Структурно-функциональная организация палеоамигдалы: фундаментальные закономерности и прикладные аспекты

Морфогенетический эффект тестостерон пропионата проявляется формированием изменений дендроархитектоники нейронов, основная направленность которых совпадает с выявленными нами при изучении половых различий. Однако, андрогенизация самок в периоде ПДМ приводит к формированию различий в дендроархитектонике нейронов по своим количественным характеристикам, превышающим половые различия - так у густоветвистых нейронов Cop определяется не только увеличение общей длины дендритов, но и увеличение площади дендритного поля. Столь значительные изменения указывают на высокую чувствительность нервной системы в периоде ПДМ к влиянию половых стероидов (Акмаев,1979).

Особого внимания заслуживают различия, отчетливо проявившиеся в реакции дендритов двух типов длинноаксонных нейронов. У длинноаксонных густоветвистых нейронов меняются количественные характеристики дендритов, у длинноаксонных редковетвистых - качественные, так как увеличивается число первичных дендритов, сопровождаемое изменением поверхности клетки. Можно высказать предположение, что два типа длинноаксонных нейронов - длинноаксонные густоветвистые и длинноаксонные редковетвистые нейроны - могут иметь различные генетические программы, определяющие формирование дендритов. Если встать на эту позицию, то легко объяснить и имеющиеся у них особенности функций, а также то, что на протяжении эволюции нервной системы, когда необходимость в повышении интегративных способностей нейронов в связи с усложнением организмов возрастает, имеет место сохранение редковетвистых нейронов.

В реализации морфогенетического действия половых стероидов (ПС) большую роль играют метаболические перестройки андрогена, осуществляемые с участием 5б-редуктазы и ароматазным ферментным комплексом. Эти ферментные системы служат маркерами структур, на которые воздействуют ПС в периоде ПДМ. Наибольшая активность ароматазного ферментного комплекса выявлена в гипоталамусе, за которым по степени активности этих ферментов следует МК (Naftolin et al., 1975). При изучении особенностей метаболизма тестостерона в ростральных и каудальных частях МК у плодов на 21 день развития отмечено, что в каудальной порции МК преобладающим метаболитом является 3б-диол (5б-андростан-3б, 17в-диол), образование которого происходит при участии 3б-окси-редуктазы стероидов (Резников и соавт., 1990, Акмаев, Калимуллина, 1993).

В последние годы интенсивно исследуется механизм влияния ПС на нейрогенез. Показано, что в культуре ткани эстрадиол ускоряет интенсивность роста нейронов и темпы формирования аксона, дендритов, их число и разветвленность (Audesirk et al., 2003). При этом 17в-эстрадиол оказывает свое влияние через ERб, экспрессия которого в нейронах происходит параллельно с экспрессией маркеров пролиферирующих нейронов Ki-67 и мигрирующих и дифференциирующихся клеток - даблкортина (Isgor,Watson, 2005). Известно, что экспрессия эстрогенных рецепторов в преоптической области, гипоталамусе и медиальном ядре МК осуществляется во время внутриутробного развития крыс (Mann, Babb, 2005).

Приведенные выше данные по морфогенетическому действию половых стероидов в раннем постнатальном периоде развития крысы указывают на то, что палеоамигдала вовлечена в процессы ПДМ и в периоде ПДМ происходит программирование ее структурно-функциональной организации как нейроэндокринного центра мозга.

Детерминация программы развития МК в периоде ПДМ реализуется в ходе развития организма через ряд последовательных этапов, одним из которых является половое созревание организма.

Отсутствие сведений в литературе о морфогенезе структур МК в раннем ювенильном периоде развития мозга крысы (с 21-28 дни жизни) указало на необходимость его исследования. Важность изучения этого вопроса была продиктована также тем, что в этот период происходит формирование механизма положительной обратной связи (Вундер, 1980, Docke et al., 1978). Большую роль играет в этот период созревание эстрадиол - связывающей системы мозга: в нейронах гипоталамуса и МК число ядерных эстрогенных рецепторов к 26 дню постнатального периода (ПП) возрастает вдвое (Резников, 1982, Perez et al., 2003).

Результаты проведенного исследования показали, что в раннем ювенильном периоде в структурах палеоамигдалы происходят напряженные пластические перестройки. На 21-й день ПП крысы среди структур палеоамигдалы хорошо дифференцируется только Med, на 28-й день распознается Mep, а Cop приобретает характерную для него цитоархитектонику только на 28-31 день ПП, с которого у крысы начинается поздний ювенильный период (Резников, 1982). Гетерохронное созревание структур палеоамигдалы, несомненно, связано с неодинаковой сложностью их структурно-функциональной организации.

Med представляет собой ядерный центр и является местом формирования конечной полоски (КП), одной из первых систем волокон мозга (Krieg, 1942). КП присутствует в мозге низших позвоночных (круглоротых и рыб), обеспечивая связь обонятельной луковицы с МК и последней с преоптической областью мозга (de Olmos, 1972). КП является путем, через который феромоны достигают гипоталамической области, включение которой обеспечивает процесс вымета гамет в водную среду.

Начиная с 24 дня, в этом ядре происходят перестройки, приводящие к появлению половых различий, которые сводятся к уменьшению его площади у самок крыс (p=0,054 на 24 день и p<0,05 на 28) при одновременном увеличении плотности расположения в нем нейронов (p<0,01 на 24 день). Это согласуется с цитоархитектоническими особенностями полового диморфизма этого ядра у взрослых крыс (Акмаев, Калимуллина, 1993). Половой диморфизм в Med указывает на особенности его функционирования у самок и самцов крыс, а именно: на причастность этого ядра у самцов к регуляции копулятивного поведения (Dominguez et al., 2001, Cooke et al., 2003, , Portillo et al., 2006), а у самок - к модуляции активности циклического центра секреции гонадотропинов (Docke et al., 1977, Beltramino, Taleisnik, 1983, Meredith, 1991, Hosokawa, Chiba, 2007).

По-видимому, тесное прилегание нейронов Med у самок друг к другу (о чем свидетельствует высокая плотность нейронов, отмеченная также и у взрослых животных) и формируемые при этом межнейрональные контакты способствуют синхронизации деятельности нейроэндокринных нейронов этого ядра (Калимуллина и соавторы, 1999). Известно, что ПС влияют на экспрессию коннексина 43 (CX43), участвующего в создании и функционировании щелевидных контактов в преоптической области мозга, обеспечивающих синхронизацию возбуждения нейронов, вовлекаемых в регуляцию эстрального цикла (Gulinello, Etgen, 2005)

Cop имеет сложную структурно-функциональную организацию. Медиальная часть ядра имеет прямые связи с добавочной обонятельной, а латеральная - с основной обонятельной луковицей (Scalia, Winans, 1975). На территории этого ядра происходит интеграция обонятельной информации, поступающей из обеих обонятельных луковиц, которая затем передается в другие структуры МК и мозга (Pro-Sistiaga et al., 2007). Эфферентные волокна из Cop достигают Med, вентромедиального ядра гипоталамуса (центр женского полового поведения) и структур гиппокампальной формации (Olmos, 1972, Coolen, Wood, 1998, Kemppainen et al., 2002). Сложностью структурно-функциональной организации этого ядра, очевидно, можно объяснить тот факт, что оно «оформляется» только на 28-31 день ПП. При этом, несомненно, играет роль и длительный морфогенез основной обонятельной луковицы, которая в отличие от добавочной обонятельной луковицы (5 день ПП) происходит до 30 дня ПП (Rosselli-Austin, Altman, 1979, Salazar et al., 2006). Половые различия в плотности нейронов, выявленные в Mep и в медиальной части Cop на 21 день ПП, отражают, вероятно, половой диморфизм добавочной обонятельной луковицы, с которой они имеют прямые связи (Segovia S et al., 2006).

Величины апоптического индекса, рассчитанные в структурах палеоамигдалы, указывают на то, что запрограммированная клеточная гибель в раннем ювенильном периоде развития крысы не является решающим событием в формировании перестроек этого периода. По всей видимости, апоптоз обусловлен специализацией синаптических мишеней и отражает процесс формирования нервных связей структур палеоамигдалы с обонятельными луковицами, а также гипоталамическими репродуктивными центрами (Калиниченко, Матвеева, 2007, Scalia, Winans, 1975, Coolen, 1998).

Полученные в работе данные согласуются с результатами экспериментальных исследований, выполненных на препубертатных крысах (Docke et al., 1977) и показавших, что на четвертой - пятой неделе ПП развития крыс в каудальном части кортико-медиального отдела МК формируется район, вовлеченный в функциональную систему мозга, принимающую участие в процессах реализации положительной обратной связи. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что только к 28-31 дню постнатального периода в заднем отделе МК происходит полный морфогенез всех структур палеоамигдалы, и они по своим цитоархитектоническим и структурно-количественным характеристикам приближаются тождественным показателям, характерным для структур палеоамигдалы в организме взрослых крыс (Акмаев, Калимуллина, 1993).

Полученные в нашей работе данные указывают на то, что в раннем ювенильном периоде развития крысы формирование полового диморфизма в палеоамигдале происходит поэтапно, начиная с дорсомедиального ядра, и завершается к концу этого периода морфогенезом заднего кортикального ядра. Выявленный дорсо-вентральный вектор отражает сложность структурно-функциональной организации, входящих в состав палеоамигдалы структур, а также роль афферентного притока из обонятельных луковиц.

Исследование цитологических характеристик нейронов, глии и сосудов структур палеоамигдалы на светооптическом уровне показало, что в составе Med, Mep и Cop выявляются кариохромные, светлые и цитохромные нейроны. При этом в составе Med, Mep преобладали кариохромные и светлые нейроны. Cop является самой полиморфной зоной палеоамигдалы, где представлены все выше названные типы нейронов, имеет место разнообразие их размеров и формы перикарионов.

Изучение ультраструктуры нейронов позволило углубить наши представления об их структурной организации. Было выявлено, что тёмные нейроны представляют собой эквивалент кариохромных нейронов. Но если в световом микроскопе тёмное, базофильное ядро казалось богатым гетерохроматином, электронная микроскопия позволила убедиться, что высокая электронная плотность ядра во многих нейронах предопределяется наличием большого числа интерхроматиновых гранул (ИХГ), которых больше по сравнению с глыбками гетерохроматина. А мелкая базофильная (пылевидная) зернистость в цитоплазме кариохромных нейронов представлена скоплениями свободных рибосом и полисом. Признаки высокой транскрипционной активности ядра сочетаются с гипертрофией комплекса Гольджи, морфологическими показателями его секреторной активности и многочисленностью митохондрий. Всё это свидетельствовало о том, что среди кариохромных нейронов, которые в электронном микроскопе носят характер темных, могут быть нейроны, как с показателями высокой, так и низкой функциональной активности, что требовало более детального исследования. Весьма важной находкой было обнаружение секреторной активности нейронов, что указывало на наличие у них характеристик нейроэндокринных нейронов.

Наряду с кариохромными нейронами мы видели и светлые нейроны. На уровне светового микроскопа для светлых нейронов было характерно наличие богатого эухроматином ядра и светлой, умеренно базофильной, цитоплазмы, в которой определялись мелкие глыбки хроматофильной субстанции. В электронном микроскопе в этих нейронах определялось наличие ровного контура поверхности ядра (в то время как в тёмных нейронах отмечены множественные выбухания и инвагинации) с присутствием в нуклеоплазме характерных нежных хроматиновых нитей со скудностью гранулярного компонента, компактное ядрышко. В цитоплазме узкие канальцы гранулярной эндоплазматической сети (ЭС) сочетались с расширенными цистернами гладкой ЭС. Расположение мембран ЭС носило нерегулярный характер. Немногочисленные митохондрии имели уплотненный матрикс. В цитоплазме светлых клеток мы видели везикулы с плотным центром. Число свободных рибосом в светлых нейронах было уменьшено по сравнению с тёмными нейронами. Однако, между тёмными и светлыми нейронами были и переходные формы, когда светлое, богатое эухроматином ядро, обладающее признаками сглаживания "деформированной" поверхности было окружено цитоплазмой, которое, в целом, имела характеристики цитоплазмы тёмных нейронов.

Светлые нейроны с хорошо развитой гранулярной ЭС были наиболее часто представлены в Cop и характеризовали ультраструктуру цитохромных нейронов. Светлое крупное, богатое эухроматином клеточное ядро в них сочеталось с наличием хорошо развитой гранулярной ЭС, канальцы которой в ряде клеток располагались в виде параллельных рядов, имеющих значительную протяженность и несущих на своей поверхности рибосомы. Эта картина соответствует ультраструктуре телец Ниссля, а именно они были отмечены нами в цитоплазме этих нейронов в виде крупных глыбок базофильной субстанции.

В отдельных зонах палеоамигдалы нам удалось отметить тесное прилежание перикариона нейронов к стенке сосудов и выявить сеть периэндотелиальных пространств. На поверхности эндотелия имелось большое количество микроворсинок, т. е. присутствовали те черты, которые характерны для сосудов нейросекреторных центров (Войткевич, Дедов, 1972). Приведенные данные свидетельствуют о наличии у нейронов трансдукционных функций (Немечек и соавт., 1978). Выявлены в составе нейропиля палеоамигдалы и определенные особенности аксонов. Они проявлялись в том, что образовывали большое количество коллатералей и по ходу имели варикозные расширения, диаметр которых достигал 2 мкм. Внутри варикозных расширений определяются группы митохондрий и везикулы с плотным центром, размером до 220 нм. Некоторые аксоны не имели миелиновой оболочки, что характерно для нейросекреторных клеток. Можно думать, что они приходили в палеоамигдалу из гипоталамической области и принадлежали ЛГ-РФ-продуцирующим нейронам (Reichlin, 1985, Reubi et al., 1987). Глия была представлена олигодендроцитами и астроцитами, которые часто располагались в тестом контакте с телами нейронов.

Выполненный анализ цитологических характеристик нейронов палеоамигдалы показал, что в составе ее структур присутствуют кариохромные, цитохромные и светлые нейроны, электронно-микроскопическими эквивалентами которых являются темные и светлые нейроны, обладающие признаками секреторной активности. Большая вариация их представительства у самок крыс по сравнению с самцами поставил вопрос о зависимости их функционального состояния от уровней половых стероидов (ПС), и указал на необходимость более детального анализа их структурно-функциональной организации.

Изучение цитологических характеристик нейронов палеоамигдалы в препаратах, окрашенных на нуклеиновые кислоты по Эйнарсону, и подсчет количества «темных» и «светлых» клеток в стадии эструс и метэструс показали, что при смене стадий эстрального цикла изменяется их соотношение. Уточнению этого наблюдения способствовал метод авторадиографии с ³Н-уридином.

В автографах Med белых крыс, которым был введен ³Н-уридин, зерна восстановленного серебра обнаруживали преимущественно в ядрах нейронов и реже (иногда) - в цитоплазме. Большую интенсивность имела метка в эндотелии сосудов и прилежащих к ним нейронах. Подсчет зерен серебра на единицу площади объекта с учетом фона вне среза показал, что у крыс на стадии эструс он равен 10,45+0,89, метэструс - 8.29+0,27. Сравнение вариационных рядов групповых средних, отражающих интенсивность включения изотопа в двух исследованных группах показало, что выявившиеся различия являются статистически значимыми (р<0,01).

Анализ результатов исследования активности сукцинатдегидрогеназы в нейронах этого ядра в различные стадии эстрального цикла (ЭЦ) свидетельствует о том, что гранулы диформазана распределяются в ткани этого ядра практически диффузно с некоторой концентрацией в отдельных клетках и свидетельствуют о высокой активности митохондрий в ткани Med.

Электронно-микроскопический анализ функционального состояния нейронов палеоамигдалы на четырех группах крыс (по 3 самки на стадиях эструс, метэструс и диэструс, а также у 3 самцов), позволил разработать классификацию нейроэндокринных нейронов этого ядра. Нейроэндокринные нейроны как у самок, так и у самцов крыс могут находиться в состоянии «покоя», отражающего режим спокойного функционирования нейронов, «умеренной активности», «повышенной активности», «пика активности или напряжения», «снижения активности по первому типу», «снижения активности по второму типу» и «возврата к исходному состоянию».

Состояние «покоя» отражает режим спокойного функционирования нейронов. Светлое, богатое эухроматином клеточное ядро находится в центре перикариона и содержит компактное ядрышко. Эухроматин представлен равномерно распределенными тонкими нитчатыми структурами. Перинуклерное пространство узкое (50 нм). В кариоплазме выявляются отдельные мелкие гранулы - интерхроматиновые (ИХГ, 20 нм) и перихроматиновые (от 40 до 60 нм). Ядрышко имеет четкие контуры, в нем выявляются крупные светлые фибриллярные центры. Небольшие глыбки конденсированного хроматина располагаются равномерно в различных зонах кариоплазмы, около ядрышка и под внутренней ядерной мембраной.

В цитоплазме представлены узкие канальцы гранулярной эндоплазматической сети (ЭС), небольшие скопления полисом и умеренное количество митохондрий округлой или овальной формы с поперечно расположенными кристами. Матрикс митохондрий обладает умеренной осмиофилией. Комплакс Гольджи (КГ) представлен стопками уплощенных цистерн, имеющих различную протяженность, располагается в перинуклеарной зоне. К боковым поверхностям цистерн прилежит незначительное количество микропузырьков и отдельные вакуоли. Вблизи от КГ или около плазматической мембраны можно найти отдельные везикулы с плотным центром, диаметр которых варьирует от 60 до 275 нм. В цитоплазме клеток выявляются первичные лизосомы и отдельные липофусциновые гранулы.

Состояние «умеренной активности» характеризуется наличием в ядрах признаков транскрипционной активности, увеличением и разрыхлением ядрышка. Ядрышко смещено к ядерной мембране, на его поверхности есть неровности, формируемые гранулами. В ядрышке увеличено число малого размера фибриллярных центров, обрамленных зоной выраженной осмиофилии - плотным фибриллярным компонентом. Количество краевого хроматина под внутренней ядерной мембраной снижено. Перинуклерное пространство местами расширено и переходит в расширенные канальцы гранулярной ЭС. Число ядерных пор увеличено. Поверхность клеточного ядра волнистая. В кариоплазме находятся небольшие очаговые скопления интерхроматиновых гранул (ИХГ). Они различаются по величине занимаемой площади. Выявляются пучки перихроматиновых фибрилл, они имеют вид либо параллельно расположенных фибрилл, либо их концы расходятся веерообразно.

При этом ядро светлое, в то время как цитоплазма за счет увеличенного числа канальцев гранулярной ЭС, большого числа прикрепленных и свободных рибосом, полисом, гипертрофии и гиперплазии темных митохондрий умеренно электронно-плотная. Продольный размер митохондрий увеличен, между ними определяются контакты. Определяется изменение ориентации крист, их неравномерное расположение. Умеренная гипертрофия КГ проявляется расширением просвета цистерн и увеличением числа транспортных пузырьков, а также появлением мелких и крупных осмиофильных гранул секрета. В цитоплазме определяется увеличенное число первичных лизосом. Выявляемые везикулы с плотным центром имеют размер от 60 до 275 нм.

Состояние «повышенной активности» характеризуется содержанием большого количества гранулярного материала в кариоплазме. Но в зонах, свободных от гранулярного материала, кариоплазма остается светлой, т.е. проницаемой для электронов. В этих, светлых участках удается видеть отдельные фибриллы, характерные для эухроматина. Гранулярный материал в кариоплазме представлен скоплениями ИХГ, которые формируют очаги в различных ее зонах. Около очагов краевого гетерохроматина присутствуют перихроматиновые гранулы. Ядро и ядрышко увеличены в размерах. В ядрышке, которое располагается эксцентрично, выявляются небольших размеров фибриллярные центры с плотным фибриллярным компонентом. Перинуклеарное пространство в отдельных участках расширено, размеры ядерных пор увеличены. Ядерная мембрана формирует складки, в участки инвагинаций поверхности ядра проникают язычки цитоплазмы.

В перинуклерной зоне цитоплазмы определяется «пояс» из митохондрий, количество и размеры которых увеличены. Митохондрии имеют темный матрикс, число крист увеличено, между митохондриями выявляются контакты. Наблюдается очаговое расширение канальцев гранулярной ЭС, которые преобразуются в цистерны. Просвет расширенных канальцев гранулярной ЭС свободен от содержимого. Число прикрепленных рибосом на поверхности их мембран уменьшается, а число свободных рибосом и полисом в цитоплазме возрастает. Полисомы в цитоплазме распределены неравномерно. Заметна гипертрофия КГ (можно видеть несколько его комплексов с расширенными цистернами, хорошо развитым вакуолярным компонентом и множеством транспортных пузырьков). Определяются мультивезикулярные, а также мультиламинарные тельца. Везикулы с плотным центром находятся около КГ или около плазматической мембраны в субповерхностных зонах, их количество увеличивается по сравнению со стадией «умеренной активности».

Состояние «пика активности или напряжения» характеризуется высокой электронной плотностью увеличенного в размерах ядра, в котором определяется не только большое количество гранулярного материала, но и присутствует осмиофильная мелкозернистая субстанция.

Ядрышко рыхлое, увеличенное в размерах, с хорошо различимым гранулярным компонентом, большим числом фибриллярных центров, имеющих плотный фибриллярный компонент. В осмиофильной кариоплазме определяются как в центральных, так и краевых зонах большие по занимаемой площади скопления ИХГ гранул, для которых в отличие от остального гранулярного материала, представленного в ядре, характерна выраженная осмиофилия, четкость контуров. ИХГ располагаются рыхло и имеют диаметр 20 - 25 нм. Количество перихроматиновых гранул (ПХГ) увеличено. В центральных зонах кариоплазмы выявляются различные по величине и плотности участки гетерохроматина, около которых находятся ПХГ, количество которых может достигать от трех до шести. Перинуклерное пространство равномерно расширено, размеры ядерных пор увеличены. Поверхность ядра складчатая.

Канальцы гранулярной ЭС расширены, на поверхности ее мембран число прикрепленных рибосом снижено, между цистернами лежат скопления полисом. КГ достигает высокого уровня развития: определяется три-четыре комплекса с хорошо развитым мембранным компонентом. Локализуется он в перинуклеарной зоне, около него определяется формирование секреторных везикул. Много гипертрофированных митохондрий, среди которых могут быть и со светлым матриксом. Определяется тесный контакт митохондрий с цитомембранами - гранулярной ЭС, КГ, наружной ядерной мембраной. Могут быть выявлены и явления блеббинга ядерной мембраны в мембраны КГ. Часто встречаются мульвезикулярные и мультиламинарные тельца.

Структурная организация нейронов указывает на высокую интенсивность протекающих в них транскрипционных процессов. Осмиофилия кариоплазмы, возможно, свидетельствует об увеличении содержания в клеточном ядре белков, принимающих участие, как в транспорте создаваемых РНК в цитоплазму, так и включающихся в процессы конденсации хроматина. В таких клетках, вероятно, происходят усиленно и процессы внутриклеточной регенерации, на что указывает наличие мультиламинарных телец.

Состояние «снижения активности по первому типу» характеризуется увеличением содержания гетерохроматина, как в краевых, так и центральных зонах ядра. При этом ИХГ или не выявляются, или их количество резко уменьшено. Размер фибриллярных центров в ядрышке увеличен, а их количество уменьшено. Кариоплазма осмиофильна за счет мелкозернистой и пылевидной субстанции. Плотное, уменьшенное в размерах ядрышко, располагается в таких нейронах эксцентрично, имея контакт с хорошо выраженным краевым хроматином. ПХГ около него или не выявляются, или единичны. Перинуклерное пространство равномерно расширено. На поверхности ядра встречаются складки.

Цитоплазма, прилежащая к ядру содержит полисомы, светлые митохондрии и липофусциновые гранулы. КГ имеет вакуолярный компонент, просвет вакуолей свободен от содержимого. Канальцы гранулярной ЭС расширены, на поверхности ее мембран определяются редкие рибосомы. Митохондрии многочисленны, размер некоторых из них увеличен. Везикулы с плотным центром немногочисленны.

Данные нейроны, имеющие плотное ядрышко и увеличенные количества конденсированного хроматина в кариоплазме, могут быть расценены как завершившие транскрипционные процессы. Однако обилие полисом в цитоплазме показывает, что в них активно происходят процессы трансляции. Снижение активности по охарактеризованному варианту следует, очевидно, за стадией напряжения.

Снижение активности по второму типу определяется в других нейронах, которые носят характер переходных (светлое ядро и темная цитоплазма), в них определяется увеличенное в размерах ретикулярное ядрышко. В составе ядрышка выявляются пять - шесть крупных фибриллярных центра и несколько мелких. Плотный фибриллярный компонент в них не определяется. Содержание гранулярного компонента в ядрышке снижено. Кариоплазма таких нейронов менее осмиофильна, чем в нейронах, находящихся в состоянии «повышенной активности» или «напряжения». Но она имеет место и обусловлена наличием пылевидной субстанции, равномерно заполняющей клеточное ядро. Содержание краевого хроматина снижено, а гетерохроматин в центральных зонах ядра носит характер рыхло расположенных небольших по размеру осмиофильных скоплений, около которых определяются ПХГ.

Перинуклеарное пространство расширено в отдельных участках до 150 нм. В этих зонах определяются увеличенные в размерах ядерные поры, хотя число их не увеличено. В просвете перинуклеарного пространства определяется пылевидная осмиофильная субстанция, в прилежащих зонах цитоплазмы много полисом и свободных рибосом. Внутри таких зон лежат митохондрии с темным матриксом, с плохо различимыми кристами. В матриксе могут встречаться небольшие очаги просветления. Мембраны митохондрий, как наружная, так и внутренняя, хорошо структурированы. В наружных, субповерхностных зонах цитоплазмы определяются длинные узкие канальцы гранулярной ЭС с редкими рибосомами. Местами канальцы расширяются, в прослойках цитоплазмы, прилежащих к канальцам, видны группы окаймленных пузырьков. Просвет канальцев свободен от содержимого. Цистерны КГ расширены, определяется формирование вакуолей. Вблизи от КГ определяются везикулы с плотным центром.

Эти нейроны, вероятно, отражают снижение функциональной активности тех из них, которые не проходили стадии «напряжения», а образовались из нейронов в состоянии «умеренной» или «повышенной активности». Это, вероятно, отражает тот факт, что нейроны могут работать с разной функциональной нагрузкой. Возможно, подобные нейроны могут быть обозначены как снижающие свою функциональную активность путем ускоренной реверсии.

Состояние «возврата к исходному состоянию». Характерной особенностью этих нейронов являются картины сегрегации гранулярного компонента ядрышка, проявляющиеся их разобщением. Эти явления указывают на блокаду синтеза РНК в ядрышке. Содержание перихроматиновых гранул может быть различным. Ширина перинуклерного пространства уменьшается (60 нм). Поверхность ядра может сохранять складки, однако, в язычках цитоплазмы, которые «проникают» в ядро, отмечается уменьшение плотности расположения полисом. Нейроны, в состоянии «возврата к исходному состоянию», вновь приобретают характер светлых клеток. В клеточном ядре определяются умеренные скопления краевого хроматина, эухроматин представлен нежными фибриллярными структурами. В кариоплазме ряда клеточных ядер четко определялось одно крупное, имеющее вид сетевидной структуры, тельце Кахала.

Снижается и число митохондрий, которые равномерно распределяются по цитоплазме. Они имеют округлую или овальную форму, небольшие размеры, четкие мембраны, умеренной осмиофилии матрикс. Канальцы гранулярной ЭС узкие, просвет свободен от содержимого. Они располагаются в различных зонах цитоплазмы, некоторые из них находятся в контакте с митохондриями. КГ представлен различными по протяженности стопками уплощенных цистерн, около которых определяется небольшое число микропузырьков. В цитоплазме обнаруживаются отдельные мультивезикулярные тельца. Лизосомы единичны и носят характер гранул накопления или липофусциновых телец. В отдельных зонах цитоплазмы выявляются окаймленные пузырьки и везикулы с плотным центром.

При изучении ультраструктуры нейронов на различных стадиях эструсного цикла (ЭЦ), мы не встретили у самок крыс ни одной клетки с признаками дегенерации (пикноморфных нейронов). Это позволяет предполагать, что нейроны способны возвращаться в исходное состояние для того, чтобы вновь активизироваться в следующую фазу ЭЦ. Полученные результаты позволили прийти к выводу, что в нейроэндокринных нейронах палеоамигдалы имеет место функциональная гормон-зависимая реверсия, происходящая в динамике ЭЦ под влиянием меняющихся уровней ПС.

У самцов встречались единичные пикноморфные клетки. Для них была характерна выраженная почти гомогенная осмиофилия ядра и цитоплазмы, уменьшение размеров перикариона, сморщивание. Клеточное ядро было деформировано, имело извилистый рельеф поверхности из-за многочисленных глубоких выбуханий и инвагинаций. Под внутренней ядерной мембраной определялись скопления гетерохроматина. Ядрышко было гомогенным, плотным, находилось в центре ядра, или подвергалось фрагментации, при этом его части выявлялись около внутренней ядерной мембраны. Перинуклеарное пространство было узким, местами плохо различимым. В прилежащих к ядру зонах цитоплазмы находились многочисленные, увеличенные в размерах, митохондрии, с просветленным матриксом и разрушенными кристами. Канальцы ЭС были плохо различимы. Между канальцами ЭС располагаются отдельные свободные рибосомы или участки гомогенной цитоплазмы. Цистерны КГ были резко расширены или, наоборот, находились в спавшемся состоянии, формируя стопки с расширениями на концах. Просвет их был пустым. Можно полагать, что в подобных случаях происходит гибель клетки путем апоптоза.

На различных стадиях ЭЦ можно найти все перечисленные разновидности, но количество нейронов того или иного состояния различается в зависимости от стадии ЭЦ.

Полученные результаты показали, что активизирующее влияние ПС проявляется во всех структурах палеоамигдалы, механизм которого можно объяснить на основании следующих данных.

Известно, что нейроны Med способны экспрессировать обе формы эстрогенных рецепторов - ERб и ERв, и обе формы прогестиновых рецепторов - PRA и PRB, при этом в одной и той же клетке может иметь место коэкспрессия этих рецепторов (Greco et al., 2001). Показано, что 17-в эстрадиол, пиковая концентрация которого имеет место на стадии проэструс, усиливает экспрессию ERб и оказывает свое влияние через этот рецептор (Audesirk et al., 2003, Marin et al., 2003). Также известно, что ERб активизирует транскрипционные процессы в нейронах, воздействуя через AP-1 чувствительный элемент (Pasterkamp et al., 1996, Paech et al., 1997, Бабичев, 2005). Исследование модулирующего влияния ПС на нейроны Med в динамике ЭЦ показало, что повышение уровня эстрогенов на стадии эструса приводит к увеличению количества нейронов в состоянии «повышенной активности» и «пика активности» (соответственно 40 и 26%), при этом общий процент этих нейронов составляет 66%.

На стадии метэструс самый большой процент нейронов (37%) находится в состоянии «снижения активности». Этот эффект можно объяснить экспрессией рецепторов ERв и PR под совместным влиянием 17в эстрадиола и прогестерона (Shugbrue et al., 1997, Moffatt et al.,1998, Isgor et al., 2002, Guerra-Araiza et al., 2003). Известно, что экспрессия ERв индуцируется совместно повышенными уровнями эстрадиола и прогестерона и оказывает тормозный эффект на транскрипционные процессы в клетке (Matthews et al., 2006). Полученные нами данные о повышенном уровне экспрессии ERв в структурах палеоамигдалы на стадии метэструс (доля иммунореактивных нейронов в Med на стадии метэструс была равна 65,03+3,03, на стадии проэструс 39,21 +3,56, p<0,001; в Mep 50,29+3,06 по сравнению со стадией проэструс 33,27+3,58, p<0,01); в медиальной части Cop на стадии метэструс 46,46+0,62, проэструс 31,16+1,39, p<0,001) хорошо согласуются с приведенными сведениями литературы.

Также показано, что торможение активации транскрипции ERб осуществляется ERв через формирование гетеродимеров обоих рецепторов (Petersson et al., 1997, Saji et al., 2005). В снижении функциональной активности нейронов на стадии метэструса, вероятно, играет роль и изменение состояния митохондрий, т.к. известно, что они являются местом локализации ERв (Solakidi et al., 2005).

Можно предполагать, что высокие уровни ПС могут изменять состояния ядерного матрикса, зная что биосинтез РНК происходит в непосредственной связи с ним (Ciejek et al., 1973, Jackson et al., 1985), а также способствовать амплификации рДНК, позволяющей объяснить быстрое нарастание числа рибосом в цитоплазме (Бельков, 1982). Все это обеспечивает интенсивный синтез белка в клетке, идущего на создание пула цитозольных рецепторов; веществ, обладающих свойствами секретов - нейропептидов.

Общепризнанно, что синтезируемая в ядре гяРНК выявляется в виде перихроматиновых фибрилл (Ченцов, 2004). До недавнего времени считалось, что главной функцией интерхроматиновых гранул (ИХГ) является обеспечение работы факторов сплайсинга (Fu, Maniatis,1990, Spector 1991, Misteli, 2000). Но новые данные показывают, что ИХГ не являются пассивными элементами, а принимают активное участие в регуляции взаимодействия транскрипционных и сплайсинговых агентов(Johnson et al., 2000). С их участием при гормональных воздействиях может усиливаться сигнал на экспрессию генов, инициируя транскрипцию, элонгацию и процессинг РНК (Nunez et al., 2008).

Все формы ядерных транскриптов обнаружены нами в ядрах нейронов палеоамигдалы. Их качественные и количественные характеристики стали основанием для суждения о функциональной активности нейронов. Особое внимание мы уделили изучению ядрышка, т.к. известно, что оно раньше других компонентов ядра реагирует на активизирующее влияние ПС созданием рибосомной РНК (Мейнуоринг, 1979), а также согласно последним данным может являться местом локализации ERб (Solakidi et al., 2005).

Следует отметить также, что выявившиеся в ядрышке явления сегрегации его компонентов, отражающие блокаду синтеза РНК (Ченцов, 2004), способствовали распознанию нейронов, возвращающихся к своему исходному состоянию после снижения функциональной активности. В нейронах, «возвращающихся к исходному состоянию» определялись и тельца Кахала, основную роль которых связывают с участием в биогенезе малых ядерных РНК (Matera, 1999). Их обнаружение в нейронах снижающих свою функциональную активность можно объяснить изменением его модульной организации, сопровождающейся дезинтеграцией комплексов телец Кахала с кластерами ИХГ. То, что такая дезинтеграция возможна, показывают результаты экспериментальной блокады транскрипции в ооцитах Achera, проявляющиеся перераспределением факторов сплайсинга в их составе (Боголюбов, 2008).

Следует отметить и осмиофилию кариоплазмы темных нейронов в «состоянии напряжения». Вероятно, она связана с накоплением в ядре большого количества белков, поступающих в него из цитоплазмы, которые играют роль регуляторов процессов транскрипции. В настоящее время выявлено много таких групп белковых молекул - коактиваторы, корепроссоры, коинтеграторы и т.д. (Смирнов, 2005, Кулинский, Колесниченко, 2005).

Исследование структуры темных нейронов выявило гипертрофию и гиперплазию многих органоидов, но особенно она была выражена в митохондриях. Этот факт можно объяснить наличием в цитомембранах рецепторов стероидных гормонов. С их участием в митохондриях обеспечивается увеличение синтеза ферментов дыхательной цепи за счет усиления экспрессии митохондриальных генов, а также митохондриогенез. ПС способны оказывать влияние и на мембраны клетки, вызывая их пролиферацию, а также влиять на процессы трансляции через ключевые активаторы - две протеинкиназы и фактор инициации трансляции 4Е (Кулинский, Колесниченко, 2005).

На стадии метэструс, для которой характерны низкие уровни эстрадиола, преобладают нейроны в состоянии «снижения активности». Показателем снижения активности нейронов было увеличение содержания в ядре конденсированного хроматина. Процесс конденсации хроматина, по-видимому, инициировался увеличением уровня прогестерона и повышением экспресcии ERв, которое было установлено нами при использовании иммуноцитохимической реакции. Эти данные согласуются с имеющимися в литературе (Смирнов, 2005, Isgor et al., 2002).

Полученные результаты указывают на наличие функциональной гормон-зависимой реверсии в структурно-функциональной организации нейронов палеоамигдалы, происходящей под влиянием половых стероидов. Впервые термин «функциональная реверсия» для характеристики пластических перестроек нейросекреторных клеток, введен Гарловым (2002). Мы посчитали его адекватным и для обозначения всей совокупности структурно-функциональных перестроек, происходящих в популяции нейронов палеоамигдалы, предопределяемых изменяющимися уровнями половых стероидов.

Известно, что модулирующее влияние ПС на нейроны осуществляется при участии моноаминов. Это предопределено механизмом ПДМ, реализация которого происходит при тесном партнерстве ПС и моноаминов (Резников и соавторы, 2004). Нами проведено исследование вовлечения катехоламинов и серотонина (С) в регуляцию ЭЦ путем определения их содержания в палеоамигдале методом ВЭЖХ. Поскольку содержание биогенных аминов в мозге имеет ограниченную информативную ценность, т.к. представляет интегральную величину их синтеза, освобождения и деградации, было решено выявить содержание основных метаболитов дофамина - 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и серотонина - 5-гидрооксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) с последующим расчетом катаболических коэффициентов (ДОФУК/ДФ) и 5-ГИУК/С.

Полученные результаты показали, что при отсутствии половых особенностей в содержании норадреналина, дофамина и серотонина, существуют значимые различия в метаболизме дофамина и серотонина, интенсивность которого больше у самцов крыс. Отражением различий были значимо большие значения катаболических коэффициентов ДОФУК/ДФ (0,44+0,11 у самцов, 0,24+0,04 у самок, p<0,05) и 5-ГИУК/С (1,52+0,18 у самцов, 0,92+0,03 у самок, p<0,01). Выявленные особенности позволяют предполагать, что в их основе могут лежать различия в активности основных ферментных систем - моноаминоксидазы и катехол-О-метилтрансферазы, которые формируются под влиянием ПС в периоде ПДМ (Casiri, Ladosky, 1973, Ladosky, Schneiber,1981, Резников, 1982, Reznikov, Nosenco, 1983).

Сравнительный анализ содержания норадреналина, дофамина и серотонина и их метаболитов на стадиях проэструса и метэструса показал наличие повышения содержания норадреналина на стадии проэструса(p<0,01) при отсутствии значимых различий со стороны других показателей. Повышение содержания норадреналина, наряду с активизирующим влиянием ПС на транскрипционные процессы в клетке, могло так же выступать в качестве фактора, вызывающего дестабилизацию хроматина, т.к. известно, что катехоламины способны проникать в нервные клетки и непосредственно взаимодействовать с хроматином (Божко, 1985).

Механизм локального повышения содержания НА в палеоамигдале на стадии проэструса можно было бы объяснить действием эстрогена через свои рецепторы на норадренэргических терминалях, однако, до сих пор отсутствуют прямые доказательства наличия на них эстрагенсвязывающих мест (Резников и соавт., 2004). Можно предполагать, что в палеоамигдале может иметь место тот же механизм, который показан в отношении медиального субъядра центрального ядра и базолатерального ядра МК (Asan, 1998, Hatfield et al.,1999, Aroniadou-Anderjaska et al., 2007), а именно: ПС могут влиять на выделение НА из терминалей через стероид-связывающий сайт ГАМК_А-рецепторов. Также известно, что нейроны НАэргических центров ствола мозга, дающие проекции в МК, имеют эстрогенные (ERб и ERв) и прогестиновые (PRA и PRB) рецепторы (Ostlund et al., 2003, Rincavage et al., 2003, Wang et al., 2006, Milner et al., 2008). Это указывает на то, что уровни ПС способны оказывать влияние на НА-продуцирующие нейроны в местах их локализации, влияния на синтез, транспортировку медиатора, а также регулируя выделение и скорость метаболизма в целевых регионах мозга.

Полученные нами данные о повышении содержания НА в палеоамигдале на стадии проэструс согласуются с ранее полученными данными Crowley et al. (1978), которые определяли содержание катехоламинов в медиальном ядре МК, не дифференцируя его на субъядра. Также следует отметить, что НА является одним из важных участников нейрохимической системы преоптической области регулирующей выделение ЛГ (Hiemke et al., 1985, Dobson et al., 2003). В преоптической области изменение содержания НА регулируется через тормозные ГАМК-ергические синапсы на НА-ергических аксонах (Mansky et al., 1982).

Палеоамигдала является интегративным обонятельным центром мозга: Med связано с добавочной обонятельной луковицей (Scalia, Winans, 1975, Hosokawa, Chiba, 2005), медиальная часть Cop имеет прямые связи с добавочной обонятельной луковицей, латеральная - с основной обонятельной луковицей (Olmos, 1972, 1978, Broadwell, 1975, Scalia, Winans, 1975, Olmos et al., 1982, Reyher, Kaulen, 1984). На территории палеоамигдалы происходит интеграция обонятельной информации, поступающей из обеих обонятельных луковиц, которая затем передается в другие структуры МК и мозга.

Показано, что специфические обонятельные стимулы (феромоны самца крысы или самки на стадии эструса) у половозрелых крыс вызывают экспрессию ранних генов (c-Fos) в вомероназальной системе мозга, включающей и Med, что сопровождается выделением лютеинизирующего гормона (Beltramino et Talesnik, 1983, Hosokawa, Chiba, 2005). Роль структур палеоамигдалы в реализации обонятельных стимулов на репродуктивные центры гипоталамуса при этом представляется чрезвычайно важной, ибо они являются единственными обонятельными центрами мозга (кроме обонятельных луковиц), с помощью которых специфическая химическая сигнализация доставляется в гипоталамус.

Какими перестройками в метаболизме катехоламинов в обонятельных луковицах и в палеоамигдале сопровождается проведение феромонального сигнала в мозг, мы решили выяснить с помощью эксперимента с сенсорной стимуляцией по методике Амстиславской (2006). После 20-ти минут экспозиции самца рядом с клеткой, в которой находилась рецептивная самка, результаты ВЭЖХ супернатантов, полученных из ткани палеоамигдалы самца, показали, что в обонятельных луковицах увеличивается содержание НА (p<0,01) и ДФ (p<0,01). В палеоамигдале повышение содержания норадреналина (p<0,05) сопровождается снижением содержания дофамина (p<0,01). Коэфициент катаболизма дофамина при этом не изменялся. Эти данные свидетельствуют о том, что при половом возбуждении самца палеоамигдала вовлекается в систему структур, опосредующих влияние запаховых раздражителей с помощью катехоламинов. Метаболизм биогенных аминов изменяется уже через 10 минут после пребывания самца рядом с рецептивной самкой (поведенческая стадия) полового возбуждения, в то время как повышение уровня тестостерона имеет место через 20 минут после сенсорного контакта (Амстиславская, 2006).

Снижение содержания ДФ в палеоамигдале при половом возбуждении объяснить на сегодняшний день трудно из-за отсутствия соответствующих сведений по взаимовлиянию в ней всего спектра нейромедиаторов. Можно предполагать наличие двух механизмов. Первый из них основывается на данных, свидетельствующих о наличии адренорецепторов на терминалях ДФэргических волокон, через которые повышение содержания НА может изменять выделение ДФ (Darracg et al., 1998, Marien et al., 2004). Второе предположение опирается на данные, свидетельствующие о конкурентных отношениях между ДФ и глутаматом, который обнаружен в Med (Dominguez et al., 2001, Sesack et al., 2003). Предполагается, что ввод глутамата из Med в гипоталамус определяет усиление выделения ДФ в медиальной преоптической области, где ДФ выступает в качестве возбуждающего нейромедиатора при организации мужского полового поведения (Dominguez et al., 2001). Уместно при этом заметить, что в деятельности циклического центра регуляции секреции гонадотропинов ведущую роль играет НА (Dobson et al., 2003). Возможно, роль различных катехоламинов (НА или ДФ) имеет значение в активизации различных репродуктивных центров - циклического у самок или полового у самцов. Оба этих центра локализуются в преоптической области гипоталамуса.

Палеоамигдала - интегративный центр мозга, формирование которого произошло на ранних этапах исторического развития позвоночных организмов, в выживании которых ведущее значение имели, кроме полового, пищевое и агрессивно-оборонительное поведение. Имеющиеся в литературе сведения показывают, что задний отдел МК причастен к регуляции пищевого поведения, а также состояния широкого круга гомеостатических систем (Ахмадеев и соавторы, 1998, Калимуллина и соавторы, 2002, King et al, 1994, 1996, 1998, 1999, Coscina et al, 2000). Это указывает на то, что палеоамигдала должна играть важную роль в системе подкрепления (вознаграждения), которая имеет ведущее значение в патогенезе наркомании.

Важность исследований МК, и, прежде всего, его древней части палеоамигдалы в аспекте проблем наркомании продиктована и перспективными возможностями использования этих знаний для разработки качественно новых стратегий в лечении наркозависимости.

Проведенное исследование экспрессии CART(cocaine-amphetamine-regulated transcript)-пептида в МК позволило выявить его в нейронах всех структур палеоамигдалы, как у самцов, так и самок крыс. Известно, что этот пептид играет роль в развитии анксиогенных реакций при употреблении наркотиков (Dandekar et al., 2007), участвует в формировании наркотической зависимости (Salinas et al., 2006). Он принимает участие в регуляции пищевого поведения и полового поведения (Dominguez et al., 2002, Dayas et al., 2008), вовлечен в нейроэндокринные взаимосвязи (Hunter et al., 2005, Xu et al., 2006, Roubos et al., 2008, Sen et al., 2008).

Формирование палеоамигдалы в онтогенезе происходит под морфогенетическим действием половых стероидов, а ее деятельность во взрослом организме осуществляется под их активизирующим влиянием. Поэтому естественно было предположить наличие модулирующего влияния ПС на экспрессию CART- пептида в палеоамигдале. Полученные результаты показали, что в дорсомедиальном и заднем кортикальном ядрах изменение уровней половых стероидов значимо влияет на число иммунореактивных нейронов, а также уровни экспрессии CART-пептида. Данные о влиянии ПС на экспрессию CART-пептида в палеоамигдале получены впервые.

Известно, что палеоамигдала имеет прямые связи с рецепторными и проводниковыми центрами обонятельного анализатора, что может быть использовано для интраназального - неинвазивного и быстрого введения лекарственных веществ. Показано, что аппликация WGA, конъюгированного с пероксидазой хрена (WGA-HR), на обонятельный эпителий приводит к аксональному транспорту этого комплекса в ядерные и экранные структуры МК (Itaya, 1987). Интраназальный путь может быть использован для введения в мозг отдельных генов при помощи вирусных векторов-носителей (Draghia et al., 1995, Williams et al., 2005). Данный подход позволяет осуществлять эффективную генную терапию, приводя к синтезу в отдельных областях мозга белков, недостаток которых вызвал патологию.

Согласно имеющимся в литературе данным, наибольшее значение в механизмах развития наркозависимости имеет дофаминовый рецептор второго типа (DRD2, Barrett et al., 2004, Koeltzow, Vezina, 2005, Edwards et al., 2007). Исследованиями по медицинской генетике выявлена ассоциация полиморфизма различных локусов генов, определяющих дофаминэргическую трансмиссию, с предрасположенностью к наркомании. Одним из интенсивно изучаемых локусов DRD2 является локус TAG 1A. Показано, что аллельная структура этого локуса играет роль в развитии алкоголизма, кокаиновой, героиновой зависимости (Blum et al., 1996, Noble, 1998, 2000, Elovainio et al., 2007, Perez et al., 2007, Munafo et al., 2007) и асоциального поведения, часто приводящего к суициду (Гайсина и др., 2004). Однако, существуют противоречия в том, какой из аллелей А1 или А2 в этом локусе является ведущим в развитии наркозависимости. Для их устранения мы провели экспериментальное исследование механизмов формирования алкогольной зависимости на крысах с модификацией аллельной структуры локуса TAG 1A DRD2.

Изучение поведения до начала принудительной алкоголизации двух групп крыс (с генотипами по указанному локусу DRD₂ А₁/А₁ и А₂/А₂) в тесте «открытое поле», позволяющем объективно оценить с помощью ряда параметров ориентировочно-исследовательскую активность животных в условиях новизны обстановки, обнаружило характерные для каждой группы особенности поведенческих реакций. Крысы с генотипом А₁/А₁ обладали значимо большей локомоторной активностью (p<0,05), в то время как крысы с генотипом А₂/А₂ в два раза дольше пребывали в состоянии неподвижности, у них был значимо больше латентный период до первой амбуляции (p<0,05). Эти данные согласуются с имеющимися в литературе сведениями о наличии особенностей поведения, реакций на стрессорные ситуации, в личностных характеристиках людей с генотипами А₁/А₁ и А₂/А₂ в локусе TAG 1A DRD₂ (Noble, 1998, 2000, Koeltzow, Vezina, 2005).