Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты

Актуальность проблемы. Значительная часть современных представлений о злокачественных новообразованиях основывается на предположении о том, что они развиваются в результате выхода клеток из-под контроля механизмов регуляции роста, деления и дифференцировки вследствие накопления соматических мутаций (Hanahan D., Weinberg R.A., 2000; Stratton M.R. et al., 2009). Наличие соматических мутаций, в число которых входят как структурные повреждения (нуклеотидные замены, небольшие инсерции и делеции, хромосомные перестройки, численные аномалии), так и эпигенетические нарушения, - неотъемлемое свойство геномов всех клеток злокачественных новообразований (Pleasance E.D. et al., 2010).

Новейшие технологии полногеномного анализа ДНК позволяют определять практически все классы структурных соматических изменений на всем протяжении генома (Mardis E.R. et al., 2009; Beroukhim R. et al., 2010). Полногеномный анализ структурных изменений, основанный на методах секвенирования нового поколения, обеспечивает получение результатов с точностью до одного нуклеотида. Фактически дальнейшее развитие этой области исследования соматических мутаций в ближайшее время будет сводиться к совершенствованию существующих технологий (Ding L. et al., 2010; Lee W. et al., 2010).

К полногеномному анализу метилирования ДНК методы секвенирования нового поколения на сегодняшний день применимы в очень незначительной степени, что объясняется в первую очередь сниженной информативностью последовательностей бисульфит-модифицированной ДНК, используемой в качестве матрицы для секвенирования (Stratton M.R. et al., 2009). Неметилированные участки ДНК после бисульфитной конверсии представляют собой последовательности из трех нуклеотидов, что значительно осложняет выравнивание фрагментов при формировании контигов; кроме того, прямые и обратные прочтения конвертированной ДНК не являются обратно комплементарными (Tost J., Gut I.G., 2007; Xi Y., Li W., 2009; Huss M. 2010). Таким образом, достоверная информация о характере метилирования ДНК с однонуклеотидным разрешением на сегодняшний день может быть получена только с использованием традиционных методов локус-специфического анализа, осуществление которого требует формирования принципов отбора кандидатных геномных локусов.

При разработке стратегия отбора кандидатных локусов для детальной характеристики метилирования следует принять во внимание все существующие возможности скрининга характеристик эпигеномов. Подходы к таким исследованиям не универсальны. Одни из них обеспечивают анализ с полногеномным покрытием, но низким разрешением; другие, при высоком разрешении, позволяют анализировать ограниченные выборки участков генома.

К первой группе относятся методы, основанные либо на аффинном обогащении фрагментированной ДНК фракциями с определенными эпигенетическими характеристиками, либо на обработке препаратов ДНК различными типами нуклеаз. Таким образом можно проанализировать не только метилирование ДНК (Weber M. et al., 2005), но и химические модификации хроматина - гистоновые метки H3K4Me1, H3K27Ac, H3K4Me3 (Heintzman N. D. et al., 2009), области доступного хроматина (Crawford G.E. et al., 2006; Boyle A.P. et al., 2008), плотность нуклеосомной упаковки (Dennis J.H. et al., 2007). Надежно определяя эпигенетические изменения на полногеномном уровне, указанные методы страдают низкой прецизионностью: исследуемые параметры характеризуются с разрешением около 100-200 нуклеотидных пар (Huebert D.J. et al., 2006; Crawford G.E. et al., 2006; Johnson D.S. et al., 2008; Serre D. et al., 2009).

Вторая группа подходов подразумевает скрининг дифференциального метилирования ограниченных выборок геномных локусов. В этой группе наиболее известны методы метилчувствительного рестрикционно-ориентированного геномного сканирования (Rush L.J. et al., 2001; Costello J.F. et al., 2009), метилчувствительного репрезентативно-дифференциального анализа (Ushijima T. et al., 1997), метилчувствительного фингерпринтинга (Gonzalgo M.L. et al., 1997), амплификации интерметилированных сайтов (Frigola J. et al., 2002). Огромным преимуществом перечисленных методов является непредвзятость скрининга, под которой понимается определение дифференциального метилирования заранее неизвестных локусов генома с последующей идентификацией их нуклеотидных последовательностей (Fraga M.F., Esteller M., 2002). Непредвзятый скрининг расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров. Непредвзятость скрининга - краеугольный камень объективной оценки состояния изучаемых метиломов (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard et al., 2006). В то же время оптимального метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодняшний день не существует (Bock, C., 2009). Указанные методы, разработанные более 10 лет назад, так и не нашли широкого применения. Требуется формирование принципиально новой концепции, учитывающей современный уровень генетических знаний и использующей преимущества завершения проекта по секвенированию генома человека.

Сопоставление результатов исследования полногеномного и локального метилирования ДНК и ряда характеристик хроматина в пределах хромосомных участков должно привести к формированию синтетического подхода к изучению метиломов злокачественных новообразований, который будет полезен как с точки зрения изучения фундаментальных основ эпигенетической регуляции при канцерогенезе, так и с точки зрения разработки молекулярно-генетических клинических диагностических маркеров. Применительно к фундаментальным и прикладным аспектам онкогеномики требуется разработка методологии анализа эпигеномов злокачественных новообразований на основе синтеза современных методов молекулярной генетики, медицинской биотехнологии, математического моделирования и биоинформатики.

Цель работы. Разработать оригинальную методологию скрининга дифференциального метилирования геномов и применить её к изучению фундаментальных характеристик метиломов злокачественных новообразований.

Задачи исследования.

1. Разработать оригинальную методологию непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов на основе синтеза современных методов молекулярной генетики, математического моделирования и биоинформатики.

2. Охарактеризовать состав репрезентаций генома, генерируемых разработанными методами скрининга районов дифференциального метилирования геномов.

3. Идентифицировать новые гены и локусы, вовлеченные в канцерогенез и подверженные аномальной эпигенетической регуляции при раке.

4. Провести анализ молекулярной патологии наиболее перспективного гена-кандидата на роль супрессора опухолевого роста из набора новых генов, выявленных в процессе исследования.

5. Идентифицировать константно метилированные участки генома человека, которые могут служить основой для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

6. Охарактеризовать локальные параметры хроматина, определяющие состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе.

7. Сформировать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе локальных характеристик генома в норме и при злокачественной трансформации.

8. Используя разработанный способ предсказания статуса метилирования участков генов, вовлеченных в канцерогенез, провести исследования эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов субъединиц ламининов).

Научная новизна.

Разработана оригинальная методология непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов AFLOAT (анализ, ориентированный на длину амплифицируемых фрагментов). Предложены принципиальные модификации методов поиска дифференциального метилирования - метилчувствительного фингерпринтинга и амплификации интерметилированных сайтов (АИМС). Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС. Выявлено 26 новых локусов, дифференциально метилированных в опухолях, условно нормальных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Из них 22 принадлежат генам LAMB1, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF1, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, AX746725/AK127124, TMEM176A/TMEM176B, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Четыре дифференциально метилированных района расположены в межгенных областях на хромосомах 1p33, 5p15.33, 12q13.13 и 13q32.1. Проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые. Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов рака молочной железы (РМЖ). Впервые выявлена герминальная мутация SEMA6B у пациентки с РМЖ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что SEMA6B - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области 19р13.3.

Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров впервые выявил константно метилированные участки генома человека, принадлежащие CpG-островку гена CUX1 в составе альтернативного 3'-концевого экзона, первым экзонам генов LAMA3A, LAMB3, LAMC3, интронным областям генов MAD1L1, TAF4 и 3'-CpG-островку гена ZBTB4.

Впервые проведено исследование эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов цепей ламининов). Шесть из них демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1 - 36%, LAMA2 - 38%, LAMA3B - 6%, LAMA4 - 2%, LAMB1 - 16%, LAMC3 - 8%. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время как образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей двух генов субъединиц ламининов - LAMA3A и LAMB3.

Впервые проведенный прицельный анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных характеристик хроматина показал совместное расположение константно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, константно неметилированных участков - с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков - с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки.

Теоретическая и практическая значимость.

Разработанные системы скрининга дифференциального метилирования геномов высоко воспроизводимы, подробно охарактеризованы и могут быть использованы в дальнейшем в работах по характеристике эпигенетических нарушений, ассоциированных с социально значимыми заболеваниями. Решена основная проблема непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов - определение геномной принадлежности дифференциально метилированных локусов. Благодаря созданию новой технологии анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов, AFLOAT, из процедуры определения геномной принадлежности локусов полностью исключается многоэтапный блок лабораторного анализа - выделение фрагментов ДНК из гелей, их реамплификация, клонирование, экстракция плазмидной ДНК и секвенирование. Предложенные методы скрининга обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, снижение токсичности, себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента. По результатам характеристики состава репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС, предложены схемы экспериментов, обеспечивающие высокое содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков, что обеспечивает базу для эффективного выявления новых генов и локусов, вовлеченных в канцерогенез и подверженных аномальной эпигенетической регуляции при раке. Выявленные константно метилированные участки генома человека обеспечивают проведение обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР. Результаты проведенного анализа геномных локусов и сформулированный синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов с учетом локальных характеристик хроматина представляют собой базу для разработки диагностических систем эпигенетических маркеров. Разработанные алгоритмы, методы и компьютерные программы оформлены в виде рекламно-технических описаний и описания новой медицинской ДНК-технологии, прошедших государственную регистрацию. Зарегистрирована заявка на патент «Способ формирования панелей маркеров метилирования ДНК».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработаны алгоритмы, протоколы и компьютерные программы для проведения метилчувствительного фингерпринтинга и анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов (AFLOAT), обеспечивающие повышение воспроизводимости результатов, снижение себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

2. Разработаны оригинальные подходы к картированию дифференциально метилированных локусов, решающие основную проблему непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов - определение геномной принадлежности выявляемых фрагментов ДНК.

3. Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и AFLOAT. Предложены схемы экспериментов, обеспечивающие высокое содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков.

4. Оригинальные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции, что подтверждает непредвзятый характер скрининга.

5. Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, свидетельствуют о том, что это один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

6. Выявлены константно метилированные участки генома человека, предоставляющие базу для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

7. Предложена гипотеза, связывающая локальные характеристики хроматина и состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе. На её основе разработан синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

8. Показан высокий предиктивный потенциал разработанной системы отбора для анализа метилирования кандидатных участков генов, на примере исследования эпигенетической патологии семейства генов ламининов.

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на конференции ГНТП "Геном человека" в 2000 г., ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2002, 2004, 2005, 2006 (диплом и премия), 2007, 2008 и 2009 гг., научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в 2002 г., 97-й ежегодной конференции Американского общества изучения рака (Вашингтон, 2006; премия), V и VI Международных конференциях «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва) в 2008 и 2009 гг., V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2009 и Ростов-на-Дону, 2010), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., V и VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2009 и 2011 гг., 6-м симпозиуме “Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний” (г. Москва) в 2009 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 г., Всемирном эпигенетическом конгрессе (г. Берлин) в 2009 г., 11-й и 12-й Европейских конференциях по цитогенетике и молекулярной генетике солидных опухолей (г. Бильбао, 2008 и г. Неймеген, 2010).

Разработанные алгоритмы, новые медицинские технологии и компьютерные программы были использованы при выполнении научно-исследовательских работ по гранту РФФИ № 08-04-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по гранту Earlier Breast Cancer Test Foundation “Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers” (2007-2010 гг.).

Личный вклад автора.

Автором разработаны план исследования и основы методологии анализа метилирования ДНК, изложенные в работе, предложены ключевые модификации методов и протоколов скрининга метилирования ДНК (90%). Постановка и апробация всех новых методов проведены автором лично. Осуществлен дизайн 100 из 112 олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР (90%). Выделение образцов ДНК и практическое исследование метилотипов различных типов злокачественных новообразований проведено совместно с коллегами из лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, полученных в результате скрининга дифференциального метилирования, с использованием компьютерных программ и доступных баз данных метилирования ДНК, сформированы детальные карты метилирования соответствующих геномных локусов (100%). Охарактеризованы локальные параметры хроматина, определяющие состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе (100%). Сформирован синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе локальных характеристик генома в норме и при злокачественной трансформации (100%).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 66 печатных работ, в том числе 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, 8 глав в учебниках, 3 статьи в сборниках и коллективных монографиях, 28 тезисов, зарегистрированы 2 новые медицинские ДНК-технологии, 3 рекламно-технических описания компьютерных программ, 1 заявка на получение патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 238 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 216 ссылок. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 98 рисунками.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал для исследования.

Образцы тканей опухолей молочной железы и прилежащих морфологически нормальных тканей получены от 270 больных РМЖ, 100 больных раком почки (РП), 55 больных раком мочевого пузыря (РМП) и 54 больных немелкоклеточным раком легких (НМРЛ), прооперированных в ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, Урологической клинике им. Р.М. Фронштейна ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России, ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России, ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России. Гистологическую идентификацию тканей проводили в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, отделе патоморфологии ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России и в патологоанатомическом отделении ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, где были получены серийные срезы замороженных образцов опухолевых и прилежащих нормальных тканей. Образцы периферической крови и буккального эпителия 90 больных В-клеточным острым лимфобластным лейкозом (В-ОЛЛ) получены в ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии" Росздрава и ФГБУ "Гематологический научный центр" Минздравсоцразвития России. Диагноз В-ОЛЛ был поставлен и подтвержден с использованием стандартного набора методов: общего анализа крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, микроскопического и цитохимического исследования мазков костного мозга, иммунофенотипирования бластных клеток, цитогенетического обследования. Клеточные линии РМЖ ZR-75-1, HBL-100, HS 578 T, BT-474, T-47D и MCF7 предоставлены Федеральным государственным бюджетным учреждением науки Институтом биологии гена РАН. Образцы крови нормальных доноров предоставлены донорским пунктом ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (150 образцов). Образцы буккального эпителия (7 образцов) любезно предоставлены сотрудниками лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН.

Экстракция и анализ геномной ДНК.

Материалом для молекулярных исследований послужила геномная ДНК, выделенная из цельной крови и образцов солидных тканей стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (Johns M.B.Jr., Paulus-Thomas J.E., 1989). Обработку ДНК бисульфитом натрия и последующую метилспецифическую ПЦР проводили в соответствии с самостоятельно разработанной и зарегистрированной ДНК-технологией (Стрельников В.В. с соавт., Разрешение ФС № 2011/134 от 27.05.2011 г.). Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование фрагментов ДНК проводили по протоколам фирмы-производителя ферментов («Сибэнзим», Россия). Метилчувствительную ПЦР проводили по схеме, разработанной автором (Strelnikov V.V.et al., 1999). Для анализа метилирования импринтированных генов применяли собственную ДНК-технологию (Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Разрешение ФС № 2011/131 от 27.05.2011 г.). Секвенирование и фрагментный анализ ДНК осуществляли по протоколам фирмы-производителя оборудования и реактивов («Applied Biosystems», США). Протоколы скрининга дифференциального метилирования ДНК разработаны самостоятельно в соавторстве с сотрудниками лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН (Кузнецова с соавт., 2004; Стрельников с соавт., 2009).

Программное обеспечение планирования и анализа результатов экспериментов.

Дизайн олигонуклеотидных праймеров для ПЦР проводили с использованием публично доступных программ OLIGO (Rychlik, Rhoads, 1989), Methprimer (Li, Dahiya, 2002), Methyl Primer Express («Applied Biosystems», США). Визуализацию и анализ электрофореграмм капиллярного электрофореза обеспечивали самостоятельно разработанными и зарегистрированными компьютерными программами PeakPick и AIMS in silico (Танас А.С., Руденко В.В., Стрельников В.В.; регистрационные номера ВНТИЦ 50201050040 от 2010 г., и 50201151514 от 2011 г.). Планирование экспериментов и характеристику репрезентаций метиломов проводили с использованием программы AIMS in silico.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного исследования разработана оригинальная методология скрининга дифференциального метилирования ДНК, проведена успешная апробация новых методов на материале клеточных линий рака молочной железы (РМЖ), после чего проанализированы репрезентации метиломов РМЖ, рака почки (РП), рака мочевого пузыря (РМП), немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (В-ОЛЛ), нормальных лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия и выявлены характерные метилотипы, а также новые гены и локусы, дифференциально и постоянно метилированные в исследованных материалах. Проведен анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных свойств хроматина и предложена гипотеза, связывающая эти характеристики.

На основе полученных результатов был сформирован синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе локальных характеристик генома в норме и при злокачественной трансформации. На завершающем этапе исследования была проведена апробация разработанного синтетического подхода на модели семейства генов, вовлеченных в канцерогенез (генов субъединиц ламининов), продемонстрировавшая высокий предиктивный потенциал метода.

В области изучения дифференциального метилирования геномов нами разработана методология как предвзятого, так и непредвзятого скрининга. Предвзятые подходы подразумевают отбор локусов для исследования на основании той или иной гипотезы, предсказывающей наиболее вероятное выявление дифференциального метилирования именно этих локусов. Непредвзятый скрининг, напротив, предполагает определение дифференциального метилирования заранее неизвестных локусов генома с последующей идентификацией их нуклеотидных последовательностей. Непредвзятый скрининг эффективно выявляет дифференциальное метилирование геномных участков, которые, в силу недостаточной изученности эпигеномов, не подпадают под известные гипотезы и не включаются в анализ методами первой группы (Fraga M.F., Esteller M., 2002).

3.1. Непредвзятый скрининг дифференциального метилирования геномов

Непредвзятый скрининг не только расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, но и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров. Непредвзятость скрининга - краеугольный камень объективной оценки состояния изучаемых метиломов (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard C. et al., 2006). В то же время оптимального метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодняшний день не существует (Bock C., 2009). Была поставлена задача разработки такого метода и приняты за основу технологии метилчувствительного фингерпринтинга (МЧФП) и амплификации интерметилированных сайтов (АИМС).

Оптимизация метода МЧФП

Метод МЧФП разработан независимо от других авторов (наиболее ранний из опубликованных аналогов - MS-AP-PCR, methylation-sensitive arbitrarily primed PCR, Gonzalgo M.L. et al., 1997). Предложенный вариант отличается от «классического» и, поскольку он опубликован позднее (Дрозд О.В., Стрельников В.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В., 2002), получил название «оптимизированного метода МЧФП».

МЧФП представляет собой один из наиболее наглядных способов визуализации дифференциально метилированных CpG-островков в составе различных геномов. Принципиальная схема метода представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема метода МЧФП. Синим цветом обозначены C,G-богатые участки геномной ДНК, оранжевым - праймеры. Внизу справа - пример визуализации продуктов МЧФП в геле путем окраски нитратом серебра. 1, 2, 3 - образцы РМЖ, М - маркер молекулярной массы; стрелкой указан фрагмент, дифференциально метилированный в представленных образцах.

Для проведения анализа образцы ДНК подвергаются поэтапному гидролизу. На первом этапе ДНК гидролизуется частощепящей рестриктазой RsaI, сайт узнавания которой не содержит нуклеотидов C и G, с целью уменьшения размера фрагментов для дальнейшей амплификации и обогащения образцов фракцией CpG-островков. Аликвоты полученных рестриктов подвергаются параллельному гидролизу чувствительным и нечувствительным к метилированию изошизомерами HpaII и MspI, имеющими сайт узнавания CCGG.

Полимеразная цепная реакция с вырожденными C,G-богатыми праймерами проводится для каждой из групп рестриктов RsaI, RsaI+MspI, RsaI+HpaII при мягких условиях (низкая температура отжига). В результате амплификации рестриктов RsaI формируется пул CG-богатых фрагментов. Амплификация проб, подвергнутых обработке RsaI и нечувствительным к метилированию ферментом MspI, позволяет определить наличие сайта узнавания CCGG, при существовании которого происходит разрыв матрицы между праймерами и ПЦР-продукт не обнаруживается. Наконец, амплификация рестриктов RsaI+HpaII позволяет проанализировать состояние метилирования фрагмента ДНК. Если внутренний CpG-динуклеотид в сайте узнавания неметилирован, фрагмент гидролизуется метилчувствительной рестриктазой и ПЦР-продукт отсутствует. В случае метилирования сайта матрица остается интактной и продукт амплификации детектируется в геле (Gonzalgo M.L. et al., 1997; Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., 2006).

В классическом варианте метода МЧФП применяется ПЦР с радиоактивно мечеными праймерами с последующей радиоавтографией денатурирующих гелей с низкой концентрацией акриламида. Такой подход означает неприемлемую в современных лабораторных условиях токсичность, высокие материальные и временные затраты, неоправданную трудоемкость исследования.

Секвенирование фрагментов МЧФП опосредуется трудоемкой и многоэтапной процедурой клонирования ПЦР-продуктов, изоляция которых из геля происходит в отсутствие возможности непосредственного визуального контроля процесса. Этот блок протокола МЧФП требует заменены, желательно, прямым секвенированием с праймеров, использующихся при постановке МЧФП. Необходимо также обеспечить непосредственный визуальный контроль за изоляцией интересующих фрагментов, а также сократить промежуток времени от анализа геля и выявления фрагментов до их реамплификации, что должно способствовать сохранению целостности ДНК.

В разработанном оптимизированном варианте метода процедура клонирования фрагментов ДНК, извлеченных из геля, заменена непосредственным прямым секвенированием с праймеров, использующихся при постановке МЧФП. Основная проблема при этом заключается в том, что даже при использовании в МЧФП пары разных праймеров продукт амплификации с высокой вероятностью может быть фланкирован только одним из них. Решение основано на том, что все интересующие продукты МЧФП содержат, по крайней мере, один сайт узнавания рестриктазы MspI, поскольку именно по этому признаку и производится их селекция. Гидролиз продуктов реамплификации фрагментов, элюированных из геля, этим ферментом приводит к образованию фрагментов различной длины, два из которых оканчиваются последовательностями, гомологичными праймеру. Секвенирование смеси рестриктов с этого праймера в подавляющем большинстве случаев приводит к получению информативной нуклеотидной последовательности, достаточно протяженной для однозначной идентификации искомого участка генома.

Критика основных недостатков классического варианта МЧФП в сопоставлении с предложенными усовершенствованиями на каждом из этапов представлены в табл. 1.

Таблица 1. Недостатки классического МЧФП и способы оптимизации метода.

Состав репрезентаций генома, генерируемых методом МЧФП

С использованием разработанной модификации метода МЧФП проанализировано 40 парных (норма + опухоль) образцов ДНК больных РМЖ и выявлено 43 фрагмента, содержащих, по крайней мере, один сайт узнавания рестриктазы MspI. Среди этих фрагментов 25(58%) были метилированы и 11(26%) неметилированы во всех образцах. Для 7(16%) фрагментов было показано дифференциальное метилирование, по крайней мере, в одной из пар образцов. Эффективность выявления дифференциально метилированных фрагментов ДНК с помощью разработанной модификации метода сопоставима с результатами, полученными другими авторами. Так в работе Liang, основанной на применении метода МЧФП (Gonzalgo M.L. et al., 1997), дифференциально метилированные фрагменты составили 13,5% от общего количества полученных фрагментов (Liang G. et al, 1998). Высокая эффективность нашего метода говорит об удачном дизайне последовательностей праймеров, выбранных для эксперимента, и об адекватности разрешающей способности применяемого способа разделения репрезентаций МЧФП.

Результаты прямого секвенирования выявленных дифференциально метилированных фрагментов позволили провести компьютерный анализ их последовательности, на основании которого они были идентифицированы как участки CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Аномальное метилирование указанных CpG-островков при РМЖ продемонстрировано впервые. Из перечисленных генов лишь для одного, супрессора опухолевого роста BIN1, доказано участие в канцерогенезе (Ge R. et al., 1999), в то время как целенаправленного изучения роли молекулярной патологии других генов при раке не проводилось.

Полученные результаты показывают, что оптимизированный метод МЧФП позволяет эффективно выявлять новые гены, подвергающиеся аномальному метилированию при канцерогенезе. В то же время, в самой природе МЧФП заложен ряд принципиально неустранимых недостатков. В частности, как было показано, продукты МЧФП, соответствующие дифференциально метилированным участкам генома, составляют в среднем не более 15% всех продуктов реакции, содержащих сайты узнавания рестриктазы MspI. На фоне же общей репрезентации доля дифференциально метилированных фрагментов не превышает единичных процентов. Таким образом, область разделения элементов репрезентации МЧФП занята в основном неинформативными элементами, доля которых может превышать 95%. Второй системный недостаток МЧФП - использование статистических праймеров, не допускающее ни малейшей стандартизации метода.

К началу 2000-х гг. назрела необходимость разработки подхода к скринингу дифференциального метилирования геномов, не уступающего по эффективности МЧФП и лишенного присущих ему недостатков. В 2002 году такая технология, основанная на адаптер-опосредованной амплификации интерметилированных сайтов (АИМС), была опубликована испанскими исследователями (Frigola J. et al., 2002).

Проведен критический анализ метода АИМС, результатом которого фактически стало создание не просто модифицированного метода АИМС, а принципиально новой технологии анализа длин амплифицируемых фрагментов - AFLOAT (Amplified Fragment Length Oriented Analysis Technique), которая может использоваться как для изучения дифференциального метилирования ДНК, так и в более широких геномных приложениях.

Разработка оригинального алгоритма непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов: технология AFLOAT

Биотехнологической основой разработки новой технологии стал метод АИМС (Frigola J. et al., 2002), представленный на рис. 2. На первом этапе ДНК обрабатывают метилчувствительной рестриктазой SmаI (сайт узнавания ССС/GGG), которая оставляет фрагменты с «тупыми» концами. Метилированные гексануклеотиды СССGGG, оставшиеся интактными, затем расщепляются рестриктазой ХmаI (сайт узнавания C/CCGGG), формирующей фрагменты с «липкими» концами. Последние способны взаимодействовать с адаптерами в реакции лигирования и амплифицироваться в последующей ПЦР. ПЦР всей совокупности лигированных фрагментов проводится с радиоактивно меченых праймеров, в целом гомологичных адаптеру, но удлиненных на 1-4 случайно выбранных нуклеотида, составляющих удлинитель универсального праймера. Дальнейшие манипуляции аналогичны таковым, производимым при МЧФП для визуализации и секвенирования дифференциально метилированных фрагментов. Регуляция количества продуктов ПЦР осуществляется путем подбора длины и состава удлинителя универсального праймера. Теоретически, исходя из представленности нуклеотидов в геноме человека, добавление каждого последующего снижает количество продуктов реакции примерно в 5 раз для C,G и в 3 раза для A,T. Подбор оптимального размера репрезентации обеспечивает хорошее разделение и высокую информативность бэндов на радиоавтографах и облегчает изоляцию интересующих CpG-островков (Frigola J. et al., 2002).

Рис. 2. Схема метода амплификации интерметилированных сайтов. Сплошная линия изображает участок геномной ДНК, содержащий семь сайтов CCCGGG. Неметилированные сайты обозначены синим цветом, метилированные - красным, адаптеры - зеленым. Радиоавтографы полиакриламидных гелей (ПААГ) иллюстрируют фингерпринты, полученные с использованием праймеров, удлиненных на 1-3 нуклеотида. Схема адаптирована из публикации Frigola J. с соавт. (2002), приводится по источнику: Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. в учебнике "Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических новообразований", 2009. С. 83.

Проведен критический анализ метода АИМС для каждого из технологических этапов, в принципе свойственных любому методу скрининга дифференциального метилирования геномов: подготовки геномных репрезентаций, их редукции, разделения элементов репрезентаций, визуализации элементов репрезентаций, определения их геномной принадлежности, сравнения репрезентаций.

На этапе подготовки геномных репрезентаций используются метилчувствительные рестриктазы (напр., SmaI, HpaII) и их нечувствительные к метилированию изошизомеры (XmaI, MspI, соответственно). Не исключено, что этот технологический этап можно оптимизировать на уровне планирования набора рестриктаз на основе математического моделирования результатов АИМС, которое могло бы продемонстрировать ряд количественных и качественных характеристик репрезентаций, получаемых при работе с тем или иным геномом.

Редукция геномных репрезентаций в методе АИМС осуществляется двумя способами. Во-первых, это выбор используемых рестриктаз: гидролиз геномной ДНК более частощепящими ферментами приводит к формированию более представительных репрезентаций. Во-вторых, на этапе ПЦР могут использоваться удлинители универсальных праймеров, снижающие мощность репрезентации, причем с увеличением длины удлинителя репрезентативность падает. Оба способа редукции используются в настоящее время, однако определение их оптимального соотношения остается эмпирическим (Esteller M., 2005). Оптимизация на этом этапе должна заключаться в разработке инструмента моделирования результатов АИМС при использовании различных способов редукции с целью получения репрезентаций, обеспечивающих наилучшие возможности их анализа на последующих этапах.

На этапах визуализации и определения геномной принадлежности продуктов реакции проблемы реализации АИМС идентичны таковым, описанным выше для МЧФП. Для метода, генерирующего такое значительное количество целевых фрагментов ДНК, как АИМС этап разделения должен быть реализован на платформе, обеспечивающей наиболее высокое разрешение фрагментов ДНК. Такая платформа представлена на сегодняшний день капиллярным электрофорезом (КЭФ) в формате фрагментного анализа. Предложен способ дискриминации продуктов АИМС, синтезированных с флуоресцентно меченых праймеров, с помощью КЭФ, который значительно повышает разрешающую способность метода, избавляет от необходимости использования радиоактивно меченых материалов, сокращает время получения результатов анализа образца. Данные КЭФ представлены в цифровом виде, что позволяет применить средства цифровой обработки сигналов для сравнения репрезентаций.

Высокая разрешающая способность капиллярного электрофореза в сочетании с компьютерным обеспечением анализа результатов обеспечивают высокоточное определение длин выявляемых дифференциально метилированных фрагментов генома. Такая информация может использоваться для определения геномной принадлежности интересующих фрагментов путем сравнения с виртуальными представлениями репрезентаций геномов, что исключает этапы физической изоляции их из геля, клонирования и секвенирования, снижая, тем самым, временные затраты, трудоёмкость и ресурсоёмкость исследования.

Сочетание преимуществ платформы АИМС, капиллярного электрофореза и математического анализа с современными возможностями биоинформатики позволяют сформировать блок-схему современного метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов (рис. 3). Было показано, что выбранный за основу разработки метод АИМС требует модификации каждого из ключевых этапов осуществления скрининга, причем многие модификации осуществимы только с применением методов биоинформатики и математического моделирования.

Рис. 3. Блок-схема метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов на основе технологии анализа длин амплифицируемых фрагментов - AFLOAT. Указаны ключевые необходимые модификации традиционных подходов.

Для обеспечения обоснованного дизайна экспериментов АИМС путем предварительного моделирования ожидаемых результатов разработана программа компьютерной симуляции «AIMS in silico». Алгоритм работы программы заключается в следующем. На первом этапе моделируется полный набор фрагментов ДНК, получаемых при обработке исследуемого генома основной рестриктазой АИМС (в классическом варианте это - XmaI). Фактически этот набор - полная репрезентация АИМС, представляющая собой субстрат для дальнейших исследований in silico с целью моделирования возможных результатов АИМС в реальном эксперименте при различных удлинителях универсального праймера. В дальнейшем полная репрезентация виртуально подвергается лигированию с предложенным пользователем адаптером и амплифицируется с универсальным праймером, содержащим заданный удлинитель. Таким образом, алгоритм моделирования результатов экспериментов практически воспроизводит протокол осуществления АИМС in vitro. С использованием разработанной компьютерной программы охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методом АИМС. Количественная иерархия продуктов в зависимости от длин и нуклеотидного состава удлинителей универсальных праймеров представлена в виде гистограммы на рис. 4. Гистограмма ясно демонстрирует ошибочность постулата авторов метода АИМС о том, что при прочих равных условиях добавление каждого дополнительного нуклеотида к универсальным праймерам предполагает снижение сложности результирующей картины в 5 раз для C,G и в 3 раза для A,T. Важно, что экспериментальное определение параметров, представленных на рис. 4, потребовало бы невероятных затрат труда, времени и материалов, а неопределение наверняка привело бы к ложной интерпретации опытных данных.

Рис. 4. Иерархическая диаграмма продуктов АИМС, предсказанных для следующих условий эксперимента: сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции C^CCGGG, удлинители всех типов от 0 до 3 нуклеотидов, длина анализируемых продуктов АИМС - до 1 тыс. нуклеотидов. Синим цветом обозначено общее количество первичных фрагментов (при отсутствии удлинителей) - около 100 тыс. Красным указаны количества продуктов, получаемых при использовании однонуклеотидных удлинителей, желтым - двухнуклеотидных, зеленым - трехнуклеотидных. Ось абсцисс представляет собой логарифмическую шкалу, поскольку разница в количестве фрагментов составляет от 1 до 100000. (В соавторстве с А.С.Танасом).

Для визуализации, анализа и дифференциации капиллярных электрофореграмм, полученных на автоматических генетических анализаторах и представленных в файлах *.fsa формата ABIF, разработана компьютерная программа PeakPick (рис. 5). Важнейшей функцией программы PeakPick является осуществление дифференциального анализа электрофореграмм репрезентаций различных геномов (нормального/опухолевого геномов, геномов организмов разных штаммов/сортов/видов) для определения степени генетического сходства/различия исследуемых образцов биологического материала. Эта опция делает программу незаменимой при проведении сравнительного анализа геномных фингерпринтов.

Рис. 5. Фрагмент окна сравнительного анализа электрофореграмм компьютерной программы PeakPick.

Традиционный дизайн АИМС предполагает клонирование и секвенирование интересующих фрагментов ДНК для определения их геномной принадлежности. Поскольку определение нуклеотидной последовательности генома человека практически полностью завершено и, соответственно, последовательности возможных продуктов АИМС также известны, этапы клонирования и секвенирования были заменены последовательными этапами рестриктазного картирования in silico и in vitro.

Для моделирования рестриктазного картирования был введен дополнительный модуль в программу AIMS in silico. Моделирование проводится на основе полной репрезентации АИМС, предсказанной для конкретных условий эксперимента, с использованием рестриктаз, выбираемых из заранее сформированного списка. Программа предоставляет информацию о фрагментах, подвергающихся гидролизу выбранной рестриктазой.

Разработан алгоритм интеграции рестриктазного картирования in silico и in vitro. Картирование продуктов АИМС, получаемых в эксперименте, проводится, как и в случае компьютерного моделирования, на основе полной репрезентации АИМС. Для создания полной репрезентации in vitro из лабораторного протокола АИМС исключается этап гидролиза ДНК метилчувствительной рестриктазой SmaI. Таким образом моделируется состояние полного метилирования изучаемого генома. Пример полной репрезентации АИМС с удлинителем ССG и картирования трех из представленных на ней продуктов АИМС приведен на рис. 6.

Рис. 6. Пример рестриктазного картирования репрезентации АИМС in vitro (использована рестриктаза BssHII). Ось абсцисс - длины фрагментов ДНК в нуклеотидах, ось ординат - интенсивность сигналов флуоресценции. Красный график - электрофореграмма интактной полной репрезентации АИМС-ССG. Черный график - электрофореграмма полной репрезентации АИМС-ССG после гидролиза. Указана геномная принадлежность детектированных участков.

Валидация технологии AFLOAT: анализ дифференциального метилирования ДНК клеточных линий рака молочной железы

Демонстрацию возможностей технологии AFLOAT проводили на модели сравнения участков геномов клеточных линий РМЖ: ZR-75-1, HBL-100, HS578T, BT-474, T-47D и MCF7. Для создания репрезентаций эпигеномов использовался протокол АИМС с удлинителем ССG. Сравнение электрофореграмм продуктов АИМС проводили в пределах длин от 150 до 200 п.н. При сравнении электрофореграмм выявлены дифференциально метилированные локусы в диапазонах длин 150-167, 167-176 и 176-190 п.н. (рис.7).

Рис. 7. Сравнение электрофореграмм продуктов АИМС с удлинителем CCG для клеточных линий РМЖ. (В соавторстве с А.С.Танасом).