Тейхоевые кислоты и гликополимеры актиномицетов: разнообразие структур, таксономические и экологические аспекты

Размещено на http://www.allbest.ru/

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

тейхоевые кислоты и гликополимеры актиномицетов: разнообразие структур, таксономические и экологические аспекты

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТУЛЬСКАЯ ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

Москва, 2009 г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные консультанты: доктор биологических наук

Евтушенко Людмила Ивановна

доктор биологических наук, профессор

Нетрусов Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Зенова Галина Михайловна.

доктор биологических наук, профессор

Эль-Регистан Галина Ивановна

доктор химических наук, профессор

Бакиновский Леон Владимирович

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится «____» ____________ 2009 г. на заседании диссертационного совета Д.501.001. 21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «____» _____________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Пискункова Н.Ф.

Общая характеристика работы

Состояние вопроса и актуальность проблемы.

На поверхности бактериальной клетки экспонированы углеводные остатки, входящие в состав биополимеров клеточной стенки (Наумова и Шашков, 1997; Shibaev, 1987; Sutcliffe, 1994; Weidenmaier and Peschel, 2008). Эти полимеры часто имеют весьма сложную структуру и играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизма. Нейтральные и кислые полисахариды, тейхуроновые кислоты, у которых углеводные остатки соединены между собой ковалентными связями, являются типичными представителями гликополимеров клеточных стенок. Моносахаридные остатки присутствуют в основном гликополимере бактериальной клеточной стенки - пептидогликане, а также в уникальных соединениях, характерных только для клеточных стенок грамположительных бактерий - тейхоевых кислотах и сахар-1-фосфатных полимерах, мономерные звенья которых объединены фосфодиэфирными связями.

Исследование структур тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок важно как в фундаментальном, так и научно-прикладном аспектах. Выявление и описание новых структур представляет интерес в связи с оценкой разнообразия биополимеров, пониманием их функций в микробной клетке и путей их биосинтеза, а также распространения у различных микроорганизмов в связи с вопросами эволюции. Исследование структур поверхностных полимеров способствует также пониманию механизмов взаимодействия бактерий внутри микробного сообщества и с внешней средой, в том числе с высшими организмами. Весьма актуальны исследования этих биополимеров микроорганизмов в медицинском аспекте. Их углеводная составляющая отвечает за биологическое распознавание поступающих извне веществ (например, лекарств), а также определяет самые разнообразные процессы клеточного узнавания, в том числе, имеющих ключевое значение при развитии многих заболеваний человека и животных, включая бактериальные и вирусные инфекции, рак, воспаления и др. (Дмитриева и др., 2007; Нифантьев, 2008; Weidenmaier and Peschel, 2008). Одним из направлений исследований тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок бактерий, получившим развитие в последние годы, является так называемое “хемотаксономическое” - изучение распространения и структур полимеров в связи с фундаментальными задачами развития естественной системы микроорганизмов и решения практичесих задач идентификации.

К началу наших исследований среди вышеупомянутых полимеров наиболее изученными были тейхоевые кислоты. С момента их открытия у лактобацилл в 50-е годы ХХ века в лаборатории профессора Джеймса Бэддили (Baddiley and Matias, 1954; Baddiley et al., 1956) проводились работы, связанные с изучением структурного разнообразия, путей биосинтеза и функций тейхоевых кислот у бактерий. Эти работы в основном были выполнены на представителях родов Bacillus*, Lactobacillus и Staphylococcus (Baddiley et al., 1962 a,b; 1972; Karamata et al., 1972; 1987; Archibald, 1974; Doyle et al., 1975; Hancock and Baddiley, 1976; Rodgers and Taylor, 1978; Yokoyama et al., 1987; Mauлl et al., 1989 и др.). Было также обнаружено, что организмы разных видов содержат различные по структуре тейхоевые кислоты, (Baddiley et al., 1961; Davison and Baddiley, 1964; Archibald et al., 1968; Baird-Parker, 1970), и была высказана идея о возможности использования данных полимеров в таксономических целях (Fiedler et al., 1981; Schleifer and Stackebrandt, 1983).

Огромный вклад в изучение разнообразия структур и распространения тейхоевых кислот у представителей различных таксонов порядка Actinomycetales внесли приоритетные работы Заслуженного деятеля науки Российской Федерации, профессора Ирины Борисовны Наумовой с сотрудниками (Наумова, 1964; 1973; 1979; Евтушенко и др., 1984; Наумова и Шашков, 1997; Naumova et al., 1980; Naumova, 1988; Naumova et al., 2001), ведущиеся в течение многих лет на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ в сотрудничестве со специалистами Института органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН и Института биохимии и физиологии им. Г.К. Скрябина РАН (отдел «Всероссийская коллекция микроорганизмов»).

Представители порядка Actinomycetales (актиномицеты) выделяются среди других прокариот размерами (до 9 млн. п.о.) и организацией генома, особенностями фенотипа, в т.ч., разнообразием морфологии и химических компонентов клетки и клеточной стенки. Актиномицеты также превосходят другие известные группы бактерий по способности синтезировать биологически активные соединения. Они являются продуцентами свыше половины из более 10000 антибиотиков и других соединений, известных к настоящему времени (Грачева, 2003; Goodfellow et al., 1988; Anderson and Wellington, 2001; Watve et al., 2001). Все вышесказанное способствовало повышенному интересу к этой группе микроорганизмов со стороны различных специалистов, прежде всего биотехнологов, микробиологов-систематиков и молекулярных биологов, что, в свою очередь, определило более успешное развитие системы актинобактерий по сравнению с другими группами пркариот.

Создание филогенетической схемы прокариот, и актинобактерий в частности, стало возможным благодаря внедрению в микробиологию молекулярно-генетических методов и определению нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. Филогенетические древа, однако, не могут быть использованы непосредственно для построения иерархической системы (Калакуцкий, 2006; Stackebrandt and Swings, 2005). Выделение новых и ревизия ранее описанных таксонов осуществляется с учетом разносторонних согласующихся данных филогенетического и фенотипического характера (принцип полифазной таксономии). Информация о фенотипе особенно важна для обоснования выделения новых таксонов родового и видового уровней и уточнения границ между таксонами.

Изучение хемотаксономических признаков (тип клеточной стенки, тип пептидогликана, состав менахинонов, жирных кислот фосфолипидов) сыграло ключевую роль в развитии системы классификации актиномицетов в «домолекулярную эру». Отличия организмов по хемотаксономическим признакам зачастую являются определяющими при обосновании выделения нового рода или вида актиномицетов и в настоящее время. Вместе с тем, многие полимеры и крупные молекулы клетки не изучены или слабо исследованы в таксономическом аспекте. В этой связи актуальны работы, направленные на поиск и оценку таксономической значимости новых биомолекул и их структурных компонентов - особенно в связи с выделением из природной среды массивов новых микроорганизмов, обособляющихся от изветсных таксонов на уровне генотипа, но неотличимых от них по традиционно используемым в систематике актиномицетов фенотипическим, в т.ч., хемотаксономическим, признакам.

К настоящему моменту определены структуры тейхоевых кислот и показана возможность использования этих полимеров и их структурных компонентов в качестве хемотаксономических маркеров видов ряда родов актиномицетов, например, Agromyces (Гнилозуб, 1994), Actinomadura, Nonomurea, Brevibacterium (Потехина, 2005). Эти и другие работы продемонстрировали также огромное структурное разнообразие тейхоевых кислот и гликополимеров в этой группе бактерий и перспективность дальнейших исследований в данном направлении.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования - изучение распространения и разнообразия тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок у представителей порядка Actinomycetales и оценка коррелятивных связей между наличием и структурой вышеназванных полимеров, с одной стороны, и таксономическим положением и свойствами организмов, с другой.

Среди основных задач исследования можно выделить следующие:

1. Изучение распространения тейхоевых кислот и других гликополимеров у представителей различных родов актиномицетов, относящихся к 12-ти семействам, 9-ти подпорядкам порядка Actinomycetales (более 100 штаммов).

2. Установление структур тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок исследуемых актиномицетов - представителей некоторых видов родов Nocardiopsis (29 штаммов); Glycomyces (4 штамма); Nocardioides (15 штаммов); Streptomyces (14 штаммов), а также Kineosporia aurantiaca.

3. Анализ полученных результатов и имеющихся в литературе сведений и оценка возможности использования вышеназванных полимеров и их структурных компонентов в качестве химических маркеров таксонов.

4. Выяснение взаимосвязи между структурой тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок стрептомицетов-возбудителей парши обыкновенной картофеля и корнеплодов и их патогенностью.

Научная новизна работы.

Впервые изучено распространение тейхоевых кислот и других гликополимеров в клеточных стенках, а также моносахаридный состав последних у более 100 штаммов, представителей различных родов актиномицетов, относящихся к 12-ти семействам 9-ти подпорядкам порядка Actinomycetales. Впервые найдены тейхоевые кислоты и другие гликополимеры клеточных стенок и установлены структуры полимеров у 63 (из 100) штаммов актиномицетов, относящихся к 28 видам, 5-ти родам 5-ти семейств 5-ти подпорядков порядка Actinomycetales. Обнаружено и описано 15 новых структур упомянутых биополимеров, среди них 11 тейхоевых кислот, 2 кислых полисахарида - полимер и олигомер Kdn (3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновая кислота), тейхуроновая кислота и нейтральный полисахарид. Впервые показана специфичность состава и строения тейхоевых кислот для видов родов Nocardiopsis, Nocardioides, Glycomyces и Streptomyces, что имеет важное значение для усовершенствования системы классификации исследованных групп бактерий. Предложен новый перспективный подход к ревизии таксономической структуры наиболее многочисленного по видовому составу рода Streptomyces, а именно, использование признака “набор и структура тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточной стенки” как критерия границ близких видов. В соответствии с отличиями по составу тейхоевых кислот клеточной стенки и с другими фенотипическими признаками, а также с обособленностью на филогенетическом уровне (анализ 16S рРНК), предложен новый вид Nocardioides prauseri sp. nov. и переописаны виды Nocardioides luteus и Nocardioides albus. Впервые показано, что клеточные стенки стрептомицетов, вызывающих паршу обыкновенную у картофеля и корнеплодов, содержат в клеточных стенках более двух анионных полимеров различных по структуре, среди которых - полимер/олигомер Kdn. Эти полимеры, наряду с фитотоксином такстомином и гидролитическими ферментами, по всей вероятности, могут считаться факторами патогенности, обусловливая специфическую адгезию фитопатогена к растению-хозяину на первых этапах развития инфекции. Выявлен ряд новых фитопатогенных актиномицетов рода Streptomyces, филогенетически и фенотипически отличных от ранее известных возбудителей парши обыкновенной картофеля и корнеплодов.

Практическое значение работы.

Полученные в результате проведенных исследований данные о химическом составе и структурных особенностях тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок фитопатогенных стрептомицетов могут служить основой для будущих исследований молекулярных механизмов взаимодействия фитопатогенов и растения-хозяина и разработки новых методов борьбы с возбудителями заболеваний растений. Полученные данные могут быть использованы для создания более совершенной системы идентификации фитопатогенов. На большом фактическом материале убедительно показано, что признак «наличие/отсутствие тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточной стенки», а также таксономическая специфичность ряда структурных компонентов, выявляемых методами хроматографии, могут быть успешно применены в повседневной микробиологической практике при идентификации микроорганизмов исследованных групп и решении вопроса о границах таксонов. Подкомитетом по систематике подпорядка Micrococcineae Международного комитета по систематике прокариот рекомендовано определять вышеназванные характеристики при описании новых родов и видов соответствующих групп актинобактерий (Shumann et al., 2009).

Значительно пополнены базы данных спектров ЯМР тейхоевых кислот и других гликополимеров бактериальных клеточных стенок, что внесло определённый вклад в гликологию, химическую микробиологию и может быть использовано при анализе структур близких полимеров в биохимической практике.

Полученные данные о структуре, разнообразии и распространении тейхоевых кислот и других гликополимеров в клеточных стенках представителей порядка Actinomycetales востребованы и цитируются в ведущих современных обзорах и монографиях (Lazarevic et al., 2002; Seltmann and Holst, 2002; Neuhaus and Baddiley, 2003; Weidenmaier and Peschel, 2008) и авторитетном международном руководстве по микробиологии - “The Procaryotes” (Kroppenstedt and Evtushenko, 2006). Кроме того, эти данные могут быть включены в курсы по биохимии и микробиологии на биологических факультетах высших учебных заведений.

Основные защищаемые положения диссертации.

? тейхоевые кислоты и гликополимеры широко распространены в клеточных стенках представителей прядка Actinomycetales, однако доминируют тейхоевые кислоты;

? тейхоевые кислоты и гликополимеры клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales проявляют чрезвычайно широкое структурное разнообразие;

? набор и структура тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales являются таксономически значимой фенотипической характеристикой таксонов разных уровней (от подпорядка до вида);

? клеточные стенки фитопатогенных стрептомицетов характеризуются ярко выраженными анионными свойствами, которые обеспечены наличием в них комплекса кислых полимеров гетерогенного состава: тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами с пировиноградной или глутаминовой кислотой в качестве дополнительного кислого компонента, кислыми поли/олигосахаридами;

? выявление новых структур гликополимеров клеточной стенки может служить не только маркером новых видов или подвидов актиномицетов, но и указывать на неизвестные до сего времени экологические функции изучаемых организмов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференция «Регуляция микробного метаболизма» (Пущино, 1989); Международных симпозиумах по биологии актиномицетов (Madison, 1991; Москва, 1994); Всероссийской конференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 1995); Международной конференции «Микробное разнообразие» (Пермь, 1996); Втором съезде Биохимического общества Российской АН, Москва, 1997); Международном симпозиуме «Современные проблемы биохимии микроорганизмов и биотехнологии» (Пущино, 2000); Втором Германо-Польско-Российском съезде по углеводам бактерий (Москва, 2002); Первой Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002); Первом конгрессе FEMS Европейских микробиологов (Ljubljana, 2003); II Московском международном конгрессе по биотехнологии (Москва, 2003); III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов», (Москва, 2004); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005); Международном конгрессе коллекций культур микроорганизмов (Gцslar, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 работ, из них обзор и 24 экспериментальные статьи в рекомендуемых ВАК'ом изданиях; тезисы 20 докладов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста и состоит из введения, 9-ти глав, включающих материалы литературных источников, касающиеся темы данной работы (3 главы обзора литературы), краткой характеристики объектов и методов исследований (одна глава), изложения результатов собственных исследований (4 главы), а также главы, посвященной обсуждению полученных результатов. Кроме того, имеется общее заключение и выводы. Работа содержит 64 таблицы, 54 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 720 ссылок. В Приложении приведён полный список исследованных штаммов актиномицетов с указанием обнаруженных моносахаридов, а также наличия (отсутствия) тейхоевых кислот в их клеточных стенках; таблицы баз данных по ЯМР-спектрам найденных тейхоевых кислот и других гликополимеров.

Содержание работы

Обзор литературы

Тейхоевые кислоты и другие гликополимеры клеточных стенок грамположительных бактерий: структурное разнообразие, распространение и некоторые функции, экологические аспекты.

Главы I, II, III. В литературном обзоре представлены сведения, касающиеся строения бактериальной клеточной стенки; разнообразия структурных вариаций, распространения и некоторых функций тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок грамположительных бактерий. Особое внимание уделено названным полимерам клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales. Приведены сведения, касающиеся современной классификации актиномицетов. Отмечена особая значимость хемотаксономических признаков, отражающих химический состав и строение клетки и клеточной стенки и являющихся одной из наиболее значимых групп фенотипических признаков в систематике актиномицетов. Обоснована актуальность и перспективность изучения тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточной стенки с целью использования для развития системы классификации актиномицетов. Представлены сведения о фитопатогенных стрептомицетах, их видовом составе, а также данные об известных к настоящему времени возможных факторах патогенности, в числе которых некоторые биополимеры клеточных стенок.

Экспериментальная часть

Глава IV. Материалы и методы, использованные в работе. В работе использован ряд микробиологических, химических, биохимических, инструментальных методов исследования. Методики, как правило, были описаны в литературе ранее и модифицированы для решения поставленных в работе задач. Исследовано более 100 штаммов актиномицетов, относящихся к различным родам актиномицетов из 12-ти семейств 9-ти подпорядков порядка Actinomycetales (http://www.bacterio.cict.fr) из различных коллекций микроорганизмов, в том числе ИНА, ВКМ и НИИ картофелеводства БелНАН. Морфологические и культуральные признаки определяли как описано Гаузе и др. (1983). Биомассу, собранную на логарифмической фазе роста, использовали для получения клеточных стенок (Стрешинская и др., 1979). Пептидогликан получали по модифицированному методу (Elliott et al., 1975). Анализ сахаров в кислотных гидролизатах клеточных стенок изучаемых актиномицетов, а также изомеров диаминопимелиновой кислоты в пептидогликане после его кислотного гидролиза, осуществляли методом хроматографии на бумаге сравнением со стандартными образцами (Стрешинская и др., 1989). Фосфолипиды определяли по методу, описанному ранее (Minnikin et al., 1984; O'Donnel et al., 1985). Тейхоевые кислоты (ТК) и гликополимеры экстрагировали 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) из клеточных стенок и обезжиренного мицелия. Очистку проводили на DEAE-Toyopearl 650M в линейном градиенте NaCl (0-0,5 М), методом препаративного высоковольтного электрофореза, а также фракционировали с помощью дробного осаждения этанолом (Tul'skaya et al., 1991).

Таблица 1. Основные продукты кислотного (2 М HCl, 100°, 3 ч) и щелочного (1 М NaOH, 100°, 3 ч) гидролизов изученных ТК.

Gro-глицерин; GroP-глицерофосфат; GroP2-бисфосфат глицерина; Gro2P3-диглицеринтрифосфат; Rbo-рибит; AhRbo-ангидрорибит; RboP-рибитфосфат; AhRboP-ангидрорибитфосфат; RboP2-бисфосфат рибита; Pi минеральный фосфат; ФЭ - фосфорные эфиры; Э3 - см. раздел 5.1.;

* боковой заместитель на остатке полиола или сахарид в коре полимера;

** фосфорные эфиры образуются при наличии заместителей на остатках полиола.

Первичную структуру ТК и гликополимеров, а именно: качественный состав (вид полиола, наличие и природа заместителей, моносахаридный состав), строение мономерных единиц, локализацию фосфодиэфирной связи, изучали химическими методами. Последние основаны на расщеплении молекулы полимера (кислотный, щелочной, ферментативный гидролизы) и изучении качественного и количественного состава полученных фрагментов, подвижности последних в электрическом поле (высоковольтный электрофорез) и в различных хроматографических системах относительно стандартных образцов, способности окрашиваться различными проявителями. Анализируя фосфорные эфиры полиолов, можно предварительно говорить о типе ТК (табл. 1). Абсолютную конфигурацию некоторых заместителей определяли, как описано (Gerwig et al., 1979; Gorshkova et al., 1997; Shashkov et al., 2006). Данные о строении фрагментов анализировали, что позволяло реконструировать структуру полимера (Kelemen and Baddiley, 1961). Молекулярные массы ТК определяли с помощью гельфильтрации на сефадексе G-50 (Tul'skaya et al., 1991). Результаты химических исследований подтверждали методами ЯМР-спектроскопии (Shashkov et al., 2001). Применялись также методы MALDI TOF масс-спектроскопии для определения структуры и молекулярной массы олигомера Kdn (Shashkov et al., 2002 а). Определение патогенности на картофеле и проростках редиса осуществляли по описанному методу (Goyer et al., 1998). Наличие такстомина в культуральной жидкости исследуемого стрептомицета проводили методом тонкослойной хроматографии.

Для определения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК использовали универсальные бактериальные праймеры 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 530f (5'-GTGCCAGCAGCCGCGC) и 1492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT). Определение нуклеотидной последовательности 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, США) в соответствии с предлагаемым фирмой протоколом. Для филогенетического анализа полученную нуклеотидную последовательность гена 16S рРНК изучаемого организма выравнивали с последовательностями типовых и референтных штаммов с помощью программы CLUSTAL W. Эволюционное расстояние рассчитывали по алгоритму (Ohta and Kimura, 1971; Kimura and Ohta 1973). Для ДНК-ДНК гибридизации Н3-меченную ДНК получали с использованием (1',2',5'-3H) дезоксицитидин-трифосфата и ферментов для ник-трансляци N 5500 (Amersham). ДНК-ДНК гибридизацию проводили на мембранных фильтрах (“Hiiu Kalur”, Таллин, Эстония) в оптимальных условиях (раствор Денхарда с 50% формамида (об/об), 50° С, 24 ч), как описано (Tijssen, 1993).

Результаты исследований

Глава V. Разнообразие структур тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок актиномицетов.

Материальной основой выявления разнообразия, различных функций в жизни микроорганизма и возможности применения ТК и гликополимеров клеточных стенок в таксономии актиномицетов является знание структур этих соединений. В настоящей главе приведены сведения, касающиеся установления структур полимеров клеточных стенок актиномицетов, изученных в работе.

5.1. Структуры тейхоевых кислот клеточных стенок видов и подвидов рода Nocardiopsis

В данном разделе приведены структуры ТК клеточных стенок 29 штаммов, принадлежащих 9 видам и подвидам актиномицетов рода Nocardiopsis, установленные нами.

N. dassonvillei ssp. dassonvillei и N. dassonvillei ssp. antarctica. Подробное изучение структуры ТК клеточных стенок с получением и исследованием фосфорных эфиров и гликозида различными химическими методами, определение соотношений компонентов их составляющих, определение молекулярной массы ТК, а также ЯМР-спектроскопические исследования проводили на трех штаммах N. dassonvillei ssp. dassonvillei (ВКМ Ас-797Т, ВКМ Ас-773, IMRU 504), а также N. dassonvillei ssp. antarcticus ВКМ Ас-836T. Позднее аналогичным образом были исследованы ТК 15-ти изолятов из почв Сейшельских островов.

Рис. 1. Повторяющееся звено и схема щелочного гидролиза ТК клеточных стенок N. dassonvillei ssp. dassonvillei и N. dassonvillei ssp. аntarcticа. Возможные пути щелочного гидролиза обозначены ?a? и ?б?

Кислотный гидролиз ТК привел к образованию моно- и бисфосфатов глицерина, галактозамина, глицерина, неорганического фосфора и фосфорного эфира 1 (Э1). Последний был идентифицирован как монофосфорный эфир галактозамина. Основным продуктом HF-деградации полимера был гликозид 1 (Г1), который оказался -GalpNAc-(1>2)-snGro. Наибольшая информация о структуре исследуемого полимера была получена при исследовании продуктов его щелочного гидролиза (рис. 1). При этом образовался ряд эфиров, основными среди которых были: Э2, идентифицированный как -GalpNAc-(1>2)-snGro-(3-P; быстро движущийся к аноду эфир Э3, который содержал два остатка глицерина, один N-ацетилгалактозаминильный остаток и три фосфатных группы [P-3/4)-GalpNAc-(1>2)- snGro-(3-P-1)-snGro-(2-P], а также моно- и бисфосфат глицерина (Э4). В работе рассмотрены пути щелочного гидролиза, имеющие место при небычной структуре полимера, что подтверждает вновь обнаруженную структуру (рис.1).

Независимо было проведено ЯМР спектроскопическое изучение препаратов ТК изучаемых организмов. В составе повторяющегося звена полимера найдены 2-ацетамидо-2-дезокси-в-D-галактопираноза с фосфатным остатком по гидроксилу при С3 и незамещенный остаток глицерина с неэквивалентными фосфатными группами и идентифицированы все сигналы этих остатков в спектре 13С-ЯМР (рис. 1). Оставшиеся три сигнала, несомненно, принадлежали еще одному остатку глицерина, алкилированному по гидроксилу при С2 и фосфорилированному по гидроксилу при С3. Об этом свидетельствовал слабопольный сдвиг сигнала при 80,20 м.д. (СН-группа согласно АРТ-спектру) и его расщепление в дублет, а также уширение пика при 65,55 м.д. и отсутствие расщепления или уширения пика при 62,15 м.д. (СН2-группы). В результате всех экспериментов была реконструирована структура ТК (рис. 1, 6 а). Все 19 изученных штаммов, принадлежащих виду N. dassonvillei ssp. dassonvillei (впоследствии N. antarcticus был переведен в N. dassonvillei ssp. аntarcticа) содержали в клеточной стенке около 20% ТК идентичной уникальной структуры, относящейся к новому IV типу (смешанная структура, Naumova et al., 2001). Молекулярная масса полимера около 6,4 кДа, что соответствует 11-13 повторяющимся поли(глицерофосфат-в-N-ацетилгалактозаминилглицерофосфатным) звеньям. ТК такой структуры дает необычные продукты щелочного гидролиза (рис. 1), включая так называемый фосфодиэфир Э3 (Тульская и др., 1992; Tul'skaya et al., 1993).

N. synnemataformans Ас-2518Т. Продукты кислотного и щелочного гидролизов клеточных стенок и препаратов ТК были аналогичны таковым для N. dassonvillei ssp. dassonvillei. Среди них был и характерный эфир Э3. Это позволило предположить, что препарат из клеточной стенки N. synnemataformans Ас-2518Т содержит ТК идентичную таковой из N. dassonvillei ssp. dassonvillei. Предположение было подтверждено ЯМР-спектроскопическими методами анализа. Однако анализ одномерного 31Р ЯМР-спектра и корреляционных пиков в двумерном 1Н,31Р HМQC спектре обнаружили отличия в структурных фрагментах, содержащих фосфор: -1)-snGro-(3-P-3)--GalpNAc-(1 и -1)-snGro-(3-P-4)--GalpNAc-(1.

Таким образом, в клеточной стенке N. synnemataformans Ас-2518Т обнаружены две ТК: основная - поли(глицерофосфат--N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат), такая же как у N. dassonvillei ssp. dassonvillei и минорная - поли(глицерофосфат--N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат), в которой фосфодиэфирная связь осуществляется по гидроксилам при С3 глицерина и С4 -N-ацетилгалактозамина, причём цепь не несёт никаких заместителей; ТК такой структуры (рис. 6 б) обнаружена впервые (Tul'skaya et al., 2007).

N. halotolerans Ас-2519Т. Профили кислотного и щелочного гидролизов клеточной стенки и препарата ТК из нее соответствовали таковым для N. synnemataformans Ас-2518Т. Кроме того, была идентифицирована пировиноградная кислота. Таким образом, можно было предположить, что и в данном случае имеем дело с ТК, подобной таковой из N. dassonvillei ssp. dassonvillei. Некоторую неясность вносило наличие пировиноградной кислоты. Локализовать фосфодиэфирные связи, а также место присоединения пировиноградной кислоты удалось лишь с помощью ЯМР-спектроскопических методов.

Характерной особенностью спектра ЯМР 13С препарата было наличие в нем пиков с химическими сдвигами 26,2 м.д. (СН3 группа согласно АРТ) и 174,2 м.д. (С=О), что с учетом сигнала при 100,2 м.д., принадлежащего четвертичному атому углерода (тест на число присоединенных протонов, АРТ, Patt and Shoolery, 1982), позволяло предположить наличие пируватных остатков в полимере. В спектре ЯМР 13С сигналы одного из остатков -GalpNAc имели химические сдвиги С4 и С6 отличные от соответствующего остатка со свободными гидроксилами при С4 и С6. Эти отличия были характерными для замещения остатка пируватом по С4 и С6 (Jansson et al, 1993), что позволяло локализовать пируватную группировку при соответствующих атомах углерода в части остатков -GalpNAc полимерной цепи препарата. Химический сдвиг 13С метильной группы пируватного остатка (26,2 м.д.) свидетельствовал об экваториальной ориентации метильной группы в шестичленном 4,6-ацетальном цикле (R-конфигурация ацетального центра). Анализ двумерных спектров ЯМР, включая спектр 1Н,31Р HМQC показал, что большая часть (90%) остатков -GalpNAc-4,6-R-Pyr имеют фосфатную группу по гидроксилу при С3, остальные остатки, находящиеся, по-видимому, на растущем конце цепи, несут при С3 свободный гидроксил. Помимо перечисленных структурных фрагментов в препарате обнаружены фрагменты с -GalpNAc, несущей фосфатные группы по гидроксилам при С4 и С3, но без пируватной группировки в последней. Приблизительное соотношение остатков с пируватом -Р-3)--GalpNAc-4,6-R-Pyr и без пирувата -Р-3)--GalpNAc, найденное по интегральным интенсивностям соответствующих сигналов в спектре ЯМР 13С, составляло 3,5 : 1. Соотношение остатков с фосфатной группировкой по гидроксилам при С3 и С4 -N-ацетилгалактозамина определено как 10,5 : 1.

Таким образом, в клеточной стенке N. halotolerans Ас-2519Т обнаружены две ТК. Основная поли(глицерофосфат--N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат), с пировиноградной кислотой по гидроксилам при С4,6 галактозамина. ТК такой структуры найдена впервые. Минорная - соответствовала таковой из N. synnemataformans Ас-2518Т (рис. 6 в, Tul'skaya et al., 2007).

N. alba ВКМ Ас-1883Т, ВКМ Ас-1879 и ВКМ Ас-1884. Результаты изучения структур ТК трех штаммов актиномицетов вида N. alba были идентичны для всех трех штаммов за исключением некоторых количественных отличий. Кислотные гидролизаты препаратов содержали глицерин, рибит, фосфорные эфиры этих полиолов и глюкозамин, что позволило предположить присутствие нескольких ТК. На это указывали данные электрофоретического исследования препаратов: были обнаружены три фосфорсодержащие зоны с подвижностью: фракция I - mGroP 1,4; фракция II - mGroP 1,57; фракция III - mGroP 1,96. Очистку и разделение ТК, выделенных из обезжиренного мицелия, осуществляли методом ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M. Были получены три фракции, содержащие фосфор (рис. 2).

Рис.2. Ионообменная хроматография препарата ТК клеточной стенки N. alba Ас-1879 на DEAE Toyopearl 650M в линейном градиенте NaCl (00,5 М) в 50 мМ Tris-HCl-буфере, рН 7,2 (колонка 16.5х500 мм; скорость протока 2 мл/мин; объем фракции 4 мл); I, II, III фракции тейхоевых кислот

Фракция I, элюирована при 0,16-0,19 М NaCl. Продукты кислотной и щелочной деградации указывали на поли(рибитфосфатную) природу ТК1 без заместителей (табл. 1). При периодатном окислении ТК1 образовался формальдегид в эквимольном

Рис. 3. Определение молекулярной массы ТК клеточной стенки N. alba (сефадекс G-50, колонка 9909,5 мм; объем фракции 2 мл).

Стандартные вещества: (1) -ТК Streptomyces antibioticus, 7,0 кДа (Shashkov et al., 1979); (2) - ТК S. violaceus, 4,0 кДа (Наумова и др., 1969); (3) - ТК S. azureus, 3,3 кДа (Стрешинская и др., 1981); (4) - монофосфат глицерина; _ - ТК1; Д -ТК2; ? - ТК3 отношении к фосфору, что указывало на необычное положение фосфодиэфирной связи. Исходя из имеющихся данных о биосинтезе ТК [от соответствующего нуклеотида к растущей цепи переносится D-рибит-5-фосфат (Baddiley, 1972)], в образовании фосфодиэфирной связи должна участвовать гидроксильная группа при С5 рибита. Тогда вторая гидроксильная группа, участвующая в образовании фосфодиэфирной связи, находится при С3 рибита. Молекулярная масса полимера составила 5,6 кДа (рис. 3), соответственно, цепь полимера состояла из 26-27 рибитфосфатных звеньев. Предполагаемая структура подтверждена методами ЯМР-спектроскопии. Таким образом, ТК 1 представляла собой незамещенный 3,5-поли(рибитфосфат) и являлась новой структурой, рис. 6 ж, (Tul'skaya et al., 1995).

Фракция II, элюирована при 0,22 М NaCl. Профили кислотного и щелочного гидролизов фракции указывали на поли(глицерофосфатную) природу ТК2 (табл. 1), в состав которой в качестве заместителя входит глюкозамин. В HF-гидролизатах ТК2 обнаружен гликозид, идентифицированный как GlcpNAc-(1>2)-snGro. Учитывая структуру гликозида, а также факт образования при щелочном гидролизе полимера щелочестабильных фосфодиэфиров глицерина, был сделан вывод, что ТК2 является 1,3-поли(глицерофосфатом), в котором часть глицериновых остатков замещена N-ацетилглюкозамином. Молекулярная масса ТК2 составляла 7,6 кДа, что соответствует, исходя из мольного содержания компонентов полимера, 40-41 глицерофосфатному звену (рис. 3). Спектр 13С-ЯМР ТК2 был типичным для замещенного на 10% б-N-ацетилглюкозамином 1,3-поли(глицерофосфата), рис. 6 з, (Tul'skaya et al., 1995).

Фракция III, элюирована при высокой концентрации NaCl (~ 0,3 М). Это указывало на бьльший отрицательный заряд ТК3 из этой фракции, чем у ТК1 и ТК2 (рис. 2), что подтверждадено высокой подвижностью ТК3 в электрическом поле (mGroP 1,96). Продукты кислотного гидролиза свидетельствовали о поли(рибитфосфатной) природе ТК3 (табл. 1), а идентифицированная при этом пировиноградная кислота, видимо, являлась заместителем в молекуле изучаемой ТК. Устойчивость ТК3 к действию щелочи свидетельствовала об отсутствии свободных гидроксильных групп, соседних с фосфодиэфирными группами (Kelemen and Baddiley, 1961), а устойчивость к периодатному окислению указывала на отсутствие в полимере незамещенных гликольных группировок. Можно было предположить, что рибитные остатки замещены пировиноградной кислотой, связанной кетальной связью, которая стабильна в щелочных условиях (Thurow et al., 1975). Молекулярная масса ТК3 составляла 5,4 кДа, что соответствует примерно 18 повторяющимся звеньям (рис. 3).

ЯМР-спектроскопическое исследование подтвердило предполагаемую структуру: 1,5-поли(рибитфосфат) полностью замещенный по гидроксилам при С2,4 рибита кетально связанной пировиноградной кислотой (рис. 6 и). ТК такой структуры выявлена впервые (Tul'skaya et al., 1995).

Соотношения найденных ТК в клеточных стенках трех изучаемых штаммов, установленные при количественном определении глицерина и рибита в них с учетом полного замещения рибитных остатков пировиноградной кислотой в ТК3, разные. Является ли этот факт штаммовым признаком - предмет дальнейших исследований на большей выборке штаммов одного вида.

N. prasina ВКМ Ас-1880Т. В кислотных гидролизатах клеточной стенки и ТХУ-препарата обнаружены фосфорные эфиры глицерина и рибита, что могло свидетельствовать о присутствии нескольких ТК. Разделение и очистку ТК, выделенной из целого обезжиренного мицелия, осуществляли с помощью метода ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M. Были получены две фосфорсодержащие фракции.

ТК из фракции I (элюирована при 0,17 М NaCl) и фракции II (элюирована при 0,22 М NaCl) соответствовали таковым из клеточных стенок N. alba, что было подтверждено химическими и ЯМР-спектроскопическими методами исследования (рис. 6 ж, з). ТК1 представляла собой незамещенный 3,5-поли(рибитфосфат), но с бульшей молекулярной массой ? 9,4 кДа, что соответствует 41 рибитфосфатной единице. ТК2 являлась 1,3-поли(глицерофосфатом), на 10% замещенным б-N-ацетилглюкозамином и на 5% О-ацетильными остатками, последнее, также как и несколько мйньшая молекулярная масса (6,0 кДа, что соответствовало 33 глицерофосфатным единицам), отличало эту ТК от ТК2 из N. alba (Тульская и др., 2000).

N. composta ВКМ Ас-2520 и N. composta ВКМ Ас-2521T. Продукты кислотного и щелочного гидролизов клеточных стенок этих организмов, также как и препаратов ТК из них свидетельствовали о глицерофосфатной природе ТК (табл. 1), замещенной глюкозамином. Образовавшиеся при HF-гидролизе гликозид, идентифицированный как GlcpNAc-(1>2)-snGro, а при щелочном гидролизе фосфодиэфир глицерина с N-ацетилглюкозамином, указывали, что данные ТК являются 1,3-поли(глицерофосфатами), замещёнными глюкозамином, что было подтверждено ЯМР-спектроскопическими методами. По интегральной интенсивности сигналов концевых и срединных остатков длина 1,3-поли(глицерофосфатной) цепи была оценена в 10 единиц.

Итак, клеточные стенки N. compostа ВКМ Ас-2520 и N. compostа ВКМ Ас-2521T содержали единственную ТК - 1,3-поли(глицерофосфат), на 10% замещённый -N-ацетилглюкозамином (Tul'skaya et al., 2007).

N. metallica ВКМ Ас-2522T. В кислотных гидролизатах клеточных стенок и препарата ТК найдены фосфорные эфиры рибита, пировиноградная кислота, а также в небольшом количестве фосфорные эфиры глицерина. Это указывало на возможное присутствие нескольких ТК, что подтверждали данные электрофоретического исследования: обнаружены две фосфорсодержащие зоны с подвижностью I mGroP 0,93 и II mGroP 1,27. Препарат из клеточной стенки был подвергнут ЯМР-спектроскопическим исследованиям.

Основные сигналы спектра ЯМР 13С препарата были идентифицированы как принадлежащие 1,5-поли(рибитфосфату) с 2,4-пируват-кетальными заместителями. Минорные сигналы в спектре принадлежали полимеру с 1,3-поли(глицерофосфатными) цепями, где часть (30%) глицериновых остатков замещена по гидроксилу у С-2 остатками -GlcpNAc. Мольное соотношение основного и минорного полимеров оценено как 7,5 : 1.

Итак, клеточная стенка N. metallica ВКМ Ас-2522T содержала две ТК. Основная - 1,5-поли(рибитфосфат), каждая рибитфосфатная единица которого несёт 2,4-кетально связанную пировиноградную кислоту и минорная - 1,3-поли(глицерофосфат) на 30% замещённый -N-ацетилглюкозамином, рис. 6 з, и (Tul'skaya et al., 2007).

N. trehalosi ВКМ Ас-942. В продуктах кислотного гидролиза клеточной стенки и ТК из нее кроме фосфорных эфиров глицерина была обнаружена глюкоза. Полимер частично гидролизовался щелочью с образованием небольшого количества моно- и бисфосфатов глицерина. Молекулярная масса полимера составила около 8,0 кДа, что соответствует приблизительно 40 глицерофосфатным звеньям.

В 13С ЯМР-спектрах ТК идентифицированы все сигналы, характерные для 1,3-поли(глицерофосфата) на 60% замещенного в-глюкозильными остатками, рис. 6 д, (Стрешинская и др., 1998).

5.2. Структуры тейхоевых кислот клеточных стенок видов рода Glycomyces

В настоящем разделе приведены структуры ТК клеточных стенок 4-х штаммов, принадлежащих двум валидно описанным видам (Labeda et al., 1985) рода Glycomyces, установленные нами.

G. rutgersensis ВКМ Ас-1248. Профиль кислотного гидролиза клеточной стенки и ТК (табл. 1) соответствовал наличию поли(глицерофосфата), а обнаружение в гидролизатах глюкозы предполагало замещение остатков глицерина этим сахаром. ТК была полностью устойчива к щелочному гидролизу, что указывало на полное замещение полимера глюкозой. В продуктах HF-гидролиза идентифицирован гликозид Г1, определенный как б-глюкозилглицерин, с гликозидной связью по гидроксилу при С2 глицерина и С1 глюкозы. Молекулярная масса ТК составила около 6,0 кДа, что, учитывая структуру полимера, составляет 19-20 повторяющихся звеньев. Таким образом, предположительно ТК была 1,3-поли(глицерофосфатом) полностью замещенным б-глюкозой (такая конфигурация гликозидного центра глюкозы найдена впервые у актиномицетов) по гидроксилу при С2 глицерина, что было подтверждено методами ЯМР-спектроскопии (Тульская и др., 1993).

G. harbinensis ВКМ Ас-1247Т, G. harbinensis NRRL 16897 и G. harbinensis IFO 14487T. Качественный состав компонентов клеточных стенок всех трех штаммов был одинаков. В кислотных гидролизатах клеточных стенок и выделенных из них ТК были обнаружены фосфорные эфиры глицерина и глюкоза. В продуктах HF-гидролизе ТК всех трех штаммов обнаружено по два гликозида: Г1 - б-глюкопиранозил-(1>2)-глицерин и Г2 - б-глюкопиранозил-(1>1)-глицерин. Обнаружение двух гликозидов свидетельствовало о присутствии в клеточных стенках двух ТК (ТК1 и ТК2), имеющих одинаковый поли(глицерофосфатный) кор и одинаковые заместители - б-глюкопиранозу, которая присоединена к глицериновым остаткам по-разному. Фосфодиэфирную связь в полимерах локализовали с помощью ЯМР-спектроскопии. Таким образом, в трех штаммах G. harbinensis обнаружено по две ТК: ТК1 - 1,3-поли(глицерофосфат), полностью замещенный по гидроксилу при С2 глицерина остатками б-глюкозы; а также ТК2 - 2,3-поли(глицерофосфат) с остатками б-глюкозы по гидроксилу при С1 глицерина (Тульская и др., 1993; Потехина и др., 1998).

5.3. Структуры тейхоевых кислот клеточных стенок видов рода Nocardioides

В этом разделе представлены сведения о структурах ТК, обнаруженных нами у изученных представителей рода Nocardioides (Prauser, 1976).

N. albus ВКМ Ас-805Т. Продукты кислотного гидролиза клеточных стенок и препарата ТК из них свидетельствовали о наличии ТК глицерофосфатной природы (табл. 1), имеющей заместители (обнаружены галактоза, глюкоза и пировиноградная кислота). Отсутствие среди них дифосфата глицерина и обнаружение в щелочных гидролизатах лишь монофосфорного эфира глицерина (Э1) указывало на поли(гликозилглицерофосфатную) природу ТК (табл.1). Эфир Э1 состоял из монофосфата глицерина, галактозы, глюкозы и пировиноградной кислоты в эквимолярном количестве. Вероятно, Э1 являлся основным повторяющимся звеном ТК. Полная структура полимера была установлена ЯМР-спектроскопическими методами. Сигналы при 70,6-72,2 и 67,85 м.д. были типичными для резонанса С1 и С3 глицериновых остатков в спектре поли(гликозилглицерофосфатной) цепи с гликозильными заместителями при С1 глицерина (Naumova et al., 1990). Сигналы при 25,9 (СН3-С), 101,9 (О-С-О) и 174,7 м.д. (С=О) были идентифицированы как принадлежащие остатку пировиноградной кислоты, локализованному в положениях 4,6 пиранозы (Шашков и др., 1992). Сигналы при 22,0 и 176,7 м.д. принадлежали О-ацетильным группам. Сигнал малой интенсивности при 109,1 м.д. обнаруживал присутствие -галактозы в фуранозной конфигурации (Bock and Pedersen, 1983). Спектры выявили присутствие -галакто- и -глюкопираноз как главных углеводных компонентов полимера. Было определено также, что -галактофураноза является минорным сахарным компонентом полимера, соотношение -Galp и -Galf составляет 7:1 (рассчитано по интенсивности сигналов при 104,2 + 102,5 м.д. и 109,1 м.д.). Таким образом, основная повторяющаяся единица полимера имеет следующую структуру:

OAc(0,5)

2

-3)--D-Galp-(11)-snGro-(3-P-

4

-D-Glcp(4,6Pyr)-1

-галактопиранозильные остатки О-ацетилированы по гидроксилу при С2 примерно на 50%. Остаток -галактофуранозы, вероятно, является терминальным на растущем конце цепи полимера и служит сигналом для прекращения его роста. Возможность существования галактофуранозного -1,6-связанного олигомера на конце цепи подтверждается анализом ТК из клеточной стенки N. luteus другого вида этого рода. ТК указанной структуры обнаружена впервые (Шашков и др., 1999; Tul'skaya et al., 2003).

N. luteus ВКМ Ас-1246Т и 12 других штаммов с идентичной ТК. Профиль продуктов кислотного гидролиза клеточной стенки и ТК из неё указывал на наличие ТК поли(рибитфосфатной) природы с галактозой и пировиноградной кислотой в качестве заместителей (табл. 1). Среди продуктов HF-гидролиза ТК был выявлен гликозид Г1 и идентифицирован как галактозилглицерин. При щелочном гидролизе, кроме фосфорных эфиров рибита (табл.1), найдены эфиры Э1 (основной) и Э2 (минорный, подробно не изучен), имеющие одинаковый качественный состав. Э1 был монофосфатом галактозилрибита с пировиноградной кислотой. Локализация фосфодиэфирных связей и пировиноградной кислоты, наличие О-ацетильных групп (?20%) при гидроксилах по С3 рибита, конфигурация гликозидной связи и ее положение установлены с помощью ЯМР-спектроскопии, кроме того, было показано наличие -1,6-связанного олигомера, состоящего ? из 6 остатков галактофуранозы (соотношение Galp:Galf составляло 3(5) : 1). Молекулярная масса ТК составила 8,6-8,9 кДа, что соответствовало 18-ти повторяющимся звеньям.

-1-Rbo-5-P-

4

-D-Galp(4,6 Pyr)-1

ТК данной структуры обнаружена впервые (Шашков и др., 2000 ; Tul'skaya et al., 2003):

«N. albus». ВКМ Ас-806. В клеточных стенках этого штамма с использованием химических и ЯМР-спектроскопических методов были обнаружены как минимум две ТК. ТК1 - такая же по структуре как и в N. luteus, однако соотношение Galp:Galf составляло 1 : 1, и ТК2 - полимер поли(рибитфосфатной) природы с рамнозой в качестве заместителя (Tul'skaya et al., 2003).

5.4. Структуры анионных полимеров клеточных стенок некоторых видов рода Streptomyces

К началу наших исследований наибольшее количество ТК было изучено именно у представителей рода Streptomyces (Наумова, Шашков, 1997), относящихся к различным филогенетическим и фенотипическим группам. В настоящей работе были исследованы представители близких видов этого рода.

S. castelarensis ВКМ Ас-832Т (ранее S. rutgersensis ssp. сastelarensis). В кислотных гидролизатах клеточной стенки и препарата анионных полимеров из нее обнаружен глицерин и его фосфорные эфиры, глюкозамин, лизин, галактоза. Разделение в электрическом поле препарата полимеров, выделенном из клеточной стенки, выявило две фосфорсодержащие зоны, что свидетельствовало о наличии как минимум двух ТК поли(глицерофосфатной) природы. Было предпринято дробное выделение полимеров из целого обезжиренного мицелия с последующим дробным осаждением 96%-ным этанолом и очисткой методом переосаждения в ледяной воде. Это позволило получить препараты, преимущественно содержащие ту или другую ТК. Дополнительную очистку ТК осуществляли методом ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M в линейном градиенте NaCl.

Препарат 1, имеющий электрофоретическую подвижность mGroP 1,2-1,3, при кислотном и щелочном гидролизах дал продукты, характерные для незамещенной глицеринтейхоевой кислоты 1,3-типа (табл. 1). Мольное соотношение фосфор - глицерин было 1 : 1. Следовало иметь ввиду присутствие в этом препарате незамещенного 2,3-поли(глицерофосфата), так как последний дает аналогичные результаты при его химических исследованиях, за исключением диглицеринтрифосфата при щелочном гидролизе. Вопрос был решен ЯМР-спектроскопическими методами.

Препарат 2, с электрофоретической подвижностью mGroP 0,9, в составе кислотных гидролизатов имел глицерин и его фосфорные эфиры, глюкозамин и лизин. HF-гидролиз препарата 2 привел к образованию двух гликозидов: Г1 - GlcpNAc-(1>2)-snGro и Г2 - GlcpNН-(1>2)-snGro и фрагмента цепи ТК - Lys-(1>2)-Gro. Эти данные в совокупности с результатами изучения продуктов щелочного гидролиза препарата 2, среди которых были найдены два фосфодиэфира глицерина с глюкозамином, причем лишь один из фосфодиэфиров был нингидрин положительным, привели к предположению, что ТК из этого препарата является 1,3-поли(глицерофосфатом) частично замещенным глюкозамином, только часть остатков которого ацетилирована. Молекулярная масса этой ТК составила 6,0 кДа, что соответствует ~25 глицерофосфатным единицам.

Независимо оба препарата были исследованы методом ЯМР-спектроскопии. В результате химическими и ЯМР-спектроскопическими исследованиями удалось установить, что клеточная стенка S. castelarensis ВКМ Ас-832Т содержит набор различных ТК. Минорные - незамещенные 1,3- и 2,3-поли(глицерофосфаты), основная - 1,3-поли(глицерофосфат), треть мономеров имеет по гидроксилам при С2 глицерина глюкозаминильные остатки, только часть которых N-ацетилирована. ТК такой структуры найдена впервые (Tul'skaya et al., 1991).

S. melanosporofaciens ВКМ Ас-1864Т, S. hygroscopicus ВКМ Ас-831Т, S. violaceusniger ВКМ Ас-583Т, S. endus ВКМ Ас-1331Т, S. endus ВКМ Ас-129. Продукты кислотного и щелочного гидролизов клеточных стенок и суммарных препаратов из них свидетельствовали (табл. 1) о присутствии 1,3-поли(глицерофосфата), а обнаруженные галактоза и глюкозамин - что ТК, замещена сахарными остатками. Электрофорез выявил три фракции, которые были накоплены методом препаративного электрофореза, элюированы, лиофилизованы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (mGroP 1,3-1,4) представляла собой, скорее всего, смесь свободных 1,3- и 2,3-поли(глицерофосфатных) цепей (Тульская и др., 1997), о чем свидетельствовали продукты ее кислотного и щелочного гидролизов (табл. 1). Фракция 2 (основная ТК, mGroP 0,82-0,9) - идентифицированы 1,3-поли(глицерофосфатные) цепи, частично замещенные б-глюкозамином, причем часть глюкозаминильных остатков N-ацетилирована в той или иной степени (кроме штамма Ас-1864Т, в ТК которого все глюкозаминильные остатки N-ацетилированы). В продуктах деградации основной ТК из S. hygroscopicus, S. endus Ас-1331Т и Ас-129, S. violaceusniger с помощью гидроксамовой реакции были обнаружены О-ацетильные остатки. Фракция 3 имела электрофоретическую подвижность mGroP 0,3 и окрашивалась реактивом Ишервуда в серый цвет. При кислотном гидролизе обнаружена галактоза, а также в следовом количестве продукты деградации ТК из фракции 2 - это свидетельствовало о том, что последняя не была основным компонентом этой фракции.