Структурно-функциональная организация хромосом при нервно-психических заболеваниях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Структурно-функциональная организация хромосом при нервно-психических заболеваниях

03.02.07 -- Генетика

Юров И.Ю.

МОСКВА-2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук «Научный центр психического здоровья» РАМН.

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор,

Бочков Николай Павлович

доктор биологических наук, профессор

Лимборская Светлана Андреевна

доктор биологических наук,

Волгарева Галина Михайловна

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук
Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Одной из наиболее значимых особенностей генома человека является его широкая вариабельность, обусловленная качественными и количественными изменениями последовательности хромосомной ДНК. Геномные вариации проявляются в виде изменений ДНК на всех основных уровнях организации генетического материала: первичной последовательности нуклеотидов ДНК (генные мутации, экспансии микро- и минисателлитных повторов), субмикроскопическом (хромосомные микроперестройки) и микроскопическом (структурные и численные аномалии хромосом) (Ворсанова и др., 2006; Iafrate et al., 2004; Sebat et al., 2004; Feuk et al., 2006; Redon et al., 2006; Sharp et al., 2006). Исследования последних нескольких лет показали, что геномные вариации затрагивают не менее 12% всех эухроматиновых (генонасыщенных) участков хромосом человека (Redon et al., 2006). С другой стороны, изменения последовательностей геномной ДНК являются причиной или факторами предрасположенности к различным наследственным заболеваниям, и имеют достаточно высокую частоту в общей популяции (Ворсанова и др., 2006; Feuk et al., 2006; Zhang et al., 2009). Большинство патологических состояний, связанных со структурными изменениями хромосомной ДНК, характеризуется нарушениями развития и функционирования центральной нервной системы (ЦНС). Геномные перестройки, выявляемые на субмикроскопическом и микроскопическом уровнях, являются одной из наиболее частых причин нервных и психических заболеваний, а при некоторых мультифакторных болезнях ЦНС специфические вариации генома имеют значительно более высокую частоту по сравнению с контролем (Ворсанова и др., 2000; 2006; Knight, Regan, 2006; Cook, Scherer, 2008). Эти открытия в области генетики человека и медицинской генетики явились результатом изучения межиндивидуальных вариаций последовательностей геномной ДНК эухроматина. Однако, вариабельность генома человека на межклеточном уровне (соматические геномные вариации или СГВ), а также в клетках разных тканей остается практически неизученной. Подобное утверждение справедливо и по отношению к гетерохроматиновым участкам хромосом человека, которые составляют около 20% всего генома и также демонстрируют исключительную межиндивидуальную изменчивость (Ворсанова и др., 2006; Lander et al., 2001; Li et al., 2001; Venter et al., 2001). Предполагается, что это является следствием отсутствия соответствующих молекулярных технологий анализа повторяющихся последовательностей ДНК, формирующих гетерохроматиновые участки генома человека (Юров, Ворсанова, 2001).

Другой формой вариабельности генома является изменения его функциональной активности или эпигенетические феномены, обусловленные на молекулярном уровне химическими модификациями последовательностей ДНК и хроматина. На клеточном уровне эпигенетические феномены проявляются в виде вариаций организации и расположения хромосом, специфических участков генома и генных локусов в интерфазном ядре (van Driel et al., 2003; Teller et al., 2007; Hirst, Mara, 2009). Следует отметить, что анализ эпигенетических процессов, в основном, проводится на фракциях молекул ДНК, РНК и белков, выделенных из большого числа клеток. Это, как правило, приводит к тому, что большинство исследований не учитывает межклеточные вариации активности генома. Тем не менее, как показано с помощью оценки профиля транскрипции индивидуальных клеток, отсутствие таких данных не позволяет полноценно охарактеризовать «эпигеном» человека (Levsky, Singer, 2002). Эпигенетические феномены, проявляющиеся на хромосомном (супрамолекулярном) уровне, изучаются в каждой отдельно взятой клетке. Однако из-за объективных методических ограничений комплекс соответствующих внутриклеточных генетических и эпигенетических процессов остается малоизученным (Gondor, Ohlsson, 2009). Более того, многие типы соматических клеток человека, в частности, клетки головного мозга, в норме и при различных заболеваниях ЦНС никогда не исследовались в данном аспекте.

Таким образом, в настоящее время особенности структурно-функциональной организации и вариабельности генома человека в соматических клетках изучены недостаточно полно. Это связано с методическими ограничениями молекулярных технологий, как для идентификации соматических геномных вариаций, так и для анализа структуры хромосом в неделящихся клетках соматических тканей человека. Последнее становится особо актуальным в свете изучения головного мозга и заболеваний, связанных с нарушениями его функциональной активности. С одной стороны, нервные клетки головного мозга практически не исследовались с помощью современных высокоразрешающих методов анализа интерфазных хромосом. С другой стороны, высокая социальная значимость болезней ЦНС и их предполагаемая связь с генетическими (эпигенетическими) внутриклеточными процессами свидетельствуют о необходимости разработки новых подходов к исследованию генома при нервных и психических заболеваниях. Анализ соматических вариаций и нестабильности генома в клетках головного мозга на хромосомном уровне может рассматриваться в качестве возможной альтернативы. Помимо этого, для изучения механизмов возникновения вариаций и нестабильности генома в соматических неделящихся клетках ЦНС необходимы онтогенетические исследования. Идентификация генетической и эпигенетической вариабельности и нестабильности генома (эпигенома) в клетках ЦНС представляется актуальной задачей молекулярной генетики и цитогенетики, решение которой затруднено исключительной сложностью организации головного мозга на клеточном уровне. Наиболее значимыми биологическими маркерами нестабильности генома в неделящихся клетках, в том числе и в мозге, которые можно исследовать современными методами молекулярной цитогенетики, являются численные хромосомные аномалии или анеуплоидия (Юров, Ворсанова, 2001). Исследования в этой области тесно связаны с проблемой выявления хромосомного мозаицизма в соматических тканях в норме и при патологии. Необходимо отметить, что, используя современные методы цитогенетического анализа, мозаицизм можно выявить лишь при наличии 10-20% аномальных клеток. Однако исключить наличие соматического мозаицизма в разных тканях в принципе невозможно из-за неравномерного распределения мозаичных клеток или феномена низкопроцентного мозаицизма (Youssoufian, Pyeritz, 2002).

На современном этапе развития медицинской генетики (нейрогенетики и психиатрической генетики) существует необходимость разработки новых, молекулярно-цитогенетических технологий для изучения нестабильности генома на хромосомном уровне в неделящихся нервных клетках. Достижения в этой области могут лечь в основу исследований особенностей структурно-функциональной организации генома в клетках мозга при генетически обусловленных нервных и психических заболеваниях. Результатом подобных исследований будут новые данные о возможных молекулярных и клеточных механизмах патогенеза болезней ЦНС, которые необходимы для создания новых методов молекулярной диагностики, эффективного медико-генетического консультирования и научно-обоснованного лечения этих заболеваний.

Цель и задачи исследования

Основной целью настоящей работы являлось изучение особенностей структурно-функциональной организации и нестабильности хромосом в клетках головного мозга на разных стадиях онтогенеза, а также при нервных и психических заболеваниях: аутизм, шизофрения, атаксия-телеангиэктазия (АТ или синдром Луи-Бар) и болезнь Альцгеймера (БА). Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать комплекс молекулярно-цитогенетических методов анализа особенностей структурной и функциональной организации генома различных типов клеток на микроскопическом и субмикроскопическом уровнях, включая определение низкопроцентного хромосомного мозаицизма как биологического маркера нестабильности генома в неделящихся клетках головного мозга человека.

2. Определить спонтанный уровень анеуплоидии в эмбриональных нервных клетках головного мозга человека, а также в условиях культивирования in vitro.

3. Определить спонтанный уровень анеуплоидии в нервных клетках головного мозга нормальных индивидуумов (кора больших полушарий, мозжечок, гиппокамп).

4. Выявить частоту мозаичных форм анеуплоидии у детей с аутизмом и умственной отсталостью.

5. Определить уровень мозаичной анеуплоидии в нервных клетках головного мозга (кора больших полушарий, мозжечок, гиппокамп) у индивидуумов с шизофренией.

6. Определить уровень мозаичной анеуплоидии и структурных хромосомных перестроек в нервных клетках головного мозга (кора больших полушарий, мозжечок) при АТ (синдроме мозжечковой нейродегенерации раннего возраста и хромосомной нестабильности).

7. Определить уровень мозаичной анеуплоидии в нервных клетках головного мозга (кора больших полушарий, гиппокамп, мозжечок) в случае нейродегенерации позднего возраста при БА.

8. Исследовать изменения структурно-функциональной организации генома в интерфазных ядрах клеток головного мозга на примере феномена соматического спаривания хромосом в норме, а также при нервно-психических болезнях на примере шизофрении, БА и АТ.

9. На основе сравнительного анализа особенностей структурно-функциональной организации генома в нервных клетках головного мозга в норме и при заболеваниях ЦНС предложить возможные механизмы патогенеза аутизма, шизофрении, БА и АТ, а также разработать рекомендации для диагностики, профилактики и повышения эффективности медико-генетического консультирования при этих заболеваниях.

Научная новизна

Разработан комплекс молекулярно-цитогенетических методов для выявления биологических маркеров геномной нестабильности (мозаичной анеуплоидии и структурных хромосомных перестроек) в клетках головного мозга человека. Комплекс методов включает оригинальные модификации многоцветовой интерфазной флюоресцентной гибридизации in situ (mFISH), количественной FISH (QFISH), полимеразной реакции in situ (PRINS), интерфазного многоцветового хромосомоспецифического окрашивания (ICS-MCB), иммуно-FISH (метод, сочетающий иммунотипирование клеток и FISH), а также оригинальный биоинформатический метод анализа генного дисбаланса при хромосомных перестройках.

Впервые выявлен феномен геномной и хромосомной нестабильности при эмбриональном развитии мозга человека. Обнаружен феномен хромосомного мозаицизма, ограниченного тканями мозга. Определены частоты спонтанной анеуплоидии в клетках разных тканей эмбриона человека (ЦНС, кожи, ворсин хориона), составляющие от 20% до 35%. Выявлен феномен индуцированной мозаичной анеуплоидии в органотипических культурах эмбриональных и фетальных нервных клетках человека в условиях in vitro.

Впервые определены частоты спонтанной анеуплоидии для разных хромосом и вариации хромосомного набора в клетках нормального головного мозга индивидуумов без нарушений психики. Определена доля анеуплоидных клеток в нормальном взрослом мозге человека, составляющая около 0,5% в расчете на хромосому. Получены данные в пользу редукции мозаичной анеуплоидии в ходе развития ЦНС от 30-35% в эмбриональном периоде до 10-12% во взрослом мозге.

Впервые показано, что при шизофрении вариации хромосомного набора в виде низкопроцентной мозаичной анеуплоидии имеют повышенную частоту в клетках головного мозга по сравнению с контролем.

Впервые представлены данные о частоте хромосомных аномалий у детей с идиопатическим аутизмом при учете соматических (мозаичных) геномных вариаций, микроперестроек, хромосомной нестабильности и определена частота мозаичных форм анеуплоидии, достигающая 16%.

Впервые продемонстрировано, что при БА мозаичная анеуплоидия с участием хромосомы 21 специфически поражает нервные клетки отделов головного мозга, подверженных дегенерации (гиппокамп и кора больших полушарий), являясь, таким образом, одним из возможных генетических механизмов патогенеза этого заболевания.

Впервые обнаружено, что при АТ (синдром Луи-Бар) мозжечковая нейродегенерация связана с мозаичным эффектом хромосомной нестабильности в виде анеуплоидии и структурных хромосомных аберраций, селективно поражающих нервные клетки определенных областей головного мозга (мозжечка).

Впервые охарактеризована ядерная организация гомологичных хромосом в интерфазных клетках головного мозга, и показано, что она определяется процессом соматических ассоциаций (спаривания) хромосомных локусов, дифференциально затрагивающих гетерохроматиновые участки разных хромосом. Определены частоты соматического спаривания хромосом и показано нарушение правила «хромосомных территорий» для определенных гомологичных хромосом в нейронах коры и мозжечка головного мозга человека.

Впервые исследованы особенности архитектоники интерфазного ядра клеток головного мозга в норме и при психической патологии, а также представлены данные о том, что характерные изменения ядерной организации генома (эпигенома) и нарушения соматического спаривания эухроматиновых участков хромосом в нервных клетках наблюдаются у больных с психическими заболеваниями (шизофрения и БА). Таким образом, нарушения соматического спаривания эухроматиновых участков хромосом могут являться одним из вероятных эпигенетических механизмов патогенеза этих болезней.

На основе полученных данных предложена оригинальная гипотеза о дифференциальной экспрессии нестабильности генома (эпигенома) в клетках ЦНС, объясняющая возможные генетические механизмы патогенеза различных нервно-психических заболеваний (аутизм, шизофрения, БА и АТ). Разработана комплексная схема патогенеза исследованных заболеваний, основанная на данных о соматических вариациях и нестабильности структурно-функциональной организации генома на хромосомном уровне.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные о соматических вариациях и нестабильности генома, а также особенностях его структурно-функциональной организации на хромосомном уровне в клетках головного мозга на разных стадиях онтогенеза и при нервно-психической патологии имеют фундаментальное значение и могут быть рекомендованы для использования в курсах лекций по разным разделам медицинской генетики, биологии развития, клеточной биологии и нейробиологии при подготовке специалистов в высших учебных заведениях медико-биологического профиля, а также включены в руководства и учебные пособия по данным специальностям.

В ходе работы было создано новое научное направление в современной экспериментальной биологии и биомедицине -- молекулярная нейроцитогенетика, которая сочетает в себе методические аспекты генетики человека (молекулярной цитогенетики) и клеточной нейробиологии и изучает особенности организации и функционирования генома на супрамолекулярном уровне в клетках ЦНС. Цель этого направления -- интегрировать знания о геноме на клеточном и молекулярном уровнях в норме и при патологии мозга, а также использовать их в контексте клинической, диагностической и терапевтической практики.

Разработанный комплекс молекулярно-цитогенетических методов для выявления особенностей структурной и функциональной организации генома на хромосомном уровне в клетках ЦНС имеет практическую значимость для поиска новых биологических и диагностических маркеров различных форм нейродегенеративных и психических заболеваний.

Выявление геномных и хромосомных нарушений при аутизме, идиопатической умственной отсталости, шизофрении и БА позволит разработать новые подходы к дифференциальной клинико-лабораторной диагностике и медико-генетическому консультированию при этих широко распространенных заболеваниях ЦНС.

Результаты настоящей работы могут быть использованы для разработки новых методов молекулярной терапии с учетом патогенетических процессов, происходящих в клетках головного мозга при аутизме, недифференцированных формах умственной отсталости, шизофрении, БА и АТ.

Основные положения, выдвигаемые на защиту

1. С помощью разработанного комплекса молекулярно-цитогенетических методов (MFISH, QFISH, ICS-MCB, Иммуно-FISH) и оригинального биоинформатического метода исследованы структурно-функциональные особенности организации хромосом и соматические геномные вариации на хромосомном уровне в постмитотических клетках головного мозга человека.

2. Молекулярно-цитогенетический анализ нервных клеток головного мозга и других тканей человека в норме и при различных заболеваний ЦНС, включая аутизм, шизофрению, АТ и БА, свидетельствует о том, что мозаичная анеуплоидия является одним из наиболее значимых биологических маркеров нестабильности генома при нервных и психических болезнях.

3. Эмбриональный мозг человека характеризуется повышенным уровнем мозаичной анеуплоидии, составляющим 30-35%; в ходе внутриутробного и постнатального развития ЦНС происходит редукция числа аномальных клеток до 10-12%, что свидетельствует в пользу существования онтогенетических геномных и хромосомных вариаций в соматических тканях человека.

4. При аутизме наблюдается повышенная частота соматических и межиндивидуальных вариаций генома в виде мозаичных форм хромосомных аномалий (нестабильности) с вовлечением хромосом Х, 9 и 15 и хромосомных вариантов в виде гетероморфизма гетерохроматиновых участков. На основе высокоразрешающего молекулярно-цитогенетического и биоинформатического исследований структурных геномных перестроек определены гены-кандидаты этого заболевания.

5. В клетках коры больших полушарий головного мозга при шизофрении выявлена повышенная частота соматических геномных вариаций, проявляющихся в виде спорадической анеуплоидии и низкопроцентного хромосомного мозаицизма по хромосомам 1, а также хромосом 18 и Х. Обнаружение геномной нестабильности в виде анеуплоидии в мозге согласуется с «онтогенетической» и «нейродегенеративной» гипотезами шизофрении.

6. Полученные данные позволяют выделить диагностические маркеры нарушения психики при аутистических расстройствах и шизофрении, связанные с мозаичными формами хромосомных аномалий и нестабильности, а также специфическими межиндивидуальными вариациями генома.

7. При нейродегенеративных заболеваниях раннего и позднего возраста (АТ и БА, соответственно) наблюдается дифференциальная экспрессия хромосомной нестабильности и мозаичной анеуплоидии в пораженных участках мозга. При АТ наблюдалась глобальная экспрессия анеуплоидии в клетках головного мозга, затрагивающая до 20-50% нейронов коры и мозжечка, а в дегенерирующем мозжечке выявлена локальная нестабильность хромосомы 14 в виде анеуплоидии и разрывов в участке 14q12. При БА выявлено 10-ти-кратное увеличение уровня анеуплоидии по хромосоме 21 в отделах мозга, подверженных нейродегенерации (кора полушарий и мозжечок).

8. Нестабильность генома и хромосом в клетках головного мозга является одним из возможных генетических механизмов таких распространенных нервных и психических заболеваний как аутизм, шизофрения, АТ и БА.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на всемирных конгрессах международного общества психиатрической генетики (ISPG): Монтерей, США (1999), Дублин, Ирландия (2004), Кальяри, Италия (2006); на всемирном конгрессе по синдрому Ретта, Каруизава, Япония (2000); на конференциях Европейской цитогенетической ассоциации (ЕСА): Париж, Франция (2001), Болонья, Италия (2003), Стамбул, Турция (2007), Стокгольм, Швеция (2009); на 14-ой международной хромосомной конференции, Вюрцбург, Германия (2001); на конференции «Обеспечение помощи людям с синдромом Ретта», Лондон, Англия (2002); на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека: Страсбург, Франция (2002), Прага, Чехия (2005), Ницца, Франция (2007), Барселона, Испания (2008), Вена, Австрия (2009); на II, III, IV, V, VI, VII и VIII конгрессах «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва (2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 и 2009, соответственно); на 54-ом ежегодном конгрессе Американского общества генетики человека, Торонто, Канада (2004); на II и III конференциях глобального колледжа нейропротекции и нейрорегенерации: Зерматт, Швейцария (2004), Упсала, Швеция (2006); на III и IV съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС), Москва (2004 и 2009, соотвественно); на 14-ом съезде, посвященному клеткам плода и их ДНК (Fetal Cells and DNA), Йена, Германия (2004); на конференции «Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты», Ростов-на-Дону (2004); на 2-х конгрессах «Национальные дни лабораторной медицины», Москва (2004 и 2008); на съезде Российского общества медицинских генетиков, Уфа (2005); на IX, XI, XII и XVI съездах педиатров России, Москва (2005, 2007, 2008, 2009, соответственно); на Европейской цитогенетической конференции, Мадрид, Испания (2005); на XIV съезде психиатров России, Москва (2005); на 3-ей конференции французской ассоциации медицинской генетики, Монпелье, Франция (2006); на VII и VIII Балканских конференциях генетики человека: Скопье, Македония (2006), Цавтат, Хорватия (2009), соответственно; на конференции «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии», Курск (2006); на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва (2006); на всероссийской конференции-выставке «Высокие медицинские технологии - Медицинский госзаказ», Москва (2006); на ХХ съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова, Москва (2007); на конференции «Актуальные проблемы медицинской генетики», Киев, Украина (2007); на конференциях Немецкого общества генетики, Йена, Германия (2007, 2010); на Европейском съезде участников проектов INTAS, Киев, Украина (2007); на 14-ом Всемирном конгрессе патофизиологии, Санкт-Петербург (2008); на IV съезде медицинских генетиков Украины, Львов (2008); на конгрессах организации генома человека (HUGO), Хайдарабад, Индия (2008), Монпелье, Франция (2010); на конференции «Плод, как часть семьи», Одесса, Украина (2009); на международной конференции «Хромосома 2009», Новосибирск (2009); на всемирной конференции-выставке по молекулярной диагностике, Пекин, Китай (2009); на третьем международном медицинском форуме-выставке «Индустрия Здоровья», Москва (2010); на конференции НЦПЗ РАМН «Биологическая психиатрия -- клинической психиатрии», Москва (2010), на VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону (2010), а также на многочисленных научных семинарах в различных научно-исследовательских учреждениях России, Германии и Франции.

Внедрение. Результаты по разработке молекулярно-цитогенетических методов применяются для диагностики хромосомных аномалий и геномных перестроек в Московском НИИ педиатрии и детской хирургии, Минздравсоцразвития РФ и НУЦ «Нейробиологическая диагностика наследственных психических заболеваний детей и подростков» Московского городского психолого-педагогического университета. Данные, полученные в ходе настоящей работы, используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре генетики биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, на кафедре медицинской генетики Российской академии последипломного образования, на факультете клинической и специальной психологии Московского городского психолого-педагогического университета.

Публикации по теме работы. По теме диссертации опубликовано 132 работы: 1 монография, 50 оригинальных статей и 22 обзорные статьи в рецензируемых отечественных и международных научных журналах (монографиях), а также 60 тезисов в материалах отечественных и зарубежных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 669 ссылок на оригинальные статьи и монографии (40 и 629 работ в отечественной и зарубежной печати, соответственно, а также 16 Интернет-ресурсов). Работа изложена на 355 страницах машинописного текста и содержит 85 иллюстраций и 50 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом цитогенетических исследований явился 1781 образец лимфоцитов периферической крови детей с умственной отсталостью и ВПР, среди которых 160 имели клинический диагноз «аутизм». Помимо этого, были также исследованы образцы лимфоцитов периферической крови 60-ти детей без клинических проявлений психических заболеваний в качестве контроля для изучения низкопроцентного мозаицизма, 93-х родителей детей с умственной отсталостью и ВПР, а также 98-ми матерей детей с аутизмом. Эмбриональные ткани, используемые в настоящей работе, были получены из 715 образцов спонтанных абортусов (срок 5-15 недель) женщин в возрасте от 16 до 47 лет (средний возраст 31 год), 12 образцов медицинских абортусов (срок 7-12 недель), у которых исследовали клетки тканей мозга, кожи и ворсин хориона, а также 6-ти образцов культивируемых in vitro клеток эмбрионального мозга (органотипические культуры). Изучение структурно-функциональной организации хромосом проводились с помощью анализа 18 образцов тканей головного мозга пациентов с шизофренией, 14 образцов тканей головного мозга пациентов с БА, 7 образцов тканей головного мозга пациентов с АТ, а также 36 контрольных образцов головного мозга. Исследовались ткани коры головного мозга (поля Бродманна 4, 5, 10, 17 и 24), хвостатого ядра, мозжечка и гиппокампа. Исследования одобрены этическим комитетом Научного центра психического здоровья РАМН и проводились с учетом международных этических и правовых норм исследований в области генетики, психиатрии, нейробиологии и эмбриологии (Boer, 1994; McGuffin et al., 2004).

В работе использовались цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярно-генетические и биоинформатические методы, а также проводилась статистическая обработка результатов. При анализе метафазных хромосом, полученных из клеток лимфоцитов периферической крови, использовались методы G- и С-окрашивания. Молекулярно-цитогенетические исследования метафазных и интерфазных хромосом проводились с использованием различных модификаций (включая оригинальные) методов FISH, многоцветового окрашивания хромосом (МСВ/ICS-MCB), метафазной СGH, серийной СGH (array СGH), PRINS, PNA и иммуно-FISH. В общей сложности при проведении анализа интерфазных хромосом было исследовано более 12 миллионов клеток. Молекулярно-генетические методы использовались для определения родительского происхождения дополнительной хромосомы у детей с синдромом Дауна, а также для оценки ее влияния на эпигеном с помощью анализа особенностей инактивации хромосомы Х в клетках индивидуумов с трисомией хромосомы 21 и их матерей. Для идентификации генов и ДНК последовательностей, оценки степени «патогенности» геномных перестроек, определения особенностей геномной организации, связанной со структурными вариациями генома, а также определения эффекта вариаций интерфазной организации хромосом в настоящей работе был предложен оригинальный биоинформатический метод, который сочетал в себе сравнительный анализ геномных и эпигенетических баз данных, а также построение интерактомных (взаимодействие белковых молекул) и реактомных (каскад метаболических реакций) цепочек на основе молекулярно-цитогенетических данных относительно структурных и функциональных вариаций хромосомных участков. В настоящей работе применяли стандартные методы статистической обработки для медико-биологических исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-цитогенетический и биоинформатический анализ структурной и функциональной организации хромосом

При проведении настоящего исследования возникла необходимость решения нескольких технических задач, которые были связаны с тем, что современные молекулярно-цитогенетические технологии исследования интерфазных клеток ограничены анализом специфических последовательностей ДНК без возможности изучения всей хромосомы, а также разрешения метафазной СGH, не позволяющей идентифицировать геномные микроперестройки. Для решения этих задач были предложены оригинальные методы хромосомоспецифического многоцветового окрашивания (ICS-MCB), QFISH, многоцветовой иммуно-FISH/ICS-MCB с использованием антител NeuN и высокоразрешающей CGH (HR-CGH). Было показано, что ICS-MCB имеет высокую эффективность при анализе интерфазных клеток, а также является единственным методом, позволяющим визуализацию целых хромосом с разрешением до хромосомного участка в интерфазных ядрах. Эффективность метода QFISH оценивалась посредством измерения гетероморфизма альфоидных или классических сателлитных ДНК в метафазных пластинках и интерфазных ядрах лимфоцитов периферической крови (n=100), ворсин хориона (n=50), эмбриональной кожи (n=12), плаценты (n=5) и нейронов головного мозга (n=30). В результате проведенного исследования было показано, что он может с успехом применяться для корректной интерпретации результатов FISH, открывая уникальную возможность идентификации низкопроцентного хромосомного мозаицизма и соматических геномных вариаций. Используя иммуно-MFISH, представляющую собой иммунотипирование нейронов с помощью антител NeuN и последующей трехцветовой FISH, было показано, что этот метод является в значительной степени эффективным для определения хромосомных аномалий в специфических типах клеток (нейронах), а также изучения функциональной хромосомной организации в интерфазных ядрах клеток головного мозга. Модификация метафазной СGH позволила увеличить разрешение этого метода до 1 млн пн.

Предложен оригинальный метод in silico для анализа геномных локусов, участвующих в хромосомных перестройках и/или демонстрирующих особую организацию в интерфазных ядрах, основанный на изучении экспрессии генов, представленных в геномных и эпигенетических базах данных (NCBI Build 37.1, ENSEMBL, BioGPS, GNF SymAtlas v1.2.4) (Wu et al., 2009). Белки, кодируемые генами, демонстрировавшими повышенную экспрессию в пораженных или исследованных тканях, изучали с помощью интерактомного и реактомного анализа. In silico анализ был с успехом использован для определения генов-кандидатов и «процессов-мишеней» при изучении хромосомных перестроек у детей с аутизмом и умственной отсталостью, исследованных методами HR-CGH или серийной CGH, механизмов образования хромосомных перестроек, а также функциональных последствий особенности организации геномных локусов (хромосомных участков) в интерфазных клетках головного мозга.

Применение методов ICS-MCB, QFISH и Immunno-FISH (Immuno-MFISH), а также их сочетание с ранее известными методиками интерфазной MFISH позволили предложить комплексный молекулярно-цитогенетический подход к определению соматических вариаций генома и хромосомного мозаицизма в ядрах интерфазных клеток с эффективностью 99,5%. Данный комплекс методов, который включал в себя детекцию хромосомного мозаицизма в отличие от ранее описанных аналогов, был апробирован и интегрирован в схему диагностики хромосомных аномалий и микроперестроек. Показано, что предлагаемый алгоритм диагностики хромосомных аномалий и вариантов, включающий методы сканирования генома (цитогенетический анализ, HR-CGH и серийную CGH), исследование хромосом на клеточном уровне (MFISH, ICS-MCB, QFISH) и биоинформатический анализ, может с успехом использоваться в медико-генетической диагностической практике.

Молекулярно-цитогенетические исследования соматических геномных вариаций в эмбриональных тканях

Анализ с помощью методов МFISH/QFISH, PRINS и ICS-MCB (рис.1) более 420000 клеток эмбрионального мозга и 85000 клеток ворсин хориона (по ~5000 ядер при анализе каждого образца эмбрионального мозга и по ~1000 ядер -- каждого образца ворсин хориона), суммированный в таблице 1, показал, что общее число анеуплоидных клеток в эмбриональном мозге составляет 30%.

Таблица 1. Сравнение частот спорадической анеуплоидии в клетках мозга и ворсин хориона.

В эмбриональном мозге средний количественный индекс нестабильности хромосом (числовой показатель /процент/ нестабильности в расчете на каждую пару гомологов) был определен как 1,25, а в тканях хориона и эмбриональной кожи -- 0,98 и 0,82 (частота анеуплоидии -- 24% и 19%, соответственно). На основе анализа около 600000 клеток было показано, что эмбриональный мозг человека демонстрирует характерные соматические вариации генома в виде повышенного уровня стохастической анеуплоидии.

В четырех образцах эмбрионального мозга был обнаружен низкопроцентный хромосомный мозаицизм, который не наблюдался в ворсинах хориона, и был представлен случаями (i) дополнительной хромосомы X (2,8% -- эмбриональный мозг, 1,2% -- ворсины хориона; p=0,004) и хромосомы Y (5,9% -- эмбриональный мозг, 1,8% -- ворсины хориона; p <0,001), (ii) моносомии хромосомы X (5,4% -- эмбриональный мозг, 1,1% -- ворсины хориона; p<0,001), (iii) моносомии хромосомы 15 (6,2% -- эмбриональный мозг, 1,2% -- ворсины хориона; p <0,001) и (iv) моносомии хромосомы 18 (6,5% -- эмбриональный мозг, 3,2% -- ворсины хориона; p <0,001).

Рис.1. Анализ клеток эмбрионального мозга. (А-В) Интерфазная MFISH с центромерными пробами: (А) два ядра с дополнительными хромосомами Y и хромосомой Х (пол плода мужской) и диплоидное ядро; (Б) ядро с моносомией хромосомы 15 и диплоидное ядро; (В) ядро с моносомией хромосомы 18 и диплоидное ядро; (Г-Е) ICS-MCB с пробами на хромосомы 9, 16 и 18, соответственно; слева направо примеры моносомии, дисомии и трисомии, соответственно, и идеограммы, показывающие схему мечения проб; (Ж) QFISH: (1) ядро с 2-мя сигналами на хромосому 18 и (2) ядро с ассоциированными сигналами на хромосому 18 (интенсивность соответствует 2-м сигналам); (3) ядро с 2-мя сигналами на хромосому 15 и (4) моносомия хромосомы 15 (интенсивность соответствует одному сигналу).

Отклонения частоты анеуплоидии были обнаружены исключительно в эмбриональном мозге методами MFISH/QFISH, PRINS, PNA и ICS-MCB и не выявлялись в клетках хориона и эмбриональной кожи этих плодов. Принимая во внимание наличие мозаичной хромосомоспецифичной анеуплоидии исключительно в тканях эмбрионального мозга, общее число анеуплоидных клеток должно составлять примерно 35%. В результате был сделан вывод о том, что эмбриональный мозг человека является, по-видимому, единственной неэкстраэмбриональной тканью, в которой выявлен тканеспецифический низкопроцентный хромосомный мозаицизм.

Поскольку идентификация возможных механизмов возникновения геномной (хромосомной) нестабильности в виде мозаичной анеуплоидии может быть проведена с помощью изучения органиотипических культур клеток эмбрионального мозга (Suzuki et al., 2004), были дополнительно исследованы 6 образцов эмбрионального продолговатого мозга и 6 образцов органотипической культуры эмбрионального мозга. Было обнаружено, что частота мозаичной анеуплоидии увеличивается в 2-5 раз после органотипического культивирования без изменения соотношения пропорций моносомных и трисомных клеток. Это согласуется с представлениями о том, что митотическое нерасхождение хромосом, связанное с меротелической ориентацией кинетохор лежит в основе образования геномной (хромосомной) нестабильности и анеуплоидизации в эмбриональном мозге человека (Ворсанова и др., 2006; Salmon et al., 2005).

Таким образом, мозг человека на ранних стадиях онтогенеза представляет собой эмбриональную ткань, в которой выявляются повышенный уровень спонтанных хромосомных мутаций и тканеспецифический хромосомный мозаицизм. Этот тип соматических вариаций генома можно рассматривать в качестве вероятной причины изменений в ходе внутриутробного развития плода, в целом, и эмбрионального мозга, в частности. По-видимому, он также может приводить к спонтанным абортам или заболеваниям головного мозга после рождения. Следовательно, чтобы оценить его эффект на внутриутробное развитие человека, необходимы исследования вариаций генома в материалах спонтанных абортусов.

Исследование методом MFISH с использованием материала 715 спонтанных абортусов позволило обнаружить хромосомные аномалии в 360 образцах (50,3%), из которых 184 образца (51,1% из всех аномалий и 25,7% из общего числа исследованных образцов) демонстрировали хромосомный мозаицизм. Частота хромосомного мозаицизма в материалах спонтанных абортусов, которая составляет примерно 25%, определена впервые. Более детальному исследованию подверглись 50 образцов без хромосомных аномалий (частота анеуплоидных клеток менее 5%) и 50 образцов с анеуплоидией аутосом и гоносом. Нестабильность была обнаружена во всех образцах и в среднем наблюдалась в 21% клеток (пересчет на весь хромосомный набор); ее индекс составил 1,67. Таким образом, показано, что спонтанные аборты имеют повышенный спорадический уровень хромосомной нестабильности. Следовательно, низкопроцентная мозаичная анеуплоидия, по-видимому, не является причиной спонтанных абортов и, таким образом, при условии пролиферации анеуплоидных клеток может быть связана с нарушениями функционирования головного мозга после рождения.

Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования детей с умственной отсталостью и/или ВПР

Цитогенетический анализ детей с умственной отсталостью и/или ВПР в сочетании с применением молекулярно-цитогенетических методов позволил выявить хромосомные аномалии в 212 случаях (13,1%) из 1781. Использование методов молекулярно-цитогенетической диагностики (MFISH, MCB или CGH) было признано необходимым для уточнения уровня мозаицизма и CIN, а также подтверждения/определения структурных перестроек и происхождения маркерных хромосом в 74% случаев (157 из 212) хромосомной патологии (9,7% среди всех исследованных детей). Хромосомный мозаицизм, представленный, в основном, случаями анеуплоидии был обнаружен в 61 случае (28,8% среди случаев хромосомной патологии) и составлял 3,8% среди всех исследованных детей. Среди детей с численными хромосомными аномалиями частота мозаичных случаев составила 54% (54 из 100). Мозаичные структурные аномалии наблюдались в двух случаях перестроек аутосом, во всех случаях изохромосом и двух случаях кольцевых хромосом. Среди детей с маркерными хромосомами мозаицизм был выявлен в 39% (9 из 23) случаев. Хромосомная нестабильность наблюдалась в 32 случаях (15,1% среди случаев хромосомной патологии; 1,9% среди всех исследованных детей), в одном из которых выявлено сочетание мозаицизма и CIN. В совокупности, частота мозаицизма и CIN составила 43,4% среди случаев хромосомных аномалий, а среди всех исследованных детей -- 5,7%.

При дополнительном молекулярно-генетическом исследовании регулярных форм анеуплоидии (синдром Дауна) было обнаружено, что вклад соматических вариаций генома в этиологию этих заболеваний значительно ниже. Это можно объяснить тем, что соответствующая клиническая картина наблюдается только в случаях, при которых большинство клеток имеют аномальный кариотип.

Суммируя полученные данные, сделано заключение о том, что мозаичные хромосомные аномалии, включая хромосомную нестабильность, имеют высокую частоту среди детей с умственной отсталостью и/или ВПР. Более того, гипотеза о том, что аномальные клетки, которые образуются за счет митотической нестабильности во время внутриутробного развития, в определенном числе случаев не подвергаются элиминации, и приводят к нарушениям жизнедеятельности организма, в целом, и головного мозга, в частности, а также, по-видимому, она верна по отношению к не менее чем 5% случаев умственной отсталости. Таким образом, молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомного мозаицизма и нестабильности является необходимой при медико-генетическом консультировании случаев умственной отсталости.

Проведены исследования с использованием методов высокоразрешающего сканирования генома (HR-CGH и серийной CGH). Метод HR-CGH позволил обнаружить несбалансированные структурные хромосомные перестройки (делеции, дупликации и анеуплоидию хромосомы Х) в 46 случаях (46%) из 100 (рис.2).

Рис.2. Примеры результатов анализа методом HR-CGH: (А) ish cgh del(1)(p36.2p33); (Б) ish cgh del(1)(p36.21p36.13); (В) ish cgh del(1)(p36.3p36.1); (Г) ish cgh del(2)(q37.3qter), del(22)(q13.33qter);

Делеции были обнаружены в 29 случаях (63%), дупликации -- в 7 случаях (15%), сочетанные делеции/дупликации -- в 7 случаях (15%). Субтеломерные перестройки (делеции и делеции/дупликации) были выявлены в 19 случаев (41%). Размер структурных перестроек варьировал в пределах от 2-2,5 до 40 млн. пн. Примечательно, что HR-CGH позволила также выявить и микроперестройки, связанные с так называемыми «новыми микроделеционными синдромами» (2 случая -- делеции 19q13.11, по одному случаю-- делеции 2q23.1, 15q13, 15q24, 16p11.2-p12.2 и 17q21.31). Особо следует отметить микроделецию, обнаруженную у ребенка с синдромом Аспергера, поскольку ранее при этом заболевании геномных перестроек не описано. Учитывая, что подобные формы хромосомной патологии выявляются практически только с помощью серийной CGH (Stankiewicz, Lupski, 2010), можно сделать заключение о том, что предлагаемый протокол HR-CGH является эффективным для диагностики субмикроскопических геномных микроперестроек (эффективность более 40%) и может быть использован для поиска генетических причин нервно-психических заболеваний. эмбриональный аутизм нервный геномный

В ряде случаев (n=14) было проведено исследование с использованием серийной CGH (рис.3). Показано что, эта технология является эффективной для диагностики регулярных хромосомных аномалий и описания вариаций генома, связанных с нервно-психическими заболеваниями. Более того, в ряде случаев (например, синдром Паллистера-Киллиана) она может быть использована для идентификации мозаицизма. Выявление субмикроскопических микроперерстоек ставит вопрос об интерпретации их патогенетического значения, как в диагностических целях, так и для определения патологических процессов, связанных с нервно-психическими заболеваниями и геномными вариациями.

Рис.3. Примеры исследования хромосомных перестроек с помощью серийной CGH. (А) Кольцевая хромосома 11: делеция 11q24.1->11qter от 121411392-ого нуклеотида хромосомы 11 до терминального (теломерного) участка (~13,5 млн. пн); (Б) Делеция 1p36.32->1р36.22, составляющая примерно 4,44 млн. пн нуклеотидов, от 4932799-ого до 9373344-ого нуклеотида хромосомы 1, и увеличение на 20-30% количества ДНК всего короткого плеча хромосомы 12 (примерно 33,5 млн. пн).

Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования детей с аутизмом и их матерей

Исследовано 160 детей с недифференцированным аутизмом. В 116 образцах лимфоцитов периферической крови детей с аутизмом была исследована мозаичная анеуплоидия (контроль: образцы 60 детей без нарушения психики), в 109 -- хромосомный гетероморфизм и аномалии (некоторые случаи исследовались дополнительно методами MFISH и HR-CGH), а также был проведен анализ 98-ми пар «ребенок-мать» для выявления возможных ассоциаций хромосомных аномалий, гетероморфизма или нестабильности с нервно-психическими нарушениями. Были обнаружены следующие хромосомные аномалии: 46,XY,t(1;6)(q42.1;q27); 46,XY,inv(2)(p11q13); 46,XY,der(6),ins(6;1)(q21;p13.3p22.1)pat; 46,XY,r(22)(p11q13) и mos47,XXX[98]/46,XX[2]. Таким образом, частота хромосомных аномалий, выявленная с помощью цитогенетического анализа, составила 5,5%. Изменения размеров гетерохроматиновых районов хромосом в виде экстремального увеличения/уменьшения (по данным QFISH), а также инверсии были выявлены у 52 детей с аутизмом (47,7%), среди которых 1phqh -- у 7% детей; 9phqh -- у 8%; 9qh+ -- у 3%; 9qh- -- у 1%; 16qh+ -- у 1%; 16qh- -- у 3%; другие хромосомные варианты у 5,7%. Сочетанные варианты наблюдались в 19% случаев. В контрольной группе хромосомные варианты наблюдались в 5,3% случаев и их частота достоверно отличалась от обнаруженной среди детей с аутизмом (Р<0,05). Исходя из полученных данных по изучению детей, можно говорить о том, что вариации околоцентромерных гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9 и 16 наблюдаются достоверно чаще при аутистических расстройствах по сравнению с контрольной группой и, следовательно, являются характерными для аутизма. При анализе косегрегации цитогенетических маркеров и нервно-психических нарушений в семьях детей с аутизмом было показано, что в 56% случаев мозаичные хромосомные аномалии и нестабильность наследовались от матерей. Косегрегация хромосомного гетероморфизма и нарушения психики была обнаружена в 70% случаев. Обнаружено увеличение частоты когнитивных нарушений и спонтанных абортов у матерей детей с аутизмом, имеющих хромосомные аномалии, а также повышенная частота умственной отсталости, смерти в раннем возрасте и нарушений репродуктивной функции в родословных этих женщин. Суммируя полученные данные, можно сделать заключение о том, что определение геномных изменений у больных детей и их матерей значимо для идентификации генетических и нейробиологических маркеров аутистических расстройств.

Молекулярно-цитогенетические исследования 120 детей с идиопатическим аутизмом и в контрольной группе из 60 детей с помощью анализа более 420000 клеток методом MFISH (рис.4) позволили обнаружить у 19 детей с аутизмом повышенную частоту анеуплоидии аутосом (8 случаев -- трисомия хромосом 9, 15 и моносомия хромосом 15, 16 и 18) и хромосомы Х (11 случаев дополнительной хромосомы Х) среди 116 мальчиков с идиопатическим аутизмом (16,4%). Дополнительная хромосома 9 представляла собой der(9)(pter->9q32:), а низкопроцентная трисомия хромосомы 15 представляла собой наличие дополнительной хромосомы der(15) (рис.4). Случаи мозаицизма XXY/XY, выявленные у 10% детей, были связаны с дополнительной хромосомой Х без структурных перестроек.

Мозаичная анеуплоидия у детей с аутизмом описывается впервые. Ее частота составляет 16% (19 из 116), позволяя рассматривать этот тип соматических геномных вариаций в качестве самой распространенной генетической аномалии при данном гетерогенном генетическом заболевании.

Рис.4. MFISH с центромерными ДНК пробами на клетках лимфоцитов детей с аутизмом. (А) Трисомия хромосомы 15 в интерфазном ядре (три сигнала); (Б) мозаичная моносомия хромосомы 18; (В) и (Г) дисомия хромосомы Х при мужском кариотипе; (Е) метафазная пластинка с дополнительной дериватной хромосомой 15.

Анализ функциональных последствий, причин возникновения и интерпретации хромосомных аномалий

В работе предложено оценить эффект анеуплоидии на транскрипционную активность хромосомы Х с помощью исследования особенностей Х-инактивации в клетках девочек с дополнительной хромосомой 21 (синдром Дауна) и их матерей. В случаях структурных геномных перестроек было предложено использовать оригинальный биоинформатический метод с последующим интерактомным и реактомным анализом. В ряде случаев CIN и мозаицизма также были проведены дополнительные исследования. Впоследствии, было обнаружено, что данный подход к оценке последствий структурных перестроек может быть с успехом использован для картирования генов-кандидатов и идентификации «процессов-мишеней», связанных с патогенезом заболеваний аутистического спектра. Биоинформатический анализ также был использован для изучения участков генома, фланкирующих точки разрыва структурных перестроек. В результате этого исследования были предложены возможные механизмы возникновения структурных хромосомных аномалий и геномных перестроек.

Сравнение данных об особенностях инактивации хромосомы Х в исследованных группах показали, что частота неравной Х-инактивации статистически достоверно увеличена среди детей с трисомией хромосомы 21 (Р<0,001). В группе матерей повышенная частота случаев неравной инактивации хромосомы Х не обнаружена (Р>0,05). Таким образом, наличие анеуплоидии может проявлять эффект не только на транскрипцию генов хромосомы, вовлеченной в численную хромосомную аномалию, но также и влиять на процесс транскрипционной регуляции генов хромосомы Х.

Случаи, отобранные для дополнительных исследований, были связаны с анеуплоидизацией аутосом и хромосомы Х, и демонстрировали средние уровни хромосомной нестабильности, сравнимые с эмбриональными тканями. Следовательно, можно с высокой долей вероятности предположить, что нарушения функционирования головного мозга в исследованных случаях являются результатом соматических вариаций генома, проявляющихся в виде анеуплоидии. Однако, проблемы, возникающие при выявлении данных форм хромосомных аномалий, связаны не только с необходимостью корректной интерпретации данных, но также и со сложностями идентификации «доверительных интервалов» (количества аномальных клеток) для того, чтобы было возможно выявлять «истинный» хромосомный мозаицизм в отдельно взятой популяции клеток. В настоящей работе было исследовано около 5 млн. клеток девятью сериями с использованием разных систем оценки мозаицизма: подсчет 100, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000 и 10000 клеток. Суммируя данные по идентификации хромосомного мозаицизма, было обнаружено, что оптимальное количество клеток для соответствующего анализа составляет от 3000 до 5000. При анализе большего числа клеток отклонений уровней мозаицизма практически не наблюдается. Распределение результатов по каждой методике позволило предложить соответствующие рекомендации (табл.2).