Внеклеточные лектины Lentinus edodes: характеристика, свойства и предполагаемые функции

В пользу отнесения пиков к OH- или NH-протонам свидетельствует то, что все сигналы в той или иной степени уширены. Причиной уширения сигналов протонов при гетероатомах обычно является их участие в обменных взаимодействиях, а в случае протонов при атоме азота - также наличием у ядра ¹⁴N электрического квадрупольного момента [Панкратов и Остроумов, 1995].

Спектр не содержит сигналов алкильных и циклоалкильных протонов, не связанных с электроноакцепторными атомными группами, а также протонов ароматических, хиноидных, пиридиновых, пиррольных, фурановых, тиофеновых циклов, альдегидных протонов (RCHO), подвижных атомов водорода карбоновых кислот (RCOOH), сульфокислот (RSO₃H), оксимов (R₂C=NOH), алкилтиолов (AlkSH).

Учитывая характер образца, можно исключить возможность присутствия фрагментов CH₂NCOR, CH₂NSO₂R, CH₂N=C=S, CH₂⁺NC, CH₂SO₂F, CH₂Cl, CH₂Br, CH₂I, структурных элементов XCH₂Y и XCHY, кроме приведенных в табл. 1 -аминокислотных, а также C=CH₂, ROC=CH, AlkNH₂, AlkNHAlk', ArNH₂, ArNHR, ArSH.

Следовательно, спектр ЯМР ¹H образца не противоречит возможности наличия в его составе углеводных и -аминокислотных звеньев, то есть протеогликановой природе L2.

Выделение и характеристика внеклеточного гликолипида L. Edodes. Используя экстракцию смесями метанол-вода-хлороформ, из L2 на промежуточной стадии его очистки мы получили препарат, содержащий Gal (выход 0,19 %) и жирные кислоты (выход 0,17 %) С 8:0 и С 9:0 (в соотношении 28 % и 72 % (m/m) от суммы двух ЖК соответственно). Путем простых вычислений из экспериментально найденного соотношения масс Gal и алкановых кислот получаем, что в выделенном препарате (обозначенном нами S3) на одну молекулу Gal приходится 1 молекула ЖК. Это в пределах погрешности эксперимента подтверждается теоретическими подсчетами (приведены в тексте диссертации). Согласно результатам элементного анализа, 15 % молекул галактолипида сульфатировано. То есть главными компонентами S3 являются Gal (1-сульфат-Gal), ацилированная остатками октадекановой или нонадекановой кислот. Указанные методы исследования дополнены ИК-спектроскопическими.

В ИК-спектре галактолипида S3 наблюдались случаи, когда полосы можно относить к сульфатной группе. Имелись типичные алифатические полосы, свидетельствовавшие о присутствии углеводородной цепи ацильного заместителя, а также признаки полиметиленовой цепи. Отнесения частот для колебания с участием связей C-O в карбоновых кислотах, сложных эфирах (1155 и 1111 см^-1) могут говорить о сложноэфирном характере присоединения жирнокислотного заместителя Gal. В целом отнесения частот не противоречат возможности наличия в составе соединения S3 углеводных звеньев и ЖК остатков.

Накопление входящих в состав S3 короткоцепочечных ЖК происходит в мицелии шиитаке на стадии формирования коричневой мицелиальной пленки и коррелирует с резким повышением внеклеточной лектиновой активности в смывах с мицелия именно на этой морфогенетической стадии. Никакого повышения содержания в мицелии ЖК С 8:0 или С 9:0 не наблюдается при образовании недифференцированных плодовых тел на белом мицелии, когда и увеличения лектиновой активности не происходит. Более подробному описанию изменений жирнокислотного состава мицелия во взаимосвязи с лектиновой активностью культуры в процессе морфогенеза посвящен один из разделов настоящей работы.

Можно высказать предположение о возможной роли S3 как одного из регуляторов активности внеклеточных лектинов. Кроме корреляции накопления компонентов S3 с увеличением лектиновой активности, о возможном вкладе гликолипида в регуляцию этой активности говорят результаты других наших наблюдений. В смесях препаратов S3 + L1 и S3 + L2 при одинаковой массовой концентрации компонентов титр гемагглютинации возрастает в 8 и 16 раз соответственно (собственной ГА активности S3 не проявляет). Кроме того, в ходе процедуры очистки препарата L2 удельная активность его проходит через максимум на промежуточной стадии, на которой L2 связан с S3, а затем заметно снижается по мере дальнейшей очистки L2.

Длительное время в литературе обсуждаются вопросы, связанные с неспецифичностью реакции клеток микроорганизмов в ответ на самые различные внешние воздействия. В общем механизме приспособления к неблагоприятным условиям или стрессу значимую роль играют регуляторные соединения, экскретируемые во внеклеточную среду (факторы стресса) [Андреев и др., 1988]. Среди компонентов фактора были выявлены урацил, фосфаты, жирные кислоты (С 9:0 и С 10:0), олигосахариды. (Примечание: среди компонентов S3 72 масс % жирно-кислотного пула приходится на С 9:0). Подобное соединение синтезируется одним из первых на фоне затухания метаболических процессов, работающих в состоянии нормы [Феофилова, 1994].

Мы полагаем, что в дополнение к комплексу вторичных метаболитов, экскретируемых культурой L. edodes, под воздействием изменившихся в отрицательную сторону условий внешней среды (питательный стресс, переход к цитодифференцировке вследствие истощения питательных ресурсов) присоединяются вещества - регуляторы лектиновой активности, одним из которых является S3.

С учетом разнообразия биологического происхождения продуцентов гликолипидов с признаками как явного сходства, так и немаловажного в функциональном плане различия молекулярного строения обсуждаемых соединений, выявляемых современными исследованиями [Cheng et al., 2003; Голубев и др., 2004; Воробьева и др., 2006; Плужников и др., 2006; Кулаковская и др., 2007], не представляется особенно удивительным тот факт, что L. edodes и, вероятно, другие макробазидиомицеты способны самостоятельно синтезировать подобные соединения, однако пока в отношении данной систематической группы такой информации в литературе мы не встречали.

Зависимость лектиновой активности от условий культивирования. Имеется ряд признанных важными физико-химических и биологических факторов внешней среды, которые могут служить триггерами процессов сложного пути развития мицелиальных грибов [Феофилова и др, 1988]. От таких параметров внешних условий, как температура культивирования, количество посевного материала, возраст культуры, состав питательной среды (природа веществ - источников углеродного и азотного питания, соотношение "C:N", кислотность), мы изучали зависимость активности лектинов L. edodes для успешного решения в дальнейшем проблемы получения этих биологически активных соединений методом глубинного культивирования.

Влияние количества посевного мицелия, температуры, возраста культуры на лектиновую активность L. Edodes. Для изучения влияния количества посевного мицелия на активность внеклеточных лектинов гриба мы выбрали способ дозирования посевной культуры - дисками сусло-агара, покрытыми мицелием (d=5 мм). Зависимость лектиновой активности КЖ от дозы посевного мицелия изучали в процессе роста культуры на синтетической Glc-Asn среде. Оказалось, что зависимость лектиновой активности КЖ от количества посевного материала характеризуется непропорционально быстрым увеличением этой активности, имеющим предельное значение при определенном количестве инокулята.

Изучение зависимости лектиновой активности от температуры культивирования показало, что титры ГА имеют более высокие значения как при повышении температуры, так и при ее понижении по сравнению с оптимумом роста (26^оС). Для корректности сравнения лектиновой активности у разных штаммов L. edodes, культивируемых одно и то же время, проведены эксперименты по определению скорости роста используемых штаммов при данных температурных условиях выращивания. Оказалось, что таких резких изменений, как это имеет место в плане лектиновой активности, скорость роста не претерпевает ни в зависимости от штамма, ни тем более от температуры выращивания. Штаммовые различия скоростей роста относительно невелики: не более чем в 1,1 раза при 37^оС, в 1,2 раза при 26^оС, в 1,3 раза при 16^оС, а штаммовые различия по лектиновой активности достигают 5,1·10³ раз (при 37^оС). Изучали влияние выбранных температур на лектиновую активность КЖ в процессе роста культуры, а также зависимость скорости роста всех исследуемых штаммов L. edodes от времени культивирования (рис. 2).

Рис. 2. Зависимость лектиновой активности КЖ (а, б, в) и скорости роста (г) L. edodes от времени культивирования при различных температурах выращивания (26^oС (a, г), 16^oС (б), 37^oС (в)), штаммы: 1 - NY, 2 - F-249, 3-2T, 4-0779

Видно, что штаммовые различия в отношении ГА активности КЖ, сравнительно небольшие при 16^oС, увеличиваются при 26^oС с одновременным изменением вида соответствующей кривой. При 37^oС штаммовые различия продолжают углубляться, резко отличается от других штамм NY. Сопоставление характера зависимостей на рис. 2 (а, б, в) с рис. 2 (г) позволяет сделать вывод, что изменения лектиновой активности в нашем эксперименте не определяются только скоростью роста. Аналогичный вывод был сделан нами и ранее для случая температурного оптимума 26^оС: лектиновая активность - биохимическая характеристика, производная не только от способности грибной культуры к накоплению биомассы.

Активность внеклеточных лектинов L. edodes в зависимости от источников углерода и азота. Исследования, связанные с образованием внеклеточных лектинов шиитаке в зависимости от условий глубинного культивирования, позволяют представить характеристику внешних условий биосинтеза лектинов культуры, выявить оптимальную в этом отношении химически детерминированную среду выращивания и усовершенствовать процедуру выделения и очистки экзолектинов. С этой целью первоначально мы изучали жидкие среды разнообразного химического состава, а именно с различными источниками углерода и азота, низкомолекулярными компонентами-добавками, значениями рН среды, в динамике роста культуры.

Анализ КЖ показал значительное увеличение титров ГА для всех сред с моносахаридами в качестве источника углерода по сравнению с лектиновой активностью сред на основе других углеводов или ацетата натрия. В этой связи особенно выделяется Ara, титр ГА при использовании которой в КЖ возрос не менее чем в 8 раз по сравнению с другими изученными веществами. Обнаружено, что наибольшей лектиновой активностью характеризуется среда выращивания "Ara - Asn" при соотношении С:N (9,5-12):1 на 15-18-е сут культивирования (титр ГА 8192), а также "Glc - Asn" при возрасте культуры 3-7 сут и C:N 17:1 (титр ГА 4096). Отмечено значительное увеличение лектиновой активности при рН 8-9 и отсутствие положительного эффекта рН-статирования растущей культуры.

Эффект некоторых низкомолекулярных компонентов среды: эксперимент и квантовохимическое рассмотрение. Катионы двухвалентных металлов. Известно стимулирующее влияние некоторых микроэлементов, в том числе катионов металлов, на синтез вторичных метаболитов различными грибами [Scott and Gaucher, 1984; Козловский и Соловьева, 1986; Hughes and Poole, 1989; Ловкова и др, 1995; Козловский и др., 2000]. О механизмах их действия на процесс в целом или на его отдельные этапы известно крайне мало. Исследование лектиновой активности L. edodes во взаимосвязи с химическим составом среды культивирования мы продолжили с использованием введения в состав синтетических сред катионов металлов (II) в виде солей. Девять металлов(II) выбрали по принципу биологической значимости их катионов для минерального питания грибов. Соли выбранных металлов входят в микроколичествах в состав оптимизированных питательных сред ксилотрофных базидиомицетов [напр., Бухало, 1988; Дворнина, 1990; Дудка и др., 1992].

Изучая зависимость лектиновой активности глубинной культуры L. edodes от концентрации солей металлов(II) в синтетической среде выращивания, мы установили, что одним из факторов, влияющих на эту активность, несомненно является присутствие в среде культивирования солей металлов в степени окисления +2. В случае меди имеет место зависимость "лектиновая активность - концентрация катиона", противоположная наблюдаемой для других металлов в настоящей работе: наибольшая активность внеклеточных лектинов проявлялась на среде с максимальным содержанием меди.

В отношении величин титров гемагглютинации и периодов проявления наибольшей лектиновой активности имеет значение не только концентрация катиона Me²⁺, но и источник углеродного питания грибной культуры. Так, среды выращивания с Ca²⁺ и Glc (рис. 3а), Suc (рис. 3б), Ara (рис. 3в) различаются как величинами титров ГА (максимальные значения составляют 1024 для Glc и Ara, 256 для Suc), так и периодами проявления наибольшей лектиновой активности. Так, титр 1024 наблюдается при содержании Са ²⁺ 1 мM на 9-е сут и в период 16-28 сут культивирования в случае Glc, но только в интервале 21-28 сут в случае Ara. Максимальная лектиновая активность (титр 256) для среды с Suc наблюдается лишь на 3-и и 5-е сут, причем при той же 1 мM концентрации Са ²⁺.

Полученные данные для металлов, образующих обсуждаемые выше катионы, позволяют составить последовательность в порядке уменьшения положительного эффекта Ме ²⁺ на активность внеклеточных лектинов шиитаке:

Mg > Ca > Cu > Fe > Mn > Zn ~ Sn > Co > Ni.

а б в

Рис. 3. Зависимость летиновой активности (lgT) КЖ L. edodes F-249 с добавкой Са ²⁺ при использовании в качестве источника углерода: D-Glc (а), Suc (б), L-Ara (в) от времени культивирования. [Ca²⁺], мM: (61,68,75) - 0; (62,69,76) - 1; (63,70,77) - 2; (64,71,78) - 4; (65,72,79) - 6; (66,73,80) - 8; (67,74,81) - 10

Катионы металлов триады железа. Интерес представляет объяснение влияния катионов металлов на лектиновую активность с позиций квантовой химии. Металлы, рассмотренные в настоящей работе, очень различны по положению в Периодической системе элементов и по свойствам. Поэтому для столь многофакторного свойства, как лектиновая активность, корректные сопоставления можно делать только в ряду близких по важнейшим характеристикам катионов металлов. Поэтому нами в этом плане рассмотрена триада железа, кобальта, никеля.

Вероятный механизм положительного влияния катионов металлов на лектиновую активность состоит в том, что они образуют смешаннолигандные комплексы с гидроксильными группами лектинов и гликоконъюгатов, способствуя обратимому связыванию гликоконъюгатов лектинами. Из-за сходства электронной конфигурации и электростатических предпосылок комплексообразования изучаемых катионов с кислородсодержащими лигандами есть основания полагать, что различия определяются термодинамикой реакций комплексообразования, прочностью связи металл - кислород. Для проверки этого предположения мы провели квантовохимическое ab initio исследование термодинамики реакций гексааквокомплексов Fe(II), Co(II) и Ni(II) с модельной системой - EG, типичным хелатообразующим реагентом и простым аналогом углеводов. Оценивали тенденцию изменения значений полной энергии молекулярных систем в ряду металлов, а именно DE как аналог свободной энергии (DG) реакции без учета энтропии (корректность использования величины DE вместо DG показана в тексте диссертации).

Ряд уменьшения склонности катионов к комплексообразованию с этиленгликолем Fe²⁺ > Co²⁺ " Ni²⁺, полученный из квантовохимических расчетов, согласуется с рядом уменьшения влияния этих катионов на лектиновую активность: Fe²⁺ > Co²⁺ > Ni²⁺. При этом все величины DE положительны, что свидетельствует о несамопроизвольности, обратимости возможных процессов комплексообразования. Катион металла не должен быть связан в прочный комплекс, и связывание лектина с гликоконъюгатом обратимо, что отражает важнейшую особенность взаимодействия лектинов с гликоконъюгатами.

Наряду с описанным выше квантовохимическим ab initio исследованием термодинамики реакций гексааквокомплексов Fe(II), Co(II) и Ni(II) с EG, мы провели экспериментальное исследование поведения моделируемой системы, определяли в динамике лектиновую активность КЖ L. edodes в разных вариантах опыта.

В качестве обобщения данной части работы следует сказать, что мы исследовали эффекты двухзарядных катионов металлов триады железа в составе жидкой синтетической среды культивирования, проявляющиеся в изменении активности внеклеточных лектинов L. edodes, и попытались объяснить влияние катионов металлов на лектиновую активность с позиций квантовой химии. Показано, что активность внеклеточных лектинов зависит от присутствия в среде культивирования двухзарядных катионов металлов триады железа. Влияние Fe²⁺, Co²⁺, Ni²⁺ на лектиновую активность изменяется симбатно с рассчитанными на уровнях теории UHF/3-21G(d,p), MP2/3-21G(d,p)//UHF/3-21G(d,p) энергиями реакций хелатообразования гексааквокомплексов металлов с модельным лигандом EG. Гипотеза об обратимом связывании катионов металлов в непрочные смешаннолигандные комплексы с лектинами и гликоконъюгатами, разумно объясняющая различное влияние катионов металлов на лектиновую активность, получила квантовохимическое обоснование на примере трех металлов (Fe, Co, Ni).

Селен в органической форме. Актуальность изучения влияния Se на физиолого-биохимические характеристики грибных культур и отсутствие соответствующей информации в отношении шиитаке (об этом можно судить при рассмотрении обзора литературы) дало нам основания к проведению описанных ниже исследований. Мы использовали новое органическое соединение Se, обладающее преимуществами перед селенатами и селенитами натрия. 1,5-Дифенил-3-селенпентандион-1,5 (препарат ДАФС-25) является одним из немногочисленных селеноорганических соединений, внедренных в практику [Древко и др., 2001].

Исследована зависимость лектиновой активности и ростовых характеристик L. edodes от присутствия в жидких и агаризованных средах селенсодержащего компонента ДАФС-25. Наблюдается стимуляция процесса накопления биомассы при глубинном культивировании в присутствии селеновых добавок; относительно быстрорастущий мицелий более подвержен позитивному влиянию препарата. Выявлено положительное воздействие ДАФС-25 на ростовые показатели L. edodes на агаризованных средах, при этом максимальный эффект достигается в случае среды с наиболее низкой скоростью роста мицелия. Под воздействием ДАФС-25 лектиновая активность как культуральной жидкости, так и мицелиальных смывов L. edodes в наибольшей степени возрастает в случае синтетической среды, характеризующейся высокой активностью внеклеточных лектинов изучаемой культуры и сравнительно низкой лектиновой активностью смывов с мицелия в отсутствие ДАФС-25.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что селенсодержащий препарат ДАФС-25 в концентрации 10^-4 г/л в пересчете на селен оказывает заметное действие на процессы жизнедеятельности L. edodes, выраженное в изменении ростовых параметров и лектиновой активности культуры как на жидких, так и на агаризованных средах. Селеновая добавка в наибольшей степени стимулирует рост и лектиновую активность шиитаке на синтетической агаризованной среде, характеризующейся низкими значениями как ростовых показателей, так и лектиновой активности смывов с мицелия, в отсутствие ДАФС-25. Кроме того, под воздействием препарата возрастает лектиновая активность и на жидкой синтетической среде, характеризующейся максимальными в нашем эксперименте титрами гемагглютинации. Сравнительно низкая при отсутствии ДАФС-25 лектиновая активность или смывов с мицелия (как это имеет место в случае синтетической среды), или культуральной жидкости (среда с дубовыми опилками) может, по-видимому, служить отчасти предпосылкой более выраженного стимулирующего эффекта ДАФС-25 в отношении активности внеклеточных лектинов культуры.

Воздействие неблагоприятных факторов на лектиновую активность L. Edodes. Одним из достаточно важных вопросов, который возникает при исследовании эффектов добавок различных компонентов к среде культивирования, является вопрос о том, как повлияют условия "питательного стресса" (терминология в соответствии с работой Е.П. Феофиловой (1994)) на изучаемую биологическую активность. В зависимости от того, будет ли наблюдаться повышение активности внеклеточных лектинов при выращивании на неполноценных синтетических питательных средах, можно было бы сделать предположение об участии лектинов в адаптации культуры к неблагоприятным факторам внешней среды.

Идентифицированные внеклеточные соединения, участвующие в адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды, по химической природе относятся к разным типам. Они представлены белками, углеводородами, органическими кислотами, нуклеотидами, аминокислотами, липопептидами, летучими соединениями [Николаев, 2004]. Однако большая часть таких соединений в настоящее время не идентифицирована. Снижение уровня энергетического и конструктивного метаболизма и выход из неповрежденных клеток компонентов внутриклеточного пула являются характерными для защитных метаболических реакций (напр., [Андреев и др., 1988]). Модуляции в лектиновой компоненте внеклеточных белков культуры L. edodes, возможно, являются одним из механизмов, регулирующих метаболизм грибных клеток под влиянием внешних факторов. Начальный подход к доказательству данного предположения осуществлен в настоящем разделе работы. Нам не удалось найти сведений об изучении в подобном аспекте микологических культур.

В качестве показателя "неблагоприятности" условий культивирования гриба мы использовали ростовые характеристики (замедление роста мицелия на агаризованных средах) и изучали, будет ли наблюдаться повышение активности внеклеточных лектинов при выращивании на таких средах. Представляло интерес исследовать культуральную жидкость L. edodes F-249 с тем же, как у агаризованных, составом исходных жидких сред на присутствие внеклеточных лектинов. Получены также данные по лектиновой активности культуральной жидкости L. edodes F-249 при выращивании на жидкой среде с Glc. В этом случае в качестве посевного материала служил мицелий, полученный на всех указанных выше агаризованных синтетических средах.

В пользу высказанных выше предположений о стимулирующей роли неблагоприятных условий выращивания на лектиновую активность шиитаке свидетельствуют медленно растущие колонии на агаризованных средах разных составов, характеризующихся одновременно высокими титрами ГА, а также примеры обратной ситуации, то есть "быстрый рост - низкая лектиновая активность".

Следовательно, результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что компоненты питательных сред, неблагоприятные для роста культуры, при определенных условиях стимулируют повышение лектиновой активности шиитаке. Вполне вероятно, что постоянное присутствие внеклеточных лектинов Lentinus edodes, обнаруженное нами, - не препятствие для предварительного (требуется дальнейшее углубленное изучение) отнесения их к описанным протекторным белкам. Здесь, опираясь на данные литературы по бактериальным внеклеточным факторам адаптации [Николаев, 2004], необходимо также учитывать, что факторы адаптации протекторного типа могут быть и, как правило, являются долгоживущими. А сигнальные молекулы, молекулы-зонды, для которых изучена динамика их появления и исчезновения из культуральной жидкости, относительно короткоживущие, они быстро накапливаются в среде до активной концентрации и быстро элиминируются.

Лектины шиитаке в процессах морфогенеза. Исследования, представленные в данном разделе, затрагивают такой малоизученный вопрос, как взаимосвязь процессов роста и развития грибного мицелия с синтезом соединений, способных регулировать включение той или иной морфогенетической программы. К числу таких соединений безусловно относят и важнейшие компоненты химического состава мицелия - липиды и углеводы [Феофилова и др., 1994, 2000; Терешина и др., 2002]. Предположение о том, что к числу таких соединений принадлежат грибные лектины, мы постараемся доказать далее. Поэтому наряду с активностью лектинов шиитаке мы исследовали углеводный состав мицелия L. edodes и жирнокислотный состав общих липидов на разных стадиях морфогенеза.

Лектиновая активность L. edodes на разных стадиях формирования плодовых тел. Особый интерес представляет обнаружение и изучение лектиновой активности культуры L. edodes в процессе развития, проследив за изменениями этой активности на стадиях образования различных вегетативных структур, в том числе пигментированной мицелиальной пленки (МП). Исследования показали, что это образование представляет собой плотное сплетение толстостенных пигментированных гиф. У L. edodes МП обычно предшествуют образованию примордиев и далее плодовых тел [Гарибова и др., 1997].

Учитывая время появления МП и титры ГА мицелиальных смывов для этой вегетативной структуры, мы сделали вывод о том, что чем выше ТГА в смывах с мицелия, тем быстрее формируется МП, с более высокой при этом лектиновой активностью. В экспериментах по получению плодовых тел на чашках Петри мы наблюдали, что в дальнейшем процессе морфогенеза и плодовые тела образуются лишь в случае МП с максимальной лектиновой активностью. внеклеточный лектин lentinus свойство

При проведении экспериментов по определению лектиновой активности на различных стадиях морфогенеза (непигментированный мицелий; пигментированный мицелий; коричневая мицелиальная пленка; мицелиальная корка; примордии; незрелое плодовое тело; зрелое плодовое тело) нами было показано, что лектиновая активность различна на всех стадиях развития гриба. ГА активность смывов с мицелия, примордиев, ножки плодового тела существенно ниже, чем в случае МП. Важно отметить тот факт, что появление пигментированного мицелия, предшествующего образованию МП, не приводит к увеличению ГА активности. Лишь формирование плотной коричневой МП дает резкое повышение титра ГА. Можно предположить определенное значение лектинов на каждом этапе морфогенетического развития гриба, особенно на стадии образования МП. Согласно имеющейся информации [Botton and Guillot, 1987; Richard, 1995], образование специализированных вегетативных структур в процессе роста грибов требует мицелиальной агрегации, и внеклеточные лектины могут участвовать в обеспечении сцепления между гифами [Kaneko et al., 1993].

Определение углеводных гаптенов для агглютининов различных вегетативных структур шиитаке позволило представить последовательность по возрастанию ингибирующей концентрации углевода: D-Lac>D-Gal>D-GalN>D-GlcN>L-Rha, которая нарушается в единственном случае (плодовое тело, штамм F-249), когда Gal и Lac в приведенном ряду меняются местами.

Формирование пигментированной мицелиальной пленки в глубинной культуре шиитаке в зависимости от активности внеклеточных лектинов. Итак, участие лектинов в формировании пигментированной мицелиальной пленки L. edodes подтверждается рядом экспериментов, описанных выше. Эти эксперименты были проведены в условиях твердофазного культивирования. Возникает вопрос о существовании взаимосвязи лектиновой активности L. edodes и морфогенетических процессов в условиях жидких питательных сред. Каковы условия формирования МП в глубинной культуре, зависит ли образование этой морфогенетической структуры от активности внеклеточных лектинов? Для выяснения этих вопросов впервые предприняты попытки получения МП на жидких синтетических средах, характеризующихся высокой лектиновой активностью.

Суммируя результаты оптимизации состава среды выращивания в отношении лектиновой активности, описанные выше, можно заключить, что активность внеклеточных лектинов L. edodes F-249 высока для сред с аминокислотным азотом (ТГА достигает значения 4096 при соотношении C:N, равном 17:1). Однако появление МП наблюдалось только после 55-60 суток культивирования.

Мы попытались получить МП L. edodes F-249 с использованием ряда добавок к синтетической среде, в частности, солей Ca, Mn(II): CaCl₂^.2H₂O, MnCl₂^.4H₂O. Обнаружен положительный эффект катионов Са²⁺ (2-10 ммоль/л) или Mn²⁺ (0,5-2 мM). В отсутствие аминокислотного источника азота не обнаружено влияния этих катионов на появление МП. Среди изученных нами эссенциальных аминокислот выражен эффект Asn на процесс образования МП в жидкой среде культивирования. То есть имеет место явный эффект одновременного присутствия двухзарядных катионов Ca или Mn и Asn на процесс формирования МП в глубинной культуре.

Естественно предположить, что Asn участвует в определенных биохимических процессах, медиированных ионами Ca²⁺ и Mn²⁺. Но ограничено ли отличие Asn как компонента жидкой питательной среды только участием в химическом связывании в растворе? Если это так, то по электронному строению молекулы Asn должен выделяться даже среди структурно близких аминокислот. Известно, что углеводы взаимодействуют с лектинами в том числе посредством образования множественных водородных связей, при этом амидный водород и карбонильный кислород Asn в структуре сайтов связывания часто включены в это белок-углеводное взаимодействие ["The Lectins...", 1986; Elgavish and Shaanan, 1997]. К рассмотрению данной проблемы нами привлечены методы квантовой химии.

Возникает предположение, что реакционным фрагментом аспарагина служит амидная группировка, однако вследствие сопряжения в амидной группе нуклеофильные свойства азота существенно понижены. Наиболее вероятным центром связывания катиона металла является атом кислорода. Это вытекает также из принципа жестких и мягких кислот и оснований [Pearson, 1990]: предпочтительно взаимодействие жесткой кислоты Льюиса - катиона Ca или Mn(II) с жестким реакционным центром - кислородным атомом. Если реакционным фрагментом является COOH-группа, то связывание металла по кислородному атому не имеет альтернативы.

Gln - ближайший структурный аналог Asn и единственная из исследованных нами аминокислот, помимо Asn, имеющая в своем составе группу CONH₂. Хотя молекула Gln отличается от Asn только одним метиленовым звеном, тем не менее Gln, в отличие от Asn, как компонент питательной среды не оказывает заметного влияния на формирование МП шиитаке. Важно объяснить разное химическое поведение этих двух структурно аналогичных соединений. Основываясь на вышесказанном, можно предположить, что различия в реакционной способности обусловлены различными зарядами на вероятных реакционных центрах.

Ограниченным методом Хартри-Фока (RHF) [Кларк, 1990] нами произведены ab initio расчеты электронной структуры цвиттер-ионов Asn и Gln. Заряды на атомах в изученных молекулярных системах служат квантовохимическим индексом, описывающим реакционную способность веществ в реакциях, управляемых электростатическими силами. Жестко-жесткое взаимодействие аминокислота - катион Ca²⁺ или Mn²⁺ как раз относится к такого рода процессам. Получили, что зарядовые характеристики возможных реакционных центров обеих аминокислот очень близки между собой. По-видимому, дифференциальный характер взаимодействия изученных аминокислот с катионами металлов не связан с различиями в электронном строении цвиттер-ионов.

Для выявления других возможных факторов, влияющих на химическое поведение двух аминокислот при взаимодействии с катионами металлов, нами с помощью программного пакета HyperChem рассчитаны QSAR-свойства цвиттер-ионов Asn и Gln. Результаты расчетов позволили сделать вывод, что, возможно, различие в реакционной способности двух цвиттер-ионов в некоторой степени связано с их дифференциальной гидрофобностью. Asn как менее гидрофобный реактант имеет более прочную гидратную оболочку и поэтому связывает катион металла менее прочно, то есть обратимо. Одной из причин высокой селективности к Asn по сравнению с Gln может являться пространственный фактор. На основе таких критериев, как ван-дер-ваальсова поверхность и особенно объем молекулы, можно направленно искать подходящие по топологии фрагменты в структуре белка, основываясь на возможных будущих данных рентгеноструктурного анализа.

Необычно высокое содержание Asn, обнаруженное нами при изучении аминокислотного состава лектина L2 (cм. выше), по меньшей мере не противоречит предположению о важности этой аминокислоты для лектинового биосинтеза. На наш взгляд, несомненна активизация процессов формирования МП в глубинной культуре шиитаке с повышенной лектиновой активностью, и Asn способствует этой активизации.

Следовательно, в данном разделе показана зависимость внеклеточной лектиновой активности L. edodes F-249 от одновременного присутствия в синтетической жидкой среде культивирования Asn и двухзарядных катионов Ca или Mn. При этом наблюдается формирование МП в глубинной культуре в течение нескольких суток. Результаты произведенных методом RHF/6-31G^* ab initio расчетов электронной структуры цвиттер-ионов Asn и Gln не позволяют связывать дифференциальный характер взаимодействия изученных аминокислот с катионами металлов с различиями в электронном строении цвиттер-ионов. Рассчитаные QSAR-свойства этих цвиттер-ионов свидетельствуют в пользу того, что различие в реакционной способности Asn и Gln в некоторой степени связано с их разной гидрофобностью. Кроме того, полученные в настоящей работе данные не позволяют и ограничивать роль аспарагина на изучаемой стадии морфогенеза L. edodes только участием в химическом связывании в жидкой среде выращивания. По нашему мнению, аспарагин включен, возможно опосредованно, в биосинтетические процессы, одним из результатов которых является формирование МП культуры.

Взаимосвязь углеводной специфичности лектинов и углеводного состава мицелия L. edodes на разных стадиях морфогенеза.

Высказываются предположения об участии углеводов в индукции процесса плодообразования у грибов. Смена стадий цитодифференцировки происходит под воздействием стрессовых факторов, что сопровождается изменением химического состава, структуры и функции клеток. Для базидиальных грибов таким регулирующим фактором часто является температура, например, холодовой стресс индуцирует образование базидиом у L. edodes [Терешина и др., 2002]. Одна из важнейших ответных реакций клетки гриба на стресс - изменение углеводного состава; это может регулировать активность ферментов и влиять на развитие гриба.

Известно в то же время, что морфогенетическая стадия коричневой мицелиальной пленки, предшествующая нормальному плодоношению шиитаке, обладает по результатам наших экспериментов высокой лектиновой активностью. Процесс формирования неполноценных плодовых тел на непигментированном мицелии, минуя стадию образования МП, практически не изучен, в частности, ничего не известно о лектиновых комплексах и изменениях углеводного состава неполноценных базидиом. Использованный в настоящем исследовании подход позволяет судить об особенностях углеводного состава и лектиновой активности, проявляющихся в условиях формирования обычных и неполноценных плодовых тел, о корреляциях состава углеводного компонента мицелия и углеводной специфичности лектинов. Кроме того, он дает возможность выявить характерные признаки, сопутствующие образованию плодовых тел, вне зависимости от их морфологии, условий формирования и стадии жизненного цикла культуры.

В данной части наших исследований мы поставили задачу выявления взаимосвязи углеводного состава мицелия шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития с лектиновой активностью и углеводной специфичностью лектинов культуры. Для этого состав углеводной фракции L. edodes изучали на разных этапах развития культуры: белый мицелий, слабопигментированный мицелий, МП, плодовое тело. Обнаружили изменения углеводного состава L. edodes на разных стадиях морфогенеза.

Углеводный состав МП отличается от такового не только плодовых тел и белого мицелия, но и слабопигментированного мицелия - стадии, предшествующей формированию собственно мицелиальной пленки. Для сравнения изучен также состав углеводной фракции на разных стадиях развития мицелия двух других штаммов культуры - 2Т и NY. Выбор указанных штаммов в качестве объектов исследования обусловлен существованием разделенных во времени явлений плодоношения и формирования коричневой пленки, при этом на белом мицелии появляются немногочисленные деформированные, "неполноценные" плодовые тела, а затем, после формирования пленки, происходит обычное, с точки зрения геометрических характеристик плодовых тел и урожайности, плодоношение.

Изучено относительное содержание углеводов, к которым специфичны лектины L. edodes. Содержание Lac у штамма F-249 максимально в МП и не обнаруживается в базидиомах. Соотношение относительных величин содержания Lac в МП и слабопигментированном мицелии составило 44: 1 соответственно. В случае двух других штаммов культуры - 2Т и NY оказалось, что на стадии белого мицелия штамма 2Т, приводящей к формированию неполноценных плодовых тел, повышено содержание Gal, не обнаруживаемой настоящим методом на других стадиях. Состав деформированных базидиом, образующихся первоначально на белом мицелии штамма NY, характеризуется относительно высоким содержанием Lac, также не найденной в наших экспериментах в непигментированном мицелии. Для обоих углеводов соотношение примерно 40:1 в сравнении с другими стадиями каждого штамма.

Определено содержание углевода, к которому специфичны лектины только плодовых тел всех изученных штаммов - D-Mal. Минимальные ингибирующие концентрации ее достаточно невысоки и составляют 8,33-16,7 мМ. В случае штамма F-249 этот дисахарид присутствует в белом мицелии, в значительных количествах накапливается в пигментированном мицелии, расходуется на стадии МП и вновь появляется в базидиомах в соотношении на указанных стадиях 1.4:5.5:1, соответственно. В случаях формирования плодовых тел без коричневой пленки (штаммы 2T и NY) Mal не обнаруживается ни в составе неполноценных плодовых тел, ни на стадиях, предшествующих плодоношению.

Количество Rha, к которой углеводная специфичность лектинов относительно низка, при плодоношении без МП возрастает одновременно с Lac и Gal, углеводная специфичность к которым проявляется в гораздо большей степени. При формировании базидиом L. edodes F-249 Rha обнаруживается лишь на стадиях, когда содержание Lac наименьшее или она отсутствует. Таким образом, в коричневой пленке накапливается только углевод, характеризующийся наибольшим "сродством" к лектинам культуры.

При рассмотрении особенностей углеводного состава мицелия шиитаке в случае плодоношения на МП обращают на себя внимание выраженные количественные изменения D-ManOH и D-Ino в зависимости от стадии морфогенеза. Cодержание ManOH в белом мицелии, пигментированном мицелии, МП и плодовом теле соотносится как 714: 55: 1: 56 соответственно. Содержание же Ino наиболее низко в белом мицелии и резко возрастает в пигментированном в соотношении примерно 1: 39. То есть ManOH накапливается, а Ino, наоборот, присутствует в минимальных количествах в белом мицелии перед плодоношением. Интересно, что те же изменения в химическом составе мицелия происходят под влиянием низкотемпературного стресса [Феофилова и др., 1994].

Таким образом, углеводная специфичность лектинов L. edodes при твердофазном культивировании в наибольшей степени проявляется к углеводам, обнаруживаемым на стадии коричневой пленки. Наблюдаются различия углеводного состава (количества Mal, Rha, ManOH и Ino) при нормальном плодоношении культуры и при образовании деформированных базидиом на непигментированном мицелии. Такие данные, как увеличение лектиновой активности и содержания углеводов, к которым специфичны лектины культуры, на фоне роста количества ManOH и снижения уровня Ino перед плодоношением, представляются нам еще одним свидетельством в пользу предположения об участии лектинов в индукции процесса плодообразования.

Изменение жирнокислотного состава общих липидов и лектиновой активности L. edodes в процессе морфогенеза. Во введении к предыдущему разделу уже упоминалось о крайне малой изученности процесса формирования неполноценных плодовых тел на непигментированном мицелии, минуя стадию образования МП. В частности, ничего не известно о лектиновых комплексах и липидах неполноценных базидиом. При выборе объектов исследования в обсуждаемой части работы мы использовали штамм L. edodes, характеризующийся "классическим" развитием плодовых тел на пигментированной мицелиальной пленке, а также штаммы, образующие деформированные плодовые тела на стадии белого мицелия, а затем, после формирования МП, приступающие к обычному для данного вида плодоношению. Подобный подход позволяет судить об особенностях жирнокислотного состава и лектиновой активности, проявляющихся в условиях формирования обычных и неполноценных плодовых тел.

Широким набором сведений о функциональной и метаболической взаимосвязи лектинов и липидов мы пока не располагаем. Однако хорошо известно, что гидрофобные участки молекул лектинов и гидрофобные взаимодействия чрезвычайно важны для функционирования этих белков. То есть усиление гидрофобности посредством образования более или менее устойчивых ассоциатов лектинов с такими соединениями, как ЖК, образующиеся после гидролиза нейтральных липидов, может влиять на биосинтез и/или активность лектинов. Задача настоящей части работы - выявление изменений ЖК состава общих липидов и активности лектинов, происходящих по мере развития шиитаке.

Обнаружены изменения ЖК состава общих липидов мицелия L. edodes на разных стадиях морфогенеза. На примере штамма F-249 показано, что по мере развития вегетативного мицелия происходит постепенное снижение ненасыщенности (за счет C18:1 и C22:1 кислот, а также увеличение относительного содержания короткоцепочечных ЖК. На стадии образования плодовых тел отмечается заметное увеличение уровня ненасыщенных ЖК (в основном за счет С 22:1 и С 24:1) и исчезновение ЖК с короткими цепями. Резкие изменения относительного содержания короткоцепочечных ЖК могут быть связаны с температурой культивирования шиитаке (развитие белого мицелия происходило при 26^оС, пигментация и образование МП при 4^оС, развитие плодовых тел при 18^оС). Ранее отмечалось, что у базидиальных грибов, выращенных при низких температурах, наблюдается укорачивание ацильных цепей ЖК липидов [Феофилова и др., 2000].

Достаточно высокая для базидиальных грибов концентрация пальмитиновой кислоты отличает L. edodes от других ксилотрофов [Феофилова и др., 1998]. Появление пигментации мицелия и затем МП у L. edodes F-249 коррелирует с заметным (в 1,7 раза) увеличением уровня С 16:0. У штамма NY высокая концентрация пальмитиновой кислоты (около 40 % от суммы ЖК) отмечается на стадии белого мицелия, у 2Т - на стадии образования плодовых тел.

Значительное содержание линолевой кислоты (С 18:2) отмечается как общая закономерность при изучении ЖК состава общих липидов грибов разных трофических групп. В нашем эксперименте у штамма F-249 каких-либо колебаний относительного содержания линолевой кислоты при переходе от белого мицелия к стадии МП, а затем к базидиомам, отмечено не было. Другая картина наблюдалась у L. edodes NY: содержание С 18:2 перед плодоношением в 3 раза превышало соответствующую величину для плодовых тел. При этом у штамма 2Т относительное содержание этой ЖК оставалось практически неизменным. Таким образом, изменения уровня линолевой кислоты в процессе морфогенеза изученных культур L. edodes нельзя однозначно связать с типом плодоношения и с наличием стадии МП.

Появление ненасыщенных длинноцепочечных ЖК в базидиомах Pleurotus ostreatus и Agaricus bisporus связывают с "холодовым шоком", который является необходимым триггером образования плодовых тел [Феофилова и др., 2000]. В то же время отмечена корреляция между появлением МП на поверхности зрелого мицелия L. edodes и началом плодообразования [Александрова и др., 1998]. С этих позиций объяснимо возрастание относительного содержания длинноцепочечных моноеновых ЖК в плодовом теле по сравнению с белым мицелием в случае плодоношения L. edodes F-249 на МП. Однако эта закономерность не прослеживалась при формировании неполноценных плодовых тел у штаммов 2T и NY. Плодообразование у этих штаммов сопровождалось резким увеличением концентрации ЖК с нечетным количеством атомов углерода, в том числе С 17:0 у NY и С 15:0 у 2Т. Данный факт требует, на наш взгляд, дальнейшего изучения.

На основании результатов проведенного исследования выявлен ряд особенностей, проявляющихся при формировании неполноценных плодовых тел шиитаке в отсутствие МП. Лектиновая активность на стадии неполноценных плодовых тел остается относительно высокой, по величине ТГА соответствует примордиям при нормальном плодоношении и существенно превышает рассматриваемые показатели для зрелого плодового тела. В отличие от плодовых тел, развивающихся на МП, образование деформированных базидиом на белом мицелии не сопровождается увеличением степени ненасыщенности ЖК. Вместе с тем, их формирование коррелирует с увеличением процентного содержания ЖК с нечетным количеством атомов углерода; а также, вероятно, уменьшением активности реакций элонгации, что выразилось в снижении относительного содержания (штамм NY) или полной редукции (штамм 2Т) длинноцепочечных ЖК. По-видимому, совокупность указанных характеристик могла бы служить дополнительным параметром биохимической оценки мицелия в процессе плодообразования. Полученные данные, свидетельствующие о существенных изменениях в направленности реакций синтеза, десатурации и элонгации жирных кислот у неполноценных плодовых тел, могут быть полезны и при обсуждении роли липидов в процессе морфогенеза.

В целом по результатам, описанным в разделе, посвященном участию лектинов шиитаке в морфогенетических процессах, можно прийти к таким заключениям. Прослеживается взаимосвязь активности внеклеточных лектинов шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам. Вероятно, лектины Lentinus edodes участвуют в процессе инициации плодообразования.

Лектины шиитаке при взаимодействии с экзогенными соединениями. Взаимодействие лектинов с органическими селенсодержащими веществами. Влияние селенсодержащих соединений на активность внеклеточных лектинов L. edodes. Литературные данные свидетельствуют о непосредственном активном участии микроэлемента селена в биохимических и физиологических процессах. Однако отмечается отсутствие достаточно обоснованных сведений о биохимических механизмах действия селена, особенно селенорганических соединений [Whanger, 2002]. Отсутствует какая-либо информация о взаимодействиях селенорганических веществ, рассматриваемых в нашей работе или им структурно подобных, - не только с лектинами, но и с белками вообще. В связи с вышесказанным нами была поставлена задача изучения активности внеклеточных лектинов L. edodes при различных условиях взаимодействия препаратов лектинов с некоторыми соединениями Se. Получение данных по влиянию селеноорганического вещества ДАФС-25, представителя ряда 1,5-ди(4-R-фенил)-3-селенпентандионов-1,5, на лектиновую активность культуры (см. раздел выше) позволило нам перейти к следующему шагу работы, уже с препаратами внеклеточных лектинов культуры.

В ходе экспериментальных и теоретических исследований, описанных в настоящем разделе, помимо препарата ДАФС-25, рассмотрены и другие органические соединения селена (табл. 2).

Таблица 2. Селенсодержащие соединения, рассмотренные в настоящей работе

На основании экспериментов с ДАФС-25 предполагались интересные результаты определения изучаемой биологической активности в реакционных смесях с выделенными из КЖ и очищенными лектинами. При этом можно ожидать, что структура селенсодержащего компонента реакционных смесей, как и его концентрация, окажут значительное влияние на лектиновую активность препарата белка, и что активность продуктов взаимодействия лектина с селенорганическим соединением будет различной в зависимости и от стадии очистки белка после его первоначального выделения из синтетической среды выращивания гриба. Все вышесказанное привело нас к выбору соединений - производных изученного нами ранее 1,5-дифенил-3-селенпентандиона-1,5 (табл. 2) и препаратов двух лектинов (L1 и L2) на трех основных стадиях очистки каждого белка, описанных в соответствующем разделе. В результате "белковых объектов" получили шесть, условно обозначив их для целей настоящей работы следующим образом: в последовательности увеличения степени чистоты препарата белка 1, 3, 5 соответствовали L1, а 2, 4, 6 - лектину L2.