Размещено на http://www.allbest.ru/

Структурно-функциональная организация палеоамигдалы: фундаментальные закономерности и прикладные аспекты

Общая характеристика работы

мозг палеоамигдала эпилепсия наркомания

Актуальность проблемы. Миндалевидный комплекс мозга (МК) вовлечён в центральные механизмы регуляции широкого круга физиологических процессов, начиная от деятельности отдельных органов и систем до целостных поведенческих актов, определяющих адаптацию организмов, их половое, пищевое и агрессивно-оборонительное поведение (Бериташвили, 1968, Чепурнов, Чепурнова, 1981, Акмаев, Калимуллина, 1993, Романова, 2005, Шаляпина, 2005, Любашина, 2008). Многообразие функций МК есть следствие длительной истории его становления, т.к. появляясь на самых ранних стадиях развития мозга хордовых, т.е. у круглоротых, он становится участником широкомасштабных перестроек мозга, происходящих в процессе его эволюции. Формирование МК проходит параллельно с процессами кортикализации головного мозга позвоночных и происходит поэтапно. Основные этапы исторического становления МК связаны с появлением интегративных центров высшего порядка, к которым относятся древняя, старая и новая кора (Карамян, 1976). Это обосновывает правомерность выделения в составе МК древней амигдалы (палеоамигдалы), старой амигдалы (архиамигдалы) и новой амигдалы (неоамигдалы, Акмаев, Калимуллина, 1993, Ахмадеев, Калимуллина, 2003, 2004).

Место МК в лимбической системе определяется ключевой ролью в анализе полисенсорной информации, поступающей из внешней и внутренней среды организма с последующим переключением её на висцеральные и нейроэндокринные центры ствола головного мозга (Любашина, 2001, Пруцкова, 2006, Aslan et al., 1997, Cox et al., 1986) и его высшие отделы - зрительный бугор, неокортекс (Любашина, 2008, Сlugent, Prise, 1996, Zald et al., 1998).

Велика роль МК в определении личностных характеристик человека в связи с его участием в формировании эмоций, кратковременной и долговременной памяти, процессах обучения (Симонов, 1987, Шуваев, Суворов, 2001; Шульговский, 2003). МК занимает ведущее место в регуляции нейроэндокринных процессов (Акмаев, Калимуллина, 1993, Veinante, Freund-Mercier, 1997, Feldman et al., 1998, Шаляпина, 2005) и модуляции деятельности иммунной системы (Dorofteiu et al., 1995, Raber, Koob, 1995, Raber, Bloom, 1996, Raber et al., 1997, Ramhres-Amaya et al., 1998). Это указывает на его значение в обеспечении взаимосвязей между нервной, эндокринной и иммунной системами. В силу указанного, исследования МК приобретают актуальность в рамках новой интегративной дисциплины - нейроиммунноэндокринологии (Акмаев, 1996, 1999, 2000).

МК как нейроэндокринный центр, который участвует в организации полового поведения, регуляции секреции и выделения гонадотропинов, полового созревания организмов, при осуществлении всех этих функций тесно взаимодействует с гипоталамической областью мозга, включаясь в регуляцию ее репродуктивных центров (Акмаев, Калимуллина, 1993). Обрабатывая и интегрируя поступающую к нему информацию (ведущую роль, среди которой играют химические сигналы) из внешней и внутренней среды организма, МК передает ее на центры преоптической области и медиобазального гипоталамуса, осуществляя их настройку в соответствии с поступившей информацией, определяя режим их функционирования, адекватный особенностям момента. Однако, тонкие механизмы взаимосвязей МК и гипоталамической области мозга остаются до сих пор невыясненными. Эволюционно-морфологический подход при их расшифровке представляется весьма перспективным.

Известно, что МК формируется в периоде половой дифференциации мозга (Резников и соавт., 1990, Акмаев, Калимуллина, 1993). Однако, его конкретные структуры, принимающие в этом процессе участие, и происходящие в них под морфогенетическим влиянием половых стероидов перестройки нейронной организации, остаются неизвестными. Нет сведений литературы, характеризующих морфогенез МК в препубертатном периоде крыс, в течение которого происходит формирование положительной обратной связи (Docke et al., 1980, Docke et al., 1983). Ранее не исследовались ультраструктурные характеристики нейроэндокринных нейронов палеоамигдалы и показатели модулирующего влияния на них половых стероидов. Не рассматривался вопрос о половых различиях и динамических перестройках во взаимовлияниях половых стероидов и моноаминов в палеоамигдале в динамике эстрального цикла и в процессе проведения феромонального сигнала в мозг.

Участие МК в регуляции широкого круга физиологических процессов объясняет его вовлечение в патогенез многих психоневрологических заболеваний. Изменение объёмных характеристик МК, выявленное с помощью новейших методов исследования мозга - компьютерной томографии и ядерно-магнитного резонанса - является ранним диагностическим признаком болезни Альцгеймера, шизофрении и височной эпилепсии (Jack et al., 1997, Ка1viainen еt а1., 1997, Hirayasu et al., 1998, Bremner et al., 2000, Goncalves-Pereira et al., 2006).

Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о важной роли МК в патогенезе эпилепсии человека (Чепурнов, Чепурнова, 1981, Бикбаев, 2000, Cain, 1992, Loscher et al., 1998, Pitkanen et al., 2000 и др.), однако, до сих пор остаются невыясненными причины низкого порога его судорожной активности, локализация мест инициации эпиактивности и механизмы ее генерализации. По мнению эпилептологов существует вероятность, что манифестации первичной генерализованной эпилепсии предшествует формирование очага в медиобазальных отделах височной доли мозга (Карлов, 1990, Chassagnon et al., 2005), где, согласно полученным в работе данным, локализуются структуры палеоамигдалы. В литературе полностью отсутствуют сведения о функциональном состоянии нейронов палеоамигдалы при абсансной генерализованной (неконвульсивной) эпилепсии и развивающихся в ней патогистологических процессах при конвульсивной эпилепсии.

Наибольшее внимание привлекают при разработке проблем наркомании структуры мезо-кортико-лимбической системы, при этом в МК изучают только его отдельные ядра: базолатеральное (Ledford et al., 2003, Fuchs et al., 2006, Floresco, Tse, 2007) и центральное (Covington et al., 2005, Dandekar et al., 2007). Между тем, МК сложное, гетерогенное образование, претендующее на роль ключевой структуры в функциональной системе наркозависимости. Ранее не проводились экспериментальные исследования по изучению механизмов формирования наркотической зависимости с использованием молекулярно-генетических моделей, посвященные выяснению роли в этом процессе палеоамигдалы и аллельной структуры локуса TAG 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2).

Эволюционный подход в исследованиях структурно-функциональной организации мозга, выявляя ее фундаментальные закономерности и этапы становления в историческом развитии, позволяет понять патогенетические механизмы неврологических заболеваний. Происходящее в условиях патологии нарушение сложившейся в эволюции мозга иерархии функциональных систем, как правило, затрагивает филогенетически более поздние, а потому, более сложные по конструктивным решениям его аппараты. В этих условиях клиническая симптоматика может отражать функциональную настройку базисных механизмов, являясь «отголоском эволюционного процесса, с возвращением к тем функциональным отношениям, которые характерны для более ранних периодов развития» (Орбели, 1958).

Цель и задачи исследования. Целью работы является комплексное исследование фундаментальных закономерностей (эволюционно-морфологический анализ цитоархитектоники, нейронной организации, механизмов формирования в период половой дифференциации мозга и препубертатный период, модулирующего влияния половых стероидов на ультраструктурные и цитохимические характеристики нейроэндокринных нейронов) и прикладных аспектов структурно-функциональной организации палеоамигдалы (показателей вовлечения в патогенез эпилепсии и наркомании).

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие основные задачи исследования:

1. на основании результатов цитоархитектонического анализа структур заднего отдела МК, учета их ядерно-палеокортикальных взаимоотношений и особенностей нейронной организации определить субстрат палеоамигдалы;

2. выяснить с помощью модельного эксперимента происходит ли в палеоамигдале реализация морфогенетического действия половых стероидов в процессе половой дифференциации мозга, опираясь на результаты количественной оценки характеристик дендритов ее нейронов. Сопоставить направленность и выраженность выявившихся изменений с результатами исследования половых различий у половозрелых крыс.

3. провести количественный цитоархитектонический и иммуноцитохимический анализ этапов формирования полового диморфизма структур палеоамигдалы в ранний ювенильный период развития крысы и путем сопоставления темпов морфогенеза со сроками нейрогенеза основной и добавочной обонятельных луковиц получить данные о роли афферентного притока как фактора онтогенеза палеоамигдалы;

4. изучить цитологические характеристики нейронов палеоамигдалы на светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях, разработать их классификацию и выявить региональные особенности представительства их основных типов;

5. разработать структурно-функциональную классификацию нейроэндокринных нейронов палеоамигдалы у самцов и самок крыс на разных стадиях эстрального цикла на основании результатов ультраструктурного анализа, выполненного с использованием комплексной оценки показателей транскрипционной активности ядра, структурной организации ядрышка, характеристик состояния ядерных мембран, белок-синтезирующего аппарата цитоплазмы, митохондриума, вакуолярной системы и явлений секреторной активности;

6. провести анализ половых различий содержания и метаболизма моноаминов в палеоамигдале и исследовать механизмы динамических структурно-функциональных перестроек в динамике эстрального цикла путем оценки интенсивности включения ³Н-уридина в ее нейроны и глию, моноаминов и уровней экспрессии эстрогенного рецептора ERв, а также регистрации нейрохимических сдвигов в процессе проведения в мозг феромонального сигнала;

7. исследовать участие палеоамигдалы в механизмах формирования наркотической зависимости путем определения локализации CART(cocaine-amphetamine-regulated transcript)- пептид иммунореактивных нейронов и уровней экспрессии CART- пептида, изучения в эксперименте темпов развития наркотической зависимости у крыс с различиями генотипа по локусу TAG 1A DRD₂ и последующего сравнительного структурно-количественного анализа палеоамигдалы у двух групп крыс (А₁/А₁ и А₂/А₂), различающихся по темпам формирования толерантности и психической зависимости;

8. изучить у крыс линии WAG/Rij (модель абсансной генерализованной неконвульсивной эпилепсии) структурно-функциональные характеристики палеоамигдалы с помощью морфометрии и регистрации функционального состояния ее нейронов, а также состав эпилептической системы у крыс с экспериментально созданной смешанной конвульсивной эпилепсией путем анализа результатов патогистологического и ультраструктурного исследования.

Научная новизна. Впервые на основании результатов комплексного исследования дано целостное представление о структурно-функциональной организации палеоамигдалы как нейроэндокринного центра, формирование и деятельность которого осуществляется под морфогенетическим и модулирующим влиянием половых стероидов при участии биогенных аминов. Исследование цитоархитектоники структур заднего отдела МК с позиций учения о ядерных и экранных центрах нервной системы и их нейронной организации позволило впервые установить локализацию на его территории редковетвистой нервной системы, составляющей субстрат палеоамигдалы. Впервые в модельном эксперименте установлен морфогенетический эффект тестостерон-пропионата, приводящий к изменениям в дендроархитектонике нейронов и обуславливающий формирование половых различий. Впервые выполненное исследование морфогенеза палеоамигдалы в ранний ювенильный период развития мозга крысы показало этапность формирования в ее структурах полового диморфизма, а сопоставление его темпов со сроками нейрогенеза основной и добавочной обонятельных луковиц позволило выявить роль афферентного притока как фактора онтогенеза палеоамигдалы. Проведен детальный анализ цитологических характеристик нейронов палеоамигдалы, позволивший впервые выявить нейроэндокринные нейроны с секреторной активностью. Впервые на основании результатов ультраструктурного анализа разработана структурно-функциональная классификация нейроэндокринных нейронов палеоамигдалы у самцов и самок крыс на разных стадиях эстрального цикла, отражающая модулирующее влияние половых стероидов. Впервые выявлены основные функциональные состояния, характеристики которых отражают явления гормон-зависимой функциональной реверсии в нейронах палеоамигдалы, предопределяемой колебаниями уровней половых стероидов. Впервые в палеоамигдале выявлены половые различия метаболизма моноаминов и установлена зависимость их содержания от колебаний уровня половых стероидов в динамике эстрального цикла. Впервые установлено модулирующее влияние половых стероидов на интенсивность включения ³Н-уридина в нейроны и глию палеоамигдалы, а также на уровни экспрессии эстрогенного рецептора ERв. Впервые выявлена синхронность изменений содержания катехоламинов в обонятельных луковицах и палеоамигдале в процессе проведения в мозг феромонального сигнала. Впервые установлено участие палеоамигдалы в формировании механизмов наркотической зависимости, и это является теоретическим базисом для разработки новых технологий ее коррекции путем интраназального введения лечебных препаратов. Впервые показано вовлечение палеоамигдалы в процессы эпилептогенеза при абсансной генерализованной (неконвульсивной) и смешанной (конвульсивной) эпилепсии.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные в работе результаты, раскрывающие фундаментальные закономерности структурно-функциональной организации палеоамигдалы, формируют теоретический базис для разработки научно-обоснованных рекомендаций по коррекции нарушений деятельности нейроэндокринных репродуктивных центров с использованием интраназального введения медикаментозных препаратов. Выявленное в работе явление гормонзависимой функциональной реверсии в нейронах палеоамигдалы свидетельствует о зависимости когнитивных способностей от уровней половых стероидов и является основой для разработки профилактических и лечебных мероприятий с их использованием. Результаты работы составляют основу концепции о палеоамигдале - нейроэндокринном центре мозга, формирование которого произошло на самых ранних этапах исторического развития позвоночных и имело значение в формировании адаптивного поведения (основу которого составляют репродуктивное, пищевое и агрессивно-оборонительное), формируемого на основе анализа сигналов (хеморецепции) из окружающей среды. Полученные в работе экспериментальные данные о роли генотипа А₁/А₁ локуса TAG 1A DRD₂ в формировании наркотической зависимости согласуются с результатами медико-генетических исследований и создают основу для разработки мероприятий, позволяющих выявлять группы риска. Асимметрия МК, выявленная у крыс, показавших ускоренные темпы формирования толерантности и психической зависимости, акцентирует внимание на возможность разработки ранних диагностических критериев при наркомании с использованием компьютерной томографии мозга. Результаты работы, свидетельствующие о вовлечении палеоамигдалы в процессы эпилептогенеза, акцентируют внимание невропатологов и психиатров на ее роли в патогенезе различных форм эпилепсии, показывая на важность регистрации ее состояния для ранней диагностики этого заболевания.

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры гистологии с курсом эмбриологии Башкирского государственного медицинского университета и кафедры морфологии и физиологии человека и животных Башкирского государственного университета, где используются при чтении лекций по «Общей гистологии» и специальных курсов «Морфология миндалевидного комплекса мозга», «Нейроанатомия», «Нейрогистология», «Эволюция и морфология мозга». Изданы учебные пособия: «Нейрогистология миндалевидного комплекса для начинающих» (Уфа, БашГУ, 2005) с Грифом УМО МГУ и Нейроморфология (Уфа, БашГУ, 2006). Получена приоритетная справка о регистрации заявки на патент РФ на изобретение «Способ приготовления переживающих срезов пириформной доли мозга» № 2008149137 от 10 января 2008 года. Удостоверение на рационализаторское предложение «Устройство для измерения линейных размеров ультраструктур при электронной микроскопии» № 1 от 16 октября 2007 года.

Положения, выносимые на защиту

1.Палеоамигдала представляет собой комплекс трех структур заднего отдела МК, расположенных на медиобазальной поверхности полушария конечного мозга под нижним рогом бокового желудочка и образованных длинноаксонными редковетвистыми нейронами. Дорсомедиальное и заднее медиальное ядро представляют собой ядерные центры, заднее кортикальное ядро является межуточной формацией.

2.Формирование палеоамигдалы как нейроэндокринного центра происходит в периоде половой дифференциации мозга под морфогенетическим влиянием половых стероидов, что предопределяет наличие половых различий в дендроархитектонике ее нейронов.

3.Модулирующее влияние половых стероидов на нейроны палеоамигдалы приводит к изменению их функционального состояния, совокупность которых отражает явление функциональной гормонзависимой реверсии. На основании учета основных функциональных состояний нейронов разработана структурно-функциональная классификация нейроэндокринных нейронов палеоамигдалы.

4.Палеоамигдала вовлечена в патогенетические механизмы формирования наркотической зависимости, а также абсансной генерализованной и смешанной конвульсивной эпилепсии.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Республиканском молодежном форуме «Интеллектуальный потенциал Башкортостана - в ХХI век» (Уфа, 1996), на конференции студентов и молодых ученых биофака БашГУ, 1997, на Ш,V Международной конференциях «Колосовские чтения» (СПб, 1997, 2006), на V Международном конгрессе по нейронаукам, (Jerusalem, Israel, 1999), на Всеросс. конференции с межд. участием «Достижения биологической функциологии и их место в практике образования» (Самара, 2003), на съезде Российских морфологов с международным участием (2004), на конгрессах Международной ассоциации морфологов (1998, 2002-2008), на Всероссийской конференции «Нейроэндокринология» (СПб, 2003), на Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей “Человек и его здоровье” (СПб, 2004-2008), на Всероссийской научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (СПб, 2004, 2006), на Х1Х и ХХ съездах Физиологического общества им. И.П.Павлова (2004-2007), на Всероссийских конференциях молодых исследователей «Физиология и медицина» (СПб, 2004, 2005), на II-IV Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, 2006, 2008), на Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2006), на Международной конференции «Ломоносов» (Москва, МГУ,2007,2009), на V-ой Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации и социализации человека» (Волгоград, 2008), на Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Д.А.Жданова, (М., 2008), на Международной научной конференции «Европейская интеграция высшего образования (Черногория, 2008), на заседании Башкирского отделения Всероссийского общества анатомов, гистологов, и эмбриологов (Уфа, 2009) и опубликованы в ведущих российских и зарубежных морфологических и физиологических журналах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 73 научные работы в отечественной и зарубежной печати, из них 22 cтатьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования (4-я глава), результатов исследований (7 глав), обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Указатель литературы содержит сведения о 596 источниках, 108 из которых на русском и 488 на иностранных языках. Иллюстрации представлены 67 рисунками (из них 61 микрофотография), цифровой материал сгруппирован в 35 таблиц.

Материал и методы исследования.

В работе использованы крысы линии Wistar в возрасте трех и шести месяцев, половозрелые крысы линии WAG/Rij, выращенные от родительских особей, предоставленных профессором Г.Д.Кузнецовой (Институт ВНД, г.Москва) с любезного согласия проф. J.van Luijtelaar и проф. А. Coenen (Dept. of Comparative and Physiological Psychology, NICI, KUN, Nijmigen, The Netherlands) и крысы инбредной линии Wistar с генотипом А₁/А₁ и А₂/А₂ по локусу TAG 1A гена рецептора второго типа (DRD₂). Пищу и питьё животные получали ad libitum, продолжительность светового дня составляла 12-14 часов. Всех использованных в работе половозрелых крыс содержали в стандартных условиях вивария, характеризующихся постоянством комнатной температуры (20⁰-22⁰)С и уровнем влажности.

Нейрогистологические методы. Цитоархитектонические и цитологические характеристики структур заднего отдела миндалевидного комплекса (МК) изучены на 10 крысах (5 самцов и 5 самок). Животных умерщвляли декапитацией с соблюдением основных требований к эвтаназии, изложенных в Приложении №4 к "Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных". Головной мозг извлекали из полости черепа и фиксировали в 10% нейтральном формалине. Прошедший фиксацию головной мозг промывали и проводили по спиртам возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин. Готовили серии фронтальных срезов мозга толщиной 20 мкм и 10 мкм, которые окрашивали по методу Ниссля (Меркулов, 1969). Особенности нейронной организации структур исследованы на фронтальных срезах мозга толщиной 100 мкм обработанных по методу Гольджи (30 крыс линии Wistar половозрелого возраста, 15 самок и 15 самцов). Нейроны зарисовывали с помощью рисовального аппарата (РА-4) при увеличении 200х. Принадлежность нейронов к I или II типу по Гольджи, их подтип и класс определяли на основании классификационных признаков, разработанных Т.А.Леонтович (1978) для подкорковых и Г.И.Поляковым (1973) для корковых нейронов.

Морфометрические методы. Планиметрирование структур палеоамигдалы и МК (40 крыс линии Вистар на разных сроках раннего ювенильного периода, половозрелые 20 крыс линии WAG/Rij с массой тела 250-320 г. с абсансной и смешанной эпилепсией, 28 крыс с генотипами А₁/А₁ и А₂/А₂ DRD₂) позволило измерить их абсолютные и удельные площади. Использовали цитоархитектонические препараты, представлявшие собой фронтальные срезы толщиной 20 мкм и окрашенные по Нисслю. Препараты изучали с помощью триокулярного светового микроскопа серии МС-300 (Австрия), пользуясь объективами 10 и 40. Микрофото получали с использованием цифрового фотоаппарата Nicon CoolPix 4500. Полученные изображения экспортировали в компьютер и анализировали с помощью программы JmageJ 1.38 (USA). Математическую обработку численных показателей, характеризующих абсолютные площади структур, проводили в условных единицах. Сравнение значений удельной площади проводили по методу ц, обеспечивающему нормальное распределение в получаемых вариационных рядах.

Количественные характеристики дендритов нейронов изучали по методике Т.А. Леонтович (1978). Измерены и подсчитаны следующие параметры дендритного дерева: число первичных дендритов (d), число свободных концов дендритов (Bd), число всех точек ветвления дендритов вне зависимости от их характера (Gd), площадь дендритного поля (Sd), общая длина дендритов (Ld). Использовали два производных параметра - соотношение числа свободных концов дендритов нейронов к числу первичных дендритов (Bd/d) и соотношение общей длины дендритов к их числу (Ld/d). При анализе морфогенетического действия андрогена в периоде половой дифференциации мозга (40 крыс) для более полного описания происходящих перестроек в структуре дендритов, кроме параметров рекомендованных Леонтович (1978), измеряли длину самого длинного дендрита (C) и подсчитывали на нем число свободных концов и число точек ветвления (Bdc, Gc). Также измеряли длину самого разветвленного дендрита (Cr) и подсчитывали число свободных его концов и число точек ветвления (Bdr, Cr). У всех нейронов определяли суммарную величину длины всех концевых веточек дендритов (Ldt). Величины выражали в условных единицах, полученные при работе с курвиметром и планиметром.

Подсчет количества нейронов, содержащих ядрышки, и глии (40 крыс при изучении морфогенеза палеоамигдалы, материал для исследования брали на 21-й, 24-й, 28-й и 31 дни жизни) проводили в поле зрения микроскопа МБИ-11 (ЛОМО, Россия) на 10 микронных срезах при увеличении в 600 раз (объектив 40, окуляр 15), площадь поля зрения при этом составляла 0,035 мм². На основании полученных данных определяли величину глиального индекса. Подсчет апоптического индекса (АИ) производили по формуле предложенной (Rakic, Zecevic, 2000), вводя в нее суммарное количество клеток, содержащихся в трех следующих друг за другом срезах.

Идентификацию структур палеоамигдалы при выполнении иммуноцитохимических реакций проводили в срезах, окрашенных толуидиновым синим, по Нисслю, на основании критериев, разработанных для высокоинформативных срезов этого образования мозга (Акмаев, Калимуллина, 1993). Подсчет количества нейронов в цитоархитектонических (окрашенных по Нисслю) и иммуноцитохимических препаратах (с положительной реакцией), проводили с объективом 40 в поле зрения микроскопа, площадь которого составляла 35000 мкм². В дорсомедиальном ядре, имевшем площадь 218600 мкм², количество нейронов подсчитывали в шести полях зрения, в заднем медиальном ядре - 5107x10² - в семи полях зрения, в медиальной части заднего кортикального ядра (8164 x10²) и в латеральной части заднего кортикального ядра (12242 x10²) число нейронов подсчитывали в одиннадцати полях зрения.

Гистохимические методы. Изучение содержания нуклеиновых кислот проведено на 20 (5 самцов, по 5 самок на стадиях метэструс, диэструс, эструс) половозрелых крысах линии Вистар с массой тела 200-250 г. Мозг фиксировали в 10% -ном формалине, заливали в парафин и готовили 7-10 мкм фронтальные срезы, которые окрашивали галлоцианином с хромовыми квасцами по Эйнарсону (Луппа, 1980). Число «темных» и «светлых» клеток в структурах палеоамигдалы подсчитывали в пяти полях зрения у каждого животного. Активность сукцинат-дегидрогеназы определяли визуально в приготовленных в криостате срезах толщиной 5 мкм, приготовленных по общепринятой методике (Луппа, 1980) у 15 половозрелых крыс (5 самцов, по 5 самок на стадиях эструса и метэструса).

Авторадиография с ³Н-уридином. ³Н-уридин (удельная радиоактивность 28 Ки/мМ) вводили внутрибрюшинно в дозе 160 МБк/г (20 крыс, 5 самцов и по 5 крыс на стадиях эструса, метэструса и диэструса) за один час до фиксации материала, которую проводили 12 ч в смеси формалин-спирт-ледяная уксусная кислота в холодильнике. Готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм, депарафинировали их и покрывали фотоэмульсией типа ПР-2М с экспозицией 1 месяц. После проявления и фиксации автографов препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Интенсивность включения изотопа оценивали по числу зерен восстановленного серебра на единицу площади объекта (100 м²) в десяти полях зрения с учетом фона вне среза.

Электронная микроскопия. Материал для электронно-микроскопического исследования модулирующего действия половых стероидов был взят у 12 крыс (по 3 самки на стадиях эструс, метэструс и диэструс, а также у 3 самцов). Стадии эстрального цикла определяли по цитологической картине влагалищных мазков. Кусочки ткани, содержащие структуры палеоамигдалы, извлекали из головного мозга под контролем микроскопа с помощью специального устройства, описанного в патенте РФ № 1679246. Материал фиксировали погружением в охлажденный 2,5%-ный раствор глютаральдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) и постфиксировали в 2%-ном растворе OsO4, обезвоживали в этаноле и заливали в эпон-812. Срезы готовили на ультратоме LKB III, контрастировали цитратом свинца (Reynolds, 1963) и анализировали в электронном микроскопе JEM 200 ЕХ (75 кВ). 12 особей было использовано для исследования палеоамигдалы у крыс с абсансной эпилепсией (по три самца линии WAG/Rij и Wistar половозрелого возраста) и смешанной конвульсивной эпилепсией (по три самца линии WAG/Rij до- и после аудиогенной стимуляции).

Иммуноцитохимические методы. Выявление CART-пептида проводили на приготовленных в криостате фронтальных срезах мозга толщиной 30 микрон, после перфузии его 1М фосфатным буфером (PBS, рН=7,4) и 4% раствором параформальдегида на 0,1 М PBS. Исследования проведены на белых половозрелых крысах линии Вистар (7 самок на стадии эструс, 7 самок на стадии метэструс, 7 самцов). Использовали первичные поликлональные rabbit-anti-CART (55-102) антитела (H-003-62, Phoeniх Pharm., Incorp, Belmont, CA, США) и вторичные goat-anti-rabbit антитела, конъюгированные с авединовым комплексом (ABC-kit 689321, ICN Biomedicals Inc., США). Визуализацию прореагировавших первичных антител производили при помощи диаминобензидинового хромогена (DAB, Sigma, США). Срезы закрепляли на стеклах с полилизиновым покрытием и высушивали при комнатной температуре. После обработки в спиртах и ксилоле срезы заключали под покровное стекло с помощью канадского бальзама.

Исследование экспрессии ER beta в нейронах палеоамигдалы на стадиях эстрального цикла - проэструс и метэструс проведены на 14 крысах линии Вистар в возрасте шести месяцев. Головной мозг фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,1 M фосфатном буфере (PBS, pH 7,3-7,4), заливали в парафин и готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые L-лизином. Для проведения иммуноцитохимической реакции применяли первичные антитела к ERв (polyclonal rabbit, Upstate) в разведении 1:100 в 1% растворе нормальной козьей сыворотки при температуре 4⁰С во влажной камере. Связывание первичных антител определяли путем инкубации срезов со вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре (goat antirabbit IgG,Vector Elite kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) в разведении 1:500 in 1% растворе нормальной козьей сыворотки и авидин-биотиновым комплексом (Vector Laboratories, CA). Для визуализации реакции использовали DAB (Sigma, USA).

Апоптозные клетки выявляли методом TUNEL. Головной мозг фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,1 M фосфатном буфере (PBS, pH 7,3-7,4), заливали в парафин и готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые L-лизином. Для выявления TUNEL-окрашенных структур использовали набор реактивов ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kit (фирма Chemicon).

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определяли содержание моноаминов (норадреналина, дофамина и серотонина) и их метаболитов - 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в палеоамигдале и обонятельных луковицах Общее количество использованных крыс линии Вистар половозрелого возраста составило 70 (30 самцов и 40 самок).

Материал для исследования брали от 3-4 крыс, умерщвленных передозировкой эфирного наркоза. После декапитации извлекали из черепа головной мозг и под контролем микроскопа на толстом фронтальном срезе (1-1,5 мм) из нативного мозга на льду выделяли область палеоамигдалы, а также основную обонятельную луковицу вместе с добавочной. Образцы, взятые из правого и левого полушария у 3-4 крыс, взвешивали (в среднем, вес навески был 25-30мг) и анализировали в одной пробе.

После взвешивания, изъятые из мозга кусочки, гомогенизировали в 20 объемах холодной 0,1М перхлорной кислоты (Sigma, USA) и 1пг/50 мкл дигидроксибензиламина гидробромида (ДГБА, Sigma, USA) в качестве внутреннего стандарта путем механического растирания в гомогенизаторе с тефлоным пестиком в течение пяти минут. Гомогенизат микропипеткой переносили в эпендорф и центрифугировали (при -20⁰С) в течение десяти минут при 6000 оборотов в минуту. Образовавшийся супернатант переносили микропипеткой в эпендорфы, снабженные специальными насадками (наборы для микрофильтрации фирмы «Биохром», Россия). Диафрагма насадки, отделяющая ее полость от эпендорфа, имела отверстия, которые мы закрывали при анализе каждой пробы сменяющимися фильтрами с величиной пор 0,02 мкм. После этого проводили повторное центрифугирование в течение трех минут. Очищенные, таким образом, супернатанты в эпендорфах помещали в специально сконструированные боксы со льдом и сразу же анализировали. Количественно содержание определяемых моноаминов и их метаболитов определяли на основании зависимости площади пика соединения от концентрации стандартного образца. Расчет содержания моноаминов в пробах осуществляли в пикограмм на мг ткани, при математической обработке их переводили в нг на мг ткани. Вычисляли и величины катаболических коэффициентов ДФ/ДОФУК и 5-ГИУК/С.

Поведенческие методики. При изучении механизмов развития наркотической зависимости регистрировали поведение двух групп крыс инбредной линии Вистар, имеющих модификацию аллельной структуры локуса TAG 1 A DRD₂. Одна группа крыс была гомозиготна по аллелю А₁, (А₁/А₁), другая по аллелю А₂ в этом же локусе - А₂/А₂. До начала эксперимента с принудительной наркотизацией с целью выявления различий между экспериментальными группами крыс (А₁/А₁ и А₂/А₂) в питьевом режиме и ориентировочно-исследовательской деятельности регистрировали среднесуточное потребления воды на протяжении одной недели, а также изучали их поведение в тесте «открытое поле».

«Открытое поле» представляло собой квадратную освещенную в центре арену, разделенную на 16 равных частей. Крысу в начале тестирования в открытом поле помещали в один из периферических квадратов и наблюдали за ее поведением в течение пяти минут. На протяжении сеанса тестирования определяли время, затрачиваемое крысой на груминг (чесательный рефлекс), пребывание в состоянии неподвижности, а также регистрировали латентный период до пересечения первого квадрата (амбуляции). Также подсчитывали количество эпизодов груминга, число пересеченных квадратов поля в центре и на его периферии, сумма которых характеризовала общую двигательную (горизонтальную) активность крысы. Исследовательскую деятельность крыс определяли подсчетом количества вертикальных стоек, которые крысы совершали в центре и на периферии поля. Сумма совершаемых крысой стоек на периферии и в центре поля характеризовала общую исследовательскую деятельность. Вегетативные реакции крыс регистрировали на основании учета числа уринаций и болюсов.

Экспериментальные модели. Неонатальная андрогенизация. Морфогенетическое действие андрогена изучено на 40 половозрелых крысах линии Вистар, содержавшихся в идентичных условиях вивария при свободном доступе к еде и воде. 10 самкам на 5-е сутки после рождения однократно был введен тестостерон-пропионат в дозе 1250 мкг. Все животные (15 самок, 15 самцов и 10 неонатально андрогенизированных самок) были умерщвлены в возрасте 3 месяцев при соблюдении всех правил работы с лабораторными животными. Головной мозг был обработан по методу Гольджи.

Двухпоилковый метод формирования наркотической зависимости (Борисова и соавторы, 1992). В эксперименте с принудительной алкоголизацией крысы двух экспериментальных групп (А₁/А₁ и А₂/А₂) в качестве единственного источника жидкости получали ad libitum в течение первой недели 6% водный раствор этилового спирта и 8% водный раствор этилового спирта - в течение второй недели. С 15-х по 21-е сутки (третья неделя) животным предоставляли выбор между раствором этилового спирта (8% раствор) и чистой водой. Регистрировали потребление воды и водного раствора наркотика в течение суток на протяжении пяти дней, а также поведение крыс в открытом поле.

Модель смешанной эпилепсии была создана по методике Кузнецовой и соавт. (Kuznetsova et al., 2000) путем аудиогенной стимуляции. Предварительно определяли аудиогенную чувствительность крыс в специальной камере (60x60x60см), используя «звон ключей» («keys ringing»). Звуковой сигнал имел диапозон 13-85 kHz (максимум спектра 20-40 kHz) и среднюю интенсивность 50-60 ДБ с величиной пиков до 80-90 ДБ. Стимульный раздражитель включал в себя ультразвуковую часть (20 кГц и выше) и был более эффективным для вызова большого судорожного припадка, чем звук звонка (Kuznetsova et al., 2000). Чувствительных к звуку крыс подвергали ежедневной в течение девяти дней аудиогенной стимуляции с продолжительностью воздействия 1,5 минуты. После завершения эксперимента пять крыс, показавших ежедневные большие судороги, были использованы для патогистологического исследования.

Статистическую обработку выполняли с использованием пакета программ «Statistica 5.5». Для оценки значимости цифровых данных использовали параметрические и непараметрические методы.

Результаты исследования и их обсуждение.

Исследование цитоархитектоники структур заднего отдела МК показало, что входящие в его состав компоненты серого вещества характеризуются гетероморфностью. Это указывало на необходимость их классификации, которая проведена нами на основании учения А.А.Заварзина (1986) о ядерных и экранных центрах нервной системы. При этом при оценке принадлежности экранных структур к формациям древней коры были учтены критерии, разработанные Pigache (1971) и Л.Б.Калимуллиной (1987).

Ядерными центрами на территории заднего отдела являются дорсомедиальное ядро, заднее медиальное ядро, латеральное ядро, базолатеральное ядро, эндопириформные ядра, добавочное базолатеральное и перивентрикулярные ядра. Палеокортикальные формации представлены пириформной и периамигдалярной корой. В этих структурах четко определяются слои: плексиформный, густоклеточный, глубокой клеточный и полиморфноклеточный. Промежуточное положение между ядерными и палеокортикальными структурами занимает заднее кортикальное ядро (Сор). Оно представляет собой межуточную формацию. С ядрами Сор роднит то, что оно имеет характер очагового скопления нейронов. Но в отличие от ядер в нём присутствует тенденция к расслоению, так как в его составе есть поверхностная бесклеточная зона, которая гомологична плексиформному слою палеокортикальных формаций. В каудальной части этого «ядра» латеральная часть клеточной зоны формирует полоску клеток, по густоте расположения нейронов которая, дифференцируется от глубоких клеточных масс.

Исследование интенсивности нуклеиново-кислого обмена в ядерных, межуточных и палеокортикальных формациях выявило достоверные различия в интенсивности включения ³Н-уридина в нейроны пириформной коры по сравнению с нейронами медиальной части заднего кортикального ядра (p<0,05). Это показывает, что в процессе эволюции мозга появление палеокортекса отражает прогрессивные изменения не только с точки зрения пространственных перестроек элементов серого вещества нервной системы (появление упорядоченности в расположении нейронов), но и инновации в ключевых звеньях клеточного метаболизма, проявляющиеся нарастанием интенсивности обмена нуклеиновых кислот.

Исследование нейронной организации выявило в составе ядер, межуточной формации и палеокортекса наличие большого разнообразия нейронов, основными типами среди которых были длинноаксонные густоветвистые и редковетвистые нейроны. При этом было обнаружено, что длинноаксонные редковетвистые нейроны концентрируются в структурах, занимающих медиобазальную поверхность заднего отдела МК, в то время как в составе структур базолатерального отдела преобладали длинноаксонные густоветвистые нейроны. Это наблюдение послужило отправной точкой в рассуждениях о субстрате древней части МК - палеоамигдале. Возник вопрос - не следует ли всю медиобазальную область заднего отдела МК, а не только дорсомедиальное ядро, в отношении которой был предложен этот термин (Акмаев, Калимуллина, 1993), рассматривать как древную часть МК?

Основанием для постановки такого вопроса послужил признанный в науке факт, установленный Т.А.Леонтович (1978), что в филогенетически древних отделах нервной системы преобладают длинноаксонные редковетвистые нейроны, а в отделах, формирование которых происходит на более поздних этапах, вследствие возрастания интегративных свойств нейронов, превалирующим типом нейронов становятся густоветвистые.

Цитоархитектонический анализ интересующей нас области показал, что на территории, занятой длинноаксонными редковетвистыми нейронами, занимающей медиобазальный угол полушария конечного мозга, находятся три структуры заднего отдела МК - дорсомедиальное (Med), заднее медиальное (Mep) и заднее кортикальное ядро (Cop).

Результаты цитоархитектонического анализа Med, Mep и Cop показали, что они топографически тесно связаны, располагаясь, друг над другом. Med является типичным ядерным центром, для которого характерна высокая плотность расположения нейронов. В Mep плотность расположения нервных клеток снижается, а разнообразие по форме тела и его размерам возрастает. Самое крупное по площади Cop имеет более сложное по сравнению с двумя другими ядрами устройство, и на основании существующих критериев должно рассматриваться как межуточная формация.

Сравнение цитоархитектоники Med, Mep и Cop показало, что на их общей территории существует дорсо-вентральный вектор усложнения структурной организации. Он проявляется в наличии плавного перехода от ядерного принципа организации серого вещества в экранный. Напрашивается аналогия со сведениями, по филогенезу МК, указывающими, что прототип МК представлен небольшой, плохо дифференцированной клеточной массой, ограниченной примордальной пириформной корой (Koikigami, 1963, Richardson, 1973, Карамян, 1976).

Тесная связь между тремя рассматриваемыми структурами имеет место в онтогенезе. Согласно данным Bayer (1980), изучавшего нейрогенез МК у крыс с 12 по 22 день эмбриогенеза с помощью ³Н-тимидина, основным местом генерации нейронов в медиальных зонах заднего отдела является область, где в последующем формируется Med. На 16 день в этой области имели метки 88 % клеток. Число клеток с метками в этот же день в области, где в последующем формируется заднее кортикальное ядро, составляло всего 7 %, указывая на существование дорсо-вентрального вектора выраженности пролиферативных процессов на территории медиальной поверхности полушария мозга. Уместно отметить, что в онтогенезе у человека МК начинает формироваться с его заднего отдела (Либерзон, 1937), что также является одним из показателей формирования заднего отдела МК на более ранних этапах исторического развития организмов, чем его центральный и передний отделы.

Другим весомым критерием для суждения о филогенетическом возрасте структур медиобазальной части заднего отдела МК является их локализация в перивентрикулярной зоне. Известно, что в процессе исторического развития мозга именно в этой зоне происходит генерация нейронов, которые, затем, мигрируя к поверхности нервной трубки, дают начало формированию различных структур мозга. Наиболее ярко этот процесс проявляется в мозге амфибий при формировании конечного мозга (Карамян, 1976).

На ростральном уровне заднего отдела ближе всего к стенке нижнего рога бокового желудочка прилежит Med, на каудальном уровне заднего отдела существует контакт со стенкой желудочка у Mep и Cop. Больше нигде на территории как центрального, так и переднего отдела МК его структуры не имеют контакта с желудочковой системой мозга.

Следующим аргументом в пользу «древности» рассматриваемых структур медиобазальной части заднего отдела МК является наличие в их перивентрикулярных зонах нейробластоформных нейронов, которые получили свое название от термина нейробласты, т.к. очень похожи на них по своим характеристикам (Леонтович, 1978). Эти нейроны чаще всего встречались в Med. Они имели два - три тонких, слабоветвящихся дендрита, которые отходили от округлых тел, располагаясь, под углом друг к другу. Характеристики этих нейронов позволяют предполагать, что они являются эквивалентами прогениторных клеток.

На правомерность такого предположения указывают результаты исследований Yachnis et al. (2000), выявивших наличие частично коммитированных клеток-предшественниц нейронов в перивентрикулярной зоне заднего отдела МК человека в материале, взятом для анализа при аутопсиях. Эти авторы охарактеризовали выявленные группы клеток как обладающие малыми размерами, имеющими округлые тела с двумя-тремя отростками, с интенсивно окрашивающимся ядром, содержащим базофильное ядрышко. Иммуноцитохимически в этих клетках выявлялись MAP-2 и тубулин в-III, Bcl-2, т.е. маркеры, позволяющие идентифицировать предшественники нейронов (Сосунов и соавторы, 2002).

На наличие тесного взаимодействия Med, Mep и Cop указывают данные об их связях. Показано, что существуют интенсивные связи Med с Cop (Canteras et al., 1992, 1995). А это означает, что указанные ядра связаны друг с другом не только топографически, но и функционально. Выявлены и важные детали связей рассматриваемых нами ядер с гипоталамической областью мозга, указывающие на время формирования в филогенезе. Так показано, что Cop дает проекции к каудальной (филогенетически новой) части медиального преоптического ядра, в то время как Med связано с передне-вентральной частью этого ядра (филогенетически старой).

Итак, исходя из приведенных выше данных, свидетельствующих о принадлежности дорсомедиального, заднего медиального и заднего кортикального ядер к редковетвистой нейронной системе, их локализации в перивентрикулярной зоне нижнего рога бокового желудочка, сведений литературы о характере их анатомических взаимосвязей и единого источника формирования в эмбриогенезе, можно заключить, что рассматриваемый комплекс ядер представляет собой единую по структурной организации и механизмам развития область МК, формирование которой проходило на самых ранних этапах его становления. Адекватным термином, отражающим эти представления, является термин «палеоамигдала».

Половой диморфизм в Med установлен на основании морфометрических показателей и данных гистофизиологического исследования (Акмаев, Калимуллина, 1982, Hines et al., 1992). При этом вопрос о механизме и сроках его формирования оставался открытым. Это послужило основанием для проведения экспериментальных исследований с неонатальной андрогенизацией самок крыс в критическом периоде половой дифференциации мозга (ПДМ).

Изучение результатов модельного эксперимента с введением тестостерон-пропионата самкам крыс на пятый день после рождения показало, что в палеоамигдале реализуется морфогенетическое действие андрогена и возникающие перестройки в дендроархитектонике нейронов происходят как в длинноаксонных редковетвистых, так и в длинноаксонных густоветвистых нейронах.

В Med у неонатально андрогенизированных крыс дендриты нейробластоформных нейронов становились не только более разветвленными (Bd, p<0,01), что было отмечено при изучении половых различий у взрослых особей, но увеличивалась и их общая длина (Ld, p<0,001). В короткодендритных нейронах имело место не только увеличение числа свободных концов дендритов (Bd, p<0,05), но нарастание числа точек ветвления дендритов (Gd, p<0,05). В ретикулярных нейронах изменения количественных характеристик отражали увеличение длины дендритов (Ld, p<0,05).

В Mep морфогенетический эффект андрогена проявляется увеличением ветвления дендритов у нейробластоформных (Bd, p<0,05) и короткодендритных нейронов, а также удлинением дендритов ретикулярных нейронов (Ld, p<0,01, Ldt, p<0,05, Sda, p<0,05) и длинноаксонных густоветвистых нейронов (Ld, p<0,01, Ldt, p<0,01). Установлено, что нарастание длины дендритов происходит за счет их концевых ветвей (Ldt), что подтверждает участием в реализации генотропного влияния половых стероидов белков цитоскелета клетки, в частности микротубулин ассоциированного белка - MАР-2 (Iwata et al., 2005). Наибольшая выраженность половых различий обнаружена среди короткодендритных нейронов Mep, у которых из семи исследованных параметров значимо отличались четыре (Bd, Sda, Gd, Ld, все при p<0,05).

В Cop популяция длинноаксонных редковетвистых нейронов у самок включала в себя все основные типы клеток: нейробластоформные, короткодендритные и ретикулярные. Результаты анализа длинноаксонных редковетвистых нейронов показали, что влияние тестостерон - пропионата приводит к увеличению числа первичных дендритов (d, p<0,001) и свободных концов дендритов (Bd, p<0,05).

Подавляющее большинство длинноаксонных густоветвистых нейронов, выявлявшихся в этом ядре, были подкорковыми кустовидными, для которых характерно ветвление дендритов на небольшом расстоянии от тела клетки. У неоандрогенизированных самок отмечены особенности в дендроархитектонике нейронов, состоящие либо в наличии диспропорций между увеличением длины дендритов при сохраняющейся их слабой разветвленности, либо в резком удлинении одного из дендритов мультиполярного нейрона (при этом чаще всего длинный дендрит был направлен в сторону поверхностной зоны заднего кортикального ядра). Результаты показали, что влияние андрогена проявляется через изменение ряда параметров: возрастает их общая длина (Ld, p<0,01), суммарная длина всех концевых веточек дендритов нейрона (Ldt, p<0,01), что приводит к значимому увеличению площади дендритного поля (Sda, p<0,05). Следует отметить, что у неоандрогенизированных самок самый длинный (С) и самый разветвленный (Cr) дендриты неодинаково различались по характеру увеличения числа точек ветвления. Если на самом длинном дендрите имело место увеличение числа точек ветвления (Gc, p<0,05) и числа свободных концов (Bdc, p<0,05), то на самом разветвленном дендрите при увеличении числа точек ветвления (Gr, p<0,05) количество свободных концов (Bdr, p>0,05) не возрастало. Это, вероятно, можно объяснить нарушением правила дихотомического ветвления дендритов (Косицын, 1976). Результаты сравнительного анализа количественных характеристик длинноаксонных редковетвистых нейронов у контрольных и неоандрогенизированных самок крыс показали, что морфотропический эффект тестостерон- пропионата, проявляется увеличением у нейронов Cop числа первичных дендритов вдвое. Такой же эффект отмечен у крыс в нейронах вентромедиального ядра гипоталамуса при введении тестостерон пропионата на второй день их жизни (Mong et al., 1999).