Роль адреномедуллина и его рецепторов в функционировании эндотелиальной клетки человека (в норме и при некоторых патологиях)

Данные проведенных исследований с использованием метода иммуноблоттинга показали что антитела обладают высокой специфичностью против трех форм CL - дегликозилированного, основно- и терминально-гликозилированного рецептора (Рисунок 8). Для подтверждения данных выводов нами были проведены эксперименты с использованием эндогликозидаз F и H, с целью определения какие из детектируемых форм рецептора являются основно- и какие терминально-гликозилированными (данные не показаны). После подтверждения специфичности полученных антител, они были использованы для проведения иммуногистохимии и иммунофлуоресценции в разных тканях органов человека (Рисунок 9).

Локализация СL в тканях человека

Определение локализации СL была проведена путем проведения метода иммуногистохимии на парафиновых срезах с использованием микро-чипа тканей и первичных антител против СL человека и вторичных антител конъюгированных с щелочной фосфатазой, локализация которой выявлена с применением реактива Vector Red (красный цвет). Клеточные ядра окрашены гематоксилином (голубой цвет). Выявлено преимущественная локализация рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла (А) эндометрия, (Б) миометрия, (В) аденокарциномы, (Г) желтого тела, и (Д и Е) стромы (стрелки) и (Е) эпителии шейки матки (короткие стрелки).

Результаты проведенных иммуногистохимических исследований обобщены в Таблице 3. Полученные данные позволили сделать заключение том, что в большинстве исследуемых органов и тканей человека рецептор экспрессирован в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла, а также в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов в некоторых из исследуемых тканей. Для подтверждения данных выводов нами была проведена двойная иммунофлюоресценция с совместным использованием двух антител: поликлональных выращенных против CL и моноклональных - против маркеров индивидуальных типов клеток: эндотелиальных, гладкомышечных клеток, лейкоцитов и макрофагов (данные не показаны). Данные проведенного анализа также подтвердили специфическую экспрессию CL в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

Исследование локализации и экспрессии функциональной формы CL рецептора в тканях и клетках

Высокая специфичность антител позволила нам также определить какие формы CL рецептора экспрессированы в тканях человека (Рисунок 10). Данные проведенных исследований указывают на то, что в большинстве исследованных тканей человека экспрессирован функциональный рецептор (терминально гликозилированный, ассоциированный с плазматической мембраной клетки) (Рисунок 10), и что этот рецептор находится на поверхности эндотелиальных клеток в соответствии с результатами иммуногистохимии (Рисунок 9). Дополнительный анализ позволил определить, что в раковых опухолях также экспрессирован функциональный рецептор (Рисунок 10Б).

Гликозилирование СL рецептора in vivo.

Белковые экстракты были получены из нормальных и раковых тканей человека и проанализированы с применением метода SDS-PAGE при восстанавливающих условиях с последующей обработкой иммуноблотов с использованием антител LN-1436 выращенными против СL человека. Стрелка, негликозилированный (~37 кД); открытый ромб, основно-гликозилированный (~45 кД); черный ромб, терминально-гликозилирован-ный (~55 кД) виды рецептора. (А)

Нормальные ткани человека (эндометрий, миометрий и желтое тело) содержат СL в той или иной форме.

Экспрессия рецептора отсутствует с плаценте человека на поздних стадиях бееременности. (Б) В тканях раковых

опухолей (почек, яичников, лейомиомы и саркомы Капоши) основная форма СL - терминально

гликозилированный рецептор.

Таким образом, нами были выращены антитела, позволяющие определять не только наличие, но и функциональную форму (экспрессированную на поверхности клетки) CL рецептора в клетках и тканях человека. Высокая специфичность данных антител позволила нам провести дальнейшие исследования по изучению свойств рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

Исследование специфичности и динамики десенситизации CL рецептора

Для выявления свойств рецептора экспрессированного в ЭКМР человека, как типа клеток в которых рецептор экспрессирован in vivo, нами была проведена серия экспериментов по изучению:

- экспрессии форм рецептора (дегликозилированного, основно- и терминально- гликозилированного);

экспрессии RAMPs;

внутриклеточной локализации рецептора;

транспорта и интернализации рецептора;

специфичности рецептора к АМ и CGRP;

десенситизации рецептора.

Экспрессия CL рецептора и RAMPs в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека

Экспрессия различных форм рецептора была проанализирована с применением методов иммуноблоттинга. Нами были выявлено что в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека (ЭКМР) присутствуют как основно- так и теминально-гликозилированная формы рецептора (Рисунок 11А).

Таблица 3

Экспрессия CL в тканях и клетках человека

Полуколичественный анализ экспрессии CL в индивидуальных клеточных типах в тканях человека был проведен по следующей шкале: - *отсутствие окраски; -/+ очень слабая; + слабая; ++ средняя; +++ сильная.

Экспрессия СL и RAMPs в эндотелиальных клетках человека

Экспрессия СL проанализирована с использованием метода иммуноблоттинга. Белковые экстракты из эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла кожи человека были проинкубированы с эндогликозидазой F (F, ячейка 2), либо эндогликозидазой H (H, ячейка 3) или в их отсутствии (-, ячейка 1) с последующим проведением SDS-PAGE при восстанавливающих условиях и иммуноблоттинга с использованием антител LN-1436 выращенными против СL человека. Стрелка, негликозилированный (~37 кД); открытый ромб, основно-гликозилированный (~45 кД); черный ромб, терминально-гликозилированный (~55 кД) виды рецептора. ~55 кД СL восстанавливается до ~37 кД белка в после обработки эндогликозидазой F, но устойчивы к действию эндогликозидазы H. Впоследствии мембраны были обработаны с использованием антител против в-актина для подтверждения использования одинаковых количеств белковых экстрактов. (Б) Экспрессия СL и RAMPs мРНК в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла кожи (ячейка 1), легких (ячейка 2), миометрия (ячейка 3) и эндометрия (ячейка 4) человека были проанализированы с использованием метода РТ-ПЦР. Праймеры для в-актина были использованы в качестве контроля для использования одинакового количества РНК для генерации кДНК использованной для РТ-ПЦР. В качестве контроля была использована РНК изолированная из ткани почек (ячейка 5). Цифры справа показывают размеры амплифицированных ПЦР-фрагментов.

Экспрессия рецептора на поверхности эндотелиальных клеток (терминально-гликозилированная форма) коррелирует с экспрессией RAMP2 и RAMP3, но не RAMP1 генов (Рисунок 11Б).

Полученные данные указывают на то, что вероятнее всего CL формирует гетеродимер CL/RAMP2 и/или CL/RAMP3 на поверхности ЭКМР человека, и поэтому представляет собой АМ1 и/или АМ2 рецептор.

Локализация CL рецептора в эндотелиальных клетках

Данный эндотелиальный рецептор экспрессирован на поверхности клетки и в эндоплазматическом ретикулуме (данные не показаны) in vitro, что подтверждает данные иммуноблоттинга (Рисунок 11), поскольку наличие основно-гликозилированного рецептора обычно ассоциировано с его локализацией в эндоплазматическом ретикулуме, а теминально-гликозилированного - на поверхности клетки, т.е. в плазматической мембране, после дополнительного гликозилирования в результате взаимодействия с RAMP в эндоплазматическом ретикулуме [McLatchie et al., 1998].

Специфичность и интернализация CL рецептора в эндотелиальных клетках

Для проверки предположения о том, что эндотелиальный CL образует АМ рецепторы (либо АМ1 - CL/RAMP2 и/или АМ2 - CL/RAMP3) нами были проведены исследования по выявлению фенотипа рецепторов, экспрессированных в эндотелиальных клетках человека.

Прежде всего нами было исследовано какие рецепторы - AM или CGRP - экспресированны эндогенно на поверхности ЭКМР человека. Результаты проведенных исследований с использованием методов по определению аккумуляции cAMP, являющейся одной из сигнальных молекул в системе адреномедуллиновых рецепторов, и миграции эндотелиальных клеток показали, что как AM так и CGRP рецепторы экспрессированы в этих клетках (данные не показаны). Эти данные противоречат сделанному предварительно предположению, что эндотелиальный CL образует только АМ рецепторы.

Поэтому нами были проведены эксперименты по исследованию динамики интернализации эндотелиального CL в ответ на стимуляцию AM или CGRP. Прежде всего такое решение было обусловлено тем, что данные работ Kuwasako и коллег [2001] указывают на то, что CL/RAMP1, CL/RAMP2 и CL/RAMP3 гетеродимеры интернализуются по разному в ответ на стимуляцию AM или CGRP. Например, CL/RAMP1 (CGRP1 рецептор) интернализуется преимущественно при взаимодействии с CGRP, а CL/RAMP2 (АМ1) и CL/RAMP3 (АМ2) рецепторы - при взаимодействии с АМ.

Проведенные нами исследования показывают, что CL в эндотелиальных клетках интернализуется только при взаимодействии с АМ (Рисунок 12; данные для CGRP не показаны). Эти данные соответствуют данных об экспрессии RAMP2 и RAMP3, но не RAMP1, в ЭКМР, предполагающих экспрессию АМ1 и АМ2 рецепторов (Рисунок 11).

Для проверки данных выводов и выяснения, существует ли какое-либо взаимодействие между CGRP и эндотелиальным CL, нами были проведены эксперименты с использованием антагонистов AM и CGRP рецепторов (AM_22-52 и CGRP_8-37 соответвенно). Данные антагонисты взаимодействуют с рецепторами, но не вызывают каких-либо функциональных изменений [Poyner et al., 2001].

Интересным результатом проведенных экспериментов явилось выявление того, что как AM_22-52 так и CGRP_8-37 способны ингибировать интернализацию эндотелиального CL после стимуляции АМ (Рисунок 12). Данные результаты указывают на то, что CGRP также может взаимодействовать с эндотелиальным CL. Если это так, то наблюдаемое ранее влияние не только АМ, но также и CGRP на миграцию и аккумуляцию cAMP в ЭКМР человека (данные не показаны) могут быть связаны со взаимодействием данного пептида с CL рецептором.

Рисунок 12

Взаимодействие AM и CGRP с СL экспрессированным в эндотелиальных клетках человека

Внутриклеточное распределе-ние СL в ЭКМР человека до (Control) и после стимуляции лигандом (AM 100 nM; в течение 15 минут) с или без добавления антагонистов AM_22-52 и CGRP_8-37 (1мМ), было определено с использованием иммунофлу-оресценции. Клетки были зафиксированы сразу после стимуляции. Иммунофлуо-ресцентная окраска была проведена с использованием антител против CL человека и вторичных антител меченных ФИТЦ (зеленый цвет). DAPI использовался для окраски ядер (синий цвет). Представленные рисунки отображают результаты двух экспериментов и демонстрируют экспрессию рецептора на клеточной поверхности (зеленые стрелки) и после интернализации (короткие стрелки).

Десенситизация CL рецептора в эндотелиальных клетках

Для проверки данного предположения нами были проведены эксперименты по исследованию механизмов десенситизации эндотелиального CL. Нами было выдвинуто предположение, что если CL взаимодействует как с АМ, так и с CGRP, то стимуляция/интернализация рецептора при взаимодействии с одним лигандом должна привести к потере ответа на повторную стимуляцию не только к лиганду который был использован для первичной стимуляции, но и на стимуляцию другим лигандом. Результаты проведенных нами экспериментов приведены на Рисунке 13, и показывают, что при стимуляции АМ ответ (фосфорилирование Akt) на стимуляцию с CGRP потерян, и наоборот.

Десенситизация эндогенных AM и CGRP рецепторов в эндотелиальных клетках.

Динамика десенситизации эндогенных AM и CGRP рецепторов в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла (ЭКМР) человека была изучена путем определения степени фосфорилирования Akt (Akt-P). В контрольной группе клетки были простимулированы 100 nM АМ (линии 2-4) либо CGRP (линии 11-13) в течение обозначенного времени. В группе предварительной стимуляции (с АМ либо CGRP; +/- обозначает было ли проведено предварительное стимулирование), клетки были простимулированы с АМ (5-9) либо CGRP (14-18) в течение 15 минут, а затем - проинкубированы в среде без лиганда в течение 30 минут. В группе предварительной стимуляции клетки затем были заново простимулированы либо с тем же антагонистом (100 nM) (5-8 для АМ и 14-17 для CGRP соответственно) или другим антагонистом (100 nM) (CGRP для клеток преинкубированных с АМ, линия 9, и АМ для клеток, престимулированных с CGRP) для изучения десенситизации рецепторов. Клетки стимулированные VEGF (10 ng/ml в течение 10 мин.; линия 10) служили в качестве контроля.

Таким образом, результаты проведенных нами исследований предполагают следующую модель регуляции рецептора, экспрессированного в ЭКМР человека (Рисунок 14). Эндотелиальный CL может взаимодействовать как с АМ, так и с CGRP (Рисунок 14). Данное взаимодействие с любым из лигандов приводит к десенситизации рецептора. Однако потеря функции (десенситизация) рецептора только в случае взаимодействия с АМ обусловлена интернализацией данного G-белок-связывающего рецептора.

Полученные данные открывают интересное направление в изучении биологии АМ и CGRP рецепторов в клетках и тканях человека. Особенно важным является изучение биологии CL при патологических условиях, при которых уровень АМ или CGRP повышен в тканях и клетках человека, как например сердечно-сосудистые заболевания различной этиологии [Hinson et al., 2000]. В данных условиях избыточная экспрессия одного или другого лиганда может привести к полнейшей десенситизации эндотелиального CL к обоим лигандам. Принимая во внимание значительную роль обоих пептидов в биологии сосудистой системы и эндотелиальных клеток в частности [Hinson et al., 2000; Nikitenko et al., 2002; Brain and Grant et al., 2004], данные изменения могут кардинально повлиять на состояние органов и тканей при патологии, особенно в том случае если CL действительно является посредником всех изученных до данного момента эффектов АМ на эндотелиальную клетку [Hinson et al., 2000; Nikitenko et al., 2006]. Результаты проведенных нами исследований указывают на то, что экспрессия и функциональное состояние CL могут оказывать значительное состояние на функционирование эндотелиальной клетки и играть роль в развитии дисфункции эндотелия при различных патологиях.

Свойства эндотелиального СL и ассоциированной с ним рецепторной системы для AM и CGRP.

Эндотелиальный СL экспрессирован на клеточной поверхности в качестве терминально гликозилированного рецептора (полисахаридные остатки связанные с аминотерминусом схематически представлены как структуры серого цвета). AM и CGRP стимулируют фосфорилирование Akt (Akt-P). (IIА) Рецептор интернализуется и направлен на деградацию после стимуляции АМ, но (IIВ) остается на клеточной поверхности после взаимодействия с CGRP. Взаимодействие либо с АМ (I-IIА- III) или CGRP (I-IIВ) приводит к десенситизации (IV) рецептора к обоим пептидам, независимо от того какой агонист был использован для начальной стимуляции, и потере активности за счет различных механизмов.

Роль адреномедуллиновых рецепторов в тканях человека в норме и при некоторых патологиях.

Проведенные исследования показали, что АМ играет важную роль в развитии и функции сосудистой системы животных. В то же время, несмотря на полученные нами данные о роли пептида и механизмов регулирующих его экспрессию и функцию его рецепторов в ЭКМР человека in vitro, вопрос о значении АМ и его рецепторов в организме человека в норме и при различны патологиях остается недостаточно изученным. Это обусловлено прежде всего отсутствием достаточного количества данных об экспрессии АМ и функциональных эндогенных адреномедуллиновых рецепторов в органах и тканях человека.

Поэтому нами был проведен спектр исследований с применением разработанных нами методов для изучения экспрессии CALCRL гена человека и функциональной формы рецептора, а также механизмов регулирующих его функцию в эндотелиальных клетках человека. Наши исследования включали исследование возможности практического применения полученных знаний о функционировании рецепторной системы адреномедуллина в эндотелиальных клетках при патологических заболеваниях сосудистой системы, в том числе:

1). Исследование роли АМ и его рецепторной системы в ангиогенезе при развитии раковых опухолей и патологических заболеваний органов репродукции путем исследования экспрессии его рецепторов.

2). Исследование возможности использования разработанных реактивов и методов (антител против человеческого CL рецептора и методов определения субхромосомной организации CALCRL гена) для диагностики неоплазм, раковых опухолей и других заболеваний (в том числе исследование корреляции экспрессии и клинико-патологических показателей).

3). Исследование возможности модулирования функционирования адреномедуллиновых рецепторов с целью коррекции их функции при патологиях развития и функции сосудистой системы (к вопросу о разработке ингибиторов и активаторов с использованием современных методов и технологий, включая разработку антител против рецептора, экспрессированного на поверхности клетки).

Практическое применение исследований функционирования рецепторной системы адреномедуллина в эндотелиальных клетках при патологических заболеваниях сосудистой системы

Роль специфической транскрипции CALCRL гена в эндотелии кровеносных сосудов и лимфатических сосудов человека

Проведенные нами исследования указывают на специфичность экспрессии CL в эндотелии сосудов различных тканей и органов человека (Рисунки 5 и 9). Дальнейшее изучение механизмов регуляции экспрессии CALCRL гена в эндотелии человека в нормальных тканях и раковых опухолях позволит разработать методы контроля экспрессии данного гена с целью ингибирования патологического ангиогенеза или регуляции функции кровеносных и лимфатических сосудов.

С целью дальнейшего изучения регуляции экспрессии CALCRL гена в эндотелии нами была использована модель саркомы Капоши (КС) как эндотелиальной опухоли [Nikitenko and Boshoff, 2006]. Современными исследованиями было показано, что КС происходит из эндотелиальных клеток, поскольку профиль/спектр экспрессии генов в этой неоплазме очень схож с таковым в лимфатическом эндотелии [Wang et al., 2004]. Этиологически КС связан с инфекцией клеток человеческим герпесвирусом 8 (human herpesvirus 8, HHV8, или Kaposi's sarcoma herpesvirus, KSHV) [Boshoff et al., 1995].

Нашими исследованиями с применением методов DNA microarray, иммуноблоттинга и иммуногистохимии было показано, что KSHV регулирует экспрессию CALCRL гена в ЭКМР человека (Рисунок 15).

Герпесвирус саркомы Капоши (KSHV) регулирует экспрессию СALCRL (CL) в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

Эндотелиальные клетки микроциркуляторного русла человека (ЭК) были инфицированы вирусом саркомы Капоши (ЭК^KSHV). (А) Экспрессия генов была выявлена методом DNA микрочипа. Относительная экспрессия отражена с использованием аналитической шкалы (синий цвет - пониженная экспрессия; красный цвет - повышенная экспрессия). Результаты анализа также отображены в виде графика, демонстрирующего повышенную экспрессию СALCRL в инфицированных клетках ЭК^KSHV (Vart et al., 2007). (Б) Экспрессия СALCRL также повышена в тканях Капози саркомы по сравнению с нормальной кожей. (В) Экспрессия CL в тканях Капоши саркомы была изучена с использованием метода иммуногистохимии и поликлональных антител против рецептора. Вторичные антитела меченные пероксидазой хрена и диаминобензидиновая реакция были использованы для выявления локализации рецептора в опухолевых веретенообразных клетках саркомы Капоши (левый и центральный снимки). Этиологически данные клетки связаны с инфицированием эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека и их последующей трансформацией в опухолевые клетки. Срезы ткани обработанные преиммунной сывороткой были использованы в качестве контроля (правый снимок). Участок среза использованный на центральном и правом снимках обозначен на левом снимке. (Г) Эндотелиальные клетки микроциркуляторного русла человека (ЭК) были инфицированы вирусом Капоши (ЭК^KSHV) in vitro. Экспрессия CL была изучена с использованием метода иммуноблоттинга. Трансляция рецептора соответствует повышенной транскрипции в ЭК инфицированных вирусом.

Мы произвели клонирование 27 генов, кодируемых вирусом [Vart et al., 2007] и провели анализ с целью выявления данных генов на экспрессию CALCRL гена человека (Рисунок 16). Нами было выявлено что К2 ген (кодирующий вирусный интерлейкин 6) является таким кандидатом (Рисунок 16). Таким образом, онкогенные вирусы способны регулировать экспрессию CALCRL гена человека. Поэтому нами была выдвинута гипотеза о том, что АМ и CALCRL играют роль в патологическом ангиогенезе и лимфангиогенезе, являющимся одним из симптомов КС. Дальнейшие исследования направлены на изучение механизмов регуляции данного G-белок связывающего рецептора с целью использования данных для разработки методов диагностики и, возможно, терапии данной неоплазмы.

Современными исследованиями с использованием мышиных моделей по изучению роли генов в эмбриогенезе была показана роль CALCRL в развитии сосудистой системы [Dakor et

al., 2006] и развитии эдемы при его отсутствии, а также сходство данного фенотипа с моделями в которых был выключен ген лиганда - адреномедуллина. [Caron et al., 2000; Shindo et al., 2001: Shimosawa et al., 2002]. Данные этих исследований также подтверждают предположения о роли CALCRL/CL в развитии и функционировании сосудистой системы и при патологическом лимфангиогенезе и ангиогенезе, как например при развитии КС.

Анализ регуляции экспрессии СALCRL гена в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека индивидуальными генами герпесвируса саркомы Капоши (KSHV)

Лентивирусная библиотека (27 индивидуальных KSHV генов) была произведена с использованием вектора pSIN и векторов двух векторов необходимых для производства лентивирусных частиц. Список клонированных генов и их производные. Эндотелиальные клетки были инфицированы с использованием лентивирусной библиотеки и экспрессия соответствующих вирусных генов была проверена с использованием метода RT-ПЦР. Эффективность инфекции была проверена с использованием лентивирусных частиц произведенных с использованием pSIN вектора экспрессирующего GFP (green fluorescent protein). Проведенный количественный RT-ПЦР анализ с использованием метода TaqMan выявил регуляцию CALCRL гена вирусным генов К2, кодирующим цитокин- вирусный интерлейкин-6 (vIL-6).

Потенциальная роль механизмов сенситизации и десенситизации адреномедуллиновых рецепторов в эндотелиальных клетках человека в дисфункции эндотелия и при сердечно-сосудистых заболеваниях

Транскрипция CALCRL гена (Рисунки 5 и 6) и экспрессия данного G-белок связывающего рецептора на поверхности клетки (Рисунок 8) являются одними из первоначальных ступеней в регуляции экспрессии данного рецептора в эндотелии. Циркуляция данного рецептора и механизмы его сенситизации и десенситизации к стимуляции лигандами также играют значительную роль в дальнейшей регуляции функции CL (Рисунки 12, 13 и 14) [Nikitenko et al., 2006; Parameswaran and Speilman, 2007].

Нами была использована модель диабетической беременности для изучения механизмов десенситизации и сенситизации АМ рецепторов в сосудистой системе человека. Нами было показано, что сосуды плаценты при диабетической беременности теряют чувствительность (десенситизируются) к стимуляции адреномедуллином (данные не показаны). Таким образом, повышенное давление у женщин при патологической беременности (диабете в данных исследованиях) может являться результатом недостаточного контроля расширения сосудов адреномедуллином. При этом регуляция АМ рецепторов в сосудистой системе может привести к уменьшению кровеносного давления у пациентов и, таким образом, облегчить течение беременности при диабете.

Аналогичный феномен наблюдался при повышении концентрации АМ в культуре эндотелиальных клеток [Nikitenko et al., 2006]. Кроме того, изменения в работе адреномедуллиновых рецепторов наблюдается в in vivo условиях когда концентрация АМ повышена. Так например, при хронической сердечной недостаточности, сердечно-сосудистом заболевании, при котором концентрация АМ в крови значительно повышена, значительный, и в то же время длительный эффект пептида на артерии скелетных мышц значительно ослаблен, частично из-за недостаточной продукции оксида азота в сосудах предплечья [Kato el al., 1996; Nakamura et al., 1997]. В то же время механизмы подобных эффектов до настоящего времени оставались не изученными. Данные проведенных нами исследований указывают на то, что данные эффекты могут быть результатом интернализации CL рецептора в эндотелиальных клетках, поскольку in vivo в тканях человека рецептор преимущественно экспрессирован именно в этих клетках (см. Рисунки 5 и 9), а также потому, что АМ стимулирует продукцию оксида азота этими клетками [Zhang and Hintze, 2001].

Таким образом, несмотря на повышенный уровень АМ при патологиях, чувствительность адреномедуллиновых рецепторов может быть понижена при определенных патологиях и поэтому существует необходимость коррекции их функции (или ресенситизации) с целью обеспечения нормальной работы сосудистой системы.

Роль адреномедуллина и его рецепторной системы в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток

Современными исследованиями было показана роль АМ в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток человека [Iwase et al., 2005; Yurugi-Kobayashi et al., 2006; Murakami et al., 2006]. Авторы предположили, что АМ влияет на стволовые клетки через гетеродимер CL/RAMP2, но какие-либо данные в поддержку данной гипотезы приведены не были. Разработанные нами антитела против CL человека могут помочь в дальнейшем решить по крайней мере вопрос об экспрессии функциональной формы данного рецептора в стволовых клетках человека, а также выявить, действительно ли АМ (или CGRP) взаимодействует с этим G-белок связывающим рецептором в данных клетках.

Нашими исследованиями была показана экспрессия всех компонентов рецепторной системы АМ (CL и RAMPs), по крайней мере на транскрипционном уровне, в предшественниках эндотелиальных клеток человека (данные не показаны) и в бластоцисте на ранних стадиях эмбрионального развития человека (Рисунок 17). Данные результаты указывают на возможную роль CL в дифференцировке стволовых клеток эмбриона и костного мозга. Таким образом, использование разработанных нами реактивов поможет ускоренному изучению роли АМ в эмбриогенезе и дифференцировке стволовых клеток человека.

Экспрессия СL и RAMPs в стволовых клетках человека

Экспрессия СL и RAMPs в бластоцисте человека была исследована методом ОТ-ПЦР. CL, RAMP1 и RAMP2, но не RAMP3 мРНК экспрессируется в бластоцисте человека на шестом дне развития. мРНК миометрия служила положительным контролем, поскольку все компоненты рецепторной системы экспрессированы в данной ткани, включая RAMP3. в-актин служил контролем.

Роль адреномедуллина и его рецепторной системы в ангиогенезе при развитии раковых опухолей и патологических заболеваний органов репродукции

Несмотря на изначальные неудачи и негативный результаты клинических испытаний, значительный прогресс сделан в течение нескольких последних лет в использовании ингибиторов ангиогенеза в опухолях и неоплазмах/новообразованиях. Несколько клинических исследований с использованием ингибиторов ключевого ангиогенного фактора - VEGF (фактор роста эндотелия) - A, не только подтвердили представление о том что ангиогенез - важная мишень для лечения опухолевых процессов, но также выявили феномен противодействия некоторых видов опухолей антиангиогенной терапии [Hurwitz et al., 2004; Kerbel et al., 2002]. В настоящее время существуют свидетельства того что ключевые ангиогенные факторы могут быть замещены другими факторами (в том числе и АМ) [Nikitenko et al., 2006] в процессе развития и дальнейшего прогресса болезни, или что другие известные или новые ангиогенные молекулы могут быть ответственны за компенсирующий («прорывной») ангиогенез в гипоксическом микроокружении раковых опухолей во время анти-ангиогенных стратегий [Ferrara and Kerbel, 2005]. Кроме того, эффективные тканеспецифические ангиогенные факторы могут быть ответственны за такое противодействие анти-ангиогенной терапии [LeCouter et al., 2002].

Поэтому определенной трудностью в транслировании результатов и открытий в исследованиях механизмов ангиогенеза является определение различий в молекулярных механизмах ангиогенеза между индивидуальными видами опухолей/стадиями путем определения роли известных и новых факторов, включая ключевые и тканеспецифичные ангиогенные факторы. Данный подход позволит осуществлять выбор селективной анти-ангиогенной терапии из спектра тех что уже используются в клинических исследованиях или в процессе разработки, а также определять вероятность эффективности для индивидуальных пациентов [Ferrara and Kerbel, 2005] для лечения того или иного типа опухоли.

В течение нескольких последних лет проявляется повышенный интерес к изучению адреномедуллина, который обусловлен в значительной мере ролью, которую данный пептид играет в ангиогенезе (Рисунок 18) [Nikitenko et al., 2006].

Роль адреномедуллина в прогрессии опухолей.

Предыдущими исследованиями была предположена роль гипоксии и цитокинов в регуляции экспрессии и секреции адреномедуллина (АМ), способствует развитию ксенографтов раковых клеток путем стимуляции автокринного роста и повышенной выживаемости опухо-левых клеток, а также путем паракринного механизма за счет воздействия на окружающие сосуды. Возможные внутриклеточные эффекты действия АМ на клетки микроокружения опухоли (гладкомышечные клетки стенки сосудов, эндотелиальные клетки и опухолевые клетки) предполагает роль данного пептида в начальном развитии опухоли, устойчивости к химиотерапии и прогрессии. АС - аденилатциклаза, GC - гуанилатциклаза, PKA - протеинкиназа А, PKG - протеинкиназа G, PLC - фосфолипаза С, MEK - протеинкиназа активированная митогеном, ERK - экстрацеллюлярная киназа, регулирующаяся сигналом (также называемая MAPK - протеинкиназа активированная митогеном).

В случае АМ, как нового ангиогенного фактора (Рисунок 18), существует несколько насущных вопросов представленных ниже [Nikitenko et al., 2006]:

1). В каких раковых опухолях наблюдается повышенная экспрессия АМ?

2). Какие клетки экспрессируют адреномедуллиновые рецепторы в раковых тканях человека?

3). Существует ли корреляция экспрессии CL рецептора с клинико-патологическими показаниями в определенных раковых опухолях?

Исследование экспрессии адреномедуллина в раковых тканях человека

На начальном этапе мы исследовали в каких раковых опухолях наблюдается повышенная экспрессия адреномедуллина путем использования ДНК чипов и клонированных нами плазмидных векторов для получения CALCRL зондов. Из 13 изученных опухолей нами была выявлена повышенная экспрессия АМ в раковых тканях почек (Рисунок 19).

Поэтому наши дальнейшие исследования по изучению экспрессии CL были направлены на данный вид опухоли, а также на изучение лейомиомы, рака яичников и КС (см. Рисунок 15), где предварительные результаты указывали на возможную роль АМ и его рецепторов в развитии данных неоплазм [Hague et al., 2000; Giacolone et al., 2003; Vart et al., 2007].

Экспрессия адреномедуллина (АМ) в нормальных и опухолевых тканях

Cancer Profiling Array (кДНК блот) состоит из нормализованных парных кДНК образцов полученных из общей РНК из 13 органов. Каждая пара состоит из опухолевого (О) образца и нормальной (Н) ткани полученных из одного и того же пациента. Парная кДНК представляет собой общее количество мРНК экспрессированной в данной ткани. Блот был использован для получения данных о корреляции экспрессии гена адреномедуллина (АМ) c развитием опухоли. кДНК АМ и убиквитина были клонированы в вектор для получения зондов. Зонды были помечены ³²Р-дЦТФ. Cancer Profiling Array и РНК Northern блот были последовательно прогибридизированы с каждым из зондов в соответствии с разработанными нами методами (Nikitenko et al., 2001). После гибридизации, промывки и экспозиции блотов, радиоактивный сигнал был зарегистрирован с использованием X-Ray пленки и измерен с помощью PhosphoScreen и ImageQuant Software. После этого зонд был удален и проведена гибридизация с последующим зондом. Отношение АМ/Убиквитин было рассчитано для определения относительного уровня экспрессии мРНК. Специфичность зондов была проверена с помощью Northern блоттинга. Экспрессия АМ была повышена только в трех видах опухолей, при этом самая большая разница была обнаружена с опухолях почек (выделено штриховой линией). Статистический анализ был проведен с использованием теста Вилкоксона (Р=0.0067).

Нами была выдвинута гипотеза о том что экспрессия АМ и CL могут являться факторами прогноза развития раковых опухолей [Nikitenko et al., 2006]. Проведенные в течение последних двух лет исследования в нашей и других лабораториях показали, что существует корреляция между экспрессией лиганда либо его рецептора и развитием либо прогрессированием опухолевых образований в определенных органах человека [Ucar et al., 2006; Pavel et al., 2006; Michelsen et al., 2006].

Исследование экспрессии функционального CL рецептора и его локализации в раковых тканях человека

Поскольку исследования проведенные в нашей лаборатории указывали на то, что экспрессия АМ повышена в опухолевых тканях почек, яичников, лейомиомы и саркомы Капоши, мы изучили экспрессию адреномедуллиновых рецепторов в этих тканях. Экспрессия АМ регулируется воспалительными цитокинами и гипоксией. Гипоксия является обычным показателем микроокружения опухолей и одной из основных причин роста и прогрессии раковых опухолей [Harris, 2002], и поэтому роль АМ как промотера данных процессов путем индуцирования ангиогенеза была предложена для многих опухолевых заболеваний включая лейомиому [Nikitenko et al., 2006]. В то же время экспрессия адреномедуллиновых рецепторов в опухолевых тканях до настоящего времени оставалась неизученной [Nikitenko et al., 2006]. Поэтому мы изучили какие клетки экспрессируют адреномедуллиновые рецепторы в опухолевых тканях на примере почек, яичников, лейомиомы и KC.

Экспрессия CL в раковых опухолях почек

Рак почек (РП) составляет 2% раковых заболеваний [http://www.cancerresearchuk.org]. Пятилетняя статистика выживаемости - 40.5% [Campaign, 2001], прежде всего из-за метастазов которые происходят у 75% процентов пациентов [Dawson and Whitfield, 1996]. Конвенционная химиотерапия либо иммунотерапия у данных пациентов приводит к ответу всего лишь у 10% процентов данных пациентов [Cancer: Principles and Practice of Oncology, 2001; Godley and Stinchcombe, 1999]. Основной проблемой при РП является диагностика и предсказание течения заболевания. Наиболее эффективным показателем является стадия развития. Другие показатели, как например, гистология и степень являются менее значительными при определении и предсказании исхода.

Экспрессия АМ мРНК была предварительно изучена при РП, но данные являлись очень немногочисленными [Fujita et al., 2002; Takahashi et al., 2002]. Исследования, проведенные Fujita и коллегами (2002) указывали на корреляцию экспрессии АМ и васкуляризацией опухолевых тканей, однако незначительное количество тканей было использовано для проведения достаточной статистической обработки полученных данных. В то же время данные о адреномедуллиновых рецепторах и корреляции их экспрессии с прогрессом развития опухолей оставался неизученным. Прежде всего это было обусловлено отсутствием антител против адреномедуллинового рецептора (CL).

Разработанные нами специфические поликлональные антитела против CL человека (Рисунок 8) позволили провести подобного рода исследования. Прежде всего нами было показано, что экспрессированный в опухолевых тканях рецептор терминально гликозилирован (Рисунок 10) и поэтому представляет собой функциональную форму рецептора (экспрессированного на поверхности клетки). Кроме того, нами были использован микрочип содержащий значительное количество (180 пар) опухолевых и нормальных тканей почек (TMA, tissue microarray) для изучения экспрессии и локализации CL методом иммуногистохимии (Рисунок 20). В опухолевых тканях рецептор экспрессирован как эндотелиальными, так и опухолевыми клетками (Рисунок 20). Экспрессия CL в опухолевых клетках значительно повышена по сравнению с нормальными эпителиальными клетками (Рисунке 20) и коррелирует с показателями выживания пациентов.

Экспрессия CL рецептора в нормальных и опухолевых тканях почек

Подобно Cancer Profiling Array (см. Рисунок 19), Multiple tissue array (MTA) состоит из гистологических образцов тканей полученных из парных опухолевой и нормальной ткани полученных от одного и того же пациента. Образцы (кол-во 180 пар; источник - архивы The Department of Cellular Pathology, John Radcliffe Hospital, Oxford, UK) были зафиксированы в формалине и гистология подтверждена патогистологами. МТА было составлено с использованием цилиндрических образцов диаметром 2мм. Полученные таким образом образцы были смонтированы на блоки, с которых были произведены гистологические срезы, содержащие от 60 до 100 образцов тканей. Срезы были использованы для иммуногистохимии с применением выращенных нами антител против CL (см. Рис. 34). МТА был использован для получения данных о локализации рецептора в нормальных и опухолевых тканях и исследования уровня его экспрессии. Рецептор локализован преимущественно в эндотелии клубочков в нормальной ткани (стрелки) и его экспрессия повышена в опухолевых клетках. Иммунореактивность CL была измерена полуколичественным методом в опухолевых клетках и проведено сравнение с нормальными эпителиальными клетками почек.

Экспрессия CL в тканях лейомиом

Лейомиомы матки - опухолевые образования в миометрии. Данные неоплазмы встречаются у трети женщин и являются значительной причиной возникновения кровотечений, болей, бесплодия и спонтанных абортов [Flake et al., 2002]. В настоящее время наиболее распространенным методом лечения фиброидов является хирургическое вмешательство и данные опухоли являются обычным показателем для гистерэктомии. Существующее мнение о том, что патологический ангиогенез является значительным фактором в процессе развития и прогрессивного роста лейомиом. Экспрессия известных ангиогенных факторов, как например VEGF и bFGF была зарегистрирована в лейомиомах и предложена их роль в ангиогенных процессах. Тем не менее было показано что среди всех изученных ангиогенных факторов, экспрессия только АМ, но не других факторов, коррелирует с количеством сосудов микроциркуляторного русла миометрия и индексом пролиферации эндотелия при развитии лейомиом [Hague et al., 2002]. Тем не менее анализ экспрессии АМ и его рецепторов в тканях лейомиом и миометрия матки одного и того же пациента не был проведен. Необходимость данного рода исследований обусловлена потенциальной возможностью воздействия на сосудистую систему лейомиом без побочных эффектов на окружающий миометрий. В связи с этим нами были проведены исследования экспрессии АМ, CALCRL и RAMPs мРНК, а также локализации CL рецептора в парных тканях лейомиомы и миометрия полученных от одного и того же пациента (Рисунок 21).

Экспрессия CL в тканях нормального миометрия и лейомиомы

Экспрессия CL была исследована методом двойной иммуногистохимии с использованием поликлональных антител против рецептора и моноклональных антител против специфических маркеров разных типов клеток: CD31 (эндотелиальные клетки),CD45 (лейкоциты) и SMA(гладкомышечные клетки). Вторичные антитела были мечены ФИТЦ либо ТК (техасским рецептор и один из маркеров определены по наличию желтой окраски после соединения двух фотографий.

Экспрессия CALCRL и RAMPs мРНК в тканях лейомиомы (Л) и окружающих тканях миометрия (М) была определена с использованием метода Northern blotting. Убиквитиновый зонд был использован в качестве контроля. Соотношение экспрессии CALCRL и RAMPs к экспрессии убиквитина отражает относительное содержание РНК в соответствующих тканях.

Срезы тканей содержащих как опухоль (лейомиома; Л) так и окружающую ткань миометрия (М) были окрашены иммунгистохимически с использованием антител против CD34 - маркера эндотелиальных клеток и, соответственно, сосудов. Подсчет количества сосудов был произведен с использованием метода «горячих точек» Chalkley counting [Fox and Harris, 2004; Hague et al., 2001; Nikitenko et al., 2006]. Результаты анализа показывают корреляцию CL и RAMP2 мРНК и количества микроциркуляторных сосудов в тканях лейомиомы и окружающего миометрия.

Нами была выявлена специфическая экспрессия CL рецептора в эндотелиальных тканях как лейомиомы так и окружающего миометрия (Рисунок 21). Следует заметить, что данные результаты отличаются от распределения рецептора в опухолевых тканях почек (Рисунок 20). Экспрессированный в эндотелиальных клетках тканей лейомиомы CL является терминально гликозилированным, а поэтому - функционально активным (ассоциированным с экспрессией на поверхности клетки) (Рисунок 21). Кроме того, экспрессия CL понижена в тканях лейомиомы, что связано прежде всего с уменьшением количества сосудов микроциркуляторного русла в данной опухоли (Рисунок 21). Принимая во внимание то, что АМ играет роль в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла миометрия [Nikitenko et al., 2006], нами было выдвинуто предположение о том, что для эффективной терапии с применением ингибиторов АМ и его рецепторов для лечения лейомиом необходимо дальнейшее изучение различий адреномедуллиновых рецепторов экспрессированных в эндотелии нормального миометрия и тканей лейомиом для выявления потенциальных различии и эффективной терапии избегающей побочных эффектов [Nikitenko et al., 2006].

Экспрессия CL в клетках саркомы Капоши

В связи с тем что нами была обнаружена повышенная экспрессия CL в КС - опухоли, связанной с трансформацией эндотелиальных клеток при инфекции онкогенным вирусом KSHV (Рисунки 15 и 16). Нами была изучена экспрессия рецептора в тканях КС с использованием метода иммуногистохимии. Результаты проведенных исследований показали, что веретенообразные клетки опухоли экспрессируют CL (Рисунок 15). Дополнительно проведенные исследования in vitro с использованием эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека (Рисунок 15) указывают на то, что вирус увеличивает экспрессию рецептора в инфицированном эндотелии. Учитывая то, что АМ является ангиогенным фактором, нами была выдвинута гипотеза о возможной роли АМ в аберрантном ангиогенезе при развитии КС [Fliss et al., 2006].

Таким образом, в результате проведенных нами исследований, была впервые изучена экспрессия функциональной формы CL рецептора в опухолевых тканях почек, лейомиомы и КС, а также локализация данного G-белок связывающего рецептора. Нами впервые показано, что в зависимости от вида опухоли, рецептор экспрессирован либо только эндотелиальными клетками (лейомиома, саркома Капоши), либо еще и в опухолевых клетках (опухоли почек и яичников). Вполне возможно, что уровень экспрессии рецептора опухолевыми клетками отражает стадию прогресса опухоли либо обеспечивает защиту клетки от воздействия радио-и химиотерапии.

Результаты проведенных нами исследований указывают на то, что дальнейшие исследования должны быть направлены на изучение потенциальных различий в свойствах данного рецептора в нормальных и раковых тканях с целью разработки методов специфичной регуляции (ингибирования либо стимуляции) их функции, в зависимости от роли которую они играют в той или иной опухолевой или нормальной ткани, а также для предотвращения побочных эффектов [Nikitenko et al., 2006]. Данного рода исследования должны включать изучение фармакологии и фенотипа рецепторов которые CL образует в клетках, в которых он экспрессирован in vivo в норме и при патологии (например, раковых опухолях). Более подробно данные идеи описаны в нашем недавнем обзоре [Nikitenko et al., 2006].

Использование разработанных реактивов и методов в диагностике неоплазм и раковых опухолей

Для обеспечения лечения раковых опухолей необходимы современные диагностические методы. К сожалению, методы диагностики рака почек в настоящее время отсутствуют. Полученные в наших исследованиях данные о возможной роли АМ в биологии рака почек (Рисунок 20), а также разработанные методы исследования экспрессии CL рецептора, позволяют диагностировать данный вид рака и прогнозировать исход данного заболевания у индивидуальных пациентов, поскольку нами было обнаружена корреляция экспрессии CL рецептора и прогнозом развития болезни у пациентов с раком почек [Nikitenko et al., 2007]. Кроме того, на основе метода 3С разработаны методы диагностики раковых и других заболеваний [Akoulitchev et al., 2006; Ramadass et al,., 2007].

Перспективы модулирования функционирования адреномедуллиновых рецепторов с целью коррекции их функции при патологиях развития и функции сосудистой системы (разработка ингибиторов и активаторов с использованием современных методов и технологий).

Результаты наших исследований механизмов регулирующих экспрессию и функцию G-белок связывающего рецептора CL в клетках и тканях человека указывают на наличие и роль многоступенчатого регуляционного процесса. Таким образом, регуляция функции CL рецептора может быть осуществлена на нескольких уровнях (Рисунок 22) и поэтому использование нескольких современных технологий может быть применено с данной целью (Таблица 4).

Многоступенчатая регуляция специфической экспрессии и функциональных свойств CL рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека

Нами был разработан особенный реактив для специфического ингибирования АМ рецептора. Мы использовали метод генетической инженерии для получения моноклональных антител узнающих CL/RAMP гетеродимер, экспрессированный на поверхности клетки (Рисунок 23). Оценка антител указывает на то, что они распознают CL/RAMP2 гетеродимер (АМ1 рецептор) (данные не показаны).

Использование данных антител в функциональных исследованиях показало, что они обладают способностью ингибировать действие АМ и, соответственно, оказывать влияние на физиологию эндотелиальных клеток человека (Рисунок 23). Проведение дальнейших исследований укажет на возможность использования данных и других антител (Таблица 4) для ингибирования ангиогенеза в раковых опухолях и регуляции АМ сигналов при патологиях связанных с повышенной активностью данного пептида или его рецептора АМ1 (CL/RAMP2).

Разработка моноклональных антител против гетеродимера CL/RAMP человека.

Моноклональные антитела против гетеродимера CL/RAMP были выращены против нативного эпитопа с использованием метода генетической иммунизации. Позитивный моноклон LCNL-Clone 6 был использован для:

(А) сравнительного анализа с использованием поликлональных антител LN-1436 выращенных нами против внутриклеточного карбокси-окончания рецептора (см.Рис. 8) и

(Б) для блокирования действия лигандов. Моноклональные антитела распознают только рецептор экспрессированный на поверхности клетки (зеленые стрелки), в то время как поликлональные антитела распознают как рецептор на плазматической мембране (белые стрелки), так и в эндоплазматическом ретикулуме (короткие белые стрелки). (Б) Применение моноклональных антител против гетеродимера CL/RAMP in vitro приводят к разрушению монослоя эндотелиальных клеток (ЭК). Монослой эндотелиальных клеток в культуре окрашен с использованием красителя calcein-AM.

ВЫВОДЫ

Путем использования лектина Ulex Europeus Agglutinin 1 (UEA1), связанного с магнитными шариками, разработаны методы выделения чистых популяций эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла эндометрия и миометрия матки человека, как органов в которых происходят процессы физиологического ангиогенеза, а также методы культивирования первичных культур данных клеток, позволяющие изучать роль ангиогенных и других факторов в их биологии.

Доказана роль нового ангиогенного фактора адреномедуллина в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека путем демонстрации его влияния на пролиферацию и миграцию этих клеток, а также ингибирование апоптоза и регуляцию проницаемости эндотелиального монослоя.

Клонированы и охарактеризованы промотер и новые гетерогенные транскрипты CALCRL гена человека, а также разработан метод определения трехмерной субхромосомной структуры генов. Показано, что экспрессия CALCRL гена зависит прежде всего от клеточно- и ткане-специфического фона. При этом ключевым фактором экспрессии CALCRL гена является его трехмерная структура, а активность промотера играет вторичную роль. Продемонстрированы влияние гипоксии на активность промотера CALCRL гена человека и роль онкогенного вируса саркомы Капоши на экспрессию CL рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

В экспериментах с использованием первичных клеточных культур и тканей человека и разработанных плазмидных векторов, позволяющих производить зонды для гибридизации in situ и Northern блоттинга, показана специфическая экспрессия CALCRL гена человека и CL рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла in vitro и in vivo.

Впервые определены функциональные свойства G-белок связывающего рецептора CL экспрессированного в тканях и эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека. Продемонстрировано, что именно CL рецептор непосредственно взаимодействует с адреномедуллином и осуществляет роль рецептора для данного пептида в эндотелии