Внеклеточные лектины Lentinus edodes: характеристика, свойства и предполагаемые функции

В качестве растворителя для соединений ряда 1,5-ди(4-R-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 выбрали смешанный растворитель ДМСО: H₂O (4: 1, v/v). Растворы селенорганических соединений I, III, IV в ДМСО использовали в таких максимальных концентрациях (С 1), при которых собственная ГА активность ни ДМСО, ни I, III, IV не проявлялась; это также дополнительно контролировалось реакцией гемагглютинации I, III, IV в выбранных концентрациях С 1, С 2, С 3. Минимальная из трех величина С 3 равна концентрации соединения I (ДАФС-25) в наших более ранних исследованиях лектиновой активности КЖ, а С 2 занимала промежуточное положение.

Изменение характеристик взаимодействия лектинов с селенорганическими соединениями в зависимости от стадии очистки препарата лектина. Стадия очистки препарата лектина оказывает наибольшее (если сравнивать с такими характеристиками, как концентрация I, III, IV) влияние на дифференциальный характер взаимодействия внеклеточных лектинов с селеноорганическими соединениями.

Так, в случае вещества I при одной и той же концентрации С 1 селенсодержащего соединения титр гемагглютинации меняется от 64 до 1024, возрастая по мере степени чистоты препарата лектина L2, и почти также резко снижается (от 1024 до 128 при С 3) по мере очистки L1. Препарат ДАФС-25, таким образом, в гораздо большей степени повышает лектиновую активность очищенного L2, чем L1, однако для этого требуются относительно высокие концентрации селенового соединения (50 мг/л Se).

Заметно выражено "сродство" препарата 1 (неочищенного L1) к соединению III, причем и при самой высокой, и при самой низкой концентрации указанного соединения титр гемагглютинации очень высок (512 и 2048 соответственно). Однако по мере очистки лектина 1 титр ГА в присутствии тех же концентраций этокси-производного (вещество III) становится равным 64. Наоборот, очищенный препарат лектина 2 значительно повышает свою ГА активность при взаимодействии с III (до величины ТГА, равной 512 - заметим, до того же значения, что и неочищенный L1). И снова для этого требуются высокие концентрации (С 1) селенового производного III. Самая низкая концентрация и ДАФС-25 (как только что говорилось), и вещества III нисколько не эффективны в отношении стимулирования лектиновой активности очищенного L2: титры ГА 16 и 8 соответственно по сравнению с величиной 32 в отсутствие селенорганических соединений. Не оказывает ингибирующего действия только вещество IV: титр ГА минимум 32, достигает 512 для обоих лектинов после первой стадии очистки. В то же время для IV менее всего из селенорганических соединений выражена зависимость его влияния на лектиновую активность от стадии очистки препарата. Это вещество достаточно индифферентно в отношении наличия примесей в препаратах лектинов 1-6, зато наблюдается оптимальная в обсуждаемом аспекте концентрация IV, когда титр ГА равен 512 независимо от степени чистоты лектинов (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость лектиновой активности от стадии очистки препаратов лектинов при концентрации селенорганических соединений С 2 = 6.33^.10⁵ моль/л (5 мг/л Se). 1, 3, 5 - L1; 2, 4, 6 - L2 на трех стадиях очистки

Подобная неспецифичность взаимодействия н-октилокси-производного (вещество IV) c лектинами при наличии явно выраженной концентрационной зависимости реактанта привели нас к мысли о каком-то едином химизме этих процессов, возможно, гидрофобных взаимодействиях с октильным радикалом.

Изменение характеристик взаимодействия лектинов с селенорганическими соединениями в зависимости от концентрации селенсодержащих соединений. Зависимость лектиновой активности обоих исследуемых белков на всех трех стадиях их очистки от концентрации селенорганического соединений проходит через максимум лишь в единственном случае соединения IV (рис. 5). Признать возможность мицеллообразования в реакционной среде в данном случае вряд ли правомерно, поскольку после достижения критической концентрации мицеллообразования, ККМ, эффективность взаимодействия, отражаемая параметром ТГА в нашем эксперименте, должна оставаться на постоянном уровне при увеличении концентрации IV. Мы этого не наблюдаем, но тем не менее считаем очень вероятным, что вещество IV, содержащее н-октильный заместитель, более способно к мицеллообразованию по сравнению с I или III. Необходимы специальные исследования с определением ККМ. Наиболее очевиден тот факт, что явная гидрофобность соединения IV по сравнению с остальными изученными селеновыми веществами вносит существенный вклад во взаимодействие с лектинами L. edodes. Соединение IV положительно влияет на активность лектинов и L1, и L2, этот аспект мы обсуждаем также в следующем разделе.

Рис. 5. Зависимость лектиновой активности препаратов лектинов (1, 3, 5 - L1; 2, 4, 6 - L2 на трех стадиях очистки) от концентрации соединения IV: С 1=6.33 10⁴ моль/л (50 мг/л Se), С 2 = 6.33 10⁵ моль/л (5 мг/л Se), С 3=6.33 10⁶ моль/л (0.5 мг/л Se)

Квантовохимические и QSAR cвойства селенсодержащих соединений ряда 1,5-ди(4-R-фенил)-3-селенпентандионов-1,5. Электронное и пространственное строение изучаемых селенорганических соединений, их QSAR свойства могут служить предпосылкой наблюдаемого нами химического поведения этих соединений в процессах их взаимодействия с лектинами L. edodes. По данным расчетов на уровне теории B3LYP/6-31G(d,p), позволивших судить о некоторых пространственных параметрах и зарядах на атомах молекул селенсодержащих соединений, электронные и топологические характеристики молекул I-III очень близки между собой. Следовательно, различие во влиянии веществ на ГА способность определяется не остовом молекул (включающим атом Se и фрагмент CH₂COAr), а заместителем в положении 4 ароматического кольца (H, OCH₃, OC₂H₅ и н-OC₈H₁₇ в случае соединений I, II, III и IV соответственно). При этом положительный заряд на атоме селена свидетельствует о том, что в процессах, в которых селен проявляет себя как антиоксидант, он является электрофильным центром и может взаимодействовать с электроноизбыточными частицами, например молекулами кислорода O₂, пероксида водорода H₂O₂, супероксидным анион-радикалом O₂, тиолами RSH и др. [Blessing et al., 2004, Jacob et al., 1999]. Примечательная особенность селена состоит в его способности окислять тиолы в восстанавливающих условиях [Turan et al., 1997; Ganther, 1999; Jacob et al., 2003; Blessing et al., 2004].

На окислении тиолов следует остановиться особо. К числу общих свойств лектинов относится в том числе стабилизация углеводсвязывающих участков дисульфидными мостиками. То есть дополнительное образование -S-S- в молекулах исследуемых лектинов вполне может способствовать усилению способности последних к взаимодействию с углеводными структурами эритроцитов, иными словами - увеличению титров ГА.

Для выявления других возможных факторов, влияющих на химическое поведение селенорганических соединений при взаимодействии с лектинами, нами рассчитаны QSAR-свойства [Hasel et al., 1988; Still et al., 1990; Bodor et al., 1989; Gavezotti, 1983; Ghose and Crippen, 1986, 1987; Viswanadhan et al., 1989; Miller, 1990; Ghose et al., 1988] молекул I-IV.

Возможно, различие в реакционной способности селенсодержащих молекул в некоторой степени связано с их дифференциальной гидрофобностью.

Из общих свойств лектинов разного происхождения следует, что углеводы взаимодействуют с лектинами посредством водородных связей, координирования металлов, ван-дер-ваальсовых, гидрофобных взаимодействий [Elagavish and Shaanan, 1997]. Несмотря на преобладающе гидрофильный характер углеводов, гидрофобные взаимодействия играют важную роль в их распознавании лектинами. Особенно примечательно взаимодействие между ароматическими фрагментами аминокислот и галактозой в углеводсвязывающих участках галактозоспецифических лектинов, что приписывается взаимодействию между частично заряженными алифатическими протонами на поверхности кольца гексозы и частичным отрицательным зарядом р-электронов ароматической системы [Elagavish and Shaanan, 1997]. Отметим, что L1 и L2 галактозоспецифичны.

Участки гидрофобного связывания вообще очень характерны для лектинов. К ним относят и липидсвязывающие участки, хорошо изученные в случае бактериальных лектинов (адгезинов и токсинов) [Лахтин, 1989]. На примере некоторых бактериальных и вирусных лектинов показано, что липидсвязывающие участки характеризуются выраженными гидрофобными свойствами. Кроме того, можно предположить и особую роль ароматического кольца в структуре исследованных нами селенорганических соединений; наличие этого кольца могло бы оказать дополнительный положительный эффект в отношении углеводсвязывающих свойств лектинов L. edodes. Так, на примере лектинов бобовых показано, что гидрофобные пептиды в составе гидрофобной полости на поверхности лектиновых молекул участвуют во взаимодействии с фенильными и метильными производными сахаридов, поскольку такие пептиды располагаются в непосредственной близости от углеводсвязывающих участков [Лахтин, 1994; Луцик и др. 1981].

Если согласно [Лахтин, 1994; Луцик и др. 1981] принять ключевую роль ароматических фрагментов молекул I-IV в связывании с лектинами, то ясно, что остальная часть молекулы по-разному, из очевидных пространственных соображений, влияет на "арил-лектиновое" взаимодействие с результирующим разным титром гемагглютинации реакционной смеси. Вероятно, значительное увеличение длины углеводородной цепи в н-октилпроизводном (IV) может отчасти экранировать участвующий во взаимодействии с гликоконъюгатами эритроцитов арильный участок молекулы IV. Этому способствует гидрофобное взаимодействие, стремящееся уменьшить поверхность контакта между гидрофобной частью молекулы (ароматическим фрагментом и углеводородной цепью) и водой. При этом алкильная цепь может стерически экранировать ароматическое кольцо, препятствуя тем самым взаимодействию с лектином.

Сравнительный анализ реакционной способности L-цистеина и L-метионина: некоторые теоретические предпосылки замещения атома серы на селен. Cys и Met - единственные аминокислоты в белках, которые претерпевают обратимое окисление/восстановление в биологических условиях. Окисление серусодержащих боковых цепей Cys и Met кислородными агентами может приводить к окислительным состояниям серы, не способным восстанавливаться в биологических условиях. То есть нужны такие механизмы окисления, которые защищают против переокисления эти кислотные остатки и предотвращают необратимую потерю активности белка. В работе [Jones et al., 2004] показано, что редокс-потенциал стационарного состояния цистеин/цистиновой пары позволяет обепечить мягкое окисление белков без прямого участия более сильных окислителей.

С биохимической точки зрения Se замещает S в определенных цистеиновых фрагментах селенопротеинов. Он отличается от серы редокс-потенциалами и стабильностью в разных степенях окисления, что приводит к множественным каталитическим процессам с его участием [Jacob et al., 1999; Blessing et al., 2004].

Анализ литературы позволяет прийти к выводу, что наиболее вероятный химизм взаимодействия соединений Se с белками (в том числе лектинами) состоит в образовании связей разной прочности с серусодержащими аминокислотами лектинов, вплоть до, возможно, полного замещения серы на селен. Оба лектина L1 и L2 имеют в своем составе заметные количества серусодержащих аминокислот, цистеина и метионина. Представляет интерес рассмотреть эту проблему химизма более подробно, проведя сравнительный анализ реакционной способности L-Cys и L-Met и обсудив некоторые теоретические предпосылки замещения атома серы на селен. Задача сравнительного исследования Met и Cys интересна и в следующем аспекте.

В живых организмах селен обнаружен в составе нескольких индивидуальных соединений, но одной из основных форм существования органического селена в растительных и грибных тканях является селенометионин (SeMet) [Whanger, 2002]. Так, SeMet - преобладающее селенсодержащее соединение обогащенных селеном дрожжей: при стандартизированных условиях выращивания дрожжевых культур около 85 % селена содержится в них в виде SeMet [Ip et al., 2000]. Культура пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae способна ассимилировать до 3 мг/г биомассы Se [Demirci, 1999], при этом более 90 % общего Se находится в форме SeМet, а селеноцистеина (SeCys) лишь 0.5 % [Schrauzer, 1998; Schrauzer, 2000]. Та же картина наблюдается у высших съедобных грибов - культивируемых базидиомицетов, в том числе наиболее интересующего нас объекта исследований L. edodes. Судя по результатам работ [Yoshida et al., 2005; Ogra et al., 2004], в культуре шиитаке, выращенной на обогащенном селенитом натрия субстрате, основное соединение - SeMet, связанный с белком.

Таким образом, налицо явное "предпочтение" грибными культурами разных систематических групп именно органической формы селена в виде SeMet. Задача, поставленная в данном разделе работы - сравнительное квантовохимическое исследование электронного строения молекул и реакционной способности двух серусодержащих эссенциальных аминокислот - L-Cys и L-Met на начальном этапе взаимодействия с электрофильными реагентами для выяснения предпосылок замещения атома серы на селен именно в молекуле L-Met. Результативным оказался следующий подход:

i) использовали выявленные нами электрофильные свойства атома селена в селенорганических соединениях I-IV как исходное положение, позволяющее предположить возможность "облегченной" димеризации аминокислот в составе белковой молекулы лектина L. еdodes. Это привело к постановке задачи по теоретическому рассмотрению влияния селенсодержащих соединений на формирование дополнительных дисульфидных связей в молекуле лектина. Тиольная группа аминокислоты служит реакционным центром биохимически важных процессов - окислительной димеризации с формированием дисульфидных мостиков [Jacob et al., 1999, 2004; Giles et al., 2003b; Jones et al., 2004], замещения атома серы на селен [Moroder, 2005] и др. Указанные процессы важны для проявления биологической активности определенных классов белков, в том числе лектинов. Как отмечалось в разделе 3.5.1-4, к числу общих свойств углеводсвязывающих белков относится стабилизация сайтов связывания углеводов дисульфидными мостиками;

ii) под влиянием селенсодержащих соединений происходит процесс не только димеризации серусодержащих аминокислот с формированием дополнительных дисульфидных мостиков в белковой молекуле, но и образования селенсодержащих аналогов, SeCys и SeMet, известны и смешанные аналоги. Однако подобные модификации аминокислот, судя по данным литературы, выражены в различной степени у Cys и Met. Для выявления некоторых возможных причин этого мы поставили задачу теоретического рассмотрения полной замены серы на селен с образованием селензамещенных аминокислот. В целом результаты настоящей части работы (электронное строение, поляризуемость, дипольные моменты, липофильность) косвенно подтверждают бульшую склонность Met замещать атом серы на селен в биохимических процессах усвоения последнего по сравнению с Cys.

Положительное влияние изученных селенорганических соединений на активность внеклеточных лектинов необходимо рассматривать в совокупности с таким аспектом, как функционирование системы антиоксидантной защиты (АОЗ) грибов. Об антиоксидантных свойствах селеновых соединений в связи с их влиянием на активность лектинов упоминалось выше (раздел 3.5.1.4). Влияние цистеиновых фрагментов белковой молекулы на биологическую активность и, в частности, на белок-углеводные взаимодействия, предполагающее возможность обратимого окисления-восстановления цистеина в биологических условиях, требует благоприятствующих условий химического окружения и состояния тиольной группы. Вероятно, первоначальный акт взаимодействия в системе "соединение селена - -аминокислота", включающий взаимную ориентацию молекул реактантов и образование межмолекулярных водородных связей, служит предпосылкой того, что тиольная группа оказывается способной принимать участие в последующих стадиях (включающих более глубокие химические превращения) биологически значимых реакций.

Увеличение внутриклеточного уровня активных форм кислорода сопряжено с гипероксидантным состоянием клетки, предшествующим процессу клеточной цитодифференцировки [напр., Гесслер и др., 2006]. Неизбежно возникающие в клетке под действием внутренних и внешних факторов активные формы кислорода с одной стороны являются сигнальными молекулами, запускающими механизмы дифференцировки, а с другой стороны они создают необходимость присутствия в клетке системы АОЗ. Защита биологических молекул осуществляется не только ферментами, но и низкомолекулярными соединениями различной химической природы, вступающими в реакцию с активными формами кислорода. Существенную роль в защите клетки от окислительного стресса играют тиоловые соединения. Накапливаются данные о том, что многие тиолсодержащие белки, локализованные на клеточной поверхности и в экстраклеточной жидкости, могут подвергаться редокс-превращениям, откликаясь на изменение редокс-статуса клеточного окружения [Октябрьский и Смирнова, 2007].

Поддержание SH-групп в восстановленном состоянии и образование дисульфидных мостиков в молекуле белка - противоположно направленные реакции при взаимодействии препаратов внеклеточных лектинов с изученными селеноорганическими соединениями. Здесь играет роль соотношение процессов: с одной стороны - стабилизации структуры лектиновых молекул (S=S мостиками), активность которых при этом возрастает (в практическом плане это важно, как нами показано в разделе 3.4, на репродуктивных стадиях развития грибной культуры, особенно в коричневой мицелиальной пленке). С другой стороны - увеличение числа восстановленных тиоловых групп под влиянием антиоксидантных свойств соединений селена способно поддержать АОЗ, важную при окислительном стрессе, сопровождающем смену фаз развития мицелия [напр., Белозерская и Гесслер, 2006].

Ввиду такой неоднородности влияния селенсодержащих веществ неудивительно, что степень проявления эффекта изученных селенорганических соединений на активность лектинов L. edodes различна и зависит не только от природы селенового производного, но и от его концентрации, от содержания примесей в препаратах лектинов (т.е. от стадии их очистки). Тонкий баланс между окислительными и восстановительными молекулами, поддержание экстраклеточного тиол-дисульфидного статуса является важным инструментом регуляции биологической активности, передачи клеточных сигналов, дифференциации [цит. по Октябрьский и Смирнова, 2007].

Взаимодействие лектинов с катионами меди (II). Хотя медь и является необходимым элементом питания (см. обзор литературы в диссертации), она вызывает окислительный стресс в результате образования свободных радикалов в реакциях Габера-Вайса и Фентона [Halliwell and Gutteridge, 1984; Деви и Прасад, 2005]. В условиях индуцированного металлом окислительного стресса время жизни образовавшихся активных форм кислорода и их токсическое действие контролируются системой актиоксидантной защиты клетки, т.е. соответствующими метаболитами [Mazhoudi et al., 1997; Noctor and Foyer, 1998].

В заключение предыдущего раздела мы уже говорили об известном явлении взаимозависимости окислительного стресса, цитодифференцировки и перехода к репродуктивной стадии развития грибного мицелия, необходимости при этом усиления АОЗ и предполагаемой нами вовлеченности в эти процессы лектинов в связи с их взаимодействием с селенорганическими соединениями. Последние проявляют себя как антиоксиданты и, по всей видимости, при участии лектинов L. edodes могли бы усиливать АОЗ. Интересно выявить результаты взаимодействия лектинов с эффектором противоположного свойства, то есть способствующим углублению окислительного стресса и активизации тех вторичных метаболитов гриба (мы полагаем, и лектинов: см. раздел 3.4 диссертации), которые принимают участие в развитии последствий этого стресса, в конечном итоге в формировании признаков генеративной стадии развития мицелия. Еще раз в ином аспекте подойти к рассмотрению описанной проблемы помогает, на наш взгляд, изучение взаимодействия меди (II) с лектинами шиитаке.

В ряду катионов, представленных выше как последовательность в порядке уменьшения положительного эффекта катионов металлов(II) на активность внеклеточных лектинов шиитаке (Mg>Ca>Cu>Fe>Mn>Zn~Sn>Co>Ni) нас прежде всего заинтересовала медь(II). Было обнаружено, что лишь в случае меди имеет место зависимость "лектиновая активность-концентрация катиона", противоположная наблюдаемой для других металлов в настоящей работе: наибольшая активность внеклеточных лектинов проявлялась на среде с максимальным содержанием меди. Можно сформулировать несколько предположений о причинах и последствиях подобного эффекта меди(II):

- добавки ионов меди приводят к усилению биосинтеза внеклеточных лектинов L. edodes, при этом в неодинаковой степени для L1 и L2. Возможно также, что в присутствии Cu²⁺ имеет место накопление внеклеточных неактивных по гемагглютинации лектинов (например, связанных с металлом в комплекс или неактивных из-за токсического действия металла на грибную культуру). В этом случае удельная лектиновая активность (титр ГА/белок) не должна возрастать, она сохраняется или даже снижается из-за увеличения массы белка;

- значительно повышается активность экстрацеллюлярных лектинов, а прирост белковой массы "отстает" - происходит в гораздо меньшей степени. Тогда удельная лектиновая активность заметно возрастает. Сопровождаться такой эффект мог бы активным взаимодействием Cu(II) с внеклеточными лектинами в культуральной жидкости L. edodes. Если бы к тому же катионы меди проявляли "предпочтение" в отношении одного из лектинов, продукция и/или увеличение активности которого стимулируется ионами меди, - это могло бы способствовать дифференциации белков КЖ и иметь положительные последствия для процесса предварительного разделения компонентов КЖ с целью дальнейшей очистки лектинов. Ниже приводим экспериментальное подтверждение своих предположений.

Более подробное исследование в динамике внеклеточной лектиновой активности шиитаке при выращивании на синтетических средах с разными концентрациями Cu²⁺ (в интервале концентраций катиона от 2^.10^-4 до 1^.10^-2 моль/л) проводили, определяя удельную лектиновую активность, достигаемую в КЖ при используемых концентрациях компонентов среды. Наилучший результат получался при концентрации ионов меди (II) в синтетической среде культивирования L. edodes - 1 мМ, D-глюкозы - 300 мМ по углероду, L-аспарагина - 20 мМ по азоту. При возрасте глубинной культуры 14 сут достигалось более чем 8-кратное увеличение удельной лектиновой активности при указанной концентрации Сu²⁺ по сравнению с более низкими концентрациями меди из приведенного выше интервала значений. Оптимальная концентрация ионов Cu(II) в среде культивирования L. edodes составляет 1^.10^-3 моль/л, при этом удельная лектиновая активность на 14-е сут культивирования более чем в 2 раза выше, чем в контрольном эксперименте.

Далее мы подтвердили, что ион меди образует с лектинами комплексы, отличающиеся по хроматографическим свойствам. К питательной среде (состоящей из Glc (5^.10² M) и Asn (1^.10² M), характеризующейся по нашим данным высокой активностью внеклеточных лектинов L. edodes, был добавлен CuSO₄·5H₂O до концентрации 10^2-10⁴ M. Далее спустя 14 сут выращивания грибной культуры получали фильтрат КЖ и проводили осаждение ацетоном. Более полно произошло осаждение (осадка получилось больше), была обнаружена третья фаза примесных соединений меди, нерастворимая в смесях вода - ацетон. Гель-хроматограммы реакционных смесей были получены для разных концентраций Cu²⁺, возрастающих от 2^.10^-4 M до 1^.10^-2 M. Степень осаждения искомого белка оказалась значительно увеличенной (судя по поглощению при 280 нм, в 7,5 раз по сравнению с контролем в случае 1^.10^-2 M Cu²⁺).

Продукты разделения (на Sephadex G-25) фильтрата КЖ L. edodes (выращенного в присутствии сульфата меди указанных выше концентраций), осажденного ацетоном и растворенного в воде, анализировали методом электронной абсорбционной спектроскопии.

Меняется интенсивность и положение полосы 270 нм - ароматическое кольцо, находящееся в сопряжении (B-полоса). При переходе к концентрации Cu(II) от 0 к 1^.10^-2 М происходит возрастание интенсивности этой полосы. Вероятно, это обусловлено увеличением количества лектина при концентрации Cu(II) до 2^.10^-3 М. Смещение перегиба на кривой поглощения из области 270 нм в область 230 нм, имеющее место при дальнейшем повышении концентрации меди, слишком велико для неспецифических сольватохромных эффектов. Скорее всего, 230 нм - это уже не B-, а K-полоса ароматического кольца, то есть некие гетероатомы (N, O, S), неподеленные электронные пары которых находились в сопряжении с р-системами ароматических колец, координируются с медью и тем самым выключаются из цепи сопряжения. Происходит химическое взаимодействие, вероятно, комплексообразование с медью. Поэтому предположительно при увеличении концентрации меди до 5^.10^-3 М возрастает количество комплекса меди с лектином. Наконец, концентрация меди(II) 1^.10^-2 М оказывается достаточно высокой для связывания значительного количества лектина, что приводит к скачкообразному увеличению содержания указанного комплекса. Полученные данные подтверждают приведенную выше информацию о том, что оптимальна в отношении удельной лектиновой активности именно миллимолярная концентрация Cu²⁺, стимулирующая, очевидно, биосинтез лектина без потери его гемагглютинирующих свойств. Избыточная медь(II) (выше 5^.10^-3 М) препятствует проявлению лектином этих свойств.

Проведенные эксперименты наводят на мысль, что взаимодействие иона меди (II) с лектинами действительно привело к дифференциации их хроматографических характеристик. Одновременно с параметрами разделения белков при использовании катионов меди в качестве добавки к синтетической питательной среде, изменяется и продукция грибной культурой одного из лектинов (L2), но из-за связывания лектинов медью(II) с увеличением ее концентрации удельная лектиновая активность (титр/белок) проходит через максимум.

Образование хелатов металла с внеклеточными соединениями, часто неидентифицированными, исследователи связывают с адаптацией микроорганизмов к высоким концентрациям металла. Причем предполагается, что клетки выделяют хелатирующие агенты именно при длительном культивировании в присутствии металла, когда последний добавлен в период лаг-фазы [Налимова и др., 2005]. Насколько дифференцировано взаимодействие L1 и L2 с Cu²⁺, насколько превалирует усиление биосинтеза одного из лектинов (L2, судя по гель-хроматографическим характеристикам)? Как меняется их массовое соотношение с изменением концентрации соли меди в питательной среде? В пределах возможностей метода ответить на эти вопросы помогло нам осуществление рентгенофазового анализа экзолектинов L. edodes. Был проанализирован ряд образцов; порядок перечисления отвечает последовательности стадий выделения и очистки. Образцы 1, 2, 3, 4, 5, 6 получены осаждением ацетоном из фильтрата КЖ. В образце 1 не было меди(II), в образцы 2, 3, 4, 5, 6 в питательную среду добавлялось 5^..10⁴, 1^.10³, 2^.10³, 5^.10³, 1^.10² моль/л Cu²⁺. Образец L1+L2 - промежуточная стадия разделения белков L1 и L2, когда оба они присутствуют в смеси.

Рентгенограммы образцов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, L1+L2 содержат две группы пиков. Интенсивность пиков первой группы уменьшается от образца 1 к образцу 6, а интенсивность пиков второй возрастает. Первая группа пиков соответствует лектину L1, а вторая - L2. Полученные данные иллюстрирует табл. 3.

Таблица 3. Соотношения (C₂/C₁) концентраций лектинов L1 и L2

Корректность развитого подхода подтверждается результатами независимого гель-хроматографического исследования со спектрофотометрическим детектированием.

Для образцов L1, L2 пиков, аналогичных остальным образцам, не получено, из чего следует, что лектины L1 и L2 взаимодействуют друг с другом. Отсутствуют также пики, соответствующие свободным углеводам (использованным в качестве стандартных веществ). Таким образом, Glc входит в состав кристаллических форм гликопротеинов.

Следовательно, в данном разделе показано, что:

- Ион меди (II) избирательно взаимодействует с одним из двух внеклеточных лектинов L. edodes. В результате двух возможных процессов - усиления биосинтеза лектинов в присутствии меди (II) и/или участия меди (II) в дифференциации белков КЖ на стадии получения ацетонового осадка белковой природы - в отделенной осаждением части КЖ значительно увеличивается количество только одного (L2) из лектинов.

- Оптимальная концентрация ионов меди (II) в синтетической среде культивирования L. edodes составляет 1^.10^-3 моль/л, при этом удельная лектиновая активность в 2 раза выше, чем в контрольном эксперименте, а количество не растворимого в ацетоне примесного осадка соединений меди достаточно мало. Более низкие концентрации меди малодейственны, а более высокие характеризуются значительным количеством указанного осадка.

- Предложена и реализована, на примере экзолектинов L. edodes, методология расчета отношения концентраций веществ в образце по данным рентгенофазового анализа с точностью до постоянной величины.

- На основании предложенного подхода можно судить о взаимодействии двух экзолектинов L. edodes между собой, а также о полноте разделения этих белков на разных стадиях их очистки.

Взаимодействие экзолектинов шиитаке с фитогормоном ИУК. Некоторые доказательства участия фитогормона ИУК в процессах морфогенетической дифференциации грибов рода Lentinus, полученные в ходе простых экспериментов, существуют достаточно давно, хотя и описаны в единичных работах [Rypacek and Sladky, 1972, 1973]. Результаты этих исследований подтвердили предположение, высказанное в еще более ранней публикации, посвященной изучению дрожжей [Kamisaka et al., 1967], о том, что гормонально контролируемый механизм регуляции роста имеет много общих особенностей у грибов и высших растений.

Известно, что не только растения и бактерии, но и некоторые микромицеты (Pisolithus tinclorius и Paxillus involutus) способны образовывать связанные формы ИУК [Цавкелова и др., 2006]. ИУК связывается с сахарами, аминокислотами и белками, образуя запасные (неактивные) формы, из которых фитогормон при необходимости высвобождается и восстанавливает свою физиологическую активность [Дерфлинг, 1985]. Имеющейся к настоящему времени информации об ИУК в культуре базидиомицетов посвящен раздел обзора литературы 1.3.3.

На примере Lentinus tigrinus исследователями Rypacek и Sladky еще в 1972-1973 гг. доказано предположение о том, что в дифференциации грибной культуры важное место принадлежит фитогормонам, и что процесс морфогенеза тесно связан с динамикой уровня эндогенных регуляторов роста, в том числе ауксина ИУК. О взаимодействии ИУК с лектинами базидиомицетов сведения в литературе отсутствуют. Для нас представляло интерес выяснить возможность взаимодействия in vitro внеклеточных лектинов и фитогормона, объединить которые можно по признаку участия в морфогенетических процессах грибной культуры.

Для изучения взаимодействия "лектин-ИУК" использовали образцы лектинов и растворы ИУК в концентрациях 0,001; 0,01 и 0,1 г/л. Препараты двух внеклеточных лектинов (L1 и L2) L. edodes исследовали на трех основных стадиях очистки каждого белка. В результате "белковых объектов" - компонентов реакционных смесей получили шесть, условно обозначив их для целей настоящей работы следующим образом: в последовательности увеличения степени чистоты препарата белка 1, 3, 5 соответствовали L1, а 2, 4, 6 - лектину L2. Растворы исходных белковых компонентов (лектины 1-6) предполагаемых реакционных смесей готовили так, чтобы они характеризовались по возможности практически одинаковой лектиновой активностью. В качестве растворителя для ИУК выбрали этанол: H₂O (1: 1, v/v). При любой использованной (и даже более высокой) концентрации спиртового раствора ИУК собственная ГАА отсутствовала.

Полученные данные демонстрируют увеличение лектиновой активности в 8-64 раза в системе "лектин-ИУК" по сравнению с исходными белковыми растворами. Не просматривается явной зависимости результатов взаимодействия ни от концентрации ИУК, ни от степени чистоты препарата лектина. Ясно только, что по мере очистки лектинов титр ГА не снижается (или возрастает). Что касается концентрации ИУК, то оптимальной (по параметру ГАА продуктов взаимодействия ее с лектинами) следует считать 0,01 г/л: для образцов лектинов 1-4 и 6 титр ГА в 2-4 раза выше при этой концентрации. Образец 5 (напомним, это очищенный L1) образует продукт взаимодействия с ИУК, характеризующийся титром ГА 1024 независимо от концентрации фитогормона.

Эти результаты наводят на мысль о коцентрационно-насыщаемом взаимодействии в системе "лектин-ИУК", приводящем к образованию химически однородных для двух лектинов продуктов взаимодействия. Для дополнительной характеристики указанных систем мы использовали спектрофотометрический метод анализа. Продукты взаимодействия препаратов лектинов и ИУК анализировали методом электронной абсорбционной спектроскопии.

Различия спектров практически не проявляются при разной степени очистки лектина 1. Кривые для лектина 2 в зависимости от стадии его очистки отличались только по интенсивности поглощения и геометрически могли бы быть получены одна из другой параллельным смещением вдоль оси ординат. Оказалось, что комплекс (L1 + ИУК) характеризуется тем же набором максимумов поглощения (200, 220 и 280 нм), однако при ином соотношении интенсивностей.

Меняется интенсивность полосы 280 нм. Она снижается почти в 2 раза при переходе от начальной к конечной стадии очистки лектина 2. При одинаковом, в пределах погрешности измерений, исходном титре ГА это может означать стимулирующее влияние примесных к L2 соединений на процесс взаимодействия лектина с фитогормоном. Вероятно, подобный эффект правомерно назвать положительным каталитическим, поскольку качественные характеристики спектра поглощения сохраняются, и лишь снижается количество продуктов взаимодействия "ИУК-L2" при удалении примесных соединений. Максимум 220 нм - это, скорее всего, K-полоса ароматического кольца, то есть гетероатомы (N, O, S), азот ИУК, неподеленные электронные пары которых находились в сопряжении с р-системами ароматических колец, координируются с лектинами и тем самым выключаются из цепи сопряжения. Происходит химическое взаимодействие, вероятно, комплексообразование с лектинами.

Итак, внеклеточные лектины L. edodes взаимодействуют с фитогормоном ИУК, при этом значительно (в 8-64 раза) увеличивается титр гемагглютинации в системе "лектин-ИУК". Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу.

ВЫВОДЫ

1. В культуральной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета Lentinus edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.

2. Культура L. edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по составу и физико-химическим свойствам. Внеклеточный лектин L1 из L. edodes - гликопротеин с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 43 кДа. L1 имеет в своем составе (10,5 ± 1,0) % (m/m) углеводов, представленных глюкозой. Внеклеточный лектин L2 - протеогликан с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 37 кДа. L2 содержит в своем составе (90,3 ± 1,0) % (m/m) углеводов, представленных глюкозой (73 % (m/m) углеводной части молекулы лектина) и галактозой (27 % (m/m) углеводной части молекулы лектина). В L2 высоко содержание Asn: 42 % (m/m) от суммы аминокислот. Этот факт наряду с составом углеводной части молекулы (Glc+Gal) позволяет отнести L2 к N-аспарагинсвязанным белкам.

3. Два лектина L1 и L2 различаются по углеводной специфичности. Оба белка специфичны к D-галактозе и D-лактозе при одинаковой для L1 и L2 минимальной ингибирующей концентрации этих углеводов (2,08 мМ Gal; 8,33 мМ Lac). Другие углеводы, к которым лектины проявляют более или менее высокое сродство: для L1 это Rha (4,16 мМ); для L2 - Ara (4,16 мМ) и ManOH (8,33 мМ).

4. Два лектина L1 и L2 различаются по антигенным свойствам, имея при этом общие антигенные детерминанты. Очищенные внеклеточные лектины L. edodes высоко избирательны при узнавании определенных структур на поверхности трипсинизированных эритроцитов кролика, не реагируя с эритроцитами других животных и человека.

5. Установлено, что активность и динамика образования лектинов L. edodes зависят от условий культивирования, а именно: температуры, количества посевного мицелия, возраста культуры, а также от состава среды глубинного культивирования: соотношения количеств углерода и азота, природы компонентов - источников углерода и азота, кислотности среды. Оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной лектиновой активности шиитаке включает в качестве источника углерода L-Ara или D-Glc, источника азота - L-Asn.

6. Одним из значимых факторов, влияющих на лектиновую активность глубинной культуры L. edodes, является присутствие в среде культивирования катионов металлов(II). В отношении величин титров гемагглютинации и периодов проявления наибольшей лектиновой активности имеет значение не только концентрация катиона M²⁺, но и источник углеродного питания грибной культуры. Полученные данные для металлов, образующих эти катионы, позволяют составить следующий ряд в порядке уменьшения положительного эффекта на активность внеклеточных лектинов шиитаке: Mg>Ca>Cu>Fe>Mn>Zn~Sn>Co>Ni. Влияние двухзарядных катионов металлов триады железа на активность внеклеточных лектинов L. edodes изменяется симбатно с энергиями реакций хелатообразования гексааквокомплексов металлов с модельным бидентатным лигандом этиленгликолем.

7. При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адаптогенной ролью лектинов L. edodes.

8. Прослеживается взаимосвязь активности внеклеточных лектинов шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам, что может свидетельствовать об участии лектинов L. edodes в морфогенетических процессах и инициации плодообразования.

9. Изменения активности внеклеточных лектинов L. edodes при различных условиях взаимодействия препаратов лектинов с соединениями - представителями ряда 1,5-ди(4-R-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 в зависимости от структуры селенсодержащего компонента реакционных смесей, его концентрации, от стадии очистки белков, позволяют выявить влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий в химических процессах с участием лектинов. При этом результаты квантовохимических расчетов и QSAR свойства косвенно подтверждают бульшую склонность Met замещать атом серы на селен в биохимических процессах по сравнению с Cys.

10. Выявлено взаимодействие лектинов L. edodes с фитогормоном ИУК, при этом значительно (в 8-64 раза) увеличивается титр гемагглютинации в системе "лектин-ИУК". Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу. Возможность взаимодействия в указанной системе in vivo может основываться на участии обоих компонентов (и лектинов, по данным нашей работы, и ИУК, по литературным данным) в процессах морфогенетической дифференцировки мицелия высших грибов.

11. Впервые из внеклеточных метаболитов Lentinus edodes выделен галактолипид S3, являющийся одним из эндогенных регуляторов активности внеклеточных лектинов L. edodes. Галактолипид представляет собой D-галактопиранозу (15 % (m/m) S3 содержат сульфат-Gal), ацилированную остатками октадекановой или нонадекановой кислот в соотношении 28 % и 72 % (m/m) от суммы двух ЖК соответственно.

12. Предложена методика эффективного разделения двух внеклеточных лектинов L. edodes, основанная на дифференциации их хроматографических свойств в присутствии Cu(II).

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pankratov A.N., Tsivileva O.M., Nikitina V.E. Laccase of Lentinus edodes catalyzed oxidation of amines and phenolic compounds: a quantum chemical consideration // J. Biochem. Mol. Biol. 2000. Vol. 33, № 1. P. 37-42.

2. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Игнатов В.В. Гемагглютинирующая активность Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler]// Микробиология. 2000. Т. 69, № 1. С. 38-44.

3. Tsivileva O.M., Nikitina V.E., Garibova L.V., Ignatov V.V. Lectin activity of Lentinus edodes // International Microbiology. 2001. Vol. 4, № 1. P. 41-45.

4. Никитина В.Е., Озерова Р.А., Цивилева О.М. Особенности роста мицелия Lentinus edodes на различных средах // Бюллетень Ботанического сада Саратовского государственного университета. Саратов: Научная книга, 2003. Вып. 2. С. 176-179.

5. Панкратов А.Н., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Учаева И.М. Квантовохимическое рассмотрение возможной роли источника азота в связи с активностью внеклеточных лектинов при глубинном культивировании Lentinus edodes // Органические реагенты в организованных средах: Межвузовский сборник научных статей. Вып. 7. Саратов: Научная книга, 2003. C. 220-225.

6. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Взаимосвязь молекулярной структуры источника азота и активности внеклеточных лектинов при глубинном культивировании Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler]// Микробиология. 2004. Т. 73, № 4. С. 486-490.

7. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Гарибова Л.В. Стимуляторы лектиновой активности Lentinus edodes на синтетических агаризованных средах // Биотехнология. 2004. № 3. С. 49-54.

8. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Древко Б.И., Никитина В.Е. Влияние 1,5-дифенил-3-селенпентандиона-1,5 на лектиновую активность глубинной культуры Lentinus edodes // Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов: Сборник науч. трудов / Под ред. проф. А.П. Кривенько. Саратов: Научная книга, 2004. C. 301-303.

9. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Древко Б.И. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на морфолого-культуральные характеристики съедобного гриба шиитаке // "Вавиловские чтения - 2004": Материалы Всероссийской научно-практической конф., посв. 117-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова. Саратов, 24-26 ноября 2004. Секция физиологии и защиты растений. - Саратов: Изд-во СГАУ, 2004. - С. 36-39.

10. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Влияние состава среды культивирования на активность внеклеточных лектинов Lentinus edodes // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41, № 2. С. 200-203.

11. Tsivileva O.M., Pankratov A.N., Nikitina V.E., Garibova L.V. Effect of media components on the mycelial film formation in submerged culture of Lentinus edodes (Shiitake) // Food Technol. Biotechnol. 2005. Vol. 43, № 3. P. 227-234.

12. Силина Ю.Е., Кучменко Т.А., Коренман Я.И., Цивилева О.М., Никитина В.Е. Применение полного факторного эксперимента для разработки газового сенсора на основе экстрактов мицелиального гриба Pleurotus ostreatus // Журн. аналит. химии. 2005. Т. 60, № 7. С. 759-764.

13. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Древко Б.И., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и лектиновую активность Lentinus edodes // Биотехнология. 2005. № 2. С. 56-62.

14. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров О.Е., Гарибова Л.В. Взаимосвязь углеводной специфичности лектинов и углеводного состава мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] на разных стадиях морфогенеза // Микробиология. 2005. Т. 74, № 5. С. 714-716.

15. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Лощинина Е.А. Поиск группоспецифичных лектинов грибного происхождения // Успехи медицинской микологии. Том V / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2005. С. 201-205.

16. Pankratov A.N., Tsivileva O.M., Nikitina V.E. A Brief Guide to Mycology Web Resources // Online Information Review. 2006. Vol. 30, № 1. P. 43-52.

17. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Использование двухвалентного марганца при получении посевного мицелия Lentinus edodes // Микология и фитопатология. 2006. Т. 40, вып. 2. С. 142-145.

18. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Лощинина Е.А., Никитина В.Е. Экспериментальное и теоретическое исследование влияния катионов металлов триады железа на активность внеклеточных лектинов Lentinus edodes // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2006. Т. 47, № 2. С. 91-96.

19. Степанова Л.В., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В., Тюрюкина Е.В. Гемагглютинирующая активность некоторых базидиальных ксилотрофов на стадии дикариотического мицелия // Микология и фитопатология. 2006. Т. 40, вып. 4. С. 307-313.

20. Лощинина Е.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Пономарева Е.Г., Шелудько А.В. Морфолого-культуральные характеристики базидиомицета Lentinus edodes при совместном культивировании с бактериями рода Azospirillum // Вестник СГАУ. 2006, № 6, вып. 2. С. 24-26.

21. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А. Взаимоотношения ксилотрофных базидиомицетов и почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum // Успехи медицинской микологии. Том VII / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2006. С. 293-294.

22. Цивилева О.М., Макаров О.Е., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Изменение жирнокислотного состава общих липидов и лектиновой активности Lentinus edodes в процессе морфогенеза // Микология и фитопатология. 2007. Т. 41. № 5. С. 450-455.

23. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Никитина В.Е., Бычков Н.А., Лощинина Е.А. Влияние некоторых неорганических соединений на активность внеклеточных лектинов гриба Lentinus edodes // Известия Саратовского университета. Новая серия. 2007. Т. 7. Серия: Химия. Биология. Экология. Вып. 1. C. 21-27.

24. Nikitina V.E., Tsivileva O.M., Pankratov A.N., Bychkov N.A. Lentinula edodes Biotechnology - From Lentinan to Lectins // Food Technology and Biotechnology. 2007. Vol. 45, № 3. P. 230-237.

25. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров О.Е., Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А. Биохимические особенности развития мицелия Lentunus edodes в совместной культуре с диазотрофными бактериями Azospirillum brasilense // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 9-12.

26. Пучкова Т.А., Филимонова Т.В., Бабицкая В.Г., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Щерба В.В., Иконникова Н.В. Меланиновые пигменты грибов Lentinus edodes и Ganoderma lucidum // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 17-20.

27. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Иконникова Н.В., Смирнов Д.А., Осадчая О.В. Гликопротеины Lentinus edodes: факторы, влияющие на их образование // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 142-144.

28. Смирнов Д.А., Щерба В.В., Никитина В.Е., Рожкова З.А., Бабицкая В.Г., Цивилева О.М., Пучкова Т.А., Осадчая О.В. Сравнительное изучение экзо- и эндополисахаридов, образуемых Lentinus edodes при различных способах культивирования // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 181-183.