Газообразные посредники как эндогенные модуляторы освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.13 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Газообразные посредники как эндогенные модуляторы освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе

Ситдикова Гузель Фаритовна

КАЗАНЬ - 2008



Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина» Федерального агентства по образованию и науке РФ

Научный консультант: чл.-корр. РАМН, доктор медицинский наук, проф. Зефиров Андрей Львович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Балезина Ольга Петровна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Бухараева Элля Ахметовна

доктор биологических наук, профессор Чинкин Абдулахат Серазетдинович

Ведущая организация: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва).

Защита состоится «11 » ноября 2008 г. в «12.00» часов на заседании диссертационного Совета Д 212.078.02 при ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстана, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстана, 2.

Автореферат разослан «11» октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор медицинских наук,

профессор Зефиров Т.Л



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

В конце прошлого века был открыт новый класс биологически активных веществ - так называемых газообразных посредников, осуществляющих как межклеточную, так и внутриклеточную регуляцию разнообразных физиологических функций (L.J.Ignarro, 1999; E.Baranano et al., 2001; D.Boehning, S.H.Snyder, 2003). В настоящее время к этому классу относят такие газы как оксид азота (II), монооксид углерода и сероводород (M.D.Maines, 2004; R.Wang, 2002). Оказалось, что физиологическое значение газов не ограничивается регуляцией функций желудочно-кишечного тракта и сосудистой системы, где оно было определено первоначально, но распространяется также на центральную и на периферическую нервную систему (Г.Ф.Ситдикова, А.Л. Зефиров, 2006; R.Wang, 2004; G.F.Sitdikova et al., 2007; Е.В.Герасимова и др., 2008).

Оксид азота (II) (NO) был первой газообразной молекулой, открытие которой привело к пересмотру классических представлений о клеточной сигнальной трансдукции (L.J.Ignarro, 1999). NO был сначала идентифицирован как эндотелиальный фактор расслабления сосудов и медиатор бактерицидного действия макрофагов (L.J.Ignarro, 1987). Впоследствии было обнаружено, что глутамат, действуя на НМДА-рецепторы в центральной нервной системе, вызывает высвобождение химического агента, свойства которого сходны со свойствами эндотелиального фактора расслабления сосудов, и были получены доказательства нейрональной роли NO (D.S.Bredt, S.H.Snyder, 1992; J.Garthwaite, C.L.Boulton, 1995). Спустя несколько лет было показано, что NO модулирует секрецию медиаторов в центральной и периферической нервной системе в условиях как in vitro, так и in vivo (E.M.Schuman, D.V.Madison, 1994; H.Prast, A.Philippu, 2001; A.Bishop, J.E.Anderson, 2005). NO является модулятором освобождения ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях как холоднокровных, так и теплокровных животных (S.A.Lindgren, M.W.Laird, 1994; А.Л.Зефиров и др., 1999; M.R.Mukhtarov et al., 1999; S.Thomas, R.J.Robitaille, 2001; S.J.Etherington, A.W.Everett, 2004; T.J.Nickels et al., 2007). Основным «рецептором» для NO в различных тканях является растворимая гуанилатциклаза (W.P.Arnold et al., 1977), активация которой приводит к повышению внутриклеточной концентрации цГМФ и соответствующих протеинкиназ (S.Andreopoulos, A.Papapetropoulos, 2000; K.A.Lucas et al., 2000). Значительная неоднородность эффектов NO, их видо- и тканеспецифичность предполагает наличие цГМФ-независимых механизмов реализации функций NO (S.Thomas, R.J.Robitaille, 2001; А.В.Яковлев и др., 2002; T.J.Nickels et al., 2007).

Монооксид углерода (угарный газ, СО) хорошо известен своими токсическими свойствами, однако, оказалось, что СО синтезируется эндогенно в микромолярных концентрациях в результате расщепления гема ферментом гемоксигеназой (M.D.Maines, 1997; 2004). Исследования функций СО как сигнальной молекулы в мозге, были вызваны тем, что активность гемоксигеназы в мозге приближается к таковой в тканях, разрушающих гем эритроцитов (например, в селезенке) (T.Ingi et al., 1996). Впоследствии по аналогии с NO-синтазой было предположено, что одна из функций гемоксигеназы - синтез СО, который активирует растворимую гуанилатциклазу с последующим увеличением уровня цГМФ в ткани (T.Morita, 1995). Однако, CO является слабым активатором растворимой гуанилатциклазы (J.R.Stone, M.A.Marletta, 1994; T.Ingi et al., 1996). По-видимому, в отличие от NO, который является сильным, но коротко живущим стимулятором синтеза цГМФ, СО за счет своей химической стабильности может оказывать хотя и слабые, но долговременные тонические эффекты (L.Wu, R. Wang, 2005). В отличие от кровеносных сосудов, где показаны кооперативные эффекты NO и CO, в некоторых областях мозга они оказывают антагонистическое действие (C.Thorup et al., 1999). Исследование клеточных механизмов регуляции активности гемоксигеназы показало, что синтез СО увеличивается в ответ на повышение цитозольной концентрации кальция, активацию протеинкиназы С и тирозинкиназ (D.Boehning et al., 2003). Показано, что СО также как NO является ретроградным мессенджером, участвующим в развитии и поддержании долговременной потенциации в гиппокампе (M.Zhuo et al., 1999). Исследований влияния СО на синаптическую передачу в системе мотонейрон-скелетная мышца не проводилось.

Предположения о физиологической роли сероводорода (H2S) возникли только в последнее время, что было связано с обнаружением высоких эндогенных концентраций сульфидов в крови и тканях мозга млекопитающих и других позвоночных животных (M.F.Warenycia et al., 1989; W.Zhao et al., 2001; J.E. Doeller et al., 2005). Эндогенно H2S синтезируется из L-цистеина пиридоксаль-5'-фосфат-зависимыми ферментами - цистатионин в-синтазой и цистатионин г-лиазой, экспрессирующимися практически во всех тканях (P.Kamoun, 2004). Также как NO и CO, H2S участвует в расслаблении гладкой мускулатуры (W. Zhao, R. Wang, 2002; B.Teague et al., 2002), физиологические концентрации этого газа усиливают активность НМДА рецепторов и облегчают индукцию долговременной потенциации в гиппокампе (K.Abe, H.Kimura, 1996). Исследования механизмов влияния сероводорода в нервной системе начались совсем недавно, а выявления его роли в периферической нервной системе не проводилось.

По-видимому, газы образуют единую систему посредников, легко проникающих через мембрану и регулирующих ферментативные реакции клетки. Данных о механизмах действия газов в нервной системе очень мало. Исследование внутриклеточных механизмов влияния NO и CO, H2S в системе мотонейрон - скелетная мышца позволит выявить основные мишени их действия при модуляции синаптических функций.

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования - выяснение роли газообразных посредников - оксида азота (II), монооксида углерода и сероводорода в регуляции секреции медиатора из двигательного нервного окончания и анализ внутриклеточных механизмов действия газов на синаптическую передачу. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

Изучить эффекты экзогенных и эндогенных доноров NO, субстрата синтеза NO - L-аргинина и блокатора синтеза NO - L-NAME на вызванную секрецию медиатора и электрогенез двигательного нервного окончания лягушки.

Выявить роль системы гуанилатциклазы и аденилатциклазы в эффектах NO на нервно-мышечную передачу.

Проанализировать участие цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в реализации эффектов NO на секрецию медиатора и потенциалзависимый калиевый ток нервной терминали.

Изучить эффекты экзогенного монооксида углерода и ингибитора гемоксигеназы на электрогенез нервного окончания и секрецию медиатора.

Выявить роль аденилат- и гуанилатциклазной систем в эффектах монооксида углерода на вызванное освобождение медиатора.

Проанализировать участие цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в реализации эффектов СО на секрецию медиатора.

Определить локализацию фермента гемоксигеназы-2 в кожно-грудинной мышце лягушки с помощью иммуногистохимического метода.

Изучить эффекты сероводорода, его донора сероводорода - гидросульфида натрия и блокаторов ферментов синтеза газа на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушки.

Проанализировать роль системы гуанилатциклазы/цГМФ и аденилатциклазы/цАМФ в эффектах сероводорода.

Выявить роль рианодиновых рецепторов внутриклеточных кальциевых депо в эффектах сероводорода.

Исследовать эффекты сероводорода и блокаторов ферментов синтеза газа на секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши.

Определить экспрессию генов ферментов синтеза сероводорода в диафрагмальной мышце мыши методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Положения, выносимые на защиту

1. Оксид азота (II) угнетает вызванную секрецию медиатора и активирует потенциалзависимые калиевые токи в двигательном нервном окончании лягушки. Гуанилатциклазная и аденилатциклазная внутриклеточные сигнальные системы опосредуют эффекты оксида азота через изменение активности цГМФ-стимулируемой цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы (фосфодиэстеразы II).

2. Монооксид углерода вызывает усиление освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки без изменения электрогенеза двигательного нервного окончания. Эффекты монокосида углерода реализуются через повышение уровня цАМФ за счет активации синтеза аденилатциклазой и снижения деградации циклического нуклеотида посредством цГМФ-ингибируемой цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы (фосфодиэстеразы III). аргинин медиатор электрогенез нервный

3. Сероводород усиливает спонтанную и вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки и мыши. Активация рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума опосредует пресинаптические эффекты сероводорода в нервно-мышечном синапсе лягушки.

4. Газообразные посредники - оксид азота (II), монооксид углерода и сероводород являются пресинаптическими модуляторами освобождения медиатора из двигательного нервного окончания и эндогенно синтезируются в области нервно-мышечного синапса.

Научная новизна

Впервые показано модулирующее влияние NO, СО и H2S на освобождение медиатора из двигательного нервного окончания холоднокровных животных. Проведен анализ внутриклеточных механизмов действия NO, СО и H2S на синаптическую передачу. Показано, что повышение внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов (цГМФ и цАМФ) снимает ингибиторное действие NO и облегчающее действие СО на секрецию ацетилхолина. Предполагается, что изменение концентрации цАМФ под действием NO или СО опосредуется цГМФ-стимулируемой или цГМФ-ингибируемой цАМФ-специфичными фосфодиэстеразами. Показано, что в основе эффектов сероводорода на секрецию медиатора лежит увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ за счет активации рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума. Ингибирование ферментов синтеза СО, NO и H2S приводит к эффектам противоположным действию газов. Кроме того, впервые показана экспрессия фермента синтеза СО гемоксигеназы-2 в скелетных мышечных волокнах лягушки. Также выявлена экспрессия мРНК ферментов синтеза H2S - цистатионин в-синтазы (CBS) и цистатионин г-лиазы (CSE) в диафрагмальной мышце мыши. Указанные результаты предполагают возможность эндогенного синтеза СО, NO и H2S в области нервно-мышечного синапса.

Научно-практическая ценность

Полученные в работе данные расширяют представления о модуляции синаптической передачи эндогенными физиологически активными соединениями. Это, в частности, касается вопросов о влиянии нового класса соединений - газообразных посредников, имеющих уникальные свойства, отличающие их от классических медиаторов, на функционирование нервной системы. Впервые исследованы внутриклеточные механизмы действия оксида азота, монооксида углерода и сероводорода на синаптическую функцию. Полученные экспериментальные данные могут служить основой для понимания возможных взаимодействий газообразных посредников с другими медиаторными и гормональными системами, так впервые показано, что активация как аденилат- так и гуанилатциклазных систем опосредуют эффекты NO и CO на освобождение медиатора. Научную ценность представляют данные об участии рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума в эффектах сероводорода. Особенности действия газов позволяют предположить их важную роль в формировании кратковременных и долговременных изменений в синаптических структурах, в процессах памяти и обучения. Поэтому выяснение молекулярных систем синтеза, инактивации и клеточных мишеней действия газообразных посредников позволит вести поиск и разработку фармакологических агентов, которые могут быть использованы для лечения и профилактики заболеваний, сопровождающихся нарушением синаптической функции, а также для целенаправленного синтеза новых фармакологических агентов, модулирующих работу ионных каналов нервного окончания и синаптическую передачу. Поскольку основные закономерности функционирования нервно-мышечного синапса идентичны процессам, происходящим в синапсах центральной нервной системы, результаты работы могут быть использованы также для объяснения механизмов регуляции процессов секреции нейромедиаторов и гормонов эндогенными газообразными посредниками в секреторных, нейросекреторных клетках и нейронах. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, биофизиков, биохимиков, фармакологов и нейрохимиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре физиологии человека и животных Казанского государственного университета, Казанского государственного медицинского университета, Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (02-04-48822, 03-04-96252, 05-04-48428, 06-04-49125); «Ведущая научная школа» (00-15-97763, НШ 1383.2003.4 НШ-4520.2006.4, НШ-3368.2008.4); АН РТ (03.-3.10.-222 (2003-2005).

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на XVIII, XIX, XX Съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001, Екатеринбург, 2004, Москва 2007), Всероссийском научном симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке» (Казань, 2002, Казань 2006), Международной школе-конференции «Фармакология синаптической передачи в нервной системе» (Киев, 2002), IV, V, VI Съездах физиологов Сибири (Новосибирск, 2002, Томск, 2005, Барнаул, 2008), Международной конференции «Функциональная роль монооксида азота и пуринов» (Минск, 2001), Международной конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008), Международном Симпозиуме «Внутриклеточная регуляция дифференциации и пластичности нейрона» (Москва, 2003), Международной конференции «Медиаторы в формировании нейрональных сетей» (Ля Сиота, Франция, 2003, 2004), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), XII Международном совещании и IV Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), научной конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» (Пенза, 2006), 1 международном междисциплинарном Конгрессе "Нейронаука для медицины и психологии" (Судак, 2006), VIII региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые нервные системы» (Казань, 2006), Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005, 2007), Международном симпозиуме “Биологическая подвижность” (Пущино, 2004, 2006, 2008), Европейском форуме по нейронаукам FENS (Женева, Швейцария, 2008).

По теме диссертации опубликовано 57 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация объемом 251 страница состоит из введения, обзора литературы, изложения объектов и методов исследования, 3 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 416 названий, из них 31 отечественных и 385 иностранных авторов. Диссертация содержит 48 рисунков и 4 таблицы.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования, использованные растворы и химические вещества. Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки Rana ridibunda и диафрагмы лабораторных белых мышей. Использовали раствор Рингера для холоднокровных животных следующего состава (в мМ): NaCl - 115; KCl - 2.5; CaCl2 - 1.8; HEPES - 5 (t=20С, рН 7.2-7.4) и раствор Кребса для теплокровных животных (в мМ): NaCl - 154; KCl - 5; CaCl2 - 2; HEPES - 5, MgCl2 - 1, глюкоза - 11 (t=20С, рН 7.2-7.4). Раствор Крепса перфузировали карбогеном в течение всего эксперимента. Для устранения сокращения мышц в раствор добавляли d-тубокурарин (20-30 мкМ) или использовали раствор Рингера с пониженной концентрацией ионов кальция ([Ca2+]0) (0.2-0.4 мМ) и повышенной концентрацией ионов магния (2-4 мМ).

Базовый раствор CO готовили непосредственно перед каждым экспериментом путем насыщения 20 мл раствора Рингера в течение 30 мин газом (96%, Россия) в вытяжном шкафу. С учетом растворимости (2,691 мг на 100 г при t =230C и давлении 760 мм рт. ст.) получали раствор с концентрацией 0.96 мМ (F.Zufall, T. Leinders-Zufall, 1997). Данный раствор сразу же разводили до получения необходимой в эксперименте концентрации CO и добавляли в систему перфузии. H2S получали в реакции: Na2S+2HCl = 2NaCl + H2S, которую проводили в вытяжном шкафу (Ю.В.Карякин, И.И.Ангелов, 1974). В двугорлую колбу помещали Na2S и медленно по каплям добавляли 20% HCl, вращая колбу для равномерного перемешивания. Образовавшимся в результате реакции H2S насыщали 20 мл раствора Рингера в течение 30 мин непосредственно перед экспериментом. С учетом растворимости H2S концентрация базового раствора составляла 98 мМ (Я.И.Михайленко, 1966). Данный раствор сразу же доводили до необходимой концентрации H2S и добавляли в систему перфузии.

В качестве донора сероводорода использовали гидросульфид натрия - NaHS [K.Abe, H.Kimura, 1996]. В водных растворах NaHS диссоциирует до иона натрия (Na+) и гидросульфидного аниона (HS-), который реагирует с протоном (Н+), образуя H2S. Известно, что в физиологическом растворе одна треть H2S находится в недиссоциированной форме, а остальные две трети существуют в виде HS- (R. O.Beauhamp et al., 1984).

В экспериментах также использовали следующие фармакологические препараты фирмы Sigma: нитропруссид натрия (SNP), S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), гидроксиламин солянокислый, L - аргинин, D-аргинин, NG-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME), цинк (II) протопорфирин IX (ZnPP-IX), гидросульфид натрия (NaHS), 4-аминопиридин, L-цистеин, аминооксиацетиловая кислота (АОАК), в-цианоаланин (в-ЦА), cisN-(2-phenylcyclopentyl) azacyclotridecl-en-amine hydrochloride (MDL-12330А), 8(4-chlorophenylthio)-adenosine-3,5-cyclic monophosphat (pCPT-cAMP), 8Br-cAMP, N-2-(p-bromocinnamyl-amino)-ethyl-5-isoquinolihe sulfon-amide dihydrochloride (Н-89), 1H-[1,2,4]-oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-l-one (ODQ), 6-anilino-5,8-quinolinedione (LY-83583), 8(4-chlorophenylthio)- guanosine-3,5-cyclic monophosphat (pCPT-cGMP), 8Br-cGMP, db-cGMP, 1,4-dihydro-5-[2-propoxyphenyl]-7H-1,2,3-triazaolo[4,5-d]pyrimidine-7-one (запринаст), erytro-9-(2-hydroxy-3nonyl)-adenine) hydrochloride- (EHNA), милринон, дантролен, кофеин.

Водонерастворимые вещества растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO). Конечная концентрация DMSO в используемых растворах не превышала 0.1%. Эксперименты со светочувствительными агентами (SNP, SNAP, ZnPP-IX, дантролен) проводились в условиях низкой или нулевой освещенности.

Электрофизиологические методы. Раздражение двигательного нерва проводили прямоугольными электрическими импульсами сверхпороговой силы длительностью 0.2-0.3 мс с частотой 0.2-0.4 имп/с или пачками ритмических стимулов (500 раздражений) с частотой 10 или 50 имп/с. Регистрацию биопотенциалов производили с помощью стеклянных микроэлектродов, имеющих сопротивление 2-5 Ом. Методом внеклеточного отведения регистрировали трехфазные ответы нервного окончания и следующие за ними токи концевой пластинки (ТКП). Известно, что первая положительная фаза ответа нервного окончания представляет собой пассивный ток, генерируемый распространяющимся потенциалом действия, вторая отрицательная фаза отражает входящий Na+-ток. Третья положительная фаза отражает К+-токи через потенциалзависимые и кальцийактивируемые К+-каналы (A.Mallart, 1984; А.Л.Зефиров, И.А.Халилов, 1985). В условиях низкого содержания Ca2+ в растворе (0.2-0.4 мМ) амплитуда третьей фазы ответа нервного окончания отражает в основном величину потенциалзависимых К+-токов (А.Л.Зефиров, И.А.Халилов, 1985). Для выявления Са2+-активируемых К+-токов в стандартный раствор Рингера ([Ca2+]0 - 1.8 мМ) для холоднокровных добавляли 4-аминопиридин (100 мкМ). При добавлении в раствор 4-аминопиридина происходит блокирование потенциалзависимых К+-каналов, что ведет к увеличению длительности потенциала действия и, следовательно, большему входу Са2+ в нервное окончание. В результате выходящие Са2+-активируемые К+-токи становятся преобладающими в суммарном выходящем токе. Таким образом, амплитуда 3-й фазы ответа будет отражать величину Са2+-активируемых К+-токов (А.Л.Зефиров, И.А.Халилов, Х.С.Хамитов, 1987).

С помощью внутриклеточных микроэлектродов регистрировали ТКП и потенциалы концевой пластинки (ПКП).

Накопление, усреднение и анализ сигналов производили при помощи персонального компьютера с использованием программы «Ritm». При внеклеточном отведении ответы нервного окончания и ТКП усреднялись по 30 реализациям (при одиночном раздражении) и по 100 реализациям (при ритмическом раздражении). Проводили анализ амплитуды и квантового состава ТКП, параметров второй и третьей фазы ответа. Квантовый состав рассчитывался по методу выпадений

m = ln N0/N,

где N0 - число раздражений, N - число раздражений, не вызвавших ТКП [М.А.Каменская, 1972]. Рассчитывали также амплитуду, время роста, постоянную времени спада внутриклеточных сигналов, а также частоту миниатюрных ТКП и ПКП. Среднее значение в серии получали по результатам экспериментов на 5-12 животных. В качестве контроля (100%) принимались параметры ответов нервного окончания и токов или потенциалов концевой пластинки, квантового состава ТКП, анализируемые в каждом эксперименте до аппликации веществ. Для статистической обработки экспериментальных данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента.

Иммуногистохимический метод Данная часть работы проведена на базе кафедры гистологии Казанского государственного медицинского университета совместно с проф. д.м.н. Р.Р. Исламовым.. Для выявления клеточной локализации гемоксигеназы-2 проводили иммуногистохимическое окрашивание непрямым иммунопероксидазным методом (R.R.Islamov et al., 2004). Для выявления гемоксигеназы-2 в скелетных мышечных волокнах использовали поликлональные антитела к гемоксигеназе-2 (OSA-200 StressGen Biotechnologies, Канада). Затем проводили иммунную реакцию с первичными антителами с помощью стрептавидин-биотинового комплекса (Elite ABC Kit; Vector Laboratories). Иммунопреципитат визуализировали с помощью диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase, Vector Laboratories, США). Для контроля проводили окрашивание без первичных или вторичных антител (отрицательный контроль). Готовые срезы изучали под световым микроскопом. Фотографии сделаны при помощи цифровой камеры Kodak DC120 Digital Access.

Проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией Эксперименты проведены в Научно-исследовательском институте сельского хозяйства РАСХН совместно с научным сотрудником, к.б.н. С.Г. Вологином.. С помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ ПЦР) определяли экспрессию мРНК ферметов синтеза сероводорода в диафрагмальной мышце мыши. Для выделения мРНК из образца ткани использовали лизирующий раствор следующего состава: 7.5М гуанидинизотиоцианат; 50% фенол, уравновешенный Трис-HCl (pH=7.0); 1% -меркаптоэтанол; 0.5 мкг/мл дрожжевой тРНК (Chomczynski, Sacchi, 1987). Реакцию обратной транскрипции проводили в смеси следующего состава: 0.25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ), буфер для М-MuLV-обратной транскриптазы (50 мМ Трис-HCl), 3 мM MgCl2, 75 мМ KCl, 5 мМ дитиотреитол, 2 единицы ингибитора РНКаз (Хеликон, Россия), 1 единица М-MuLV-обратной транскриптазы (СибЭнзим, Россия), олигонуклеотиды (dT)15 (500 нг). В реакционную смесь объемом 20 мкл вносили 5 мкл препарата выделенной РНК.

ПЦР проводили в реакционной смеси следующего состава: смесь дНТФ (0.2 мМ), буфер для Taq ДНК-полимеразы (ТрисHCl, 60 мМ, MgCl2,1.5 мМ, KCl, 25 мМ, -меркаптоэтанол, 5 мМ, Тритон Х-100 (0.05%), 1 единица Taq ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия), олигонуклеотидные праймеры (1 мкМ). В реакционную смесь объемом 20 мкл вносили 5 мкл препарата кДНК. Амплификацию ДНК проводили с использованием системы «Терцик MC2» (ДНК-Технология, Россия). Для реакции ПЦР нами были сконструированы ген-специфичные праймеры с использованием информация о нуклеотидной последовательности мРНК CSE и CBS, содержащаяся в базе данных GenBank (локусы NM_145953 и NM_178224). Разработанные пары праймеров получили название CSEm-f и CSEm-r, также CBSm-f и CBSm-r. Данные праймеры являются гомологами олигонуклеотидов, описанных для выявления мРНК CSE и CBS у крысы Rattus norvegicus (W.Zhao et al., 2001), и модифицированы нами с учетом нуклеотидных последовательностей мРНК выявленных для мыши [I.Ishii et al., 2004]. Нуклеотидные последовательность праймеров приведены ниже: CSEm-f - 5'-aagcagtggctgcgttg-3', CSEm-r - 5'-tgtggtgtaatcgctgcc-3', CBSm-f - 5'-agccaacttctggcaac-3', CBSm-r -5'-caccagcatatccagcttc-3'. Ожидаемый размер амплифицируемых фрагментов ДНК, ограниченных праймерами CSEm-f и CSEm-r, составил 232 пар оснований (п.о.), а для олигонуклеотидов CBSm-f и CBSm-r - 325 п.о. Вычисление оптимальных термодинамических показателей было проведено с помощью компьютерной программы «Oligo 6». На рис 1 и 2 представлены фрагменты мРНК CSE и CBS, амплифицируемые в ОТ ПЦР.

Рис. 1. Последовательность мРНК CSE, амплифицируемая в ОТ-ПЦР (232 п.о.).

В прозрачной рамке - области посадки праймеров, в заштрихованной рамке - сайт распознавания рестриктазы HaeIII (разрезание на фрагменты 39 и 193 п.о.).

Рис. 2. Последовательность мРНК CBS, амплифицируемая в ОТ-ПЦР (325 п.о.).

В прозрачной рамке - области посадки праймеров, в заштрихованной рамке - сайт распознавания рестриктазы HaeIII (разрезание на фрагменты 78 и 247 п.о.).

Для проверки специфичности реакции полученные фрагменты кДНК обрабатывали рестриктазой HaeIII (СибЭнзим, Россия) в течение 2-х часов при температуре 370С. Рестриктаза HaeIII разрезает полученные фрагменты в определенном месте (Рис.1 и 2, заштрихованный участок) с получением фрагментов известных размеров.

Детекцию результатов проводили методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле, содержащим бромистый этидий (0,5 мкг/мл). Разделение проводили в трис-боратном буфере (pH 8,0). Результаты визуализировали в УФ-свете (л=310 нм). Электрофореграммы фотографировали цифровым фотоаппаратом Nikon CoolPix 4500 с оранжевым светофильтром. Для определения размеров амплифицированных фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярных размеров (СибЭнзим, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование молекулярных механизмов действия оксида азота (II) на секрецию медиатора в двигательном нервном окончании лягушки Часть исследований, посвященных выявлению молекулярных механизмов действия NO на синаптическую функцию, проведена совместно с ассистентом кафедры физиологии человека и животных Казанского государственного университета, к.б.н. А.В.Яковлевым.

Эффекты экзогенных и эндогенных доноров оксида азота (II) на вызванную секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушки. В качестве экзогенных доноров NO использовали SNP (100 мкМ) и SNAP (250 мкМ), которые в водных растворах распадаются с образованием NO. Аппликация SNP или SNAP снижали среднюю амплитуду ТКП до 17.33.2% (n=12; р0.05) и 21.5±6.8 (n=6; р<0.05), соответственно, относительно контроля. Снижение амплитуды ТКП сопровождалось уменьшением квантового состава ТКП до 11.261.1% (n=12; р0.05) и 10.6±6.6% (n=6; p<0.05), соответственно, относительно контроля (рис. 3). На фоне действия экзогенных доноров NO происходило увеличение амплитуды 3-ей положительной фазы ответа, отражающей выходящие калиевые токи, которая возрастала до 275.013.8% (n=12; p0.05) и 196.2±10.3% (n=6; p<0.05), соответственно, от исходной величины (рис. 3). Эндогенный донор NO - гидроксиламин в концентрации 1 мМ также снижал среднюю амплитуду и квантовый состав ТКП до 57.8±5.4% и 66.8±12.0% (n=5; р<0.05), соответственно, относительно исходной величины. При этом амплитуда 3-ей фазы ответа нервного окончания увеличивалась до 146.4±2.4% (n=5; р<0.05) относительно контроля.

Таким образом, экзогенные и эндогенный доноры NO приводили к угнетению вызванного освобождения медиатора и усилению потенциалзависимого калиевого тока нервного окончания.

Исследование эффектов L-аргинина - субстрата для NO-синтазы на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания. NO образуется в результате окисления L-аргинина с одновременным синтезом другой аминокислоты L-цитруллина в присутствии О2 и НАДФН (Е.Б.Меньшиков и др., 2000). В нервно-мышечном препарате лягушки L-аргинин в концентрации 100 мкМ вызывал достоверное уменьшение средней амплитуды и квантового состава ТКП до 53.2±4.5% и 80.1±5.8% (n=9; р<0.05), соответственно (Рис. 4 А).



Рис. 3. Влияние донора NO - SNAP на ионные токи нервного окончания и секрецию медиатора.

А. - Усредненные ответы (30 реализаций) в контроле и после действия SNAP (250 мкМ). Эффекты SNAP показаны стрелками. Б. - Изменение амплитуды 3 фазы ответа нервного окончания (3 фаза) и квантового состава токов концевой пластинки (ТКП) (m). По оси ординат - изменение квантового состава ТКП (¦) и третьей фазы ответа нервного окончания (?) в % относительно исходных значений. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ.

При этом наблюдали увеличение амплитуды 3-ей фазы ответа нервного окончания до 112.7±3.5% (n=9; р<0.05) относительно контроля (Рис. 4 А). Эти эффекты аналогичны эффектам экзогенных и эндогенного доноров NO. Можно думать, что эффекты L-аргинина в концентрации 100 мкМ вызваны увеличением синтеза NO в нервно-мышечном синапсе. Блокирование синтеза NO с помощью неспецифического блокатора NO-синтазы L-NAME в концентрации 100 мкМ приводило к эффектам противоположным действию субстрата и доноров NO (Рис. 4 Б): амплитуда ТКП увеличивалась до 258.943.6% и квантовый состав ТКП - до 289.121.6% (n=9; р0.05) относительно контроля. При этом происходило уменьшение амплитуды 3-ей фазы ответа нервного окончания - до 81.64.4% (n=9; р0.05) относительно исходных значений. Таким образом, субстрат NO-синтазы оказывает эффекты сходные с эффектами доноров NO, а блокирование NO-синтазы - противоположные, что свидетельствует о наличие эндогенного синтеза оксида азота в области нервно-мышечного синапса.

Увеличение концентрации L-аргинина до 1000 мкМ приводило к быстрому увеличению вызванной секреции медиатора. К 20 минут перфузии квантовый состав ТКП возрастал до 1372.3±72.9% (n=5; p<0.05) относительно контроля, параметры ответа нервного окончания не изменялись. Было предположено, что L-аргинин, являясь субстратом для синтеза NO, вовлечен в механизм ингибирования NO-синтазы. Поэтому исследовали эффекты L-аргинина на фоне блокирования NO-синтазы. На фоне действия L-NAME L-аргинин в концентрации 100 мкМ не проявлял своих эффектов, а в концентрации 1000 мкМ приводил к дальнейшему увеличению квантового состава ТКП до 642.4±21.5% (n=5; p<0.05) относительно контроля, не изменяя 3-ей фазы ответа нервного окончания. Таким образом, на фоне блокирования NO-синтазы эффекты L-аргинина (1000 мкМ) на секрецию медиатора сохранялись, хотя и в меньшей степени, чем в контроле. Было предположено, что работа NO-синтазы может быть заблокирована повышением концентрации субстрата либо механизму субстрат-ферментного ингибирования, либо путем ферментативного декарбоксилирования L-аргинина в агматин, который ингибирует все изоформы NO-синтазы, либо образованием других его метаболитов (E.Galea et al., 1996).



А

Б

Рис. 4. Влияние субстрата (L-аргинин) и ингибитора NO-синтазы (L-NAME) на ионные токи нервного окончания и секрецию медиатора.

Изменения третьей фазы ответа нервного окончания (3 фаза) и квантового состава ТКП (m) при действии L-аргинина в концентрациях 100 мкМ (A) и L-NAME в концентрации 100 мкМ (Б). По оси ординат - изменение квантового состава ТКП (¦) и третьей фазы ответа нервного окончания (?) относительно исходных значений. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ.

Для выявления стереоспецифичности эффектов L-аргинина исследовали его правовращающийся оптический изомер - D-аргинин в концентрациях 100 мкМ и 1000 мкМ. D-аргинин в концентрации 100 мкМ вызывал увеличение квантового состава ТКП до 225±3.2%, а в концентрации 1000 мкМ до 392±22.8% (n=5; p<0.05) по сравнению с контролем (Рис.5 А). При этом происходило уменьшение 3-ей фазы ответа нервного окончания до 92±2.3% при действии D-аргинина в концентрации 100 мкМ и до 68.4±8.1% (n=5; p<0.05) при действии D-аргинина в концентрации 1000 мкМ (n=5; p<0.05) (Рис.5 Б). Таким образом, D-аргинин в обеих концентрациях дозозависимо увеличивал квантовый состав и уменьшал амплитуду третьей фазы ответа. Эффекты D-аргинина аналогичны эффектам ингибирования NО-синтазы, что, по-видимому, связано со стереохимической специфичностью фермента синтеза NO. Действительно, на фоне действия L-NAME D-аргинина в обеих концентрациях не изменял ни секрецию медиатора, ни амплитуды 3-ей фазы ответа нервного окончания.

Таким образом, выявлены существенные различия между эффектами стереоизомеров аргинина на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушки. Предположено, что L-аргинин в больших концентрациях усиливает секрецию медиатора за счет ингибирования синтеза NO, однако, имеются и другие механизмы его влияния, которые могут быть связаны как с непосредственным действием L-аргинина на внутриклеточные мишени, так и с образованием метаболитов, имеющих собственные эффекты.

Рис. 5. Эффекты D-аргинина на фоне блокирования NO-синтазы.



Изменение квантового состава ТКП (белый столбик) и третьей фазы ответа нервного окончания (заштрихованный столбик) при действии D-аргинина (D-арг) в концентрациях 100 мкМ и 1000 мкМ, L-NAME (100 мкМ), D-аргинина (100 и 1000мкМ) на фоне действия L-NAME.

По оси ординат - изменение квантового состава ТКП или третьей фазы ответа нервного окончания в % относительно исходных значений. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05

Исследование роли гуанилатциклазной системы в эффектах NO на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания. Для повышения внутриклеточной концентрации цГМФ использовали мембранопроникающие аналоги: 8Br-cGMP, db-cGMP и селективный ингибитор цГМФ-специфичной фосфодиэстеразы - запринаст. Аппликация аналогов цГМФ (100 мкМ или 1 мМ) и запринаста (100 мкМ) не приводила к изменению ни параметров ответа нервного окончания, ни квантового состава ТКП (Рис. 6). SNP после часовой инкубации нервно-мышечного препарата в растворе Рингера, содержащего 8Br-cGMP, db-cGMP или запринаст, не изменял достоверно ни амплитуды 3-ей фазы ответа нервного окончания, ни амплитуду и квантовый состав ТКП в течение всего эксперимента (Рис. 6). Селективный блокатор гуанилатциклазы - ODQ в концентрации 0.1 мкМ вызывал достоверное снижение вызванной секреции медиатора - квантовый состав ТКП уменьшился до 73.92.3% (n=6; p<0.05) относительно контроля. В условиях сниженной активности гуанилатциклазы эффекты SNP сохранялись, но были менее выражены, чем в контроле: квантовый состав ТКП снижалась до 41.11.4% (n=6; p<0.05), амплитуда 3-ей фазы ответа нервного окончания возрастала до 160.95.8% (n=6; p<0.05) относительно контроля (Рис.6 А, Б).



А

Б

Рис. 6. Влияние изменения активности гуанилатциклазной системы на эффекты донора оксида азота - SNP на вызванную секрецию медиатора и потенциалзависимые калиевые токи нервного окончания.

Изменение квантового состава ТКП (А) и амплитуды 3 фазы ответа нервного окончания (Б) при действии донора NO (SNP, 100 мкМ), блокатора гуанилатциклазы (ODQ, 0.1 мкМ), SNP на фоне действия ODQ, аналога цГМФ (8Br-cGMP, 100 мкМ) и SNP на фоне 8Br-cGMP.

За 100% уровень приняты значения квантового состава ТКП и амплитуды 3 фазы ответа в контроле - до аппликации соответствующих веществ. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05.

Таким образом, повышение внутриклеточной концентрации цГМФ снимало эффекты NO на секрецию медиатора и потенциалзависимые К+-токи, а в условиях пониженного синтеза цГМФ эффекты NO были менее выражены, чем в контроле. Можно предположить, что повышение концентрации цГМФ опосредует модулирующие эффекты NO на синаптическую передачу, но существуют и цГМФ-независимые эффекты NO.

Исследование роли аденилатциклазной системы в эффектах NO на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания. Добавление 8Вr-cAMP (100 мкМ) вызывало прогрессирующее увеличение амплитуды и квантового состава ТКП до 189.37.8% и 155.813.1% (n=10; р<0.05), соответственно, относительно контроля, не изменяя ответа нервного окончания (Рис. 7 Б). На фоне повышенной внутриклеточной концентрации цАМФ (часовая инкубации препарата в растворе Рингера с 8Br-cAMP) SNAP не вызывал достоверных изменений ни квантового состава ТКП, ни амплитуды третьей фазы ответа (Рис. 7 Б). Специфический ингибитор аденилатциклазы - MDL-12330A в концентрации 1 мкM вызывал уменьшение секреции медиатора без изменения параметров ответа нервного окончания. Квантовый состав ТКП при действии MDL-12330A уменьшался до 31.74.9% (n=5; p<0.05), относительно контроля.

А

Б

Рис. 7. Роль аденилатциклазной системы в эффектах NO на секрецию медиатора и третью фазу ответа нервного окончания.

А - Изменения квантового состава ТКП при действии MDL-12330A (1 мкМ) и SNАP (250 мкМ) на фоне MDL-12330A. За 100% уровень принят уровень секреции в контроле до воздействия веществ

Б - Изменение квантового состава ТКП (m, ¦) и 3-ей фазы ответа нервного окончания (3 фаза, ?) при добавлении в раствор 8Br-cAMP (100 мкМ) и SNАP на фоне 8Br-cAMP в процентах от исходного уровня. Время действия веществ показано сплошной линией. [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05

В условиях сниженной активности фермента (часовая инкубация нервно-мышечного препарата в растворе с MDL-12330A) эффекты SNАP были выражены в той же степени, что и в контрольных условиях - квантовый состав ТКП снижался до 5.30.6% (n=5; p<0.05), амплитуда 3-ей фазы ответа возрастала до 149.111.4 (n=5; p<0.05) относительно исходных значений. По-видимому, эффекты NO не связаны с непосредственным уменьшением активности аденилатциклазы, а опосредуются влиянием на другие звенья аденилатциклазной системы. Было предположено, что ингибирующее действие NO на вызванную секрецию медиатора и активирующее - на потенциалзависимые К+-токи может опосредоваться через изменение концентрации цАМФ, которая зависит от активности цГМФ-специфичных цАМФ-фосфодиэстераз.

Исследование роли цГМФ-ингибируемой и цГМФ-стимулируемой цАМФ-специфичных фосфодиэстераз в эффектах NO на секрецию медиатора и ионные токи нервного окончания. Внутриклеточная концентрация цАМФ может регулироваться как синтезом соответствующими циклазами, так деградацией фосфодиэстеразами (J.A. Beavo, 1995). Две из них - цГМФ-стимулируемая (ФДЭ-II) и цГМФ-ингибируемая (ФДЭ-III) являются цГМФ-зависимыми и служат для перекрестной связи между цАМФ- и цГМФ-зависимыми сигнальными системами (C.Lugnier, 2006).

А

Б

Рис. 8. Роль цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в эффектах NO на вызванное освобождение медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания.



Изменение квантового состава ТКП (А) и амплитуды 3 фазы ответа нервного окончания (Б) при действии донора NO (SNAP, 250 мкМ), блокатора фосфодиэстеразы II (milrinone, 20 мкМ), SNAP на фоне милринона (milrinone+SNAP), блокатора фосфодиэстеразы III (EHNA, 50 мкМ) и SNAP на фоне EHNA (EHNA+SNAP [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05

Добавление селективного блокатора цГМФ-ингибируемой цАМФ- фосфодиэстеразы - милринона (20, 100 мкМ) не влияло непосредственно ни на электрогенез нервного окончания, ни на секрецию медиатора. На фоне действия милринона эффекты SNAP на секрецию медиатора и потенциалзависимый К+-ток сохранялись (Рис.8 А, Б).

Блокатор цГМФ-стимулируемой цАМФ-фосфодиэстеразы - erytro-9-(2-hydroxy-3 nonyl)-adenine) hydrochloride (EHNA, 50 мкM) вызывал значительное увеличение амплитуды и квантового состава ТКП до 258.3±16.3% и 382.6±5.1% (n=5; р<0.05), соответственно, от исходной величины (Рис. 8 А). Амплитуда 3-ей фазы достоверно снижалась до 84.2±1.2% (n=5; р<0.05) относительно контроля (Рис. 8 Б). В условиях ингибирования цГМФ-стимулируемой цАМФ-фосфодиэстеразы SNAP уменьшал квантовый состав ТКП до 63.5±6.9% (n=5; p<0.05) по отношению к уровню секреции на фоне EHNA (Рис. 3 А). Амплитуда 3-ей фазы ответа нервного окончания в течение всего эксперимента не изменялись (Рис. 3 Б).

Таким образом, снижение активности цГМФ-стимулируемой цАМФ-фосфодиэстеразы ослабляет ингибиторное действие NO на вызванную секрецию медиатора и устраняет активирующее влияние NO на потенциалзависимые К+-токи.

Исследование роли протеинкиназы А в эффектах NO на ионные токи нервного окончания и вызванную секрецию медиатора. цАМФ-зависимая протеинкиназа или протеинкиназа А опосредует большинство биологических эффектов цАМФ во всех клетках эукариот и является ключевым ферментом аденилатциклазного пути передачи сигнала. Селективный ингибитор протеинкиназы А - Н-89 в концентрации 10 мкМ не изменял параметров ответа нервного окончания, но быстро подавлял вызванную секрецию медиатора. Квантовый состав ТКП снижался до 68.6±6.1% (n=5; p<0.05), относительно исходных величин. На фоне действия Н-89 SNAP уменьшал квантовый состав ТКП - до 36.1±5.5% (n=5; p<0.05) относительно исходной величины, не изменяя амплитуды 3 фазы ответа нервного окончания.

Можно думать, что активация потенциалзависимого калиевого тока при действии NO связана со снижением активности протеинкиназы А, которая также опосредует эффекты NO на вызванную секрецию медиатора.

Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют, что экзогенный и эндогенный NO оказывает ингибирующее действие на секрецию медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки. Действие NO может быть связано как с изменением длительности потенциала действия нервного окончания путем модуляции выходящего К+-тока, так и посредством изменения активности гуанилатциклазного и аденилатциклазного метаболических каскадов. Предположено, что NO активирует растворимую форму гуанилатциклазы, тем самым, увеличивая концентрацию цГМФ. Повышение концентрации цГМФ ведет к активации цГМФ-стимулируемой фосфодиэстеразы и к усилению гидролиза цАМФ. Снижение концентрации цАМФ в нервном окончании снижает активность цАМФ-зависимых протеинкиназ, что, в свою очередь, ведет к уменьшению секреции медиатора и усилению потенциалзависимого К-тока нервного окончания. Не исключено, также, что NO может модулировать потенциалзависимые К+- и Са2+-каналы с внешней и внутренней стороны мембраны путем S-нитрозилирования, образования свободных форм кислорода и пероксинитритов или модуляции Са2+-каналов внутриклеточных депо (В.П.Реутов и др., 1998; B.Gaston, 1999; С.Erxleben, A.Hermann, 2001; A.Schwingshackl et al., 2002).

Исследование влияния и механизмов действия монооксида углерода на освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе

Влияние экзогенного CO на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания. В условиях двухэлектродной фиксации потенциалов нами было исследовано влияние экзогенного СО на миниатюрные ТКП (МТКП) и ТКП в стандартном растворе Рингера ([Ca2+]0 - 1.8 мМ). Добавление СО (96 мкМ) приводило к быстрому и обратимому увеличению спонтанной секреции медиатора (Рис. 9 Б). Частота МТКП возрастала до 207.0±3.1% (n=5; p<0.05) по сравнению с контролем к 20 минуте эксперимента, амплитудно-временные параметры МТКП не изменялись (Рис. 9 А). При этом происходило увеличение амплитуды ТКП до 245.3±45.2% (n=5; p<0,05) относительно контроля без изменения временных параметров ТКП (Рис.9 А, Б). Так как СО не влиял на амплитудно-временные параметры МТКП и время

Рис. 9. Влияние СО (96 мкМ) на спонтанную и вызванную секрецию медиатора. Усредненные миниатюрные токи концевой пластинки (МТКП) (А) и токи концевой пластинки (ТКП) (В) в контроле и после аппликации СО. Изменение частоты МТКП (Б) и амплитуды ТКП при действии СО (Г).[Ca2+]0 -1.8 мМ, * - p<0.05.

полуспада ТКП можно думать, что его эффекты не связаны с изменением работы ацетилхолинорецепторов постсинаптической мембраны и влиянием на активность ацетилхолинэстеразы.

В условиях сниженной концентрации внеклеточного Са2+ ( [Ca2+]0 - 0.3-0.4 мМ) с использованием внеклеточной регистрации исследовали влияние СО на квантовый состав ТКП и ионные токи двигательного нервного окончания. Аппликация экзогенного СО (96 мкМ) приводила к быстрому и значительному увеличению усредненной амплитуды и квантового состава ТКП (Рис.10 А, В): амплитуда ТКП достигала 188.1±26.7% (n=5; p<0.05), а квантовый состав ТКП - 287.6±17.4% (n=5; p<0.05) относительно контроля (Рис.10 А, В). Эффект газа был обратим и не сопровождался изменением параметров ответа двигательного нервного окончания (Рис.10 А, Б).

Рис.10. Эффекты СО на ионные токи нервного окончания и вызванную секрецию медиатора.

А - суперпозиция ответов нервного окончания и токов концевой пластинки при внеклеточной регистрации в контроле, при действии СО и после отмывки раствором Рингера (по 10 реализаций). Б - изменение квантового состава ТКП при действии СО. Время действия газа показано сплошной линией. В - эффекты СО на амплитуду второй и третьей фазы ответа нервного окончания: потенциалзависимые натриевые (Na-ток) и калиевые токи (Kv-ток) проанализированы в условиях [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, кальций-активируемые калиевые токи (K(Ca)) - в условиях [Ca2+]0 - 1.8 мМ, d-тубокурарин (20-30 мкМ), 4-аминопиридин (100 мкМ).Г - дозозависимость эффектов СО на квантовый состав ТКП [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ.

Для выявления влияния СО на кальций-активируемые калиевые токи исследовали его эффекты на фоне блокирования потенциалзависимых калиевых каналов 4-аминопиридином в условиях нормального содержания ионов кальция в растворе. В данных условиях третья фаза ответа нервного окончания отражает выходящие токи через кальций-активируемые калиевые каналы. Аппликация СО (96 мкМ) не приводила к достоверным изменениям амплитуды 3-ей фазы ответа, что свидетельствует об отсутствии влияния газа на кальций-активируемые калиевые токи нервного окончания (Рис.10 Б).

На Рис.10 Г показана дозозависимость эффектов СО на вызванную секрецию медиатора. Оказалось, что уже в концентрации 0.96 мкМ СО вызывал повышение квантового состава ТКП до 148.7±2.70% (n=5, p<0.05) относительно контроля, в концентрациях 48 и 96 мкм значение квантового состава ТКП выходило на уровень плато, EC50=29.7 мкМ. В последующих экспериментах использовали СО в концентрации 96 мкМ.

Для контроля действующего начала раствора, содержащего СО, проводили эксперименты, выдерживая базовый раствор в течение 2 часов после насыщения при комнатной температуре. В данных условиях раствор не оказывал никакого эффекта на квантовый состав ТКП, что, по-видимому, связано с диффузией газа из раствора.

Исследование роли гуанилатциклазной системы в эффектах СО на функцию двигательного нервного окончания. Действие СО во многих тканях реализуется путем активации гуанилатциклазы и увеличения уровня цГМФ (T.Ingi et al., 1996; F.Zufall, T.Leinders-Zufall, 1997). На фоне действия 8Br-cGMP СО не вызывал достоверных изменений амплитуды и квантового состава ТКП (Рис. 11). Для ингибирования гуанилатциклазы использовали ODQ (0.1 мкМ) и LY-83583 (30 мкМ). На фоне действия ODQ CO увеличивал квантовый состав ТКП до 144.9±3.0% (n=6; p<0.05) (Рис. 11). Сходные эффекты СО проявлял и на фоне действия LY-83583: квантовый состав ТКП повышался до 191.2±11.0% (n=5; p<0,05) относительно контроля (Рис. 11).

Таким образом, увеличение внутриклеточного уровня цГМФ полностью снимало эффект СО, тогда как на фоне ингибирования гуанилатциклазы СО увеличивал вызванное освобождение медиатора, хотя и в меньшей степени, чем в контроле. Полученные данные невозможно объяснить влиянием СO исключительно на цГМФ-зависимый механизм.

Исследование роли аденилатциклазной системы в эффектах СО. Пресинаптическая активация аденилатциклазы и последующий синтез цАМФ представляет важнейший механизм модуляции синаптической передачи. Во многих случаях кратковременная и долговременная модуляция синаптической передачи связана с активацией протеинкиназы А и последующей модификацией синаптических белков и субъединиц ионных каналов (H.Kuromi, Y.Kidokoro, 2000; C.Chen, W.G.Regehr, 1997). Было предположено, что цАМФ опосредует усиление секреции медиатора при действии экзогенного СО.



Рис. 11. Роль гуанилатциклазной системы в эффектах СО вызванную секрецию медиатора.

Изменение квантового состава ТКП на фоне действия CO (96 мкМ), СО на фоне 8Br-cGMP (100 мкМ), СО на фоне действия ингибиторов гуанилатциклазы LY-83583 (30 мкМ) и ODQ (0.1 мкМ). [Ca2+]0 - 0.2-0.4 мМ, * - p<0.05.

На фоне действия 8Вr-cAMP СО не вызывал достоверных квантового состава ТКП (Рис.12 А, В). На фоне ингибирования аденилатциклазы MDL-12330A (10 мкМ) CO также не проявлял своих эффектов (Рис. 12 Б).

Таким образом, 8Вr-cAMP имитировал действие СО, а ингибирование аденилатциклазы предотвращало эффект СО на вызванную секрецию медиатора. По-видимому, увеличение внутритерминального уровня цАМФ является основным механизмом действия СО на вызванное освобождение медиатора.

Исследование роли цГМФ-зависимых фосфодиэстераз в эффектах монооксида углерода на вызванное освобождение ацетилхолина. Эффекты СО могут быть связаны с изменением уровня внутриклеточного цАМФ в двигательном нервном окончании, посредством изменения активности цГМФ-зависимых фосфодиэстераз (ФДЭ). Аппликация СО в присутствии блокатора ФДЭ II EHNA приводила к повышению квантового состава ТКП до 266.7±19.7% (n=5; p<0.05). Как видно из Рис.13 этот эффект не отличался от эффекта СО в контрольных условиях (без предварительной аппликации EHNA).

...