Моделирование с помощью программы AIMS in silico предсказывает получение в эксперименте АИМС с удлинителем CCG в указанном диапазоне трех групп продуктов: 1) ccg164, ccg165, ccg168; 2) ccg176, ccg177.1, ccg177.2, и 3) ccg189. С помощью программы AIMS in silico разработан и реализован план рестриктазного картирования этих локусов. В качестве примера приведем локус ccg165, для которого in silico предсказана уникальная картирующая рестриктаза SbfI. Гидролиз полной репрезентации АИМС этим ферментом позволил определить положение на электрофореграмме сигналов продуктов, соответствующих искомому локусу. Эти сигналы наблюдаются на уровне длин 160 и 162 п.н.; кроме того, на электрофореграмме виден один из продуктов гидролиза - 115 п.н. (рис. 8).

Рис. 8. Сравнение электрофореграмм полной репрезентации продуктов АИМС (черным) и после гидролиза SbfI (красным). Зелеными стрелками обозначены пики продуктов, соответствующие продукту АИМС ccg165, синей стрелкой - продукт гидролиза.

В результате серии экспериментов однозначно определено положение на электрофореграмме пиков продуктов АИМС с удлинителем CCG, соответствующих локусам, дифференциально метилированным в исследуемых клеточных линиях, и охарактеризована геномную принадлежность этих локусов. Четыре из них представляют собой участки промоторных CpG-островков генов ATMIN, ANK3, MAFK и C2CD2, распространяющихся на первые экзоны и первые интроны генов. Два локуса являются межгенными CpG-островками, расположенными на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1. Седьмой локус не принадлежит CpG-островку и соответствует первому экзону гена PURB.

Результаты анализа метилирования, полученные методом AFLOAT, подтверждали метилспецифическим секвенированием исследуемых локусов (рис. 9).

Рис. 9. Пример валидации результатов AFLOAT методом метилспецифического секвенирования. Фрагменты электрофореграмм секвенирования локуса ccg177.2 в клеточной линии MCF7. Стрелками указаны сайты узнавания рестриктазы SmaI в полностью метилированном состоянии (после бисульфитной обработки - TTCGGG).

Сравнение результатов, полученных методами AFLOAT и метилспецифического секвенирования, показало совпадение оценок статуса метилирования в 92% (33/36) случаев. В 3 случаях из 36 метилспецифическое секвенирование не подтвердило наличия метилирования, выявленного AFLOAT. Возможно, данные метилспецифического секвенирования в некоторых случаях не подтверждают метилированного статуса по причине недостаточной чувствительности собственно метода секвенирования. Опубликованные в литературе оценки различных методов выявления мутаций в отношении их способности определять мозаичные мутации показало следующие значения чувствительности (детектируемая доля молекул ДНК с мутацей в пуле ДНК дикого типа): секвенирование по Сэнгеру - 15-50%, анализ полиморфизма конформации однонитевых фрагментов / анализ гетеродуплексов - 5-25%, денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография - 5-25% и параллельное секвенирование - 1%. Использования только секвенирования по Сэнгеру недостаточно для выявления мозаичных мутаций низкого уровня. Параллельное секвенирование при достаточном количестве прочтений (глубине покрытия) позволяет достичь наилучших результатов, однако возможности его использования на сегодняшний день ограничены сложностью, высокой стоимостью анализа и доступностью оборудования.

В настоящем исследовании в качестве дополнительного метода подтверждения результатов AFLOAT применен метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов, показавший их аномальную электрофоретическую подвижность, говорящую о наличии метилированных клонов в спорных образцах. Проведенное исследование говорит о высокой чувствительности разработанного метода анализа дифференциального метилирования геномов.

Выявление и характеристика дифференциально и константно метилированных локусов в образцах рака молочной железы

Применение технологии AFLOAT к выборке операционных образцов РМЖ и нормальных тканей позволило идентифицировать 19 новых локусов генома, аномально метилированных при РМЖ. Совокупно с результатами применения МЧФП, в работе выявлено 26 таких локусов (табл. 2). Среди них 4 являются межгенными (области хромосом 1p33, 5p15.33, 12q13.13 и 13q32.1), 5 - интронными (гены BIN1, RAI1, GPC2, PPP2R5C, PHF1), 2 расположены в первых экзонах (гены ATMIN, IQSEC2). Лишь около половины полученных фрагментов (относятся к генам LAMB1, KCNH8, DOCK6, SH3KBP1, C2CD2, KIAA1324L, AX746725/AK127124, TMEM176A/TMEM176B, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135, KCNH2, CACNG4 и PSMF1) имеют локализацию, каноническую для дифференциального метилирования при канцерогенезе. Таким образом, разработанные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции.

Сравнение электрофореграмм полных репрезентаций и продуктов АИМС для образцов ДНК нормальной молочной железы, РМЖ, РП, РМП и мононуклеаров периферической крови выявило среди продуктов АИМС с удлинителями GCG и CCG четыре константно метилированных фрагмента (рис. 10). Картирование показало, что эти фрагменты соответствуют интронному СpG-островку гена TAF4, участку интрона гена MAD1L1, CpG-островку гена CUX1 в составе альтернативного 3'-концевого экзона, и 3'-CpG-островку гена ZBTB4.

Рис. 10. Пример выявления константно метилированных локусов генома путем сравнения электрофореграмм полной репрезентации (синяя линия) и продуктов АИМС (красная линия) с удлинителем СCG для образца ДНК нормальной молочной железы. Сигналы константно метилированных локусов указаны стрелками.

метилирование геном новообразование опухолевый

Таким образом, разработана оригинальная методология непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов злокачественных новообразований, в основе которой лежат способы получения фингерпринт-подобных репрезентаций по протоколам гидролиза ДНК метилчувствительными рестриктазами с последующей амплификацией (методы МЧФП и АИМС). Использование разработанных технологий для скрининга дифференциального метилирования геномов клеточных линий РМЖ и операционных образцов РМЖ позволило выявить 26 участков генома, подверженных аномальному метилированию, значительная часть из которых характеризуется неканонической локализацией, что подтверждает высокую эффективность методов и непредвзятость проведенного скрининга.

Особенности метилирования участков генома, выявленных скринингом дифференциального метилирования, проанализированы локус-специфическими методами анализа метилирования ДНК.

3.2. Локус-специфический анализ дифференциального метилирования геномов

Методология анализа метилирования отдельных геномных локусов

Методы анализа локус-специфических паттернов метилирования в большинстве своем требуют осуществления первоначальной амплификации исследуемой последовательности. Поскольку ДНК-полимераза в ходе синтеза ДНК не различает цитозин и 5-метилцитозин, в процессе полимеразной цепной реакции и клонирования информация о метилировании утрачивается. Ряд ферментов и химических соединений, таких как, метилчувствительные рестриктазы, бисульфит (HSO₃^-), гидразин (N₂H₄), перманганат (MnO₄^-), могут быть использованы для модификации оснований, что позволяет различить цитозин и 5-метилцитозин в ходе последующего анализа.

Для детекции продуктов расщепления ДНК метилчувствительными рестриктазами использован метод метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Праймеры для проведения МЧ-ПЦР фланкируют сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции, поэтому исследуемый фрагмент амплифицируется только при отсутствии расщепления ДНК по этому сайту. Для предупреждения ложноположительных результатов, возникающих из-за неполного гидролиза матрицы, необходимо предпринимать ряд предосторожностей. Поскольку доступность ДНК для рестрикции обычно уменьшается вследствие наличия примесей, наилучшим способом обеспечения полноты гидролиза является тщательная очистка ДНК с применением протеиназы К (Singer-Sam J. et al., 1990a). Следует учитывать и вероятность получения ложноотрицательных результатов, когда продукт МЧ-ПЦР с гидролизованной матрицы отсутствует не по причине полного гидролиза неметилированной ДНК образца, а по причине его плохого качества (деградация ДНК, ингибиторы ПЦР). Очевидно, адекватную техническую диагностику ложноположительных и ложноотрицательных результатов МЧ-ПЦР можно обеспечить лишь включением в систему двух типов контролей: эффективности ПЦР и полноты гидролиза матрицы.

За всю историю практического использования МЧ-ПЦР в исследованиях и диагностике вопросы о необходимости таких контролей поднимались (и решались) лишь на этапе разработки технологии как таковой (конец 80-х годов прошлого века, на уровне однолокусных реакций) и в последние годы (после 2005 г., в связи с внедрением высокопроизводительных технологий метилчувствительного анализа). В одной из ранних работ при формировании внутреннего контроля полноты гидролиза удачно эксплуатируется неметилированное состояние ДНК М13, которая использовалась в качестве носителя при экстракции ДНК исследуемых эукариот (Singer-Sam J. et al, 1990а). Теми же авторами был предложен и элегантный дизайн контроля эффективности ПЦР, для которого in vitro искусственно создавалась делеция тестируемого локуса, элиминирующая сайт узнавания метилчувствительной рестриктазы (Singer-Sam J. et al, 1990b).

Анализ литературы показывает, что предложенные в 1990 г. технические решения впоследствии на практике не применялись. Тем не менее, общая идеология дизайна контроля полноты гидролиза на основе матрицы, всегда содержащей сайты узнавания метилчувствительной рестриктазы в неметилированном состоянии, сохранилась в более поздних разработках. Так, в дизайне количественного теста для определения аномалий метилирования при синдромах Прадера-Вилли и Ангельмана в формате MLPA (мультиплексной лигазной проба-зависимой амплификации) авторы использовали в качестве такой матрицы участок промоторного CpG-островка гена MLH1 (Procter M. et al., 2006). Другая технология определения количественного метилирования при тех же синдромах, основанная на ПЦР в реальном времени, использует в качестве контроля полноты гидролиза промоторный участок гена CFTR (von Kanel T. et al., 2010).

Следует учитывать, что указанные контроли полноты гидролиза ДНК разработаны для использования в исследованиях, связанных с геномным импринтингом. При болезнях импринтинга нарушения характера метилирования ограничены достаточно небольшими хромосомными участками (в частности, при синдромах Прадера-Вилли и Ангельмана - 15q11-q13). Это позволяет рассматривать практически весь остальной метилом как стабильную систему и как плацдарм для произвольного выбора контрольных локусов. Такая логика неприменима в исследованиях аномалий метилирования при канцерогенезе. В геномах злокачественных новообразований наблюдаются многочисленные нарушения нормального метилирования, в том числе гиперметилирование CpG-островков, что не позволяет использовать большую их часть в качестве контрольных. Так, для MLH1, который является классическим геном-супрессором опухолевого роста, показана частая инактивация в опухолях посредством метилирования промоторного CpG-островка (Залетаев Д.В. с соавт., 2009). Аномальному метилированию при канцерогенезе могут подвергаться и гены, предполагать роль инактивации которых в формировании фенотипа опухолевых клеток a priori трудно. Например, промотор гена CFTR, неметилированный во всех нормальных тканях, демонстрирует плотное метилирование в клеточных линиях РМЖ и РПЖ, HeLa, MCF7, и LNCaP. Таким образом, этот локус может служить контрольным лишь для исследований аномалий метилирования при врожденных генетических болезнях, в то время как в исследованиях метиломов опухолевых клеток состояние его метилирования может оказаться скорее маркерной, чем контрольной категорией.

В то же время принадлежность гена классу опухолевых супрессоров не означает автоматически возможности аномального метилирования его промоторной области в геномах опухолей. Одним из примеров такого рода служит ген ING1, продукт которого непосредственно взаимодействует с белком р53 и является компонентом соответствующего регуляторного пути, т.е. задействован в процессах остановки клеточного цикла и инициации апоптоза. Нарушения экспрессии ING1 характерны для самых разнообразных злокачественных опухолей, а частота потери гетерозиготности, в частности, в образцах НМРЛ превышает 50% (Luo Z.G. et al., 2011). В промоторной области гена расположен классический CpG-островок, что обусловило проведение исследования, ставящего целью выявить его маркерное аномальное метилирование при канцерогенезе. Результат получен неожиданный: исследуемый CpG-островок неметилирован не только в нормальных тканях человека (кровь, буккальный эпителий, аутопсийный материал молочной железы), но и во всех исследованных типах опухолей - РМЖ, ОЛЛ, НМРЛ, РП, РПЖ, РЖ, РМП. Статус метилирования ING1, исследованный в общей сложности на более чем 1000 образцов биологического материала, во всех случаях оказался отрицательным. Результаты настоящего исследования подтверждаются недавно опубликованными на сайте Калифорнийского университета (http://genome.ucsc.edu) результатами ограниченного бисульфитного секвенирования CpG-островка гена ING1.

Таким образом, возможность дифференциального метилирования геномных локусов в опухолях далеко не в полной мере определяется функцией гена и промоторным расположением его CpG-островка. Вопрос о дополнительных предикторах дифференциального метилирования обсуждается ниже, однако необходимо принимать во внимание, что использование локуса в качестве субстрата для формирования контролей полноты гидролиза ДНК для МЧ-ПЦР должно предваряться подробными исследованиями характера его метилирования в широком спектре нормальных и опухолевых тканей. Результаты такого рода исследования, проведенного для CpG-островка гена ING1, позволили впервые предложить обоснованные контроли полноты гидролиза для МЧ-ПЦР (рис. 11).

Рис. 11. Пример анализа метилирования промотора гена LAMC3 методом МЧ-ПЦР. М - маркер молекулярной массы ДНК. N - отрицательный контроль ПЦР. 1-5 - парные образцы тканей молочной железы (t - опухоль, n - норма). 1t и 2t - метилированное состояние промотора LAMC3 в опухолях. Р - положительный контроль ПЦР (в качестве матрицы использована негидролизованная ДНК). Для контроля полноты гидролиза ДНК использован фрагмент гена ING1, содержащий сайты узнавания метилчувствительной рестриктазы, но не подвергающийся метилированию в опухолях. Внутренний контроль ПЦР обеспечивает фрагмент гена MeCP2, не содержащий сайтов узнавания используемой рестриктазы. Приводится по источнику: Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. в учебнике "Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических новообразований", 2009. С. 96.

Решение вопроса о формировании систем контролей эффективности амплификации для МЧ-ПЦР также оказалось неочевидным. В частности, предпринят подход к использованию в качестве контрольных участков нормально импринтированных генов. Для CpG-островков импринтированных генов показано постоянное метилирование одного из аллелей в тканях взрослого организма, за исключением довольно редких случаев болезней импринтинга (Немцова М.В., Залетаев Д.В., 2004). Проведен анализ характера метилирования импринтированного гена IGF2 в образцах НМРЛ, РМЖ, ретинобластомы и ОЛЛ, показавший, что при этих злокачественных новообразованиях наблюдается потеря импринтинга, которая выражается в аномальном деметилировании гена IGF2. Таким образом, критерий состояния метилирования гена IGF2 можно использовать скорее как маркер опухолевого процесса, нежели как признак эффективности амплификации в МЧ-ПЦР.

После исключения возможности использования импринтированных локусов в качестве основы для дизайна контролей эффективности МЧ-ПЦР была предпринята попытка такого дизайна на основе последовательностей генома, полностью лишенных сайтов узнавания используемых метилчувствительных рестриктаз (HpaII, HhaI). Важно, что кандидатные локусы должны обладать общими свойствами с последовательностями, тестируемыми методом МЧ-ПЦР, а именно, характеризоваться богатым G,C-составом для обеспечения специфического отжига всех пар праймеров при проведении многолокусной реакции. Проведенный поиск таких последовательностей лишь подтвердил известный факт высокой плотности сайтов узнавания метилчувствительных рестриктаз в участках G,C-обогащения. По результатам нашей работы максимальная протяженность внутреннего контрольного продукта МЧ-ПЦР, для формирования которого приемлемы температуры отжига праймеров, превышающие 68°С, составила 105 п.н. (участок CpG-островка гена MeCP2). Пример использования этого внутреннего контроля представлен на рис. 11. Очевидным его недостатком является малый размер ПЦР-продукта, не удовлетворяющий требованию к внутреннему контролю ПЦР о превышении размера тестируемого фрагмента.

Ключ к формированию внутренних контролей МЧ-ПЦР получен в настоящей работе по результатам использования методов непредвзятого скрининга метиломов, выявивших локусы, постоянно метилированные во всех исследованных нормальных и опухолевых тканях. В частности, с использованием AFLOAT выявлено константное метилирование участков генов CUX1, MAD1L1, TAF4, ZBTB4. Протяженности охарактеризованных константно метилированных последовательностей достаточны для формирования систем внутреннего контроля эффективности МЧ-ПЦР с любой разумной молекулярной массой и широким выбором температур отжига праймеров.

Метилчувствительная ПЦР идеальна для анализа метилирования индивидуальных локусов. В то же время многие ДНК-диагностические процедуры предполагают исследование нескольких генов (локусов) в рамках одного теста. Решение этой задачи при помощи традиционного подхода проведения многолокусной ПЦР в одной пробирке применительно к анализу метилирования наталкивается на препятствие в виде особенностей первичной структуры CpG-островков. От достаточно индивидуальных кодирующих областей генов CpG-островки отличаются сниженной информативностью нуклеотидных последовательностей, что не позволяет осуществлять дизайн удовлетворительно уникальных праймеров для ПЦР-анализа. Как следствие, проведение многолокусной метилчувствительной ПЦР чревато образованием неспецифических продуктов реакции, затрудняющих анализ и интерпретацию результатов диагностики.

Повышение специфичности достигается при использовании для анализа метилирования многих локусов технологии ДНК-микрочипов. Положительный эффект обеспечивается дополнительным этапом анализа - гибридизацией ПЦР-продуктов со специфичными ДНК-зондами. Однако, несмотря на то, что консенсусной последовательности CpG-островка как такового не существует, степень гомологии между различными CpG-островками значительно выше, чем между различными индивидуальными кодирующими последовательностями ДНК. Такая пониженная информативность последовательностей CpG-островков в случае применения ДНК-микрочипов создает технические проблемы, вызванные перекрестной гибридизацией. В целом, любые технологии анализа метилирования ДНК, включающие этап гибридизации (будь то отжиг праймеров или гибридизация зондов на последовательностях CpG-островков), исключительно требовательны к дизайну многолокусных реакций, а их специфичность прогрессивно снижается по мере увеличения количества локусов, анализируемых в рамках одного теста.

Один из подходов, позволяющих избежать этапа гибридизации ДНК в процессе анализа метилирования, - адаптер-опосредованная ПЦР фрагментов ДНК, полученных в результате гидролиза метилчувствительными рестриктазами. Такой подход использовался при разработке метода AFLOAT, направленного на поиск дифференциально метилированных локусов геномов. На сегодняшний день адаптер-опосредованная ПЦР, в частности, в формате АИМС, - единственная многолокусная система метилчувствительного анализа ДНК, полностью свободная от проблем, связанных с перекрестной гибридизацией C,G-обогащенных участков ДНК с пониженной информативностью нуклеотидных последовательностей. Возможность расширения количества амплифицируемых локусов создает условия для эффективного всестороннего контроля метилчувствительной реакции на основе константно метилированных и константно неметилированных локусов, естественным образом присутствующих в репрезентациях АИМС (рис. 12).

Рис. 12. Электорофореграммы продуктов АИМС, полученных на ДНК из образцов рака молочной железы (красные графики), соотнесенных с полной репрезентацией АИМС (черные графики).

Показано аномальное метилирование промоторных CpG-островков генов KIAA1324L, PURB, ATMIN, IQSEC2 и EST CN371412. Два раздвоенных высокоамплитудных сигнала метилирования в центре каждой электрофореграммы соответствуют фрагментам генов CUX1 и ZBTB4, характеризующимся метилированным состоянием в нормальных и опухолевых тканях человека и служащим контролем эффективности амплификации. Двоение некоторых пиков, соответствующих индивидуальным продуктам АИМС, объясняется различиями в электрофоретической подвижности комплементарных нитей амплификатов в высокоразрешающем денатурирующем полиакриламидном геле и не влияет на качество анализа результатов исследования. Естественный контроль полноты гидролиза ДНК обеспечивают облигатно неметилированные локусы генома (соответствующие продукты АИМС отмечены фиолетовыми стрелками).

Таким образом, в результате анализа нормальных и опухолевых тканей, в том числе с использованием методов непредвзятого скрининга дифференциального метилирования ДНК, впервые сформированы системы контролей полноты рестрикции геномной ДНК и эффективности амплификации, обеспечивающие достоверность исследований метилирования отдельных локусов геномов при канцерогенезе методом МЧ-ПЦР.

Характеристика метилирования отдельных локусов генома, выявленных методами непредвзятого скрининга

С использованием разработанных систем МЧ-ПЦР охарактеризованы частоты аномального метилирования локусов, выявленных методами непредвзятого скрининга, в образцах РМЖ (табл. 2).

Таблица 2. Частоты метилирования локусов, выявленных методами непредвзятого скрининга, в образцах ткани РМЖ, прилежащей условно нормальной ткани и нормальной ткани молочной железы. н/д - различия недостоверны.

3.3. Предвзятый подход к выявлению новых маркеров аномального метилирования ДНК в злокачественных опухолях

Несмотря на элемент отрицательной эмоциональной окраски слова «предвзятый», такой подход обладает определенной эффективностью и занимает свою специфическую нишу в эпигенетических исследованиях, а до недавнего времени он лежал в основе большинства проводимых работ в этой области. В рамках настоящего исследования поставлена задача проанализировать основные предпосылки, определяющие выбор кандидатных локусов генома, для которых предполагается дифференциальное метилирование при злокачественных новообразованиях, и сформировать многофакторную систему отбора таких локусов.

Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе функций известных генов

Поиск дифференциального метилирования участков генов с известными функциями, предположительно ассоциированными с процессами канцерогенеза, оправдан гипотетической перспективой формирования научно обоснованных панелей диагностических маркеров метилирования. При этом в качестве основной гипотезы принимается предположение об инактивации генов, вовлеченных в канцерогенез, метилированием их CpG-островков. Для хорошо изученных генов, мутации или нарушение экспрессии которых ассоциированы с определенными свойствами опухолей, предполагается сохранение этих ассоциаций для случаев аномального метилирования - предположение, которое, несомненно, требует проверки для каждого конкретного гена.

Определен профиль метилирования генов - супрессоров опухолевого роста RВ1, P16/CDKN2a, P15/CDKN2b, P14/ARF, CDH1, ER, CALCA, MGMT, HIC1 и N33 в опухолях разного типа, куда вошли РМЖ (85 образцов), НМРЛ (54 образца) и В-ОЛЛ (90 образцов). Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Частоты метилирования генов RВ1, P16/CDKN2А, P15/CDKN2В, P14/ARF, CDH1, ER, CALCA, MGMT, HIC1 и N33 в опухолях различного гистогенеза (в соавторстве с В.В.Земляковой).

Данные о значительном количестве генов, которые перестают функционировать в результате гиперметилирования их промоторных областей при различных типах опухолей, привели к попытке определить специфический набор генов, метилирование которых характерно только для определенного вида рака. Esteller и сотр. (2001) предложили термин «метилотип», который представляет собой совокупность генов, наиболее часто метилированных при определенном типе опухоли. Предполагается, что гены, входящие в «метилотип», должны иметь частоту метилирования в определенном типе опухоли больше 10%. Например, «метилотип» для рака желудка и кишечника состоит из генов P16/CDKN2А, P14/ARF, MGMT, АРС и MLH1, для опухолей печени и желчных путей - 14-3-3, АРС, CDH1, GSTP1. На основании полученных результатов и данных литературы нами составлены метилотипы для РМЖ, НМРЛ и В-ОЛЛ (рис. 13).

Рис. 13. Метилотипы РМЖ, НМРЛ и В-ОЛЛ. Красным отмечены гены, добавленные по результатам настоящей работы, синим - по результатам анализа данных литературы.

Составленные метилотипы для исследуемых типов опухолей различны. Однако, некоторые гены такие, как RB1, P16, CDH1 и HIC1 входят во все метилотипы. Это может свидетельствовать о том, что в процессе опухолеобразования задействованы сходные механизмы. Так, высокий процент метилирования гена CDH1 может говорить о высокой метастатической активности опухолей, что согласуется с клиническими характеристиками этих заболеваний.

Поиск кандидатных локусов для анализа дифференциального метилирования в областях потери гетерозиготности, характерных для отдельных типов опухолей

Изучение нарушений копийности ДНК в геномах опухолей с разрешением, превышающим возможности классической цитогенетики, привело к обнаружению специфичных для разных типов опухолей изменений копийности ДНК. Целенаправленное изучение соответствующих локусов позволило обнаружить новые гены, вовлеченные в канцерогенез (Futreal P.A. et al., 2004; Santarius T. et al., 2010). По некоторым оценкам, поиск генов, вовлеченных в канцерогенез, в областях потерь гетерозиготности более эффективен, чем описанный выше подход анализа генов с определенными функциями (Stratton M.R., 2011). Тем не менее, существуют известные исключения. Так, в областях частых сочетанных делеций 1p/19q, маркирующих олигодендроглиомы, обнаружен только один ген, предположительно вовлеченный в канцерогенез - CAMTA1 с локализацией 1p36.3 (Barbashina V. et al., 2005; Henrich K.O. et al., 2011). Другая загадочная область, в которой также часто наблюдаются потери гетерозиготности при злокачественных новообразованиях - 19р13.3, дистальный сегмент короткого плеча 19-й хромосомы. Это С,G-богатый участок ДНК, содержащий большое количество генов (Puttaguntaet al., 2000). Потеря гетерозиготности по 19р13.3 была показана при различных видах злокачественных новообразований, в частности при РМЖ, при раке ободочной кишки, шейки матки, при миелоидном лейкозе (Wang Z.J. et al., 1999; Lee J.Y. et al., 1998; Tniwaki B.M. et al., 1994). Высокие частоты потерь гетерозиготности по ряду микросателлитных маркеров в локусе 19р13.3 и недавно продемонстрированная ассоциация частоты этих потерь со степенью злокачественности опухолей молочной железы заставляют предположить наличие в этой области одного или нескольких генов-супрессоров опухолевого роста (Yang T.L. et al., 2004). Проведенное исследование позволяет предложить на роль такого гена-кандидата идентифицированный методом МЧФП ген SEMA6B.

Анализ статуса метилирования SEMA6B в образцах РМЖ был выполнен методом мультилокусной МЧ-ПЦР, аномальное метилирование выявлено в 38% опухолей. В свете показанного в настоящей работе дифференциального метилирования промоторной области SEMA6B при РМЖ необходимо упомянуть, что гиперметилирование промотора другого представителя семейства семафоринов, SEMA3B, было ранее описано при НМРЛ (Kuroki et al., 2003), причем недавние эксперименты по реактивации SEMA3B в клетках рака молочной железы показали, что он обладает свойствами гена-супрессора опухолевого роста с проапоптотическим действием.

Учитывая высокую частоту метилирования SEMA6B в образцах РМЖ, мы предположили, что этот ген может служить одним из кандидатов на роль гена-супрессора в критической области 19р13.3, и изучили некоторые особенности его молекулярной патологии при РМЖ и других злокачественных опухолях.

Частота метилирования CpG-островка второго экзона гена SEMA6B в образцах опухолевой ткани мочевого пузыря составила 31% (17/55), кроме того метилирование было обнаружено и в 16% (5/31) образцов прилежащей морфологически неизмененной ткани, причем в 4-х образцах наблюдалось наличие метилирования и в норме, и в опухоли. Наличие метилирования в прилежащей к опухоли ткани может быть связано с контаминацией исследуемого материала опухолевыми клетками или же с тем, что эпигенетическая модификация гена SEMA6B может являться одним из ранних событий при опухолеобразовании. Достаточно высокое значение выявленной нами частоты аномального метилирования в опухолях мочевого пузыря позволяет предполагать, что метилирование гена SEMA6B может являться маркером опухолевого процесса при РМП.

Анализ метилирования CpG-островка гена SEMA6B в образцах РП методом метилчувствительной ПЦР показал наличие метилирования в 100% образцов, что согласуется с выявленным нами методом метилспецифического секвенирования моноаллельным метилированием этого локуса как в опухолевых, так и в нормальных тканях почки (рис. 14).

Рис. 14. Результат метилспецифического секвенирования участка CpG-островка гена SEMA6B в ДНК из нормального образца почки. Наличие полуметилированных остатков цитозина, отмеченных стрелками, указывает на моноаллельный характер метилирования локуса.

Доля образцов РМЖ с признаками аллельного дисбаланса по результатам микросателлитного анализа и анализа однонуклеотидных полиморфизмов составила 59% (27/46). Полученное значение достаточно высоко и позволяет расценивать аллельный дисбаланс в области гена SEMA6B как маркер опухолевого процесса в молочной железе. Ранее для локуса 19р13.3 уже был показан высокий уровень аллельных делеций, составивший от 29 до 38% в зависимости от расположения исследуемого локуса (Yang T.L. et. al, 2004), однако прицельного исследования аллельной копийности гена SEMA6B прежде не проводилось.

Анализ аллельных потерь проведен также и для образцов РМП. Доля гетерозигот в исследуемой выборке составила 62% (36/58). Среди информативных образцов потеря гетерозиготности была выявлена только лишь для одной пары (3%). Хотя хромосомные делеции являются одним из наиболее часто встречающихся нарушений при РМП, по данным литературы делеции локуса 19p не характерны для опухолей мочевого пузыря (Prat E. et al., 2001). Таким образом, полученные результаты согласуются с данными литературы, а выявленная делеция может являться следствием общей нестабильности генома опухолевых клеток, и, по всей видимости, не является специфическим нарушением при РМП.

Одним из возможных событий, приводящих к инактивации супрессоров опухолевого роста при спорадических формах рака, являются соматические мутации. В поисках такого рода мутаций нами проведено секвенирование экзонов гена SEMA6B в материале кДНК, полученной из образцов РМЖ.

В одном из опухолевых образцов была выявлена миссенс-мутация в 8 экзоне SEMA6B (рис. 15). Замена в 867 нуклеотиде кДНК приводит к изменению аминокислотной последовательности белка: к замене гистидина на аргнин. Высокая степень консервативности среди различных видов, характерная для данного аминокислотного остатка, позволяет предполагать, что обнаруженная нами мутация может влиять на функциональную активность белка SEMA6B.

Выявленная при секвенировании кДНК мутация в 8 экзоне подтверждена рестриктазным анализом (рис. 15).

Рис. 15. Результаты секвенирования (А, Б) и рестриктазного (В) анализа фрагмента SEMA6B-ex7-9. А - контрольный образец ДНК, не несущий нуклеотидных замен; Б - образец РМЖ, стрелкой отмечена позиция обнаруженной мутации; В - в первой и четвертой дорожках представлены фрагменты SEMA6B-ex7-9, не обработанные рестриктазой, во второй и третьей - результаты гидролиза ПЦР-продукта SEMA6B-ex7-9 рестриктазой FatI (выявленная мутация приводит к отсутствию одного сайта узнавания рестриктазы). Рядом с полосами указаны размеры фрагментов.

Таким образом, проведен анализ возможных путей инактивации гена SEMA6B при РМЖ, исследованы состояние зиготности, статус метилирования и сохранность нуклеотидной последовательности гена в образцах опухолевых и морфологически неизмененных тканях молочной железы, почки и мочевого пузыря. В целом, наличие в образцах РМЖ хотя бы одной из исследованных форм молекулярной патологии было обнаружено в 75% случаев. Полученные данные подкрепляют высказанное предположение о том, что SEMA6B - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе локальных характеристик хроматина. Синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов

Приведенные выше примеры говорят об эффективности отбора кандидатных локусов для поиска аномального метилирования при канцерогенезе на основе известных функций генов и в областях нарушенной копийности ДНК (потерь гетерозиготности). В то же время, остается открытым вопрос о том, какие именно участки кандидатных генов целесообразно тестировать в поисках аномального метилирования. Возникает необходимость выявления неких свойств геномных локусов, с учетом которых можно было бы осуществлять более эффективное предсказание участков генов, предрасположенных к тому или иному характеру метилирования: к постоянному (константному) метилированию, к постоянному неметилированию, и, наконец, к дифференциальному метилированию. Возможно, такими предсказательными признаками могут служить локальные характеристики хроматина: плотность нуклеосомной упаковки по результатам обработки ДНК нуклеазой микрококков и области доступного хроматина, определяемые ДНКазным тестом.

Свойства хроматина, ассоциированные с константным метилированием ДНК, рассмотрены на примерах константно метилированных локусов, выявленных нами непредвзятыми методами скрининга метилирования геномов: TAF4, MAD1L1, ZBTB4, CUX1, LAMC3. Анализ локализации константно метилированных участков генов TAF4, MAD1L1 и ZBTB4 показывает, что они пространственно совпадают с областями плотной упаковки нуклеосом и закрытого хроматина (рис. 16, 17, 18).

Рис. 16. Сопоставление структурно-функциональных характеристик геномного локуса с помощью программы просмотра элементов генома UCSC Genome Browser. Красным обведена выявленная область константного метилирования (фрагмент интрона гена TAF4), сиреневым - участок высокой концентрации нуклеосом, синим - область открытого хроматина, оранжевым - область закрытого хроматина. Показано пространственное совпадение трех сравниваемых характеристик: константного метилирования, высокой нуклеосомной плотности и закрытого состояния хроматина.

Рис. 17. Сопоставление структурно-функциональных характеристик для участка интрона гена MAD1L1.

Красным обведена выявленная область константного метилирования, сиреневым - участок высокой концентрации нуклеосом. Нижняя часть рисунка показывает отсутствие значимых областей открытого хроматина по результатам обработки ДНКазой. Показано пространственное совпадение трех сравниваемых характеристик: константного метилирования, высокой нуклеосомной плотности и закрытого состояния хроматина.

Рис. 18. Сопоставление структурно-функциональных характеристик фрагмента экзона гена ZBTB4. Красным обведена выявленная область константного метилирования, сиреневым - участок высокой концентрации нуклеосом, синим - область открытого хроматина, оранжевым - область закрытого хроматина. Показано пространственное совпадение трех сравниваемых характеристик: константного метилирования, высокой нуклеосомной плотности и закрытого состояния хроматина.

Один из локусов константного метилирования, выявленных методом AFLOAT, приходится на последний экзон одного из альтернативных транскриптов гена CUX1, содержащий CpG-островок (рис. 19). Поскольку этот участок гена CUX1 метилирован во всех исследованных нами нормальных и опухолевых тканях, мы предположили возможность его совместного расположения с областями плотной упаковки нуклеосом и закрытого хроматина, по аналогии с вышеописанными константно метилированными участками генов ZBTB4, TAF4 и MAD1L1. Однако проведенное для подтверждения этой гипотезы сопоставление структурно-функциональных характеристик (рис. 19) дало неожиданный результат: при высокой плотности нуклеосомной упаковки исследуемый CpG-островок пространственно совпадает с выраженным окном открытого хроматина.

Рис. 19. Сопоставление структурно-функциональных характеристик CpG-островка альтернативного 3'-терминального экзона гена CUX1. Красным обведена выявленная область константного метилирования, сиреневым - участок высокой концентрации нуклеосом, синим - область открытого хроматина. Показано пространственное совпадение областей константного метилирования, высокой нуклеосомной плотности и открытого состояния хроматина.

Результаты хроматин-иммунопреципитации (Giresi P.G. et al., 2007) показывают, что окно открытого хроматина в области альтернативного 3'-терминального экзона гена CUX1 соответствует участку связывания транскрипционного фактора CTCF (СССТС-связывающий белок). В отличие от других распространенных факторов транскрипции, таких, как MYC или RNAPII, СTCF взаимодействует преимущественно с дистальными участками генов и внутригенными участками (Lee B.-K. et al., 2012). Связывание с CTCF определяет активность инсуляторов у позвоночных (Kim T.H. et al., 2007). Показано, что метилирование ДНК в области сайта узнавания препятствует связыванию CTCF (Hark A.T. et al., 2000). Известно также, что метилирование ДНК приводит к эффекту, аналогичному делеции сайта связывания CTCF - утрате блока транскрипции генов (Bell A.C. et al., 2000).

Возможно, состояние метилирования описываемого участка ДНК определяет возможность связывания транскрипционного фактора CTCF, регулируя, таким образом, образование различных изоформ транскрипта CUX1. Наиболее выраженная экспрессия альтернативной изоформы CUX1 показана в клетках Сертоли и сперматидах (Kroll M.R. et al., 2011). В подтверждение этой гипотезы, результаты ограниченного бисульфитного секвенирования (http://genome.ucsc.edu) для нормальных тканей яичка демонстрируют преимущественно неметилированное состояние альтернативного 3'-терминального экзона гена CUX1.

Таким образом, выявленный нами участок гена CUX1 не является истинно константно метилированным во всех тканях, чем и объясняется необычная комбинация характеристик хроматина в этой области. В то же время, в изучаемых нами образцах (нормальные и опухолевые ткани молочной железы) этот участок метилирован постоянно, что позволяет использовать его как положительный контроль реакции амплификации интерметилированных сайтов.

Совместное расположение области константного метилирования ДНК и высокой плотности нуклеосомной оккупации с участком закрытого хроматина показано для гена LAMC3. На примере этого гена демонстрируется и противоположная ситуация - низкая нуклеосомная оккупация и открытый хроматин в области дифференциального метилирования ДНК при РМЖ (рис. 20).

Рис. 20. Карта метилирования промоторного участка гена LAMC3 (вверху), проксимальная часть которого предрасположена к дифференциальному метилированию при РМЖ, в то время как дистальная облигатно метилирована. Метилированные CpG-динуклеотиды изображены в виде зачерненных кружков, неметилированные незакрашены. Область перехода от первого ко второму участку характеризуется резким переходом к состоянию закрытого хроматина и к нарастанию плотности нуклеосом. Синим обведена область открытого хроматина, сиреневым - участок низкой концентрации нуклеосом.

Дифференциально метилированные участки генов CUX1 и LAMC3 ассоциированы с двумя различными комбинациями локальных характеристик хроматина: для CUX1 характерна плоная нуклеосомная упаковка при открытом хроматине, для LAMC3 - низкая концентрация нуклеосом, также при открытом хроматине. Рассмотрение других выявленных в настоящем исследовании локусов показывает, что обе комбинации состояния хроматина могут пространственно совпадать с участками дифференциального метилирования ДНК (рис. 21, 22).

Рис. 21. Сопоставление локализации дифференциально метилированного межгенного CpG-островка гена ATMIN с локальными характеристиками хроматина. Красным обведена область дифференциального метилирования, синим - область открытого хроматина, сиреневым - участок низкой концентрации нуклеосом. Показано пространственное совпадение трех сравниваемых характеристик.

Рис. 22. Сопоставление локализации дифференциально метилированного межгенного CpG-островка, хромосома 1р33, с локальными характеристиками хроматина. Красным обведена область дифференциального метилирования, синим - область открытого хроматина, сиреневым - участок низкой концентрации нуклеосом.

На основании проведенных исследований предложен синтетический подход к поиску новых локусов, аномально метилированных в процессе канцерогенеза, объединяющий: 1) эффективный способ предвзятого отбора собственно кандидатных генов на основе известных функций и/или ранее описанных областей потери гетерозиготности, характерных для определенных типов опухолей, и 2) способ выбора для анализа метилирования участков конкретных локусов с учетом особенностей локальных характеристик хроматина. Анализ дифференциального метилирования исследуемых генов целесообразно проводить на участках, пространственно совпадающих с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки.

Валидация синтетического подхода проведена на примере анализа метилирования всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов цепей ламининов).

Изучение эпигенетической патологии семейства генов ламининов на основе синтетического подхода к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов