонии, характерные для данного типа клеток, в течение первых 24 часов. Из проведенного количества экспериментов 80% имели свои результатом успешное изолирование эндотелиальных клеток. Лишь часть из полученных препаратов (<5%) содержала другие типы клеток, количество которых, тем не менее, не превышало 1-5%. ЭКМР эндометрия имели морфологию типичную для клеток данного типа (Рисунок 2) с большим ядром, заметным контактным ингибированием в точках соприкосновения и отсутствием наползания клеток друг на друга при достижении конфлюенции. Магнитные шарики оставались прикрепленными к эндотелиальным клеткам после того как они были посеяны впервые, впоследствии было отмечено их спонтанное освобождение при первой пересадке. Кроме того, эндотелиальные клетки обладали способностью образовывать “капилляроподобные” структуры при пересадке на специфический матрикс Матригель (Рисунок 2). Предыдущими исследованиями было показано, что только эндотелиальные клетки обладают такой способностью. Более подробные детали проведения вышеуказанных экспериментов описаны в наших работах [Nikitenko et al., 2000; Nikitenko et al., 2006].

Полученные из тканей первичные клетки необходимо было охарактеризовать на наличие специфических маркеров того или иного типа клеток. ЭКМР были охарактеризованы с использованием специфических маркеров эндотелия (Рисунок 2, Таблицы 1 и 2). Для проведения анализа специфичности полученной популяции эндотелиальных клеток нами был проведен иммуногистохимический анализ клеток изолированных из эндометрия, миометрия и децидуальной ткани. Для этого нами был использован спектр моноклональных и поликлональных антител, распознающих антигены, которые экспрессированы специфически на определенных типах клеток (Таблица 1). Иммуногистохимия и иммунофлюоресценция были проведены соответственно методам описанных в спектре наших работ [Nikitenko et al., 2000; Nikitenko et al., 2001; Nikitenko et al., 2006].

Таблица 1

Моноклональные и поликлональные антитела использованнные для характеризации эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла

Антитело/Клон	Антиген a	Литература	Источник
1А4	Гладкомышечный актин	Skalli et.al., 1986	Dako
F8/86	Фактор вон Виллебранла	Naiem et.al., 1982	Dako
JC/70A	CD31	Parums et.al., 1990	Dako
LP34	Кератины 5,6 and 18	Moll et al., 1982	Dako
MNF 116	Кератины 5,6,8,17,19		Dako
PG-M1	CD68	Falini et al., 1993	Dako
V9	Виментин	Osborn et al., 1984	Dako
MM1	Ki-67		Novocastra
Поликлональные	Фактор вон Виллебранла	Bukh et al., 1986	Dako
Поликлональные	VEGFR II (KDR)	Barleon et al., 1994	Gift from Dr H.Weich

^a CD31 - cluster designation 31; CD68 - cluster designation 68; VEGFR II - vascular endothelial growth factor receptor II.

Маркеры CD31, фактор вон Виллебранда и места связывания лектина Ulex europeus agglutinin присутствовали на эндотелии как в тканях так и in vitro в течение 4-5 пассажей (Таблица 2). Интенсивная типичная “точечная” окраска на фактор вон Виллебранда была отмечена в цитоплазме эндотелия микроциркуляторного русла эндометрия и децидуальной ткани в культуре (Рисунок 2). При достижении конфлюенции антиген CD31 присутствует в местах клеточных контактов в данных клетках (Рисунок 2). Кроме того, клетки обладали способностью к эффективной пролиферации как показано с применением маркера Ki-67 (Рисунок 2).

Кроме того, нами были использованы антитела против гладкомышечного актина, кератинов и CD68 (Таблица 1) для определения присутствия мышечных и эпителиальных клеток, а также макрофагов соответственно в культурах эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла. Данные эксперименты выявили наличие всего 1-5% неэндотелиальных клеток в менее чем 5 процентах полученных препаратов первичных клеток из исследуемых тканей.

Таким образом, оптимизация метода привела к получению чистых (95-100%) первичных культур ЭКМР из тканей человека (децидуа и эндометрий- рисунок 2).

Применение данного метода с использованием ткани миометрия также привело к успешному получению ЭКМР из данной ткани человека. Происхождение ЭКМР миометрия было охарактеризовано с использованием морфологических, иммуногистохимических и молекулярно-биологических методов .

Исследование роли адреномедуллина

Получение чистых культур ЭКМР позволило впервые изучить влияние АМ на биологию данного типа клеток человека и проверить гипотезу о роли этого пептида в ангиогенезе в тканях и органах человека. Нами были проведены эксперименты по изучению роли АМ в росте, миграции и регуляции монослоя ЭКМР (Рисунок 3).

Митогенные свойства адреномедуллина

Митогенный анализ (влияние на пролиферацию) свойств адреномедуллина был проведен с использованием метода инкорпорации радиоактивно меченного тимидина (метил-³Н) [Nikitenko et al., 2000]. Первичные эндотелиальные клетки четвертого пассажа были посажены в 96-луночные тарелки (5000 клеток на лунку). На следующий день среда была заменена на среду с низким содержанием человеческой сыворотки (20%). На третий день клетки были простимулированы факторами роста: эндотелия (VEGF), фибробластов (bFGF), эпидермиса (EGF) или адреномедуллином (AM) в среде содержащей 10% сыворотки человека и с добавлением радиоактивно меченного тимидина (1 мCi). После 24-часловой инкубации клетки были трипсинизированы и собраны на фильтры для измерения радиоактивности с помощью сцинтилляционного бета-счетчика.

АМ индуцировал инкорпорацию тимидина в культурах ЭКМР эндометрия и миометрия (Рисунок 3) человека. Интенсивность стимуляции была сравнима с таковой полученной при использовании известных ангиогенных факторов - VEGF и bFGF, экспрессия которых была ранее выявлена в матке человека [Bicknell and Rees, 1995].

Адреномедуллин стимулирует миграцию эндотелиальных клеток

Для исследования влияния АМ на миграцию эндотелиальных клеток нами были использованы аппараты Transwell (Рисунок 3) [Nikitenko et al., 2006]. Эндотелиальные клетки были посажены в верхнюю камеру вкладки Transwell. Пептиды (адреномедуллин, CGRP или амилин, принадлежащие к одному и тому же семейству пептидов) [Poyner et al., 2002] были добавлены в нижнюю камеру. Полная среда для культивирования эндотелиальных клеток (содержащая несколько факторов роста для эндотелиальных клеток) или VEGF были использованы в качестве положительных контролей. Среда без факторов роста (0.5% ТС) была использована в качестве отрицательного контроля. После 24-часовой инкубайии клетки были помечены флуоресцентным красителем (calcein^-AM), и количество мигрировавших клеток определено путем измерения флуоресценции клеток с использованием счетчика Elx 800 с возможностями чтения нижней части вкладыша. Данные были проанализированы и статистически обработаны, и фотографии получены с использованием Программ RC4v30 PowerReports и Nicon CoolPix 990 Camera соответственно. Только мигрировавшие сквозь поры светонепроницаемой мембраны клетки могут быть детектированы счетчиком.

Проведенные эксперименты показали что АМ и CGRP, но не амилин, являются факторами миграции эндотелиальных клеток (Рисунок 3). Полученный при использовании данных пептидов миграционный эффект был сравним по интенсивности с таковым полученным при использовании ангиогенного фактора VEGF. Значительный интерес при этом представляет сходство ангиогенных эффектов (пролиферации и миграции) полученных при использовании эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека и in vivo моделей с использованием тканей цыпленка (Рисунок 3) и ксенотрансплантированных клеточных линий сверхэкспрессирующих АМ в мышиных моделях (Рисунок 3).

Таблица 2

Иммунореактивность эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла эндометрия человека на криостатных и парафиновых срезах и в культуре с использованием моноклональных и поликлональных антител

Фактор вон	+++
Виллебранда
CD31	+++
Виментин	++
Места связывающие	НО
лектин UEA1
Ki-67	НО
VEGFR II (KDR)	++
Гладкомышечный	-
актин
Кератины	-
5,6,8,17,18,19
CD68	-

+++ очень интенсивная окраска; ++ сильная окраска; + слабая окраска; - отсутствие окраски; NE - анализ не проведен. ^а - Сходная окраска была получена при использовании поликлональных и моноклональных антител на замороженных срезах.

^a Данная таблица также включает результаты окраски с использованием лектина Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA 1).

^b Сходная окраска была получена на парафиновых и криостатных срезах.

Окраска была оценена с использованием полуколичественного метода: +++ - очень сильная окраска, ++ -

Роль адреномедуллина в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) человека (А) Пролиферация ЭКМР эндометрия в ответ на стимуляцию АМ (результаты стимуляции с использованием VEGF, bFGF и FGF приведены для сравнения). (Б) Пролиферация ЭКМР миометрия при стимуляции АМ. (В) Миграция ЭКМР кожи (см. ниже) в ответ на стимуляцию АМ. Данный эффект АМ на ЭКМР in vitro сравним с эффектом наблюдаемым in vivo при использовании (Г) CAM (chicken chorioallantoic membrane assay) (фото адаптировано из Zhao et al., 1998) и (Д) мышиных ксенографтных моделей (фото адаптировано из Oehler et al., 2001) (Е) АМ защищает монослой ЭКМР от действия активаторов апоптоза (например, низкое содержание сыворотки в среде для культивации). Данный эффект противоположен (Ж) эффекту, наблюдаемому в сосудистой системе мышей при выключении/удалении гена адреномедуллина (фото адаптировано из Shindo et al., 2001).



Ингибирование апоптоза адреномедуллином

Нами были также проведены исследования по выявлению роли АМ в ингибировании апоптоза, вызванного пониженной концентрацией сыворотки в культивируемой среде (Рисунок 3). Результаты данных исследований показывают, что АМ защищает монослой эндотелиальных клеток человека от разрушений вызванных пониженной концентрацией сыворотки и гибелью эндотелиальных клеток в данных условиях. Значительный интерес при этом представляет сходство морфологии эндотелия человека при ингибировании АМ сигналов и эндотелия органов у гомозиготных АМ -/- эмбрионов мышей (Рисунок 3) [Shindo et al., 2001].

Таким образом, в результате первого этапа исследований нами были разработаны методы изолирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла эндометрия и миометрия, как органов в которых происходят процессы физиологического ангиогенеза. Данные методы получения эндотелия сосудов микроциркуляторного русла человека позволили впервые проверить гипотезу о возможной роли адреномедуллина в данных клетках при процессах ангиогенеза и изучить роль этого пептида в биологии данного типа клеток. Результаты проведенных экспериментов продемонстрировали впервые роль адреномедуллина в росте и миграции эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека.

Необходимо отметить, что одновременно исследованиями, проведенными в лабораториях за рубежом, были сделаны открытия о роли АМ в эмбриогенезе [Caron and Smithies, 2001; Shindo et al., 2001] и развитии раковых опухолей [Oehler et al., 2001; Oehler et al., 2002], ингибировании апоптоза [Kato et al., 1998; Shichiri et al., 1999] и гиперпроницаемости эндотелиальных клеток [Hippenstiel et al., 2001]. Обобщение данных исследований и предыдущего знания о вазоактивных свойствах АМ позволило нам сделать заключение о важной роли данного пептида в микроциркуляторном русле [Nikitenko et al., 2002].

В свою очередь данные открытия указывали на необходимость исследования адреномедуллиновых рецепторов в клетках и тканях человека, и в том числе механизмов регулирующих их экспрессию и функцию.

Механизмы, регулирующие экспрессию адреномедуллиновых рецепторов

Необходимость изучения экспрессии эндогенных адреномедуллиновых рецепторов обусловлена прежде всего тем что лиганд может быть секретирован практически любой клеткой. Однако остается неясным, какие клетки являются мишенью для данного пептидного гормона в органах и тканях. Прежде всего, данная информация необходима для разработки методов терапии и регуляции (активирования или ингибирования) физиологических и патологических процессов ангиогенеза. Поэтому нами был разработан спектр методов для изучения экспрессии, а также механизмов регулирующих транскрипцию гена и функционирование рецептора в эндотелиальных клетках.

Исследованиями, проведенными С. Фордом и коллегами [McLatchie et al., 1998] было показано, что G-белок связывающий рецептор Calcitonin receptor-like receptor (CRLR, впоследствии переименованный в CALCRL ген и CL рецептор в соответствии с номенклатурой Геномного Проекта Человека и Фармакологического Союза, соответственно) путем формирования гетеродимера с одним из трех RAMPs (белков модифицирующих активность рецепторов) образует рецепторы для нескольких пептидов кальцитониновой группы. Таким образом, CL играет ключевую роль в формировании адреномедуллиновых рецепторов (Рисунок 4). Поэтому наши исследования на следующем этапе были сфокусированы на исследовании механизмов транскрипции CALCRL гена и экспрессии функционального CL рецептора.

Исследования экспрессии CALCRL гена in vitro и in vivo

Первоначально исследованиями, проведенными с использованием тканей человека в нашей лаборатории и применением метода гибридизации in situ было показано, что мРНК CALCRL локализована преимущественно в кровеносных сосудах in vivo. (Рисунок 5). Данные этих исследований указали на то, что in vivo именно микрососуды являются мишенью для адреномедуллина и CGRP, несмотря на широкий эффект данных гормонов in vitro на многие другие клеточные линии происходящие из разных органов [Hinson et al., 2000]. Несмотря на данные результаты, исследованию регуляции экспрессии адреномедуллиновых и CGRP рецепторов препятствовало отсутствие знаний прежде всего о регуляции экспрессии CALCRL гена. Поэтому первоначальной целью наших исследований являлось клонирование промотера, выявление регуляторных элементов в его структуре и исследование механизмов регулирующих транскрипцию CALCRL гена в эндотелиальных клетках человека.

Транскрипционный анализ CALCRL гена с использованием метода RT-PCR

Для транскрипционного анализа (профайлинга) экспрессии человеческого CALCRL гена, нами были использован метод полимеразной цепной реакции с предварительным использованием обратной транскриптазы (RT-PCR) и кДНК полученных из эндотелиальных и неэндотелиальных клеток, а также из тканей человека. Полученные данные показали, что экспрессия CALCRL гена происходит преимущественно в микроциркуляторных эндотелиальных клетках человека изолированных из легких, эндометрия, миометрия и кожной ткани (Рисунок 5).

Определение транскрипционного старта CALCRL гена с использованием метода RАСЕ

Для выявления транскрипционного старта и промотера CALCRL гена человека нами был использован метода быстрой амплификации концов кДНК (RACE). RACE является методом, основанным на использовании метода ПЦР и служит эффективным методом в изолировании полной последовательности кДНК специфических генов. Первоначально мы провели дизайн ген-специфического праймера 5'CCCACAAGCAAGGTGGGAAAGAGTG, соответствующего первому экзону опубликованной последовательности CALCRL гена человека. РНК эндотелиальных клеток была транскрибирована обратной полимеразой с применением олиго-дТ праймера для получения одноцепочечной комплиментарной ДНК. Адапторные последовательности были лигированы к обоим концам полученной ДНК для получения двухцепочечной кДНК. Лигированная ДНК была использована для проведения ПЦР с использованием ген-специфического и адапторного праймеров.

Использование метода 5'-RACE привело к амплификации основного продукта длиной 200 нуклеотидов (Рисунок 6). Данный продукт ПЦР был очищен методом изолирования из геля, просиквенирован, и полученная последовательность сравнена с последовательностью кДНК и геномной последовательностью c целью определения транскрипционного старта CALCRL гена человека. Наши данные привели к выявлению начала транскрипции и позволили определить потенциальный промотер CALCRL гена, и поэтому сделать возможным проведение его клонирования и анализа.

G-белок связывающий рецептор CL -ключевая молекула в адреномедул-линовых рецепторах



CL экспрессирован в клетке в виде основно- гликозилированного белка который локализирован в эндоплазматическом ретикулуме. Белки модифицирующие активность рецептора (RAMPs) принимают участие в терминальном гликозилировании, транспорте CL к плазматической мембране и определяют фенотип гетеродимеров. Гетеродимер CL/RAMP1 является рецептором для CGRP (CGRP₁ рецептор), в то время как CL/RAMP2 и CL/RAMP3 гетеродимеры по своим Фармакологическим свойствам являются соответственно AM₁ и AM₂ рецепторами.

Транскрипция CALCRL гена в клетках и тканях человека

Преимущественная экспрессия CALCRL мРНК в эндотелиальных клетках полученных из разных органов человека. Экспрессия гена намного ниже в неэндотелиальных клеточных линиях и первичных клеточных культурах. CALCRL мРНК локализуется в клетках сосудов микроциркуляторного русла матки как в эндометриальной так и миометриальной тканях (стрелки), но не эпителиальных гландах (короткие стрелки) и строме (звезды) эндометрия (Э), либо гладких мышцах (звезды) миометрия (М). Замороженные срезы гибридизированы с антисенс-зондом меченым ³⁵S для выявления локализации CALCRL мРНК (микроскопия с использованием светлого и темного полей). Сигнал отсутствует при использовании сенс-зонда. СП - светлое поле, ТП - темное поле

Изначально нами были проведены исследования промотера CALCRL гена, а также гетерогенность его транскриптов и субхромосомной организации в эндотелиальных клетках человека.

Определение начала транскрипции CALCRL гена человека в эндотелиальных клетках с использованием метода 3'RACE

Праймер специфичный для экзона 1 CALCRL гена (GSP-1) был использован для проведения 3'RACE реакции амплификации. (А) Амплифицирован-ный продукт размером 200 нуклеотидных пар для CALCRL гена человека (1) и 2500 нуклкотидных пар для трансферринового рецептора (TFR; 2; контроль). GSP-1 (3), TFR (4) или смесь унмверсальных праймеров (5) при использовании поодиночке не производят данных продуктов, указывая на их специфичность. Амплифициро-ванный фрагмент CALCRL кДНК был выделен из геля, очищен и просеквенирован для определения 5'нетранслированного участка (5'UTR; untranslated region) CALCRL кДНК. (Б) Проведенное секвенирование позволило точно определить начало транскрипции CALCRL гена человека.

Клонирование и характеристика промотера CALCRL гена

Клонирование промотера было проведено с использованием данных 5'RACE эксперимента. Нами был проклонирован фрагмент геномной ДНК соответствующий 2.3 кб до транскрипционного старта. Конструкты 5'-flanking участка были использованы в экспериментах с модифицированным вектором для подтверждения роли клонированного участка CALCRL гена в транскрипции [Nikitenko et al., 2003]. Полученные данные указывают на то, что клонированный участок геномной ДНК действительно обладает способностью обеспечивать транскрипцию и поэтому вполне вероятно что он является промотером CALCRL гена.

Кроме того, использование программы SIGNAL SCAN позволило определить потенциальные участки связывания известных транскрипционных факторов (ТФ), включая NF-1, Sp1 и глюкокортикоидные рецепторы [Nikitenko et al., 2003]. Кроме того, нами был проведен дополнительный анализ промотера, который позволил выявить наличие участка ответа на гипоксию (hypoxia-respose element, HRE). Для выявления роли этого участка в транскрипции CALCRL гена в гипоксических условиях, нами был проведен мутагенез данного фрагмента промотера и соответствующие функциональные исследования (Рисунок7).

Результаты данных исследований подтвердили функциональную роль HRE в экпрессии CALCRL гена.



Рисунок 7

pGL3- CALCRL-516mut

pGL3- CALCRL-516mut _G__AT___ pGL3-CALCRL-516

pGL3-CALCRL-516 CACACACACACACACGCCTA

Относительная активность промотера

Последовательность нормальной и мутированной pGL3-CALCRL плазмид. pGL3-CALCRL-516 вектор и pGL3- CALCRL-516mut последовательности pGL3-CALCRL-516 одинаковы (… … … ) за исключением замены трех нуклеотидов (подчеркнуто) в последовательности HRE мутированного вектора. (Б) Анализ транзитной экспрессии нормального и мутированного векторов. Первичные ЭКМР кожи человека были транфицированы с phPGK (для определения равномерной трансфекции) и pGL3-CALCRL-516 либо pGL3-CALCRL-516mut. Трансфицированные клетки были проинкубированы при 20% 0₂ в течение 4 часов, после чего проинкубированы при 20% 0₂ либо 0.1% 0₂ в течении 16 часов. pGL3/phPGTK отношение было определено для каждой плазмиды и нормализовано к результатам для pGL3-CALCRL в клетках при 20% 0₂. Соотношение pGL3 (относительная активность pGL3) было расчитано для определения активности участка HRE при гипоксии (mean±S.E.M.; one way ANOVA анализ).

Гетерогенность CALCRL транскриптов

Проведенные нами эксперименты с использованием метода Northern blotting и CALCRL зонда выявили наличие нескольких РНК (данные не показаны), но в то же время 5'-RACE эксперимент показал наличие только одного фрагмента (промотера) CALCRL гена (Рисунок 6). Поэтому нами были проведены дальнейшие исследования гетерогенности транскриптов CALCRL гена.

Нами был использован метод З'-RACE и клонирования амплифицированных фрагментов для выявления гетерогенности CALCRL транскриптов. Анализ полученных клонов указал на наличие альтернативных участков терминации и полиаденилирования CALCRL гена

Субхромосомная организация CALCRL гена

Проведенные З'-RACE эксперименты и клонирование выявили наличие нескольких мРНК транскрибированных с CALCRL гена, а также наличие первого интрона длиной 60-kb [Nikitenko et al., 2003]. Поэтому мы предположили что пермиссивная транскрипция CALCRL гена обеспечивается уникальной структурой гена в эндотелиальных клетках.

Мы провели исследования регуляции промотера CALCRL гена в транскрипционно-пермиссивных (эндотелиальные клетки) и непермиссивных (неэндотелиальные клетки) клетках человека. Для этого нами был использован G-less вектор и ядерные экстракты из клеток человека и проведен эксперимент по транскрипции in vitro [Ramadass et al., 2007]. Данные этого эксперимента показали что промотер CALCRL гена может быть активен не только в эндотелиальных клетках но и в неэндотелиальных клетках, поскольку транскрипционные факторы, активирующие экспрессию данного гена, присутствуют в ядерных экстрактах тех и других клеточных линий [Ramadass et al., 2007].

Поскольку специфическая экспрессия CALCRL гена наблюдается в эндотелиальных клетках (Рисунок 5), но промотер может быть активен и в других клетках [Ramadass et al.,2007], это подтверждает ранее вынесенное предположение, что организация (трехмерная структура) данного гена различается в транскрипционно-пермиссивных (ЭК) и непермессивных (неэндотелиальных клетках) человека.

Для проверки данной гипотезы мы использовали метод chromosome conformation capture (3CC) разработанный в лаборатории А. Акуличева (Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, United Kingdom) для выявления субхромосомной организации CALCRL гена [Akoulitchev et al., 2006; Ramadass et al., 2007]. Данный метод позволил нам проанализировать терхмерную структуру CALCRL гена в транскрипционно-пермессивных и непермиссивных клетках человека. Результаты данного эксперимента [Ramadass et al., 2007], подтверждают нашу гипотезу о наличии разных трехмерных структур CALCRL гена в эндотелиальных и неэндотелиальных клетках человека. Наличие разнообразия структур в CALCRL гене обеспечивается постоянной активностью РНК полимеразы и поэтому ее расположением в разных участках данного гена при активной транскрипции в эндотелиальных клетках. В то же время в неэндотелиальных клетках структура CALCRL гена указывает на то что, полимераза находится в одном доминирующем положении, которое препятствует активной транскрипции данного гена [Ramadass et al., 2007].

Таким образом, проведенные нами исследования указывают на то, что экспрессия CALCRL гена зависит прежде всего от клеточно- и ткане-специфического фона. При этом ключевым фактором в экспрессии CALCRL гена является его трехмерная субхромосомная структура, которая скорее всего обеспечивается эпигенетическими механизмами. В данных условиях активность промотера играет вторичную роль.

Регуляция экспрессии функционального CL рецептора в клетках и тканях

Для выявления механизмов регулирующих экспрессию CL рецептора необходимо изучение трансляции и экспрессии белка в клетках и тканях. Поэтому нами были получены и характеризованы специфические антитела (АТ) против CL рецептора.

Разработка антител против CL рецептора и их характеристика

Для выработки антител против CL человека (кодируемого CALCRL геном) нами была выбрана стратегия с применением синтезированного пептида из 19 аминокислот, соответствующего карбокси-окончанию белка (HDIENVLLKPENLYN; аминокислотная последовательность 427-461). Специфичность последовательности была проверена с использованием программы CLASTP analysis [http://www.ncbi.nlm.nih.gov] Иммунизация новозеландских кроликов была проведена после связывания пептида с KLH (keyhole limpet haemocyanin). Сыворотка кроликов была забрана один раз до и три раза после иммунизации (с промежутком в один месяц) для выявления титра полученных антител методом ELISA. После получения удовлетворительного титра сыворотка иммунизированных животных была забрана и заморожена при -20С.

Анализ антител был проведен с использованием метода иммуноблоттинга. кДНК CALCRL и RAMPs генов были клонированы в вектор pcDNA3.1 (вектор для экспрессии в клетках млекопитающих) для сверхэкпрессии функциональных гетеродимеров в клеточной линии HEK293T. CALCRL кДНК, содержащая полную последовательность кодирующую рецептор, была амплифицирована с использованием РНК полученной из эндотелиальных клеток. Белковые экстракты полученные из клеточных линий сверхэкспрессирующие CL, CL+RAMP1 или CL+RAMP2 были использованы для первичной оценки поликлональных антител выращенных против CL человека (Рисунок 8).

Временно экспрессированный и эндогенный CL



Кодирующая ДНК CALCRL гена человека была клонирована в pcDNA3.1 - вектор для экспрессии в клетках и назван pcDNA3.1-CALCRL. Для проверки функциональности клонированной кДНК нами была осуществлена коэкспрессия с RAMPs в клетках HEK293T и анализ содержания цАМФ при стимуляции соответствующими лигандами. Дикий тип HEK293T клеток не экспрессирует эндогенных AM и CGRP рецепторов, т.к. концентрация цАМФ в ответ на стимуляцию данными пептидами отсутствует. В то же время в клетках HEK293T которые содержат трансфицированные CALCRL и RAMPs человека, рецепторы активны (данные не показаны). Белковые экстракты из (А) клеток и (Б) тканей были проанализированы методом SDS-PAGE при восстанавливающих условиях, и иммуноблоты обработаны первичными поликлональными антителами выращенными против CL человека. (А) Антитела специфически распознают CL человека в HEK293T клетках трансфицированных только pcDNA3.1-CALCRL или вместе с RAMP1 или RAMP2 (CL+ RAMP1 или CL+ RAMP2; функциональными АМ или СGRP рецепторами соответственно). Нетрансфицированные HEK293T клетки (MOCK) или трансфицированные с вектором pcDNA3.1 или RAMP1 или RAMP2 не экспрессируют CL. Разновидности рецептора массой ~40-45 кД (открытый ромб, основно-гликозилированный рецептор) присутствует в HEK293T клетках трансфицированных только с pcDNA3.1-CALCRL. Рецептор массой ~55 кД (закрытый ромб; терминально гликозилированный рецептор) производится клетками только в том случае коэкспрессии CL с RAMPs (детали эксперимента по дегликозилированию указаны на Рис.35). (Б) Антитела также распознают эндогенный CL человека экспрессированный в тканях. Стрелка - дегликозилированный рецептор (~37 кД). Иммуноблоты являются экземпляром двух независимо проведенных экспериментов. Для подтверждения равномерности количества использованных белковых экстрактов были использованы антитела против в-актина.

...