Тейхоевые кислоты и гликополимеры актиномицетов: разнообразие структур, таксономические и экологические аспекты

Суммарные препараты клеточных стенок каждого исследуемого стрептомицета были изучены методами ЯМР-спектроскопии. Эти исследования подтвердили предварительные предположения, основанные на химических методах. Таким образом, клеточные стенки исследуемых стрептомицетов содержали одновременно четыре анионных углеводсодержащих полимера. Три ТК: незамещенные 1,3- и 2,3-поли(глицерофосфаты) и 1,3-поли(глицерофосфат) с большей или меньшей степенью замещения остатками б-глюкозамина, часть которых N-ацетилирована (табл. 6). Четвертый - обнаруженный впервые в природе полимер Kdn, замещенный в-Galp, состоящий ~ из 20 мономерных звеньев (Тульская и др.. 2007а).

Итак, ТК данной группы стрептомицетов были аналогичны таковым у S. castelarensis ВКМ Ас-832Т, а в клеточных стенках последнего была также найдена галактоза, поэтому было предпринято повторное исследование препаратов полимеров этого штамма на предмет обнаружения полимера Kdn. В результате методами ЯМР-спектроскопии в препаратах из клеточной стенки S. castelarensis также был идентифицирован полимер Kdn той же структуры, что и у вышеупомянутых штаммов (Тульская и др.. 2007а).

S. sparsogenes ВКМ Ас-1744Т. Профили кислотного и щелочного гидролизов клеточной стенки и препарата ТК свидетельствовали (табл. 1) о присутствии полностью замещенной гликозильными заместителями поли(глицерофосфатной) цепи 1,3-типа. В качестве гликозильных заместителей были выявлены глюкозамин, галактозамин и глюкоза. Дополнительная информация была получена при изучении продуктов гидролиза ТК 47%-ной HF. Идентифицировано два соединения. Соединение 1 было идентично GlcpNAc-(1>2)-snGro, полученному нами ранее из ТК2 S. castelarensis. Соединение 2 содержало галактозамин и глюкозу. ЯМР-спектроскопические исследования препарата из клеточной стенки и соединения 2 позволили установить повторяющуюся единицу основной ТК:

в-D-Glcp-(1>3)-б-D-GalpNAc-(1>3)-в-D-GalpNAc-(1>6)-б-D-GlcpNAc-1

v

2

-1)-sn-Gro-(3-P-

ТК такой структуры обнаружена впервые (Шашков и др., 1998). Электрофорез выявил присутствие минимум двух ТК в клеточной стенке стрептомицета: кроме основной ТК обнаружено минорное количество незамещенного 1,3-поли(глицерофосфата), что было подтверждено ЯМР-спектроскопическим исследованием. Молекулярная масса основной ТК составила 9,8 кДа, что соответствует приблизительно 11 повторяющимся звеньям.

Streptomyces sp. ВКМ Ас-2274 (=МБ-8). Продукты кислотного и щелочного гидролизов клеточной стенки и ТХУ-препарата указывали на присутствие 1,3-поли(глицерофосфатных цепей), табл. 1, а обнаружение галактозы, 3-О-метилгалактозы (мадурозы), глюкозамина предполагало, что либо эти сахариды являются заместителями в молекуле ТК, либо они образуют некий гликополимер. ТХУ-препарат в электрическом поле разделился на три фракции, которые были накоплены и исследованы отдельно.

Фракция 1 (минорная, mGroP 1,3). При кислотном гидролизе идентифицированы моно-, бисфосфаты глицерина и неорганический фосфат. Образование таких же продуктов, а также диглицеринтрифосфата при щелочном гидролизе могло свидетельствовать о том, что фракция 1- незамещенный 1,3-поли(глицерофосфат) (Kelemen and Baddiley, 1961). Фракция 2 (основная, mGroP 0,82). После кислотного гидролиза обнаруживались глицерин, его моно- и бисфосфаты, неорганический фосфат и глюкозамин. Изучение продуктов HF- (гликозид Г1) и щелочного гидролизов (фосфодиэфир Э1) привело к предположению, что ТК этой фракции - 1,3-поли(глицерофосфат), частично замещенный -N-ацетилглюкозамином. Фракция 3 (mGroP 0,56). Окрашивалась реактивом Ишервуда в серый цвет. Кислотный гидролиз привел к образованию, галактозы, 3-O-метилгалактозы, а также следовых количеств продуктов деградации ТК из фракции 2. Следовательно, ТК не являлась основным полимером этой фракции.

Суммарный препарат полимеров, а также фракции 2 и 3 исследовали ЯМР-спектроскопическими методами, кроме того, фракция 3 была подвергнута MALDI TOF масс-спектроскопическому анализу. В результате проведенных исследований оказалось, что клеточная стенка исследуемого стрептомицета содержит в своем составе две ТК. Основная - 1,3-поли(глицерофосфат), на 60% замещенный -D-N-ацетилглюкозамином; минорная - незамещенный 1,3-поли(глицерофосфат). Кроме того - олигомер 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновой кислоты (Kdn), имеющий следующую структуру:

(-D-Galp3OMe) -D-Galp-1 1--D-Galp3OMe (-D-Galp)

9 9

-Kdn-(24)--Kdn

Кислый олигосахарид такой структуры обнаружен впервые (Shashkov et al., 2002).

Streptomyces sp. МБ-2, МБ-5, МБ-6, МБ-7, МБ-10. В кислотных гидролизатах клеточных стенок были идентифицированы рибит, его моно- и бисфосфаты, ангидрорибитфосфат, неорганический фосфат, ангидрорибит, глюкоза, галактозамин, пировиноградная кислота (для трех штаммов: МБ-2, МБ-5, МБ-6), а также неидентифицированное нингидрин-положительное соединение. Кислотный гидролизат суммарных препаратов из клеточных стенок этих стрептомицетов содержал тот же набор продуктов. Однако количество глюкозы было бьльшим, чем количество рибитфосфата во всех случаях, кроме МВ-5. Полученные данные однозначно свидетельствовали о наличии рибиттейхоевой кислоты с глюкозой в составе суммарных препаратов, и не исключали присутствия полимеров иного строения, в структуру которых также входит глюкоза. Таким образом, можно было предположить, что эти организмы содержат в клеточных стенках похожий набор анионных полимеров. Электрофорез суммарных препаратов из каждого организма в отдельности выявил несколько фракций, которые были накоплены методом препаративного электрофореза, элюированы, лиофилизированы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (mGroP 1,3), стрептомицеты MB-2, MB-5, MB-6. Продукты кислотного гидролиза (табл. 1) свидетельствовали о том, что фракция 1, вероятно, является 1,5-поли(рибитфосфатом), несущим остатки пировиноградной кислоты. Предположение было подтверждено данными ЯМР-спектроскопического анализа. Фракция 2, (mGroP 0,9-1,1), все 5 стрептомицетов. Профили продуктов кислотного и щелочного гидролизов этой фракции указывали на поли(рибитфосфатную) природу ТК из нее. Образование при щелочном гидролизе фосфорного эфира, идентифицированного как глюкозилрибитфосфат, а при HF-гидролизе гликозида, определенного как глюкозилрибит, свидетельствовало о том, что полимером фракции 2, вероятно, являлся 1,5-поли(рибитфосфат), замещенный глюкозой, что было подтверждено ЯМР-спектроскопическими исследованиями. Фракция 3 (mGroP 0,45-0,52), для 4-х стрептомицетов, кроме МБ-10. Кислотный гидролиз привел к образованию галактозамина, а также неидентифицированного нингидрин положительного соединения, и, кроме того, следовых количеств продуктов деградации ТК из фракции 2. Структура полимера этой фракции была установлена методами ЯМР-спектроскопии для каждого организма. Это была тейхуроновая кислота: >4)-в-D-ManpNAcA-(1>3)-б-D-GalpNAc-(1>, найденная ранее (Шашков и др., 2001) у стрептомицетов. Фракция 4 (mGroP 0,34), для всех стрептомицетов, за исключением МВ-5. Окрашивалась реактивом Ишервуда в серый цвет, в кислотных гидролизатах этой фракции найдена глюкоза и неидентифицированное соединение, окрашивающееся азотнокислым серебром. Структура полимера этой фракции была расшифрована с помощью ЯМР-спектроскопических исследований. Им оказался полимер 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновой кислоты (Kdn), замещенный -глюкозой (Shashkov et al., 2000).

Итак, клеточные стенки 5-ти стрептомицетов содержали по два-четыре анионных углеводсодержащих полимера. Среди них ТК: 1,5-поли(рибитфосфат), разной степени замещения в-Glcp, встречающийся во всех изученных организмах; а также 1,5-поли(рибитфосфат), несущий кетально связанную по гидроксилам при С2-С4 рибита пировиноградную кислоту, который был обнаружен в клеточных стенках лишь трех (МБ-2, МБ-5, МБ-6) стрептомицетов. Для 4-х изученных организмов характерно наличие в клеточных стенках тейхуроновой кислоты. Клеточные стенки почти всех изученных стрептомицетов (кроме МБ-5) содержат полимер Kdn, замещенный в-Glcp (табл. 9, Тульская и др, 2003).

Streptomyces sp. ВКМ Ас-2534 (=Ив-219). Продукты кислотного гидролиза клеточной стенки и суммарного препарата полимеров указывали на присутствие ТК поли(рибитфосфатной) природы (табл. 1), видимо, с глюкозой и глюкозамином в качестве заместителей, а также неидентифицированного нингидрин положительного соединения. Электрофорез суммарного препарата привел к разделению на две фракции, которые были накоплены электофоретически, элюированы, лиофилизированы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (mGroP 1,10), минорная, содержала ТК рибитфосфатной природы, вероятно, несущей в качестве заместителей глюкозу и глюкозамин, о чем свидетельствовали продукты кислотного гидролиза (табл. 1). При аммонолизе фракции образовались лизин и амид лизина, последний, по-видимому, входил в структуру ТК. Изучение продуктов дефосфорилирования (HF-гидролиз) привело к обнаружению двух гликозидов, идентифицированных как: Г1 - глюкозилрибит; Г2 - N-ацетилглюкозаминилрибит. Можно было предположить, что полимер этой фракции представляет собой 1,5-поли(рибитфосфатную) ТК, отдельные рибитфосфатные остатки которой несут глюкозу, в то время как другие - замещены N-ацетилглюкозамином. Фракция 2 (mGroP 0,52), преобладающая, была проявлена реактивом Ишервуда в виде белого пятна на фореграмме. Кислотные гидролизаты этой фракции содержали лишь следовые количества продуктов деградации фракции 1, а также неидентифицированное нингидрин положительное соединение. Таким образом, ТК не являлась основным компонентом этой фракции.

Тип фосфодиэфирной связи, положение гликозильных заместителей и их конфигурация в ТК фракции 1, а также структура полимера из фракции 2 были определены с помощью ЯМР-спектроскопии.

Таким образом, было доказано, что клеточная стенка изучаемого фитопатогенного стрептомицета содержит два анионных углеводсодержащих полимера. Минорный полимер - ТК, 1,5-поли(рибитфосфатные) цепи которой несут по гидроксилам при С-2(4) рибита в-глюкопиранозу, однако некоторые рибитфосфатные звенья полимера замещены в-N-ацетилглюкозамином, нарушая тем самым его регулярность. Второй полимер, преобладающий, представлял собой тейхуроновую кислоту, повторяющейся единицей которой является дисахарид:

4)--D-Manp2,3NAcyA-(13)--D-GalpNAc-(1, где Acy - ацетил или L-Glu

Полимер такой структуры обнаружен впервые у грамположительных бактерий (табл. 9, Тульская и др., 2007б).

5.5. Тейхоевая кислота и полисахарид клеточной стенки Kineosporia aurantiaca ВКМ Ас-702Т.

К началу наших исследований имелись сведения (Евтушенко и др., 1984) о том, что клеточная стенка Kineosporia aurantiaca ВКМ Ас-702Т, представителя семейства Kineosporiaceae подпорядка Frankineae, содержит ТК глицерофосфатной природы. Однако структурные исследования последней, а также возможных других гликополимеров, имеющихся в ней, ранее не проводили.

В кислотных гидролизатах клеточной стенки и суммарного препарата из неё обнаружены галактоза и манноза, а также некоторое количество глицерина, его моно- и бисфосфатов, неорганический фосфат и глюкозамин. Электрофорез суммарного препарата обнаружил наличие двух фракций, которые были накоплены методом препаративного электрофореза, элюированы, лиофилизированы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (минорная, mGroP 0,93) при кислотном гидролизе дала продукты, позволяющие предположить наличие глицеринтейхоевой кислоты, замещенной глюкозамином (табл. 1). Ценная информация о структуре ТК была получена при изучении фосфорных эфиров, полученных после щелочного гидролиза фракции 1, а также гликозидов, полученных после ее обработки 47%-ной HF. Полученные продукты гидролизов, изученные по схеме, приведенной для S. сastelarensis, оказались идентичными таковым для названного стрептомицета. Таким образом, следовало думать, что полимер из фракции 1 является 1,3-поли(глицерофосфатом) частично замещенным б-глюкозаминильными остатками, только часть которых N-ацетилирована. Это предположение было подтверждено ЯМР-спектроскопическими исследованиями. Фракция 2 (основная) была электронейтральна и проявлена на фореграмме AgNO3 в нейтральной области. При кислотном гидролизе найдены галактоза и манноза в соотношении ~ 1 : 2. Абсолютная конфигурация галактозы и маннозы определена методом ГЖХ после их превращения в ацетилированные (S)-октан-2-ил гликозиды сравнением с октан-2-ил D-гликопиранозами (Gerwig et al., 1979). Эти результаты показали, что данная фракция вероятнее всего содержит нейтральный полисахарид. Структура последнего была полностью расшифрована с помощью ЯМР-спектроскопии.

Моносахаридная последовательность в повторяющейся единице полисахарида установлена на основании анализа 1H, 1H ROESY и 1H, 13C HMBC спектров:

>3)-в-d-Galp-(1>6)-в-d-Manp-(1>4)-в-d-Manp-(1>3)-в-d-Galp-(1>4)-в-d-Manp-(1>4)-в-d-Manp-(1>.

Одинаковая D-конфигурация каждого из моносахаридных остатков подтверждена при определении гликозилирующих эффектов в 13C ЯМР спектрах полисахарида (Lipkind et al., 1988; Shashkov et al., 1988). Структура данного нейтрального полисахарида описана впервые (Tul'skaya et al., 2005).

Анализ собственных результатов и литературных данных указывает на широкое распространение тейхоевых кислот в клеточных стенках представителей порядка Actinomycetales: более 80% всех изученных нами к настоящему времени штаммов актиномицетов содержат эти полимеры, причем до 70% всех обнаруженных тейхоевых кислот составляют глицеринтейхоевые кислоты. Рибиттейхоевые кислоты менее распространены в клеточных стенках бактерий. И, наконец, тейхоевые кислоты, содержащие другие полиолы (эритрит, арабит, маннит, 6-О-метил-галактит) в коре полимера, выявлены у актиномицетов в редких случаях, рис. 4.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Известные в настоящее время полиолы, входящие в состав тейхоевых кислот.

Заметим, что именно для глицеринтейхоевых кислот обнаружено наибольшее разнообразие (рис. 4.) в локализации фосфодиэфирных связей: 1,3- и 2,3-поли(глицеринфосфаты), поли(гликозилглицеринфосфаты), поли(глицеринфосфат-гликозилглицеринфосфаты). Недавно найден новый тип тейхоевых кислот: поли(ацилгликозилглицерофосфат), фосфодиэфирная связь в котором осуществляется по гидроксилу при С2 глицериновой кислоты, ацилирующей хиновозамин в коре полимера, и гидроксилу при С3 остатка глицерина (Козлова и др., неопубликованные данные).

Итак, глицеринтейхоевые кислоты наиболее широко распространены в природе, и среди них выявлено наибольшее разнообразие структур.

Интересные данные были получены в наших совместных работах с сотрудниками группы чл.-корр. РАН И.С.Кулаева (Кулаев и др., 1996; Степная и др., 1997, 2004). Бактерии с глицеринтейхоевой кислотой были практически не подвержены действию комплекса литических ферментов, тогда как наличие рибиттейхоевой и/или тейхуроновой кислот приводило к усиленному лизису микроорганизмов. Возможно, глицеринтейхоевые кислоты защищают микробную клетку от лизиса.

Являются ли глицеринтейхоевые кислоты наиболее значимыми для выживания микроорганизмов в их экологической нише по сравнению с другими тейхоевыми кислотами, в коре которых имеются другие полиолы, предмет дальнейших исследований.

Глава VI. Тейхоевые кислоты клеточных стенок как видоспецифический маркер актиномицетов.

Ранее было показано успешное применение признака “наличие тейхоевых кислот” для разделения стафилококков и микрококков (Schleifer and Stackebrandt, 1983): первые содержат ТК, вторые - нет. Идея о возможности использования ТК в систематике актиномицетов была выдвинута впервые немецкими исследователями для рода Brevibacterium (Fiedler et al., 1981) и развита в работе И.Б.Наумовой (Naumova, 1988).

Участие ТК клеточных стенок в жизненно важных процессах, происходящих в живой бактериальной клетке (Neuhaus and Baddiley, 2003; Weidenmaier and Peschel, 2008), их колоссальное структурное разнообразие (см. Главу V, обзоры: Наумова и Шашков, 1997; Потехина, 2006; Naumova et al., 2001), детерминированное информацией, содержащейся в кодирующих их генах (Lazarevic et al., 2002), а также их широкое распространение в грамположительных бактериях (наши данные; Weidenmaier and Peschel, 2008), с очевидной вероятностью демонстрируют возможность их применения в систематике бактерий.

С начала 70-х годов в таксономической практике успешно используется строение пептидогликана (Schleifer and Kandler, 1972) - основного гликополимера клеточной стенки прокариот. Тогда как таксономическая значимость структур ТК и других гликополимеров клеточной стенки с таксономической точки зрения не оценена в полной мере, поскольку до сих пор не проводилось направленного анализа с целью обнаружения коррелятивных связей между наличием и структурой ТК и гликополимеров клеточных стенок актиномицетов и таксономическим статусом последних. К настоящему времени показана возможность использования тейхоевых кислот в качестве видоспецифического маркера для представителей родов Agromyces (Гнилозуб, 1994), Actinomadura, Nonomurea и Brevibacterium (Потехина, 2005).

В настоящей главе анализируются полученные автором и литературные данные о структурных типах и подтипах ТК, обнаруженных в клеточных стенках представителей нескольких родов актиномицетов (Nocardiopsis, Glycomyces, Nocardioides, Streptomyces), принадлежащих 4-м различным семействам четырех подпорядков порядка Actinomycetales.

6.1. Структуры и набор тейхоевых кислот клеточных стенок как видоспецифические маркеры видов и подвидов рода Nocardiopsis.

В данном разделе проанализированы собственные результаты (29 штаммов) и литературные данные (5 штаммов) исследования клеточных стенок 34 штаммов, принадлежащих к 13 видам и подвидам рода Nocardiopsis (семейство Nocardiopsaceae, подпорядок Streptosporangineae, Fisher et al., 1983; Yassin et al., 1993; 1997; Evtushenko et al., 2000; Al-Zarban et al., 2002; Kдmpfer et al., 2002). Структуры и комбинация ТК в клеточных стенках актиномицетов рода Nocardiopsis хорошо коррелируют с филогенетической группировкой этих организмов, основанной на данных анализа генов 16S рРНК и данными ДНК-ДНК гибридизации. С другой стороны, филогенетически близкие организмы (сходство генов 16S рРНК до 99,9%) различаются по составу анионных полимеров.

Таблица 2. Тейхоевые кислоты клеточных стенок видов и подвидов рода Nocardiopsis.

Тейхоевая кислота

N. dassonvillei ssp. dassonvillei

N. synnematofor-mans

N. halotolerans

N. dassonvillei ssp. albirubida 1

N. alba (3 strains)

N. listeri 2

N.metallicа

N. prasina

N. lucentensis 2

N.compostа

N. trehalosi

N.tropica 3

Группа N. dassonvillei

Группа N. alba

Поли(глицерофосфат-в-N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат)/ связь -3-P-3 -

Поли(глицерофосфат-в-N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат)/ связь -3-P-4 -

Поли(глицерофосфат-в-N-ацетилгалактозаминил-глицерофосфат)/ связь -3-P-3 -, с пируват-кетальной группой

Поли(глицерофосфат-в-N-ацетилгалактозаминил-глицерофосфат)/ связь -3-P-4 - , с O-сукцинильным остатком

Незамещенный 3,5-поли(рибитфосфат) ТК1

1,5-Поли(рибитфосфат) с 2,4- пируват-кетальной группой ТК3

1,3-Поли(глицерофосфат) с -N-ацетилглюкозамином ТК2

1,3- Поли(глицерофосфат) с в-глюкозой

1,5- Поли(рибитфосфат) с боковыми глицерофосфатными олигомерами

1 Шашков и др, 1997; 2 Стрешинская и др., 1998; 3 Стрешинская и др., 1996.

основная (преобладающая) тейхоевая кислота

Рис. 5. 13С ЯМР-спектры ТК клеточных стенок видов и подвидов Nocardiopsis.

Таблица 3. Дифференцирующие характеристики видов и подвидов рода Nocardiopsis, основанные на сравнении продуктов химической деградации общей фракции ТК или клеточных стенока).

Продукты химической деградации

N. dassonvillei ssp. dassonvillei

N. synnematofor-mans

N. halotolerans

N. dassonvillei ssp. albirubida 1

N. alba (3 штамма)

N. listeri 2

N.metallicа

N. prasina

N. lucentensis 2

N.compostа

N. trehalosi

N.tropica 3

Группа N. dassonvillei

Группа N. alba

Кислотный гидролиз

Глицерин Рибит Глюкоза Глюкозамин Галактозамин Пировиноградная кислота Янтарная кислота

+

+

+ + +

+ +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + +

+ +

+ +

+ +

+ +

Щелочной гидролиз

Глицерин GroP, GroP2 Рибит RboP, RboP2 RboP3 Э3б) Фосфодиэфир Gro c GlcNAc

сл + +

сл + +

сл + +

сл +

+ + сл + +

+ + сл +

+ + сл +

+ + сл + +

+ + +

+ + +

+ + + + +

а) +, присутствует; , отсутствует; б) Фосфодиэфир содержит два остатка глицерина, один - N-ацетилгалактозамин и три фосфатных группы: P-(3/4)-GalpNAc-(1>2)-snGro-3-P-1-snGro-2-P; 1 Шашков и др, 1997; 2 Стрешинская и др., 1998; 3 Стрешинская и др., 1996.

В первую группу (табл. 2) N. dassonvillei (N. dassonvillei ssp. dassonvillei, N. synnematаformans, N. halotolerans, N. dassonvillei ssp. albirubida) входят организмы, содержащие в клеточной стенке уникальный, обнаруженный только у представителей этого рода поли(полиолфосфатгликозилполиолфосфат). Штаммы вида N. dassonvillei ssp. dassonvillei, имеют единственную ТК с фосфодиэфирной связью между глицерином и аминосахаром по (-3-P-3-). Два вида N. synnematаformans и N. halotolerans, содержат по две ТК: минорную - с фосфодиэфирной связью между глицерином и аминосахаром по (-3-P-4-) и основную - N. synnematаformans, как и у N. dassonvillei ssp. dassonvillei, а N. halotolerans - ТК с кетально связанным пируватом; и, наконец, подвид N. dassonvillei ssp. albirubida (Шашков и др, 1997), имеет единственную ТК с фосфодиэфирной связью между глицерином и аминосахаром по (-3-P-4-), но несущую сукцинильный остаток по гидроксилу при С3 аминосахара.

Во вторую группу (табл. 2) N. alba (N. alba, N. prasina, N. composta, N. metallica, N. listeri, N. lucentensis) объединяются виды, содержащие в клеточных стенках различный набор полимеров: ТК1, ТК2 и ТК3 (табл. 2). При одинаковом наборе ТК имеются выраженные количестванные различия в их содержании (основная или минорная ТК, N. listeri и N. metallicа), а также степени замещения и длине цепи полимера (N. lucentensis и N. composta). Два других изученных организма этого рода N. tregalosei и N. tropica (Стрешинская и др., 1996) содержат в клеточной стенке ТК иных структур (табл. 2), имеют низкую степень филогенетического родства как между собой, так и с N. dassonvillei и с N. alba.

Следует отметить, что именно на этой группе организмов впервые показана возможность использования 13С ЯМР-спектров как фингерпринтов для идентификации видов и подвидов рода Nocardiopsis (рис. 5).

Кроме того, виды и подвиды рода Nocardiopsis отличаются по набору и комбинации продуктов кислотного гидролиза как самих полимеров, так и нативных клеточных стенок, которые могут быть легко определены с использованием методов хроматографии (табл. 3). Определение некоторых специфических продуктов щелочного гидролиза полимера или нативной клеточной стенки расширяет таксономические возможности при использовании этого подхода. Например, N. alba и N. listeri, которые характеризуются похожими профилями продуктов кислотной деградации (табл. 3), можно отличить друг от друга по наличию в щелочных гидролизатах их клеточных стенок моно- и бисфосфатов рибита у N. alba.

6.2. Структуры и набор тейхоевых кислот клеточных стенок как видоспецифический маркер актиномицетов рода Glycomyces

В данном разделе проанализированы собственные результаты исследования клеточных стенок 5 штаммов трех видов рода Glycomyces (семейство Glycomycetaceae подпорядок Glycomycineae): G. harbinensis (три штамма) и G. rutgersensis, а также G. tenuis, правомочность выделения которых подтверждена данными ДНК-ДНК гибридизации и анализа последовательностей 16S рРНК генов (Labeda et al., 1985).

Виды рода Glycomyces хорошо идентифицируются при сравнении набора и структур ТК клеточных стенок, установленных химическими и ЯМР спектроскопическими методами (табл. 4). Вид G. tenuis характеризуется наличием в клеточных стенках редко встречающейся эритриттейхоевой кислоты (Potekhina et al., 1993).

Таблица 4. Тейхоевые кислоты клеточных стенок видов рода Glycomyces.

Тейхоевая кислота	G. tenuis	G. rutgersensis	G. harbinensis (три штамма)
1,4-Поли(эритритфосфат), замещенный по С2(3) эритрита -глюкозамином
1,3-Поли(глицерофосфат), замещенный по С2 глицерина -глюкозой ТК1
2,3-Поли(глицерофосфат), замещенный по С1 глицерина -глюкозой ТК2

Для вида G. rutgersensis характерным оказался 1,3-поли(глицерофосфат) практически полностью замещенный по гидроксилам при С2 глицерина -глюкозой, а в клеточных стенках у всех штаммов вида G. harbinensis были обнаружены одновременно две ТК: 1,3-поли(глицерофосфат), замещенный по гидроксилам при С2 глицерина -глюкозой (ТК1) и 2,3-поли(глицерофосфат), замещенный по гидроксилам при С1 глицерина -глюкозой (ТК2), причем количественное соотношение этих двух ТК варьировало в зависимости от штамма (см. ниже).

И в данном случае в качестве дифференцирующих характеристик видов можно использовать продукты кислотной (HCl и HF) и щелочной деградации как самих полимеров, так и нативных клеточных стенок изучаемых организмов: глицерин, эритрит, глюкоза, глюкозамин, различные гликозиды - все эти соединения могут быть легко определены с использованием методов хроматографии и электрофореза.

Изучение спектров 13С ЯМР ТК клеточных стенок видов рода Glycomyces показало, что они значительно различаются между собой (рис. 6), поэтому соответствующие им полимеры можно идентифицировать при наличии соответствующих баз данных по химическим сдвигам.

Характерными явились химические сдвиги в аномерной области атомов углерода при 99,7 м.д. (рис. 6). Учитывая интегральные интенсивности сигналов углеродных атомов ТК1 и ТК2, было вычислено, что в клеточной стенке G. harbinensis NRRL 16897 ТК2 в два раза больше, чем ТК1. Анализ гликозидов, полученных из клеточных стенок двух других штаммов G. harbinensis IFO 14487T и G. harbinensis ВКМ Ас-1247Т показал, что ТК1 и ТК2 находятся в них примерно в одинаковом количестве. Следует учесть, что все три исследуемых штамма были выращены в стандартных условиях - до середины логарифмической фазы роста. Эти данные, вероятно, можно расценивать как штаммовые различия внутри вида G. harbinensis, выявленные с помощью ЯМР-спектроскопических методов анализа.

тейхоевый кислота гликополимер клеточный



Рис. 6. 13С ЯМР спектры ТК клеточных стенок видов рода Glycomyces. Вверху - для G. rutgersensis, внизу - для G. harbinensis.

6.3 Структуры и набор тейхоевых кислот клеточных стенок как видоспецифические маркеры видов и подвидов рода Nocardioides

Род Nocardioides (семейство Nocardioidaceae, подпорядок Propionibacterineae) был предложен в 1976 году Г. Праузером (Prauser, 1976) для нокардиоформных актиномицетов с Nocardioides albus в качестве типового вида.

В данном разделе проанализированы собственные результаты обследования клеточных стенок 17 штаммов из этого рода, принадлежащих, как было установлено, к 5-ти видам.

Предварительные исследования клеточных стенок видов рода Nocardioides показали, что ТК, наличие которой определяли по образовавшимся фосфорным эфирам после кислотного гидролиза клеточных стенок, присутствует у N. albus, N. luteus, N. prauseri и N. jensenii, тогда как у N. plantarum - нет. Структуры ТК установлены для видов N. albus, N. luteus и «N. albus» (см. раздел 5.3.), образующих хорошо развитый ветвящийся вегетативный мицелий, и характеризующихся высокой степенью сходства по морфологии и некоторым физиологическим признакам.

В работе изучены образующие мицелий изоляты с белыми колониями (ВКМ Ac-562, ВКМ Ac-563, ВКМ Ac-564, ВКМ Ac-565, ВКМ Ac-566, ВКМ Ac-567, ВКМ Ac-568), выделенные из почв разных регионов. Вследствие большого сходства с видом N. albus (колонии белого цвета и некоторые физиологические признаки) эти изоляты были описаны как штаммы названного вида (Евтушенко и Зеленкова, 1989).

Однако все изученные изоляты содержали в клеточных стенках ТК, идентичную таковой из клеточных стенок N. luteus ВКМ Ас-1246Т, что предполагало их ближайшее родство именно с данным видом.

Изучение ДНК-ДНК гомологии показало, что все упомянутые изоляты имеют 37-45% сходства с N. albus ВКМ Ac-805T, тогда как с N. luteus ВКМ Ас-1246Т - 63-74%, что указывало на их принадлежность к тому же геномовиду (Wayne et al., 1987), что и ВКМ Ас-1246Т.

Кроме того, обнаружено, что и другие изученные в работе штаммы рода Nocardioides (ВКМ, рабочая коллекция: ВКМ AcW-29146, AcW-29169, AcW-29196, а также DSM 46114, DSM 46115) содержали в клеточных стенках ТК полностью идентичную таковой из клеточных стенок N. luteus ВКМ Ас-1246Т, и, следовательно, также скорее всего принадлежали к виду N. luteus - очевидно, наиболее распространенному в природе виду этого рода.

Полученные результаты показали, что члены двух геномовидов, N. albus и N. luteus (включающий штаммы с белой окраской колоний), легко дифференцируются по структуре их ТК, а также по некоторым компонентам их клеточных стенок, таким как рибит и глицерин, которые легко определяются хроматографически в гидролизатах клеточных стенок.

Таким образом, наши исследования позволили уточнить диагноз двух видов рода Nocardioides:

Nocardioides albus. В дополнение к признакам, данным Г.Праузером (1976, 1989), вид характеризуется наличием в клеточных стенках галактозы и глицерина и содержит ТК. ТК является поли(галактозилглицерофосфатом), в котором -D-галактопиранозильные остатки по гидроксилам при С4 замещены -D-глюкопиранозой, несущей по гидроксилу при С4,6 кетально связанную пировиноградную кислоту S-конфигурации; соотношение пиранозной и фуранозной форм галактозы 7 : 1.

Nocardioides luteus В дополнение к признакам, данным Г.Праузером (1984, 1989): вид характеризуется белой или желтой окраской воздушного мицелия; клеточнык стенки содержат галактозу, рибит и ТК. ТК является 1,5поли(рибитфосфатом), замещенным -D-галактопиранозой, несущей по гидроксилу при С4,6 кетально связанную пировиноградную кислоту R-конфигурации, соотношение пиранозной и фуранозной форм галактозы от 3 : 1 до 5 : 1.

Штамм “Nocardioides albus” ВКМ Ас-806 был выделен и описан Г. Праузером. Он характеризовался обильно ветвящимися гифами, растущими на поверхности и внутри агаризованных сред и образовывал нерегулярно ветвящийся или неветвящийся воздушный мицелий. И первичный, и воздушный мицелий распадался на неправильные палочковидные или кокковидные фрагменты, не способные к движению. Цвет колоний был белый, организм не синтезировал кислоту из L-рамнозы и сахарозы. На основании этих свойств он был причислен к виду Nocardioides albus.

Однако уровень сходства ДНК с обоими референтными типовыми штаммами оказался низким и составил: 36,0% с N. аlbus ВКМ Ас-805 Т и 52,2% с N. luteus ВКМ Ac-1246T. Это свидетельствовало о том, что N. аlbus ВКМ Ас-806 представлял собой третий геномовид, и его таксономическое положение, таким образом, оставалось неопределенным.

Кроме того этот штамм отличался как от N. аlbus, так и от N. luteus по составу клеточной стенки (от последнего вида - в меньшей степени).

Так в клеточной стенке ВКМ Ас-806 обнаружено по меньшей мере две ТК: одна из которых полностью идентична рибиттейхоевой кислоте из клеточной стенки N. luteus, за исключением того, что соотношение Galp:Galf составляло 1:1, вторая имела поли(рибитфосфатную) природу, с рамнозой в качестве заместителя. Таким образом, штамм ВКМ Ас-806 дифференцирован от N. luteus соотношением Galp и Galf (1Н ЯМР-спектр, сигналы при 5,34 и 5,04 м.д.) и присутствием бьльшего количества рамнозы в гидролизатах ТК или клеточной стенки (см. раздел 5.3.). Эту разницу легко установить методами хроматографии или ЯМР-спектроскопией, сигнал при 18 мд (рис. 7).

Рис. 7. 13С ЯМР-спектры ТК клеточных стенок видов Nocardioides.

От N. аlbus штамм ВКМ Ас-806 хорошо дифференцируется по наличию рибита и рамнозы (см. раздел 5.3., рис. 7) в гидролизатах ТК или клеточных стенок, которые также легко определяются методами хроматографии.

13С ЯМР-спектры ТК для представителей данного рода могут являться фингерпринтами при идентификации видов (рис. 7).

Принимая во внимание все обнаруженные различия в хемотаксономических признаках изученных видов, а также данные об их ДНК-ДНК гибридизации (36,0-52,2%), также как и существующее определение этих актинобактерий (Wayne et al., 1987), нами был предложен новый вид в составе рода Nocardioides, названный Nocardioides prauseri sp. nov, в честь германского микробиолога Гельмута Праузера, который внес большой вклад в систематику актиномицетов и описание рода Nocardioides (Tul'skaya et al., 2003).

Таким образом, клеточные стенки изученных представителей видов рода Nocardioides содержали ТК разной структуры, что подтверждает видоспецифичность структур ТК внутри этого рода. Наличие пировиноградной кислоты и в-галактофуранозы в структуре полимеров может являться признаком, характерным для изучаемого рода.

6.4 Тейхоевые кислоты клеточных стенок как хемотаксономический маркер кластер-вида “Streptomyces violaceusniger”

Род Streptomyces семейства Streptomycetaceae является в настоящее время наиболее многочисленным по видовому составу среди бактерий (включает более 500 видов). На протяжении многих лет стрептомицеты как продуценты новых биологически активных природных соединений зачастую необоснованно описывались как новые виды в связи с патентованием, и к началу 70-х годов род насчитывал около 3000 видов, большинство из которых не были включены в Список одобренных наименований (Anderson and Wellington, 2001; Kдmpfer, 2006). Достоверная дифференциация близких видов и описание новых внутри групп филогенетически близких организмов по-прежнему остаётся неразрешенной проблемой в терминах традиционных фенотипических характеристик. К одной из таких групп относится фенокластер “S. violaceusniger” (включающий виды S. violaceusniger, S. Castelarensis, S. melanosporofaciens, S. hygroscopicus, S. еndus и ряд других). Видовой статус перечисленных организмов, характеризующихся серым воздушным мицелием, спиральными спороносцами и складчатой поверхностью спор (Williams et al., 1983а; Al-Tai et al., 1999, подтверждён данными ДНК-ДНК гибридизации (Labeda and Lyons, 1991b; Kumar and Goodfellow, 2008).

Таблица 5. Отличительные характеристики ТК изученных стрептомицетов.

Характеристика	S. melanosporo-faciens ВКМ Ас-1864Т	S. castelarensis ВКМ Ас-832Т	S. hygroscopicus ssp. hygroscopicus ВКМ Ас-831Т	S. endus ВКМ Ас-1331Т	S. endus ВКМ Ас-129	S. violaceusniger ВКМ Ас-583Т	S. sparsogenes ВКМ Ас-1744 Т
Преобладающая ТК3 - 1,3-поли(глицерофосфат) с б-глюкозаминильными заместителями
Степень замещения б-N-ацетилглюкозамином и б-N-глюкозамином, %	57	33	66	50	47	40	-
Доля б-N-ацетил-глюкозамина, %	100	83	83	45	50	55	-
1,3-Поли(глицеро-фосфат) с тетраса-харидом	-	-	-	-	-	-
Продукты HF-гидролиза ТК или клеточных стенок
N-ацетилглюкоз-аминилглицерин
Глюкозаминил-глицерин
Трисахарид

С целью поиска критериев, дифференцирующих фенотипически и филогенетически близкие виды группы “S. violaceusniger” (до 99,8% сходства генов 16S рРНК), было проведено сравнительное изучение ТК их клеточных стенок.



Рис. 8. 13C ЯМР-спектры суммарных препаратов анионных углеводсодержащих полимеров клеточных стенок изучаемых стрептомицетов. а - S. endus ВКМ Ас-1331Т; б - S. endus ВКМ Ас-129; в - S. hygroscopicus ssp. hygroscopicus ВКМ Ас-831Т; г - S. castelarensis ВКМ Ас-832 Т; д - S. violaceusniger ВКМ Ас-583 Т; е - S. melanosporofaciens ВКМ Ас-1864Т; ж - S. sparsogenes ВКМ Ас-1744 Т.

Сходство структуры преобладающей ТК - 1,3-поли(глицерофосфатный) кор с непосредственно присоединенным к остаткам глицерина б-глюкозамином - является еще одним свидетельством того, что филогенетически близкие организмы имеют высокое сходство. Кроме того, клеточные стенки изученных организмов (за исключением филогенетически более удаленного S. sparsogenes) содержали в дополнение к преобладающей ТК незамещенные 1,3- и 2,3-поли(глицерофосфатные) полимеры в минорном количестве. Цепи имеют также О-ацетильные и О-лизильные группы.

Штаммы близких видов кластера “S. violaceusniger” (S. melanosporofaciens, S. castelarensis, S. hygroscopicus, S. endus и S. violaceusniger) имели разную степень замещения основного полимера (66%; 50%; 40%) и различались по соотношению ацетилированных и неацетилированных глюкозаминильных заместителей (83%; 45%; 55%), выявляемых методом ЯМР-спектроскопии (табл. 5; рис. 8).

Кроме того, S. melanosporofaciens легко дифференцируется от штаммов видов S. hygroscopicus, S. endus и S. violaceusniger по наличию единственного гликозида в HF-гидролизатах клеточных стенок или суммарного препарата полимеров из нее, определяемого с помощью хроматографических методов.

S. sparsogenes, также входящий в фенокластер “S. violaceusniger” (Williams et al., 1983а), но имеющий шиповатую поверхность спор, значительно отличался от вышеперечисленных видов по составу полимеров, и содержал в клеточной стенке две ТК: минорную - незамещенный 1,3-поли(глицерофосфат) и основную - с тетрасахаридом в качестве заместителя по гидроксилам при С2 остатков глицерина. Впоследствии было показано, что этот вид более удален от других исследованных штаммов и на филогенетическом уровне (Kumar and Goodfellow, 2008).

Следует также отметить, что спектры 13С ЯМР полимеров клеточных стенок представителей фенокластера “S. violaceusniger” в целом имеют некоторые индивидуальные особенности и в данном случае могут быть также использованы как фингерпринты, полезные для дифференциации видов исследуемой группы (рис.8).

Сравнительный анализ собственных результатов исследования организмов рода Streptomyces (представители 3-х фенокластеров, Тульская и др., 1997а; 2003а; 2007а, б; Shashkov et al., 2002a) и литературных данных (5 фенокластеров, работы Стрешинской с соавт.) показывает, что имеется высокая степень корреляции между структурными особенностями тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок, с одной стороны, и генотипическими характеристиками организмов, с другой. Ряд фенокластеров, неоднородных по составу полимеров, гетерогенен также и на филогенетическом (геномном) уровне. Штаммы с высоким сходством ДНК-ДНК (55-70%) имеют практически идентичные анионные полимеры клеточных стенок и могут различаться некоторыми нюансами, например, фенокластер “S. violaceusniger”, кластер-вид Streptomyces griseoviridis, кластер-вид Streptomyces cyaneus и др. Результаты исследований открывают новые возможности в решении задачи по уточнению границ видов и реорганизации таксономической структуры рода Streptomyces в целом на основе полифазного подхода.

Глава VII. Распространение тейхоевых кислот и моносахариды клеточных стенок у представителей порядка Actinomycetales

В связи с огромной ролью, которую играют ТК в жизнедеятельности микробной клетки, а также в связи с таксономической значимостью этих биополимеров, нами были продолжены исследования по изучению распространения ТК в клеточных стенках организмов порядка Actinomycetales. Кроме того, параллельно в клеточных стенках многих из исследованных организмов был изучен моносахаридный состав, что также представляет таксономическую ценность.

Таблица 6. Распространение тейхоевых кислот среди представителей различных таксонов порядка Actinomycetales.

Подпорядок, семейство	ТК	Таксоны имеющие ТК
Подпорядок Streptosporangineae Сем. Nocardiopsaceae Сем. Streptosporangiaceae* Сем. Thermomonosporaceae*	+ + +	Все изученные виды
Подпорядок Glycomycineae Сем. Glycomycetaceae	+	Все виды Glycomyces
Подпорядок Corynebacterineae Сем. Corynebacterineae Сем. Gordoniaceae Сем. Nocardiaceae Сем. Mycobacteriaceae	? ? ? ?
Подпорядок Pseudonocardineae Сем. Actinosynnemataceae Сем. Pseudonocardiaceae	? ?
Подпорядок Frankineae Сем. Geodermatophilaceae* Сем. Frankiaceae* Сем. Kineosporiaceae	? ? В	Kineosporia aurantiaca
Подпорядок Streptomycineae Сем. Streptomycetaceae	В	Все виды Streptomyces; Следы поли(GroP) у Kitasatospora spp.*
Подпорядок Micrococcineae Сем. Brevibacteriaceae* Сем. Rarobacteraceae* Сем. Cellulomonadaceae* Сем. Intrasporangiaceae* Сем. Promicromonosporaceae Сем. Dermabacteraceae* Сем. Microbacteriaceae* Сем. Micrococcaceae*	+ + ? ? ? В В В	Некоторые виды Brachybacterium* Некоторые виды Agromyces* Группа «Arthrobacter nicotinae»*
Подпорядок Micromonosporineae Сем. Micromonosporaceae*	В	Все виды Spirilliplanes Большинство видов Actinoplanes
Подпорядок Propionibacterineae Сем. Nocardioidaceae Сем. Propionibacteriaceae*	+ ?	Aeromicrobium, Nocardioides

В - признак вариабелен у представителей таксона;

* - данные по ряду организмов указанных родов взяты из публикаций: Евтушенко и др., 1984; Наумова и Шашков, 1997; Козлова и др., 2000; Потехина, 2006; Fiedler and Schдffler, 1987; Takeuchi and Yokota, 1989; Schubert et al., 1993; Evtushenko et al., 2007.

7.1 Распространение тейхоевых кислот в клеточных стенках некоторых представителей порядка Actinomycetales

Всего в данной работе обследовано более 100 штаммов различных родов актиномицетов, относящихся к 12-ти семействам 9-ти подпорядкам порядка Actinomycetales. Как видно из табл. 6, организмы ряда высших таксонов (подпорядки и семейства), характеризуются наличием или отсутствием ТК. Последние обнаружены в клеточных стенках у всех изученных актиномицетов подпорядков Glycomycineae и Streptosporangineae и не выявлены у представителей подпорядка Corynebacterineae и Pseudonocardineae. Не содержат ТК в клеточных стенках и большинство изученных штаммов подпорядка Frankineae. В случае вариабельности признака «наличие ТК» внутри высших таксонов, признак характерен для всех организмов более узких филогенетических групп (родов или близких видов в составе рода).

Можно также отметить, что ТК обычно свойственны организмам с хорошо развитым воздушным мицелием и сложными репродуктивными структурами, реже встречаются у нокардиоформных и палочковидных организмов и не выявлены у кокковых форм. Полимеры обнаружены у абсолютного большинства изученных организмов, включая Kineosporia aurantiaca, содержащих LL-диаминопимелиновую кислоту в пептидогликане. Доля ТК в клеточной стенке нокардио- и коринеформных организмов (семейство Nocardioidaceae) обычно ниже, чем у спорообразующих (напр., Streptomycetaceae). ТК не обнаружены у анаэробов семейства Propionibacteriacea, а также у организмов с арабиногалактаном или арабиногалактаном и миколовыми кислотами в клеточных стенках (подпорядки Corynebacterineae и Pseudonocardineae), у организмов с муреином Б-типа (семейство Microbacteriaceae), за исключением единичных видов рода Agromyces (Гнилозуб, 1994), и у абсолютного большинства организмов (включая спорангиальные) с лизином и орнитином в составе муреина. Исключение - Rarobacter (Takeuchi and Yokota, 1989), а также ряд филогенетически обособленных видов рода Arthrobacter (семейство Micrococcaceae, Fiedler and Schдffler, 1987), которые, видимо, должны быть выведены из состава рода.

В качестве примера практического использования на ранних этапах работы признака “наличие ТК” можно привести нашу работу (Стрешинская и др., 1989 г.) по уточнению таксономического положения ряда видов рода Nocardiopsis, сходных с Saccharothrix морфологически и по типу клеточной стенки (III C). Было исследовано 9 штаммов видов Nocardiopsis и Saccharothrix и выявлено две группы организмов внутри рода Nocardiopsis. К первой относились четыре штамма видов N. dassonvillei и N. trеhalosi (доминирующий моносахарид клеточной стенки - глюкоза, клеточные стенки содержали ТК глицерофосфатной природы). Вторую группу составили N. atra, N. coeruleofusca, N. longispora и N. syringae (доминирующий моносахарид клеточной стенки - галактоза, ТК отсутствуют). Виды второй группы по указанным критериям и ряду других характеристик оказались близкими к изученным Saccharothrix spp. Было сделано предположение, что их следует вывести из состава рода Nocardiopsis и отнести к Saccharothrix. Впоследствии зарубежными авторами было подтверждено это предположение и представители второй изученной нами группы (N. coeruleofusca, N. longispora и N. syringae) реклассифицированы в род Saccharothrix (Grund and Kroppenstedt, 1990).

7.2 Моносахариды в клеточных стенках изученных актиномицетов

Состав диагностических моносахаридов клеточной стенки, определяемый обычно в препаратах целых клеток, наряду с диаминокислотой пептидогликана, предложенный в качестве хемотаксономического признака, дифференцирующего роды (группы родов) в период становления хемотаксономического направления в систематике актиномицетов (Lechevalier and Lechevalier 1970a,b,c), продолжает успешно использоваться и в настоящее время. Признак несет информацию о специфических для определенных групп организмов компонетах клеточной стенки. Для ряда мицелиальных организмов метод определения сахаров в целых клетках даёт те же результаты, что и в препаратах клеточных стенок, однако последний метод более инфрмативен и позволяет выявлять дополнительные диагностические для таксона моносахариды (например, глюкозу, рибозу, галактозу). Помимо клеточной стенки, такие сахара могут происходить из цитоплазмы, капсул и экзополисахаридов, и традиционно не рассматривались в качестве диагностических. Так, например, принято считать, что для стрептомицетов характерен тип клеточной стенки I - LL-диаминопимелиновая кислота и отсутствие «дифференцирующих» сахаров.

Сравнительный анализ опубликованных и наших данных по «сахарам клеточных стенок» (определяются на первых этапах изучения структуры ТК и других гликополимеров) показал, что моносахариды, не относящиеся к группе «дифференцирующих сахаров», часто входят в состав этих полимеров и в ряде случаев являются важной дополнительной характеристикой таксона. Так, галактоза является ценным химическим маркером группы видов стрептомицетов из кластера “S. violaceusniger”, галактоза и манноза (происходящие из галактоманнана) характерны для Kineosporia aurantiaca, наличие галактозы (глюкозы) свойственно ряду видов Nocardiopsis и Saccharothrix (см. выше), и т.д. Изучение состава сахаров препаратов клеточных стенок позволяет также выявить моносахариды, считавшиеся ранее не свойственными представителям того или иного рода (например, мадуроза для ряда видов стрептомицетов).

С другой стороны, обнаружение у штамма нового моносахарида, не найденного в составе клеточных стенок известных (близких) видов, с высокой степенью вероятности свитетельствует о том, что такой штамм относится к новому таксону. Специфичность биосинтеза «нового» сахара и полимера, включающего такой сахар, обусловлена специфичностью соответствующих локусов генома микроорганизма.

При изучении 6-ти новых изолятов рода Kribbella в клеточной стенке 3-х штаммов нами были выявлены редкий сахар 2,3-ди-О-метил-D-галактопираноза и высший сахар - псевдаминовая кислота. Клеточные стенки двух других штаммов содержали 2,4-диацетамидо-2,4-дидезокси-D-глюкозу - впервые обнаруженный сахар (названный крибелозой), который сходен с бацилозамином (Schдffer et al., 2001), отличающемся от вновь найденного наличием О-метильной группы у пятого атома углерода глюкозы. В клеточной стенке еще одного штамма обнаружен редкий диаминосахар - 2,3-диацетамидо-2,3-дидезокси-D-глюкоза. Изученные штаммы содержали также в клеточной стенке то или иное количество галактозы и маннозы. Отличия изученных штаммов от известных видов рода по составу моносахаридов, входящих в полимеры, связанные с пептидогликаном, позволяют предполагать, что они принадлежат как минимум к трем новым видам рода Kribbella. Вопрос о видовой принадлежности этих изолятов будет решен в дальнейшем на основании изучения фенотипических и генотипических характеристик.

Глава VIII. Экологические аспекты изучения анионных углеводсодержащих полимеров клеточных стенок актиномицетов

Среди множества обитающих в почве сапрофитных видов стрептомицетов в возрастающем количестве обнаруживаются фитопатогенные организмы, вызывающие экономически значимые заболевания сельскохозяйственных растений, включая паршу картофеля обыкновенную (Takeuchi et al., 1996; Loria et al., 1997; Bouchek-Mechiche et al., 2000; Bukhalid et al., 2002). Основными факторами патогенности известных стрептомицетов-возбудителей парши являются фитотоксин (такстомин), ингибирующий биосинтез целлюлозы, некротический белок и гидролитические ферменты (Loria et al., 1997; Bukhalid et al., 2002). Вместе с тем, сведения о механизме взаимодействия патогена с растением-хозяином, в который, несомненно, вовлечены поверхностные структуры клеточной стенки фитопатогена, крайне фрагментарны. Обнаружение (Shashkov et al., 2000) у фитопатогенного штамма Streptomyces sp. ВKM Ac-2090, наряду с тейхоевой кислотой, полимера Kdn, обладающего адгезивными свойствами по отношению к тканям растения, положило начало исследованиям по выявлению особенностей строения анионных полимеров клеточной стенки у возбудителей парши картофеля в связи с возможным участием этих полимеров в патогенезе.

Нами были исследованы анионные полимеры клеточных стенок у 13 штаммов - изолятов из пораженных паршой клубней картофеля различных сортов, почвы картофельных полей, а также представителей типовых штаммов известных «почвенных» видов, таксономически близких к фитопатогенам (табл.7). Кроме того, были проведены эксперименты по проверке вирулентности, определению такстомина и целлюлозолитической активности у вышеупомянутых и других организмов, у котрых были обнаружены аналогичные по структуре полимеры клеточных стенок (табл.7). С целью идентификации штаммов, были также определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК. На основании полученных данных, было установлено, что рассматриваемые объекты относятся к 3 филогенетическим группам: “Streptomyces scabei”, “Streptomyces setonii-griseus” и “S. violaceusniger” (табл. 8).

Таблица 7. Вирулентность, синтез такстомина и наличие Kdn у изученных штаммов фитопатогенных стрептомицетов

<...

Номер п/п	Название культуры	Вирулентность	Kdn	Таксто-мин
		Карто-фель	редис
1	*Streptomyces sp. ВКМ Ас-304	++	+++	+	+
2	*Streptomyces sp. ВКМ Ас-305	+	+++	+	+
3	*Streptomyces sp. ВКМ Ас-306	++	+++	+	+
4	Streptomyces sp. ВКМ Ас-2274 (МВ-8)	++	н.о.	+	+
5	S. hygroscopicus ssp. hygroscopicus ВКМ Ac-831T	+++	н.о.	+	-
6	S. violaceusniger ВКМ Ас-583 T	++	н.о.	+	-
7	S. endus ВКМ Ac-1331T	+++	++	+	-
8	S. endus ВКМ Ac-129	+++	+++	+	-
9	S. castelarensis ВКМ Ac-832T	+++	н.о.	+	-
10	S. melanosporofaciens ВКМ Ас-1864 T	+++	н.о.	+	-
11	*S. griseus ssp. cretosus ВКМ Ac-712T	+++	++	+	-
12	*S. griseus ssp. griseus ВКМ Ac-800T	н.о.	++	+	-
13	*Streptomyces sp. ВКМ Ас-841	++	н.о.	-	-
14	*S. flavogriseus ВКМ Ac-1325T	н.о.	н.о.	-	-
15	*Streptomyces sp. ВКМ Ac-2117 (ОБИ-7)	+++	н.о.	+	-
16	*Streptomyces sp. ВКМ Ac-2124 (ОИЗ-4)	+++	н.о.	+	-
17	*Streptomyces sp. ВKM Ac-2277 (B-15)	+	н.о.	+	-
18	*Streptomyces sp. ВКМ Ac-2528	++	н.о.	-	-

реферат "Тейхоевые кислоты и гликополимеры актиномицетов: разнообразие структур, таксономические и экологические аспекты" скачать

Подобные документы

• Сущность и природа актиномицетов

  Классификация актиномицетов по Красильникову и Ваксману-Генрици. Морфология и физиология. Сущность постинфекционного иммунитета. Генетическое картирование актиномицетов. Перенос генетического материала с помощью плазмид. Патогенность и патогенез.
  
  презентация [858,2 K], добавлен 04.11.2013
  

• Перенос генетического материала и генетическое картирование у актиномицетов

  Исследование механизмов передачи генетического материала и создание новых способов генетического картирования. Перенос генетического материала с помощью плазмид, с помощью рекомбинации и посредством трансдукции. Генетическое картирование актиномицетов.
  
  реферат [25,9 K], добавлен 15.12.2010
  

• Нуклеиновые кислоты. Роль в воспроизведении и реализации наследственной информации

  Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).
  
  презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014
  

• Фотоповреждение клеток и клеточных структур ультрафиолетовым излучением

  Фотоповреждение нуклеиновых кислот ультрафиолетовым излучением. Нуклеотид-эксцизионная репарация повреждений ДНК. Фотоповреждение аминокислот и белков ультрафиолетовым излучением. Влияние ультрафиолетового излучения на биомембраны и клетки организма.
  
  контрольная работа [1,2 M], добавлен 19.08.2015
  

• Моделирование пахового канала

  Исследование особенностей размещения и строения пахового канала. Описание паховых отверстий, колец, ямок и стенок канала. Физиологические функции пахового канала. Характеристика защитного механизма рефлекторной деятельности стенок канала и его отверстий.
  
  презентация [754,6 K], добавлен 08.11.2013
  

• Слабые места стенок брюшной полости

  Исследование возрастных особенностей слабых мест стенок брюшной полости. Анализ условий для возникновения грыж, выхода внутренних органов из брюшной полости вместе с пристеночным листком брюшины. Обзор поясничного треугольника и поясничного пространства.
  
  лекция [765,1 K], добавлен 15.12.2011
  

• Клеточное ядро: от прозрачного пузырька, увиденного Робертом Броуном, до сложной системы клеточных компьютеров с сотнями тысяч генов-процессоров

  Схема происхождения клеточных мембран, построенная на основе динамической мембранной модели. Функциональная организация генетического аппарата и взаимодействия его механизмов в различных состояниях клеточного ядра. Компартментная организация ядрышка.
  
  статья [1,5 M], добавлен 02.08.2013
  

• Строение ДНК И РНК

  История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.
  
  контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012
  

• Оксикоричные кислоты

  Характеристика оксикоричневых кислот и этиленовых связей. Основные виды ароматических органических кислот: бензойная, салициловая, галловая. Общее описание Родиолы розовой. Применение препарата "Экстракт родиолы жидкий". Анализ цикориевой кислоты.
  
  курсовая работа [755,2 K], добавлен 06.04.2012
  

• Система крови

  Понятие о внутренней среде организма. Обеспечение определенного уровня возбудимости клеточных структур. Постоянство состава и свойств внутренней среды, гомеостаз и гомеокинез. Функции, константы и состав крови. Объем циркулирующей в организме крови.
  
  презентация [967,9 K], добавлен 26.01.2014
  

• ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

  История открытия дезоксирибонуклеиновой кислоты - биологического полимера, состоящего из двух спирально закрученных цепочек. Первичная структура и конформации компонентов нуклеиновых кислот. Макромолекулярная структура ДНК, полиморфизм двойной спирали.
  
  презентация [1,1 M], добавлен 07.11.2013
  

• Нуклеиновые кислоты

  Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая - ДНК, рибонуклеиновая - РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.
  
  реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014
  

• Характеристика актиномицетов

  Актиномицеты как бактерии, имеющие способность к формированию на некоторых стадиях развития ветвящегося мицелия. Сапрофиты, живущие за счет разложения органических веществ в почве. Возбудители заболеваний животных и сельскохозяйственных растений.
  
  презентация [2,3 M], добавлен 16.12.2013
  

• Строение и функции ионных каналов и переносчиков. Механизм электрогенеза

  Изучение строения и определение биологических функций клеточных мембран. Разнообразие функций каналов и переносчиков ионов через мембрану. Роль (Na)-насоса в поддержании допустимого осмотического давления в клетке. Электрические характеристики мембран.
  
  презентация [1,5 M], добавлен 05.03.2015
  

• Развитие эмбриона птиц

  Морфогенетические процессы в яйцеклетке птиц. Образование клеточных потоков при асинхронном дроблении зиготы, появление бластомеров; формирование многослойной дискобластулы - эпибласта и гипобласта; возникновение эмбриональных зачатков органов и тканей.
  
  реферат [13,6 K], добавлен 01.12.2011
  

• Липиды центральной нервной системы и структура клеточных мембран

  Липидный состав нервной ткани серого и белого вещества мозга человека. Деятельность мембран и способность к фазовым переходам в физиологических условиях. Ацилобменные реакции и их механизм. Участие липидов в рецепции, миелин и локализация ганглиозидов.азо
  
  курсовая работа [2,5 M], добавлен 27.08.2009
  

• Углеводородокисляющие микроорганизмы – перспективные объекты экологической биотехнологии

  Особенности использования углеводородокисляющих микроорганизмов для решения экологических проблем. Современные методы борьбы с нефтяными загрязнениями воды и почвы. Трансформации, осуществляемые спорами грибов и актиномицетов. Соокисление и кометаболизм.
  
  курсовая работа [2,7 M], добавлен 02.01.2012
  

• Простые липиды. Жирные кислоты

  Характеристика жирных кислот — алифатических одноосновных карбоновых кислот с открытой цепью, содержащихся в этерифицированной форме в жирах, маслах и восках растительного и животного происхождения. Их расщепление, виды существования в организме.
  
  презентация [305,5 K], добавлен 04.03.2014
  

• Дезинтеграция как инструмент для направленного разрушения клеток и клеточных структур

  Рассмотрение структуры бактериальной клетки, устройства и функций клеточной мембраны. Изучение основных методов дезинтеграции. Описание особенностей разрушения клеточной стенки при использовании физических, химических и химико-ферментативных методов.
  
  реферат [171,5 K], добавлен 17.01.2015
  

• Нуклеиновые кислоты

  Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.
  
  презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014
  

Другие документы, подобные "Тейхоевые кислоты и гликополимеры актиномицетов: разнообразие структур, таксономические и экологические аспекты"

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам