Внеклеточные лектины Lentinus edodes: характеристика, свойства и предполагаемые функции

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛЕКТИНЫ LENTINUS EDODES: ХАРАКТЕРИСТИКА, СВОЙСТВА И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ ФУНКЦИИ

03.00.04 - Биохимия, 03.00.07 - Микробиология

ЦИВИЛЕВА ОЛЬГА МИХАЙЛОВНА

Саратов - 2008

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук (ИБФРМ РАН, г. Саратов).

Научный консультант:

Никитина Валентина Евгеньевна, доктор биологических наук.

Официальные оппоненты:

Щеголев Сергей Юрьевич, доктор химических наук, профессор;

Терешина Вера Михайловна, доктор биологических наук, профессор;

Бородулин Владимир Борисович, доктор медицинских наук, профессор.

Ведущая организация: ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН.

Защита диссертации состоится "21" мая 2008 года в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу: 410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК

Автореферат разослан "21" февраля 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.146.01, доктор биологических наук В.Е. Никитина.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы данной работы определяется прежде всего ее направленностью на разрешение проблемы явного несоответствия между весьма ограниченным к настоящему времени уровнем информации о важных биологически активных соединениях, лектинах ксилотрофных базидиомицетов, и заинтересованностью исследователей в углубленном изучении этих углеводсвязывающих белков самого разного биологического происхождения. Грибы являются очень интересной в теоретическом и практическом плане группой живых организмов, в то же время внеклеточные грибные лектины практически не описаны.

Вопрос о возможности искусственного выращивания грибов уже свыше двух тысячелетий занимает человечество. Объектом научных исследований во всем мире являются более 100 тыс. видов. Промышленное производство высших грибов во многих странах мира выделилось в самостоятельную, интенсивно развивающуюся высокопроизводительную отрасль.

Общеизвестно функциональное значение грибов в различных биогеоценозах, где они благодаря широкому набору ферментов принимают активное участие в процессах деструкции и минерализации органического вещества. В настоящее время известно большое количество видов базидиальных грибов, которые представляют интерес в качестве продуцентов биологически активных веществ. К числу перспективных микологических объектов для поверхностного и глубинного культивирования с целью получения дополнительного источника белка, биологически активных соединений безусловно относится ксилотрофный базидиомицет Lentinus edodes.

Глубокие исследования физиологии высших грибов начались в последние три-четыре десятилетия. Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и биохимические процессы, их интенсивность, определяющиеся наследственными качествами самого организма и факторами внешней среды, требуют дальнейшего изучения. При этом кроме факторов, определяемых самим организмом, т.е. вид и штамм гриба, возраст культуры, способность к вегетативному размножению и образованию биологически активных веществ, интенсивность дыхания и др., необходимо учитывать и регулировать факторы внешней среды, влияющие на физиологические и биохимические процессы, как важнейшие факторы, определяющие активность гетеротрофных организмов [Дворнина, 1990].

Исследования роста базидиомицетов, в том числе L. edodes, на жидких средах направлены на изучение питательных потребностей и физиологии вида в чистой культуре, разработку технологии погруженного культивирования мицелия с целью получения биомассы кормового и пищевого назначения, препаратов, обладающих онкостатическим действием [Соломко и Митропольская, 1994]. Глубинное культивирование также предлагается как быстрый и эффективный метод производства посевного материала для грибоводства [Yang and Jong, 1989]. Значительно меньшее число работ посвящено биохимии глубинного культивирования, ее связи с физиологией роста и развития грибного организма в глубинной культуре. В частности, лектиновая активность высших грибов изучена явно недостаточно, лишь отдельные работы касаются изучения лектинов в связи с физиологическими аспектами, проблемами морфогенеза грибов. На стадиях, предшествующих плодоношению и характеризующихся у отдельных видов формированием специализированных вегетативных структур, таких как коричневая мицелиальная пленка шиитаке, исследование лектиновой активности приобретает особую актуальность, поскольку биохимические условия возникновения подобных особенностей морфогенеза и способов дальнейшего развития (перехода либо к нормальному плодоношению, либо к образованию недифференцированных базидиом) давно интересовали исследователей, оставаясь неопределенными.

Не обсуждалась роль лектинов при неблагоприятных условиях роста культур базидиомицетов, взаимодействие лектинов с важнейшими биологически активными соединениями (как антиоксидантной природы, так и вызывающими окислительный стресс; с соединениями фитогормональной природы, принимающими участие в цитодифференцировке у высших грибов). Не были выявлены регуляторы внеклеточной лектиновой активности, поэтому представляло интерес изучить не только эффекторы - компоненты синтетических сред культивирования, но и обнаружить какие-либо эндогенные низкомолекулярные регуляторы указанной активности, внешние условия их биосинтеза и проявления, что удалось реализовать в рамках настоящей работы.

Следовательно, ко времени начала наших исследований в этой области налицо был недостаток сведений по вопросам выявления лектиновой активности грибных культур, получения очищенных препаратов внеклеточных грибных лектинов, изучения их свойств и предполагаемых функций. Актуальным представляется наш посильный вклад в описание новой группы гликопротеинов ксилотрофных базидиомицетов, внеклеточных лектинов, физико-химические свойства которых важны для понимания их физиологической роли, морфогенетических функций в грибном организме как объекте микробиологических исследований. Учитывая вышеизложенные обстоятельства, нами было предпринято настоящее исследование.

Цель работы - характеристика внеклеточных лектинов культивируемого ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes и условий проявления их биологической активности.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг штаммов Lentinus edodes на присутствие лектинов.

2. Выделить внеклеточные лектины L. edodes, изучить их химический состав, физико-химические свойства, углеводную специфичность.

3. Изучить зависимость лектиновой активности культуры L. edodes от условий выращивания. Выявить оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной лектиновой активности. Разработать способ получения экзолектинов L. edodes F-249 с целью повышения выхода препаратов.

4. Исследовать влияние катионов металлов (II) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением расчетных методов квантовой химии и QSAR.

5. Изучить влияние неблагоприятных внешних условий на лектиновую активность L. edodes во взаимосвязи с ростовыми характеристиками культуры.

6. Исследовать взаимосвязь активности внеклеточных лектинов L. edodes и морфогенеза (формирования коричневой мицелиальной пленки) в глубинной культуре.

7. Выявить взаимосвязь углеводного и жирнокислотного состава мицелия шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития с лектиновой активностью и углеводной специфичностью лектинов культуры.

8. Исследовать влияние некоторых элементоорганических соединений (Se-, серу-, азотсодержащих) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением теоретических представлений (пространственная и электронная структура молекул, QSAR свойства реактантов).

9. Исследовать биологические свойства лектинов: их способность к взаимодействию с веществами фитогормональной природы, с разными типами эритроцитов; антигенные свойства.

10. Изучить возможности использования глубинной культуры L. edodes при модифицированном способе ее выращивания в качестве технологически перспективного посевного материала.

Научная новизна работы. Впервые в культуральной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета L. edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.

Выделены чистые препараты лектинов из культуральной жидкости L. edodes, изучены их физико-химические свойства, охарактеризована реакционная способность лектиновых препаратов.

Впервые показано, что максимальное повышение внеклеточной лектиновой активности базидиомицета наблюдается при условиях, отличных от оптимальных для выращивания культуры.

Впервые установлено участие лектинов в морфогенетических процессах и инициации плодообразования шиитаке. Выявлена взаимосвязь активности лектинов с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре; с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании; с биосинтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам.

Впервые обнаружен и выделен необычный для макробазидиомицетов гликолипид моносахаридной природы, способный модифицировать активность внеклеточных лектинов шиитаке.

Впервые выявлено взаимодействие лектинов ксилотрофного базидиомицета с фитогормоном ИУК, сопровождающееся значительным увеличением лектиновой активности в системе "лектин-ИУК".

Научные положения работы расширяют и углубляют современные представления о разнообразии лектинов базидиомицетов и о физиолого-биохимических механизмах регуляции их биосинтеза и активности; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в жизнедеятельности грибных культур, в адаптационных и морфогенетических процессах.

Практическая значимость исследования. Работа вносит вклад в развитие направления лектинологии, связанного с изучением лектинов высших грибов, в рамках которого положено начало новой области исследования препаратов внеклеточных лектинов ксилотрофных базидиомицетов.

Показана принципиальная осуществимость выделения и очистки внеклеточных лектинов из жидких синтетических сред культивирования ксилотрофных базидиомицетов. Разработана методика эффективной дифференциации хроматографических свойств двух внеклеточных лектинов, способствующей их более эффективному разделению. Выявлены низкомолекулярные вещества - эффекторы проявления внеклеточными лектинами их биологической активности, изучено взаимодействие лектинов с соединениями - антиоксидантами и индукторами окислительного стресса, с разными типами эритроцитов в реакции гемагглютинации; некоторые антигенные свойства. Подобная характеристика внеклеточных лектинов способствует перспективному использованию выделенных белков при проведении научных и прикладных исследований в области биохимии, энзимологии и иммунологии.

На основании результатов проведенного исследования выявлен ряд особенностей, проявляющихся при формировании неполноценных плодовых тел шиитаке в отсутствие характерной для данного вида коричневой мицелиальной пленки. Совокупность отличных от нормального плодоношения характеристик, в том числе по лектиновой активности, составу жирнокислотного и углеводного пула мицелия, могла бы служить дополнительным параметром биохимической оценки мицелия в процессе плодообразования. Полученные данные, свидетельствующие о существенных изменениях в направленности реакций синтеза, десатурации и элонгации жирных кислот у неполноценных плодовых тел, могут быть полезны и при обсуждении роли липидов в процессе морфогенеза.

Наше предположение и дальнейшее обоснование роли лектинов как потенциальных морфообразующих белков позволило внести определенный вклад в создание эффективного способа получения посевного мицелия шиитаке.

Материалы работы и препараты лектинов используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе химического факультета СГУ, СВИРХБЗ, лаборатории микробиологии Института микробиологии НАН Беларуси.

По результатам работы получен патент РФ, а также положительное решение формальной экспертизы. Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006).

Внедрение результатов диссертационной работы подтверждено соответствующими актами, представленными в Приложении к диссертации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В культуральной жидкости и на поверхности мицелия культур ряда штаммов Lentinus edodes присутствуют внеклеточные лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.

2. Культура L. edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по своим физико-химическим свойствам, составу, углеводной специфичности, антигенным свойствам, агглютинации разных типов эритроцитов, реакционной способности в отношении низкомолекулярных биологически значимых соединений.

3. Активность и динамика образования внеклеточных лектинов L. edodes зависят от физико-химических условий культивирования. Наиболее значимыми факторами, влияющими на лектиновую активность глубинной культуры L. edodes, являются присутствие в среде культивирования аминокислотных источников азота, катионов металлов(II), селена в органической форме.

4. При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адаптогенной ролью лектинов L. edodes.

5. Лектины L. edodes принимают участие в морфогенетических процессах культуры. Установлена взаимосвязь внеклеточной лектиновой активности шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам.

6. Одним из эндогенных регуляторов активности лектинов L. edodes является необычный для ксилотрофных базидиомицетов галактолипид S3, впервые выделенный из внеклеточных метаболитов L. edodes.

7. Экзогенными регуляторами внеклеточной лектиновой активности L. edodes могут служить низкомолекулярные соединения - индукторы окислительного стресса, а также антиоксиданты, в частности, селенорганические соединения, при взаимодействии с которыми сильно влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий.

8. Лектины L. edodes взаимодействуют с фитогормоном ИУК, при этом значительно увеличивается лектиновая активность в системе "лектин-ИУК". Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу.

9. Эффективным способом разделения двух внеклеточных лектинов шиитаке на основе дифференциации хроматографических характеристик и усиления биосинтеза одного из лектинов является воздействие Cu(II).

Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствии с плановой тематикой "Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия" (№ гос. регистрации 01970008158, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина), "Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов " (№ гос. регистрации 01200606184, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина).

Физико-химические задачи работы выполнены совместно с лабораторией структурных методов исследования ИБФРМ РАН (зав. лабораторией - к.х.н. Е.Е Федоров), с лабораторией биохимии (зав. лабораторией в период выполнения исследований - д.б.н. В.В. Игнатов), а также на кафедре аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), при непосредственном участии д.х.н., профессора А.Н. Панкратова; на кафедре органической и биоорганической химии СГУ (зав. кафедрой - д.х.н., профессор А.П. Кривенько).

Частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (№№ проектов 03-04-48129, 06-04-81042-Бел_а), Федерального агентства по науке и инновациям в рамках федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы (государственный контракт № 02.444.11.7331), программы Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" в рамках совместного проекта ИБФРМ РАН и ИРЭ РАН, 2007 г.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на: 37th IUPAC Congr. Frontiers in Chemistry: Molecular Basis of the Life Sciences, 27th GDCh General Meeting (Berlin, Germany, Aug. 14-19, 1999); науч. конфер. "Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии" (Саратов, 1999); 5th World Congr. of Theoretically Oriented Chemists - WATOC'99 (Imperial College, London, 1-6 Aug., 1999); 1-й регион. конфер. мол. ученых (Саратов, 26-27 марта 2002); Первом съезде микологов России "Современная микология в России" (Москва, 18-20 апреля 2002); межд. науч. конфер. "Физиология и биохимия культивируемых грибов" (6-8 июня 2002, Саратов); IV Всерос. конфер. мол. ученых (Саратов, 23-25 июня, 2003); Int. Symp. "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants" (Saratov, 28-30 July, 2003); VIII Int. Conf. "The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology" (Saratov, September 9-13, 2003); 8-й Межд. Пущинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 мая 2004); III Всерос. школе-конфер. "Химия и биохимия углеводов" (9-11 сентября 2004, Саратов); II Российской школе-конфер. "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине" (Саратов, 13-16 октября 2004); Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 13-15 октября 2004); Всерос. научно-практич. конфер. "Вавиловские чтения - 2004" (Саратов, 24-26 ноября 2004); II Всерос. симп. "Тест-методы химического анализа" (Саратов, 2004); 3-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2005); 9-й Межд. Пущинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 18-22 апреля 2005); Межд. конфер. "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 14-16 сентября 2005); Всерос. конфер. "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты" (Саратов, 15-17 июня 2005); V Всерос. конфер. мол. ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 22-24 июня 2005); Int. Conf. "Biocatalysis-2005: Fundamentals&Applications" (St. Petersburg, 19-23 June, 2005); II Межд. симп. "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 25-30 сентября 2005); 10-й Пущинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 апреля 2006); 4-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, 29-31 марта 2006); Межд. науч. конфер. "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева)" (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006); III межрегион. конфер. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 10-12 октября 2006); Межд. науч. конфер. "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 1-2 июня 2006); Втором Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2006); 5-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007); 4-й Росс. конфер. "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 4-5 июня 2007); VI Всерос. интерактивной конфер. мол. ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, июнь 2007); XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 16-22 September 2007), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит идея, разработка путей экспериментального выполнения и теоретическое обоснование всех основополагающих задач, поставленных в диссертационной работе, ключевая роль на всех этапах исследования, интерпретации и теоретической обработки полученных результатов.

Благодарности. Следует отметить вклад в выполнение данной работы д.б.н., зав. лабораторией В.Е. Никитиной, явившейся вдохновителем самого факта проведения исследований с такими объектами, как Lentinus edodes и лектины этой культуры, а также организатором углубленных исследований важной морфогенетической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки и эффекта неблагоприятных условий внешней среды. Интересное и полезное обсуждение результатов было обеспечено со стороны В.Е. Никитиной на всем протяжении периода выполнения работы.

Правильная интерпретация полученных результатов в терминах физико-химических, спектроскопических, аналитической химии была бы крайне обеднена, а квантовохимическая интерпретация - невозможна, без сотрудничества с д.х.н., профессором кафедры аналитической химии и химической экологии СГУ им. Н.Г. Чернышевского А.Н. Панкратовым.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 78 научных работ, в том числе 38 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 19 статей в рецензируемых иностранных изданиях и российских журналах, входящих в "Перечень периодических научных изданий, рекомендуемых ВАК …", 19 статей в сборниках научных трудов), 1 патент РФ, 1 положительное решение формальной экспертизы. Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников литературы и приложения. Приложение содержит документальное подтверждение внедрения материалов диссертации в учебный процесс и практику научных исследований.

Работа изложена на 353 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 55 рисунками и 54 таблицами. Список цитируемой литературы включает 519 источников (отечественных и зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзор литературы. В обзоре литературы (глава 1), представленном 3 разделами, 12 подразделами, изложены современные представления о свойствах и функциях лектинов грибов (общее понятие о лектинах, предполагаемая роль, биологические свойства, применение грибных лектинов). Во второй части обзора охарактеризованы морфолого-культуральные и физиолого-биохимические особенности Lentinus edodes (дана краткая характеристика этого вида как гриба "белой" гнили, оценены питательные свойства и медицинское значение шиитаке). В третьей части обзора литературы рассмотрено значение экзогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности мицелиальных культур. Значительное внимание уделено соединениям селена в процессах жизнедеятельности биотехнологически значимых грибных культур (селен описан как составляющая часть минерального питания грибов, представлена общая информация по химии селена в живой клетке, данные о влиянии искусственных добавок селенсодержащих веществ на развитие грибных культур). Далее подчеркнуты важнейшие функции, выполняемые соединениями меди в жизнедеятельности микроорганизмов, в основном в связи с биохимией микологических объектов. В следующем подразделе описаны имеющиеся в литературе немногочисленные исследования фитогормона в-индолил-3-уксусной кислоты во взаимосвязи с искусственной культурой базидиомицетов.

На основании каждого из разделов представленного обзора сформулированы аспекты исследования для достижения цели настоящей работы и определен круг решаемых для этого задач.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования, условия культивирования. Данное исследование выполнено на материале коллекции штаммов высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. В работе использованы 4 штамма L. edodes: NY, F-249, 2T, 0779. Культуры грибов поддерживали на сусло-агаре при 4^оС.

В процессе исследования лектиновой активности L. edodes на разных стадиях морфогенеза промежуточную культуру для получения плодовых тел выращивали на среде следующего состава ([Song et al., 1987], г/л): D-Glc - 10; L-Asn - 1; KH₂PO_4-5; MgSO₄^.7H₂O - 2.5; FeSO₄^.7H₂O - 0.03; тиамин - 5^.10^-4; H₂O до общего объема 1 л.

При изучении влияния состава среды культивирования на активность внеклеточных лектинов L. edodes использовали следующие источники углерода (300 мM по углероду): D-Glc, Suc, L-Ara, L-Rha, D-Man, D-Mal, D-Fru, D-Gal, D-Lac, CH₃COONa^.3H₂O. В качестве источника азота в среду вносили в различных концентрациях L-Asn, NaNO₃, NH₄Cl. Рассчитывали оптимальное соотношение C:N. В состав сред входили только указанные компоненты. Кислотность исходной среды культивирования устанавливали добавлением HCl или NaOH (0,05 M) в стерильных условиях после раздельной стерилизации компонентов.

Для исследования взаимосвязи молекулярной структуры источника азота и активности внеклеточных лектинов при глубинном культивировании L. edodes использовали синтетические среды на основе D-Glc (50 мM) с источниками азота: NH₄Cl или NaNO₃ (соотношение C:N в среде составляло от 7,5:1 до 150:1); эссенциальные аминокислоты (20 мM по азоту). В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали катионы Ca²⁺ или Mn²⁺ в виде хлоридов.

С целью изучения стимуляторов лектиновой активности на агаризованных средах при культивировании L. edodes использовали синтетические среды с источником углерода (концентрация 300 мM по углероду): D-Glc, Suc, L-Ara, L-Rha, D-Man, D-Mal, D-Fru, D-Gal, D-Lac; источником азота (концентрация 20 мM по азоту): Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Met, Asp, Glu, Asn, Phe, Trp, NH₄Cl, а также среду с PBS (рН 7,2) и композиции указанных компонентов. Среды Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Met, Asp, Glu, Asn, Phe, Trp содержали также 0,4500 г/л Glc. Среда PBS содержала также, г/л: Glc - 0,4500, NH₄Cl - 0,2140. Среда Glc-NH₄Cl содержала, г/л: Glc - 0,4500, NH₄Cl - 0,2140.

Исследование влияния селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и лектиновую активность L. edodes проводили на жидких и агаризованных средах. При глубинном культивировании L. edodes использовали среды: с Glc и Asn, соотношение C:N 15:1 (среда I); пивное сусло, 2^o по Баллингу (среда II); среда на основе пшеничной муки (20 г/л) (среда III); среда на основе экстракта дубовых опилок (среда IV). В состав плотных сред того же состава (Ia, IIIa, IVa) и 4^o-го агаризованного пивного сусла (IIa) входил дополнительно агар (18 г/л). ДАФС-25 синтезирован, описан и любезно предоставлен Б.И. Древко [Древко и др., 2001]. Концентрация в пересчете на селен в средах культивирования составляла 0,1 мг/л.

Изучая влияние Me²⁺ на активность внеклеточных лектинов шиитаке, использовали синтетические жидкие среды с источником углерода (концентрация 300 мМ по углероду): D-Glc, L-Ara, Suc; источником азота служил Asn (10 мМ). В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали соли металлов (концентрации 0-10 мM): MgSO₄^.7H₂O, CaCl₂^.2H₂O, MnCl₂^.4H₂O, FeSO₄^.7H₂O, CuSO₄^.5H₂O, ZnSO₄^.7H₂O, CoCl₂^.6H₂O, NiSO₄^.6H₂O, SnCl₂^.2H₂O.

Синтетическая среда для изучения процессов хелатообразования в рамках проблемы влияния Fe(II), Co(II), Ni(II) на активность внеклеточных лектинов L. edodes состояла из Glc (50 мМ), Asn (10 мМ), включала добавки Fe(II), Co(II), Ni(II) (4 мМ) и EG (2 мМ или 4 мМ).

Методы исследования. При посеве грибной культуры в качестве инокулята использовали 14-сут культуру L. edodes F-249, выращенную на агаризованном пивном сусле при 26^oС. Cпособ дозирования посевной культуры состоял в засеве жидких сред дисками сусло-агара диаметром 5 мм с культурой гриба, взятыми из одной зоны растущего мицелия, обычно 3 диска на 50 мл среды или 1 диск на чашку Петри.

Растворы органических Se-, S-, N-содержащих соединений, используемых в качестве добавок к среде выращивания, после стерилизации в тонком слое УФ облучением добавляли непосредственно перед посевом.

Получение плодовых тел L. edodes осуществляли как на органической плотной среде из смеси дубовых опилок и пшеничного зерна (4:1, v/v), так и на чашках Петри со средой сусло-агар, по модифицированной методике [Stamets, 1993] с применением холодового шока и суточных температурных колебаний. Время от засева субстрата до начала плодоношения составляло от 38 до 70 сут. в зависимости от штамма.

Ростовой коэффициент (РК) вычисляли по формуле:

РК = dhg/t,

где d - диаметр колонии, мм; h - высота колонии, мм; g - плотность колонии, балл; t - возраст колонии, сут. Величину g оценивают по трехбалльной шкале [Бухало, 1988]. Скорость роста при глубинном культивировании определяли по накоплению сухой биомассы в единицу времени в зависимости от продолжительности выращивания.

Лектиновую активность в жидких пробах определяли реакцией ГА с самопроизвольным оседанием эритроцитов, используя 2%-ную суспензию трипсинизированных кроличьих эритроцитов в серии последовательных разведений лектина [Луцик и др., 1981]. ТГА выражали как наибольшее разведение раствора, вызывающее агглютинацию эритроцитов.

Углеводную специфичность определяли в серии последовательных разведений углевода (от 0,3 М) при использовании раствора испытуемого гемагглютинина с титром 4 в реакции ГА. В работе использовали 21 препарат углеводов (Serva). Углеводную специфичность оценивали по минимальной концентрации углевода, ингибирующующей реакцию ГА лектина в данных условиях. При отсутствии ингибирования в интервале концентраций углевода от 0 до 100 мM считали, что специфичность исследуемого лектина к данному углеводу отсутствует.

Изучение зависимости лектиновой активности от температуры культивирования мицелия проводили: при 26^оС как оптимальной температуре роста мицелия для данного вида, 16^оС - температуре замедленного роста, 32^оС и 37^оС - верхних предельных значениях температурного интервала развития этой культуры на плотных и жидких средах соответственно.

Относительную молекулярную массу белковых образцов определяли с помощью электрофореза в 15 %-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) по методу Лэммли. В качестве стандарта использовали набор белков маркеров фирмы "Amresco" (США) Визуализация белковых полос осуществлялась методом окраски геля при помощи 0,2 %-ного раствора Coomassie' Brilliant Blue G-250 или 0,1 % (m/v) раствора AgNO₃.

Аминокислотный состав белков определяли на аминокислотном анализаторе ААА 339 (ЧССР). Подготовку образца проводили по общепринятому методу (при 105^оС 24 ч в 6М HСl).

Состав углеводной фракции исследовали методом капиллярной газовой хроматографии на неподвижной жидкой фазе SE-54 в режиме программирования температуры, с предварительным получением силильных производных сахаров.

Хроматографию проводили на приборе "Chrom 5" (ЧССР) с пламенно-ионизационным детектором, используя кварцевую капиллярную колонку длиной 25 м, при программировании температуры от 150 до 280^оС со скоростью нагрева термостата колонок 8 град/мин. Объем пробы 1 мкл. Газ-носитель - гелий.

Триметилсилиловые эфиры исследуемых проб и соединений-стандартов получали с использованием 1,1,1,3,3,3-гексаметилдисилазана и триметилхлорсилана в качестве катализатора [Пецев и Коцев, 1987].

Липиды экстрагировали модифицированным методом С. Song с соавторами (1989), включающим обработку сухого мицелия смесями метанол-вода-хлороформ в объемном соотношении (1:2:3), высушивание в токе азота или аргона и экстракцию сухого остатка гексаном. Жирные кислоты анализировали в виде метиловых эфиров методом газожидкостной хроматографии. Метиловые эфиры ЖК разделяли на газожидкостном хроматографе "Биохром-1" на кварцевой капиллярной колонке (длина 25 м, внутренний диаметр 0.2 мм) с неподвижной фазой SE-54. Использовали режим программирования температуры термостата колонки от 130 до 270^оС со скоростью нагрева 4^оС/мин. Температура испарителя 150^оС, детектора 270^оС. Газ-носитель - гелий, скорость потока 1.6 мл/мин.

Жирные кислоты идентифицировали по временам удерживания их метиловых эфиров. В качестве стандартов метиловых эфиров ЖК использовали набор Bacterial Acid Methyl Esters CP Mix (Supelco): 11:0, 2-OH 10:0, 12:0, 13:0, 2-OH 12:0, 3-OH 12:0, 14:0, i-15:0, a-15:0, 15:0, 2-OH 14:0, 3-OH 14:0, i-16:0, 16:1⁹, 16:0, i-17:0, 17:0, 2-OH 16:0, 18:2^9,12, 18:1⁹, 18:0, 19:0, 20:0, а также в дополнение другие метиловые эфиры ЖК (Sigma): 7:0, 8:0, 9:0, 10:0, 18:1, 20:2, 21:0, 22:1, 22:0, 23:0, 24:1, 24:0.

Поликлональные кроличьи антитела получали на хроматографически очищенный препарат внеклеточного лектина L1. Иммунизацию проводили 3 раза с интервалом 2 недели, последовательно вводя в подколенные лимфатические узлы кролика 50, 100 и 150 мкг лектина. Антиген растворяли в физрастворе, забуференном фосфатами (рН 7.2) до концентрации 100 мкг/мл и смешивали с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Кровь отбирали через неделю после третьей иммунизации. Фракцию иммуноглобулинов G получали из антисыворотки осаждением сульфатом аммония.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли в полистироловых 96-луночных планшетах. В качестве ферментативной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с анти-кроличьими козлиными антителами. В качестве субстратного реагента использовали орто-фенилендиамин с перекисью водорода. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 нм на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С (ЗАО ИЛИП, г. Санкт-Петербург). Результаты твердофазного ИФА продемонстрировали наличие общих антигенных детерминант в составе двух внеклеточных лектинов.

Съемку рентгенограмм проводили на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3 на Cu-K_б излучении в следующем режиме: сила анодного тока 75-150 А, катодное напряжение 75-150 В. Скорость сканирования 2 град/мин.

Спектры ЯМР получали на спектрометре Varian FT 80A (США), частота 80 МГц, для 2-3 % растворов образцов в 99.96 % D₂O при 303К (внутренний стандарт - ацетон, ?_н 2.225 м.д., ?_с 31.45 м.д., и внешний стандарт - 85 % водная Н ₃РО ₄, ?_р 0 м.д.). Для калибровки спектров использовали Na-соль 3-(триметилсилил)-пропионовой-2,2,3,3-d₄ кислоты (внутренний стандарт, ?_н 0).

Инфракрасные спектры регистрировали на приборе ИК-Фурье спектрометр ФСМ 1201 в тонком слое вазелинового масла и гексахлорбутадиена.

QSAR-свойства вычисляли с помощью программы комплекса HyperChem по атомно-аддитивным схемам [Hasel et al., 1988; Still et al., 1990; Bodor et al., 1989; Gavezotti, 1983; Ghose and Crippen, 1986, 1987; Viswanadhan et al., 1989; Miller, 1990; Ghose et al., 1988].

При изучении влияния Fe(II), Co(II), Ni(II) на активность внеклеточных лектинов L. edodes квантовохимические ab initio расчеты проводили неограниченным методом Хартри - Фока (UHF) в базисе 3-21G(d,p) (UHF/3-21G(d,p)) [Hehre et al., 1986; Кларк, 1990]с использованием программ из пакета HyperChem [HyperChem (TM), Hypercube, Inc., 1115 NW 4th Street, Gainesville, Florida 32601, U. S. A.]. Полную оптимизацию геометрии проводили посредством алгоритма Полака - Рибера (Polak - Ribiere conjugate gradient algorithm) [Дэннис и Шнабель, 1988]. Предварительную оптимизацию геометрии осуществляли методом PM3 [Stewart, 1989a; 1989b] посредством программы из того же пакета. При квантовохимических расчетах задавали условие, чтобы норма градиента не превышала 0.02 ккал/(моль^.Е). Корреляционные поправки к хартри-фоковским энергиям рассчитывали для оптимизированной геометрии (Single Point) в рамках теории возмущений Меллера - Плессе второго порядка (MP2) [Hehre et al., 1986; Кларк, 1990] в том же базисе (подход MP2/3-21G(d,p)//UHF/3-21G(d,p)).

При оценке полученных результатов пользовались методом расчета стандартного отклонения среднего арифметического; данные, представленные в настоящей работе, имеют соответствующие доверительные интервалы при уровне доверительной вероятности 0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обнаружение, выделение, определение специфичности агглютининов Lentinus edodes. Обнаружение лектинов Lentinus edodes. О наличии лектинов L. edodes информация крайне ограничена и представлена двумя работами [Jeune et al., 1990; Wang et al., 1999], касающимися выделения лектина из плодовых тел L. edodes. В литературе отсутствуют данные о внеклеточных лектинах шиитаке. Поэтому, учитывая важность и разнообразие функций лектинов в живых организмах, а также разностороннее значение базидиомицета L. edodes, мы предприняли исследования по обнаружению внеклеточных лектинов, находящихся в культуральной жидкости гриба, а также в пассивных смывах с поверхности мицелия в условиях твердофазного культивирования.

В результате экспериментов по поискам гемагглютининов культуральной жидкости была обнаружена ГА активность в КЖ у всех взятых в эксперимент штаммов L. edodes F-249, 2T, 0779, NY, выращенных на минеральной среде при 26^оС. Анализ КЖ показал значительные вариации ГА активности в зависимости от штамма шиитаке. Возникает вопрос, не объясняются ли эти штаммовые различия по продукции внеклеточных гемагглютининов разной способностью культур к накоплению биомассы? Для корректности сравнения ГА активности у разных штаммов L. edodes, культивируемых одно и то же время, проведены эксперименты по определению скорости роста используемых штаммов на минеральной среде, позволившие заключить, что различия в отношении ГА активности заметно превосходят различия в скорости роста культур штаммов.

Полученные данные позволили говорить о большом количестве внеклеточных агглютининов, выделяющихся в среду выращивания. Для доказательства принадлежности выявленных гемагглютининов к классу лектинов были получены результаты определения углеводной специфичности агглютининов КЖ методом ингибирования агглютинации эритроцитов углеводами. Агглютинины всех штаммов высокоспецифичны к D-Gal (кроме NY), D-Lac, в меньшей степени - D-Mal. Ингибирующая концентрация углевода минимальна в случае Lac и штамма F-249. При этом аминопроизводные Gal и Glc малоэффективны в отношении ингибирования реакции ГА лектинов КЖ всех штаммов, а GalNAc и GlcNAc ингибируют только ГАА лектинов штамма NY (4,17 и 16,7 мМ соответственно).

К L-Rha особенно специфичны лектины штамма F-249: реакцию ГА ингибирует концентрация этого углевода 11,1 мМ. Исключительно в отношении лектинов штамма F-249 наблюдается явно выраженная углеводная специфичность к D-ManOH и D-Cel (8,33 и 33,3 мМ соответственно в сравнении с величинами, превышающими 100 мМ, для других штаммов). Мы осознаем, что преждевременно было бы говорить об углеводной специфичности грибных лектинов как о систематическом штаммоспецифичном признаке, однако из полученных нами данных довольно четко видны различия этого параметра у разных культур штаммов.

Предположив, что гемагглютинины присутствуют и на поверхности грибных гиф при выращивании на плотных средах, и что ГА активность будет проявляться в пассивных смывах с мицелия, мы провели эксперименты по обнаружению внеклеточных гемагглютининов при твердофазном культивировании. Была выявлена ГА активность в пассивных смывах с мицелия у всех взятых в эксперимент штаммов L. edodes, выращенных на агаризованных средах разного состава. Различия в отношении ГА активности заметно превосходят различия ростовых характеристик культур штаммов, и корреляций ГА активности со скоростью накопления биомассы не выявляется (как и при жидкофазном культивировании). Определение углеводных гаптенов для агглютининов вегетативного мицелия культур 4-х штаммов шиитаке показано присутствие во всех без исключения случаях лектинов с высокой специфичностью только к D-Lac. Специфичность к D-Gal и D-GalN, несомненно, ниже, но также обнаружена для всех штаммов. Лектины с аналогичной высокой специфичностью к Lac были обнаружены нами и в КЖ.

Таким образом, данные, полученные из экспериментов по обнаружению гемагглютининов шиитаке, позволяют утверждать, что агглютинины L. edodes присутствуют в КЖ и в пассивных смывах с мицелия у всех взятых в эксперимент штаммов L. edodes, выращенных в условиях жидкофазного и твердофазного культивирования. Определение углеводных гаптенов позволяет отнести выявленные гемагглютинины к классу лектинов. Различия в отношении лектиновой активности заметно превосходят различия ростовых характеристик культур штаммов.

Выделение и очистка, определение углеводной специфичности лектинов. Для дальнейших исследований по выделению и очистке внеклеточных лектинов шиитаке мы использовали штамм L. edodes F-249. Выбор был основан на следующем: высокая лектиновая активность в условиях эксперимента; быстрый рост вегетативного мицелия на агаризованных средах; именно для штамма F-249 нам удалось получить плодовые тела на чашках Петри в течение не более чем 60 суток.

При выделении внеклеточных лектинов L. edodes F-249 в качестве грубого белкового экстракта использовали КЖ. В состав синтетической среды входили Glc (50 мМ) и Asn (10 мМ). Сконцентрированный фильтрат КЖ осаждали ацетоном, выпавший при 4^оС осадок отделяли от супернатанта. Осадок растворяли в воде, получая неочищенный раствор лектина 1 (L1). Супернатант освобождали от ацетона, высушивали при 30-32^оС, остаток растворяли в воде, получая неочищенный раствор лектина 2 (L2). Полученные водные растворы лектинов пропускали через колонку с Sephadex G-25, элюент вода. Выход белковых фракций регистрировали на приборе Uvicord S-II (LKB) при 280 нм.

Далее очистку лектинов L1 и L2 проводили с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. При нанесении активных по ГА фракций, сошедших с колонки после гель-эксклюзионной хроматографии, на колонку с катионообменником Toyopearl СМ-650M большинство примесей связалось с носителем, тогда как очищенные лектины выходили со свободным объемом. После гель-фильтрации на колонке с Toyopearl HW-55S (рис. 1) удалось выделить и разделить две активные по ГА фракции целевых белков. Анионообменная хроматография указанных фракций, содержавших преимущественно L1 или L2, на колонке с Toyopearl DEAE-650M привела к удалению большинства примесей и полному разделению двух лектинов, выходивших с колонки при существенно различной ионной силе элюента (L1 при концентрации NaCl 0,3 моль/л; L2 элюировался PBS с концентрацией NaCl 0,14 моль/л). Окончательную очистку проводили на колонке с Sephadex G-75. Обессоленные водные растворы L1 и L2 концентрировали.

Рис. 1. Профиль элюции лектинов L1 и L2 Lentinus edodes F-249 на колонке с Toyopearl HW-55S: 1 - L1; 2 - L2

SDS-PAGE показал, что оба белка мономерны, характеризуются молекулярными массами 43 и 37 кДа соответственно. Дополнительное подтверждение указанных величин получили при использовании калиброванной по молекулярной массе колонке с Sephadex G-75. Установлено, что внеклеточные лектины L. edodes F-249 являются гликопротеинами, однако содержание углеводов в L2 значительно выше, чем в L1.

Определение углеводной специфичности показало, что оба лектина проявляют специфичность к D-Gal и D-Lac. И для L1, и для L2 минимальные ингибирующие концентрации этих углеводов 2,08 мМ Gal и 8,33 мМ Lac. Другие углеводы, к которым лектины проявляют более или менее высокое сродство: для L1 это Rha (4,16 мМ); для L2 - Ara (4,16 мМ) и ManOH (8,33 мМ).

Интересна специфичность одного из лектинов (L2) и гемагглютиннов КЖ к ManOH. Известно, что метаболизм ManOH играет важную роль в развитии плодовых тел гриба. У L. edodes содержание этого полиола может достигать 30-50 % от общих углеводов. По нашим данным ManOH накапливается в белом мицелии L. edodes перед нормальным плодоношением на коричневой мицелиальной пленке.

Лектины обнаруживают высокую специфичность к гликопроизводным, в составе молекул которых есть прежде всего D-галактозид или, в меньшей степени, к производным 4-О-D-глюкопиранозы, предпочтительнее 4-О-б-D-Glc- по сравнению с 4-О-в-D-Glc-. Никакие иные D-глюкозидные производные, как и сама Glc, не проявляют сродства к исследуемым лектинам.

Внеклеточный гликопротеин L. edodes - лектин L1. Внеклеточный лектин L1 из L. edodes F-249 - гликопротеин с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 43 кДа. L1 имеет в своем составе (10,5 ± 1,0) % (m/m) углеводов, представленных Glc.

По результатам определения аминокислотного состава L1 обращает на себя внимание достаточно высокий уровень полярных аминокислот (Asх, Glх, Lys, Arg). Так, содержание Lys и Arg составляет 10,4 и 16,5 мол. % соответственно. Много и кислот, занимающих промежуточное положение между гидрофильными и гидрофобными, особенно Hys, Ser и Gly. Для L1 индекс полярности равен 54,6 %. Такая высокая полярность характерна для большинства водорастворимых белков, для которых величина указанного индекса находится обычно в рамках интервала 47 ± 6 %.

На хроматографически очищенный препарат внеклеточного лектина L1 получали поликлональные кроличьи антитела. Результаты твердофазного ИФА продемонстрировали наличие общих антигенных детерминант в составе двух внеклеточных лектинов.

Агглютинирующие свойства лектинов L. edodes на разных стадиях очистки препаратов этих белков изучали в зависимости от типа эритроцитов (разных животных и 4 групп крови человека) и их предварительной обработки (нативных и трипсинизированных). Очищенные лектины демонстрировали высокую избирательность при узнавании определенных структур на поверхности трипсинизированных эритроцитов кролика, не реагировали с эритроцитами других животных и человека. Обработка эритроцитов трипсином значительно повышала чувствительность реакции.

Внеклеточный протеогликан L. edodes - лектин L2. Внеклеточный лектин 2 из L. edodes F-249 - протеогликан с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 37 кДа. L2 содержит в своем составе (90,3 ± 1,0) % (m/m) углеводов, предсталенных Glc (73 % общей массы углеводной части молекулы лектина) и Gal (27 % общей массы углеводной части молекулы лектина).

В L2 высоко содержание полярных аминокислот, прежде всего Asх - около 42 % от суммы аминокислот. Элементный анализ (на содержание азота) показал, что Asх присутствует в виде Asn. Менее 10 % в L2 других полярных аминокислот: Glх, Lys, Arg. Для L2 индекс полярности равен 56,7 %.

Содержание углеводов в L2 значительно выше, чем в L1. Высокое содержание Asn в составе L2 согласуется с нашими данными о положительном эффекте Asn в отношении формирования коричневой мицелиальной пленки L. edodes в глубинной культуре. Кроме того, высокий уровень Asn в L2 наряду с составом углеводной части молекулы (Glc и Gal) позволяют отнести этот лектин к N-аспарагинсвязанным, имеющим N-гликозидную связь в молекуле протеогликана. Белковая часть связывается с углеводной через Asn [Коваленко, 1997].

Более детальная структурная характеристика L2 была получена с помощью спектроскопии ЯМР. Спектр ЯМР ¹H образца L2 содержит две группы сигналов (табл. 1). Химический сдвиг протона воды (H₂O), содержащейся в растворителе (D₂O), равен 4.632 млн.¹. Поэтому с высокой степенью достоверности пики при 4.380, 4.884, 5.047 и 5.087 млн.¹ могут быть отнесены к протонам гидроксильных групп.

Кроме того, пики при 5.047 и 5.087 млн.¹ могут относиться к алкиламинным (AlkNH₂, AlkNHAlk') или алкиламидным протонам (AlkCONH₂, AlkCONHAlk'), для резонанса которых характерны химические сдвиги 5.0-8.0 и 5.0-8.5 млн.¹ соответственно [Панкратов и Остроумов, 1995].

Отметим, что сигналы метиленовых и метиновых протонов групп CH₂OH и CHOH обычно проявляются в области 3.6 и 3.8 млн.¹ соответственно. Это согласуется с предположением о наличии в составе образца названных групп.

Таблица 1. Данные спектра ЯМР ¹H внеклеточного лектина L2 из L. edodes F-249