Структурно-функциональная организация хромосом при нервно-психических заболеваниях

Таблица 2. Рекомендации для определения СГВ, хромосомного мозаицизма и CIN с помощью МЦГ методов, основанные на полученных данных (анализ ~5 млн. клеток).

Примечание: * -- эффективость соответствует проценту аномальных клеток, выявляемых с помощью соответствующих методов и системы оценки мозаицизма.

С помощью оригинального биоинформатического метода было проведено исследование случаев структурных геномных перестроек, обнаруженных с помощью методов HR-CGH и серийной CGH. Было показано, что предложенный биоинформатический метод может быть с успехом использован для интерпретации результатов высокоразрешающего сканирования генома методами HR-CGH и серийной CGH. Он также эффективен для оценки эффекта CNVs на фенотипические проявления при умственной отсталости и ВПР. Более того, этот алгоритм может быть с успехом использован для поиска генов-кандидатов различных нервно-психических заболеваний. В связи с этим, было рекомендовано провести соответствующий анализ для детей с аутизмом, у которых были обнаружены геномные перестройки. Использование метода in silico позволило определить несколько генов-кандидатов у детей с аутизмом, для которых был также проведен интерактомный и реактомный анализ геномных/протеомных сетей: SCARB2, TPPP, PDCD6, NPTX1, STCH, NRIP1, CXADR, SEPT5, GP1BB и PI4KA при аутизме и CCK -- при синдроме Аспергера. Геномные перестройки при аутистических расстройствах приводят к потере генов, интерактомный/реактомный анализ которых указывает на изменения в таких процессах, как регуляция клеточного цикла (митоза и сегрегации хромосом) и запрограммированная клеточная гибель. В аспекте данных о высокой частоте хромосомного мозаицизма среди детей с аутизмом и в тканях эмбрионального мозга этот факт позволяет сделать вывод о том, что существует связь между этими феноменами. In silico анализ делеций и дупликаций также показал, что взаимодействие генных кластеров гомологичных и негомологичных хромосом может рассматриваться в качестве наиболее вероятного процесса, за счет которого образуются структурные геномные перестройки.

Молекулярно-цитогенетические исследования клеток головного мозга в норме

Методами MFISH, QFISH, ICS-MCB и иммуно-FISH были проанализированы 12 образцов коры головного мозга (поле Бродманна 10) индивидуумов в возрасте от 24 до 60 лет. В ходе исследования 288000 клеток постмортального головного мозга нормальных индивидуумов было обнаружено, что число анеуплоидных клеток в случае аутосом варьирует в пределах 0,2-0,6%, а хромосомы Х -- 2% (табл.3).

Таблица 3. Частота анеуплоидных клеток (средняя) в образцах постмортального мозга по данным MFISH/QFISH и ICS-MCB с ДНК пробами на хромосомы 1, 9, 16, 18 и Х.

Для анализа анеуплоидии в определенных типах клеток головного мозга в норме была использована иммуно-FISH. В результате исследования примерно 10000 ядер было показано, что частота анеуплоидии не демонстрирует статистически достоверного различия между популяциями нейронов и глиальных клеток (Р=0,03), даже несмотря на то, что последних в 10-100 раз больше. Суммируя данные относительно соматических геномных вариаций в клетках голоного мозга человека в норме, можно заключить, что, несмотря на трехкратное снижение частоты анеуплоидных клеток в ходе онтогенеза, их число, тем не менее, является значительным, составляя примерно 10%.

Молекулярно-цитогенетические исследования клеток головного мозга при шизофрении

Сочетание методов MFISH/QFISH и ICS-MCB с ДНК пробами на хромосомы 1, 9, 15-18, Х и Y (рис.5) позволило исследовать примерно 1 млн. клеток головного мозга больных шизофренией (n=18) и контрольных образцов (n=18). Средняя частота моносомии и трисомии хромосомы 1 составила 0,6% (0,3-0,9%; M+3SD=3,5%) и 0,5% (0,2-0,8%; M+3SD=2,7%), соответственно. В случаях мозаицизма моносомия наблюдалась в 3,6%, трисомия -- в 4,7%. Анализ контрольных образцов (n=18) показал, что частота анеуплоидии хромосомы 1 составляет 0,6% (0,3% -- моносомия/0,2-0,4%; 0,3% -- трисомия/0,2-0,4%) (рис.5), M+3SD -- 0,7%. Случаев низкопроцентного мозаицизма при данном исследовании обнаружено не было. Средний уровень анеуплоидии хромосомы 1 в образцах головного мозга при шизофрении был оценен как 1,8% (0,9% -- моносомия/0,3-1,5%; 0,9% -- трисомия/0,2-1,7%). При определении среднего уровня анеуплоидии хромосомы 1 без учета двух случаев низкопроцентного мозаицизма он составил 1,1% (0,6% -- моносомия/0,3-0,9%; 0,5% -- трисомия/0,2-0,9%), M+3SD -- 0,7% и статистически достоверно отличался от контроля (Р=0,005 и Р=0,001 для моносомии и трисомии, соответственно).

Рис.5. Анализ анеуплоидии клеток головного мозга больных шизофренией. Интерфазная MFISH/QFISH с центромерными ДНК пробами: (А) ядро с моносомией хромосомы 1 (один сигнал; относительная интенсивность 3910) и с дисомией хромосомы Х; (Б) ядро с дисомией хромосомы 1 (два сигнала; относительная интенсивность 3840 и 2450) и дисомией хромосомы Х; (В) ядро с дисомией хромосомы 1 (один сигнал; относительная интенсивность 6290) и с дисомией хромосомы Х. ICS-MCB при применении ДНК пробы на хромосому 1: (Г) моносомия и (Д) трисомия.

При анализе других хромосом было обнаружено три дополнительных случая низкопроцентного мозаицизма в клетках головного мозга при шизофрении. В одном была обнаружена моносомия хромосомы 18 в 3,2% клеток. Исследование контрольных образцов подобную аномалию выявило в 0,3% клеток. Увеличение уровней нестабильности в виде стохастической анеуплоидии хромосомы 18 в клетках головного мозга больных шизофренией также обнаружено не было: 0,4% -- контрольные образцы (0,3% моносомия и 0,1% трисомия), 0,5% -- образцы индивидуумов с шизофренией (0,3 моносомия и 0,2% трисомия) M+3SD для шизофрении и контроля -- 0,6% (Р<0,05). Два других случая низкопроцентного мозаицизма представляли собой сочетанные аномалии: трисомия хромосомы 18 и трисомия хромосомы Х. В одном образце трисомия хромосомы Х была выявлена в 4% клеток (Р<0,001), а трисомия хромосмоы 18 -- в 2,5% клеток (Р<0,001). Во втором -- трисомия хромосомы Х обнаружена в 3% клеток (Р<0,001), а трисомия хромосомы 18 -- в 0,5% клеток (Р<0,05). Анализ других аутосом (хромосомы 9, 15, 16, 17) и хромосомы Y также не выявил повышенного уровня хромосомной нестабильности в виде стохастической анеуплоидии, который варьировал в пределах 0,2%-0,6% в контроле и 0,3%-0,7% -- при шизофрении (Р<0,05 во всех случаях). Увеличение уровня нестабильности в виде стохастической анеуплоидии хромосомы Х (моносомии и трисомии) было также не обнаружено: 1,2%-1,7% в контроле и 1,5%-1,9% -- при шизофрении (Р<0,05 во всех случаях). В результате проведенного исследования 18 образцов головного мозга индивидуумов, страдающих шизофренией, и 18 контрольных образцов было показано, что при этом заболевании повышен уровень CIN, проявляющейся в виде мозаичной анеуплоидии хромосомы 1. Помимо этого, было показано, что 5 из 18 (около 30%) случаев шизофрении ассоциированы с низкопроцентной мозаичной анеуплоидией: трисомией хромосомы 1, моносомией хромосомы 1, моносомией хромосомы 18 и сочетанной трисомией хромосом 18 и Х, обнаруженной в двух случаях. Учитывая полученные данные, можно сделать обоснованный вывод о том, что определенное число случаев шизофрении могут быть связаны с хромосомным мозаицизмом в клетках головного мозга. Повышенный уровень хромосомной нестабильности, вероятно, отражает результат нарушений ЦНС в ходе развития, которые описаны при шизофрении (Jarskog et al., 2005). Согласно литературным данным, гены хромосомы 1 участвуют в различных молекулярных и клеточных процессах, которые нарушены в клетках головного мозга при данном заболевании (Camargo et al., 2007). Следовательно, увеличение уровня хромосомной нестабильности и низкопроцентная мозаичная анеуплоидия в тканях ЦНС при шизофрении может рассматриваться, как вероятный элемент механизма возникновения этого гетерогенного заболевания.

Молекулярно-цитогенетические исследования клеток головного мозга при болезни Альцгеймера

Используя интерфазную МFISH/QFISH и ICS-MCB, было показано, что в клетках коры головного мозга при БА наблюдается повышенный уровень мозаичной анеуплоидии с вовлечением разных хромосом (рис.6). Анализ был проведен на более 250000 клеток контрольных образцов, и более 250000 клеток образцов тканей головного мозга индивидуумов с БА. Было обнаружено, что средняя частота анеуплоидии (моносомии и трисомии) значительно варьирует в зависимости как от исследуемой пары гомологичных хромосом, так и на межиндивидуальном уровне.

При исследовании хромосом 1, 7, 14 и X методом ICS-MCB средний процент анеуплоидии при БА был 1,4-2,6%. Различие между частотами анеуплоидии в клетках головного мозга при БА и в контроле были незначительными (Р>0,05). Процент анеуплоидии с вовлечением хромосомы 21 был в 6-15% клеток мозга при БА и 0,8-1,8% -- в контроле. Среднее значение анеуплоидии с вовлечением хромосомы 21 в мозге при БА было определено как 10,7% (6,5-14,7%) и 1,7% (1,4-2,7%) -- в контроле. Различие между образцами БА и в контроле было статистически значимым (Р<0,001).

Анализ проводился также методом immunno-FISH с целью определения анеуплоидии в NeuN-позитивных (нейроны) и NeuN-негативных («ненейрональные» клетки) клетках головного мозга контроля и БА. Различие между уровнем анеуплоидии в NeuN-позитивных и NeuN-негативных клетках, а также в норме и при БА было статистически недостоверным (Р>0,05). В связи с этим было сделано заключение о том, что все типы клеток в равной степени подвержены процессу анеуплоидизации.

Рис.6. МЦГ исследование клеток головного мозга при БА. (А) Моносомия хромосомы 18, обнаруженная MFISH/QFISH; (Б) Моносомия хромосомы 14, определенная с помощью метода ICS-MCB; (В) Моносомия хромосомы 21, определенная с помощью метода ICS-MCB; (Г) Трисомия хромосомы 21, определенная с помощью метода ICS-MCB.

Поскольку при БА нейродегенерация поражает преимущественно кору и гиппокамп (Dillen K., Annaert, 2006; Swerdlow, 2007), был проведен сравнительный анализ вариаций хромосомного набора в клетках соответствующих областей головного мозга: кора (поле Бродманна 10), гиппокамп и мозжечок пяти индивидуумов с БА (всего 15 образцов). Исследование клеток, полученных из образцов мозжечка пациентов с БА и контрольной группы, показало, что анеуплоидия варьирует в пределах 0,7-3,7% (БА) и 0,3-1,7% (контроль). При сравнение было показано, что при БА наблюдается повышенный уровень CIN в виде мозаичной анеуплоидии (Р<0,05). Однако в мозжечке при БА не была обнаружена мозаичная анеуплоидия хромосомы 21. Анализ клеток гиппокампа показал, что в этой области головного мозга наблюдается наиболее высокий уровень нестабильности как по сравнению с мозжечком, так и корой. Был также обнаружен (как и в коре) высокий уровень анеуплоидии хромосомы 21 в гиппокампе, который варьировал в пределах от 15,3% до 29,1%. Исключив анеуплоидию хромосомы 21, анеуплоидия с участием других хромосом составила 3,1-10,2%, в контрольной группе -- 0,7-2,3%. Примечательно, что один из образцов демонстрировал повышенный уровень анеуплоидии хромосомы Х -- примерно 10% (моносомия; пол пациента женский) в коре и гиппокампе, но не в клетках мозжечка.

В заключение, необходимо отметить, что в работе впервые представлены данные о том, что мозаичная анеуплоидия хромосомы 21 в клетках гипокампа и коры головного мозга связана с нейродегенерацией при БА. Это меняет современные представления о патогенезе этого заболевания, демонстрируя, что соматическая геномная/хромосомная нестабильность, которая преимущественно ассоциирована с малигнизацией, может быть причиной нарушения функционирования головного мозга. Однако, для подтверждения связи между CIN и нейродегенерацией необходимы дополнительные исследования клеток головного мозга при других заболеваниях, ассоциированных с дегенерацией нервных клеток. Наиболее адекватной моделью нейродегенерации специфических областей головного мозга является АТ, которая также является синдромом CIN (McKinnon, 2004; Yang, Herrup, 2005; Ziv et al., 2005; Lavin, 2008). Следовательно, изучение областей головного мозга, в которых наблюдается дегенерация нервных клеток, при АТ необходимо для дополнительных доказательств связи CIN с нейродегенерацией.

Молекулярно-цитогенетические исследования клеток головного мозга при атаксии-телеангиэктазии (синдром Луи-Бар)

В работе впервые проведен анализ CIN и селективной гибели нервных клеток в пораженном нейродегенерацией мозжечке. Для этого была определена частота анеуплоидии и хромосомных разрывов в клетках коры и мозжечка постмортальных образцов головного мозга в норме и при АТ МЦГ методами, а именно, интерфазной MFISH и ICS-MCB. При синдроме АТ молекулярно-цитогенетическое исследование показало уровень анеуплоидии в пределах от 1,3 до 5,6% для аутосом и хромосомы Y. Анеуплоидия хромосомы Х была обнаружена в 1,6-3,7% клеток. Таким образом, общее число анеуплоидных клеток, обнаруженное в образцах мозжечка индивидуумов с АТ, составило 5908 из 35000 (16,9%), а в контроле -- 1176 из 35000 (3,4%). Сравнение уровня анеуплоидии при АТ и в контроле показало, что они достоверно отличаются (р<0,0001). Следует отметить, что в случае аутосом в 2-3 раза чаще наблюдалась моносомия по сравнению с трисомией. Полиплоидия и полисомия была обнаружена в очень небольшом числе клеток (21 клетка из 35000) при АТ и практически не наблюдалась в контроле (8 клеток из 35000). Анализ образцов мозжечка у индивидуумов с АТ и в контрольной группе с использованием ICS-MCB подтвердил данные MFISH/QFISH по количеству анеуплоидных клеток в контрольной группе. Однако, в тканях мозжечка, помимо анеуплоидии, были обнаружены также клетки с перестроенными хромосомами 7, 14, Х. Аномалии хромосом 7 и Х в 0,8-7,3% клеток были представлены, в основном, разрывами в участках локализации афидиколиновых ломких сайтов FRA7C, FRAXB и FRAXC, подтверждая наблюдения о том, что мутации гена ATM приводят к нестабильности частых сайтов ломкости хромосом (Ozeri-Galai et al., 2008). Наиболее распространенной формой хромосомных перестроек в клетках мозжечка пациентов с АТ являлась дериватная (во многих клетках дополнительная) хромосома 14. ICS-MCB анализ показал, что ее структура соответствует der(14)del(14)(q12). В большинстве клеток перестроенная хромосома присутствовала вместо одной нормальной хромосомы 14 или являлась дополнительной при диплоидном наборе хромосом. Тем не менее, в небольшом числе клеток выявлялись 2-6 дополнительные перестроенные хромосомы 14. Частота клеток с перестроенными хромосомами 14 составляла от 1,2 до 47%. С использованием оригинального биоинформатического метода для анализа хромосомного участка 14q12 и определения экспрессии генов, расположенных в нем, удалось картировать наиболее вероятные точки хромосомных разрывов, которые соответствовали локусами генов NOVA1 и FOXG1B (рис.7). Сравнение частоты анеуплоидии и хромосомных перестроек (разрывов), выявленных с помощью ICS-MCB показало, что в клетках мозжечка при АТ наблюдается в значительной степени повышенный уровень нестабильности хромосом. Следовательно, можно заключить, что при этом заболевании селективная дегенерация мозжечка связана с нестабильностью генома в виде анеуплоидии и хромосомных перестроек (разрывов).

Рис.7. Анализ разрывов хромосомы 14 в клетках мозжечка при АТ. (А) Методом ICS-MCB показано наличие четырех дополнительных перестроенных хромосом 14 -- der(14)del(14)(q12); (А1) Схематическое изображение перестройки (идеограмма) показано на А; (Б) Методом ICS-MCB показано наличие клетки с потерей хромосомы 14 и der(14), а также клетки, в которой при потери хромосомы 14 наблюдается пять перестроенных хромосом 14; (Б1) Схематическое изображение перестройки (идеограмма) показано на Б; (В) Картирование точек разрыва в участке 14q12 с помощью ICS-MCB и биоинформатического метода, демонстрирующее, что наиболее вероятными геномными локусами разрывов являются гены NOVA1 и FOXG1B; (Г1-Г3) Частота клеток с различным количеством перестроенных хромосом 14 в трех образцах.

Образцы мозжечка при АТ были также исследованы с помощью метода иммуно-FISH с целью определения типа клеток, наиболее подверженных CIN и анеуплоидизации. Использование трехцветовой FISH в сочетании с иммунотипированием нейронов при помощи антител NeuN показало, что анеуплоидия преимущественно наблюдается в NeuN-негативных клетках (20% -- NeuN-позитивные клетки, 80% -- NeuN-негативные) (рис.8). Следовательно, можно предположить, что CIN при АТ преимущественно наблюдается в «ненейрональных» клетках в отличие от шизофрении и БА. Данное наблюдение также отчасти объясняет увеличение уровней нестабильности генома в зависимости от возраста пациентов.

В настоящее время имеются данные молекулярно-биологических и биохимических исследований, которые могут объяснить наличие повышенного уровня анеуплоидии в клетках мозжечка больных с АТ. С одной стороны показано, что в ходе пренатального развития наблюдается повышенная экспрессия гена АТМ. Предполагается, что это связано с его значением в поддержании стабильности генома в ходе нейрогенеза (Allen et al., 2001; McKinnon, 2004).

Рис.8. Многоцетовая иммуно-FISH (NeuN+FISH) на клетках мозжечка при АТ. (А) трехцветовая MFISH (хромосома 1 -- голубые сигналы, хромосома 18 -- розовые сигналы, хромосома Х -- красные сигналы), окрашивание ядер DAPI и иммуногистохимической реакцией с антителом NeuN; в NeuN-негативном ядре -- моносомия хромосомы 1; (Б) Частота NeuN-позитивных (~20%) и NeuN-негативных (~80%) ядер в мозжечке пациентов с АТ.

Более того, показано, что наиболее высокая активность этого гена в ходе внутриутробного развития наблюдается непосредственно в клетках мозжечка (Oka, Tashima, 1998). С другой стороны, в нормальном эмбриональном мозге уровень анеуплоидии наблюдается примерно в 30-35% клеток и снижается до 10% во взрослом мозге. Этот факт свидетельствует, по-видимому, о том, что ген АТМ является в определенной степени «протектором» против анеуплоидизации нервных клеток, способствуя селективной элиминации аномальных клеток в процессе эмбрионального и постнатального нейрогенеза (Allen et al., 2001; Shiloh, 2003; McConnell et al., 2004; McKinnon, 2004). Можно предположить, что нарушение функций белка ATM приводят к увеличению числа анеуплоидных клеток в мозжечке при данном заболевании. Это также подтверждается исследованием изменения экспрессии белков-регуляторов клеточного цикла, взаимодействующих с белком ATM в клетках головного мозга (Yang, Herrup, 2005). Таким образом, учитывая современные представления о молекулярных и клеточных механизмах развития ЦНС и данные, полученные в настоящей работе при молекулярно-цитогенетическом анализе клеток головного мозга при БА и АТ, обосновано заключение о том, что CIN и анеуплоидизация с участием определенных хромосом в специфических отделах головного мозга является одним из механизмов нейродегенерации.

Анализ функциональной организации интерфазных хромосом в клетках головного мозга в норме и при нервно-психических заболеваниях

До настоящего времени функциональная (ядерная) организация хромосом в клетках головного мозга человека не исследовалась. В данной работе было проведено исследование методами MFISH/QFISH и ICS-MCB с использованием ДНК проб на хромосомы 1, 9, 16, 18, 19 и Х примерно 300000 клеток головного мозга. Помимо индивидуумов без нервно-психической патологии организация хромосом в интерфазных клетках головного мозга исследовалась при шизофрении и БА (200000 клеток).

Результаты анализа организации хромосом в интерфазных клетках головного мозга показали, что хромосомы занимают определенную территорию, которая, тем не менее, не является строго заданной. Иными словами, в отличие от неоднократно исследованных митотических клеток (Croft et al., 1999; Leitch, 2000; Jackson, 2003; Gilbert et al., 2005; Finch et al;., 2008; Cremer, Cremer, 2010) расположение хромосом в интерфазных ядрах клеток ЦНС в значительной степени варьировало. Более того, размер территории всех исследованных интерфазных хромосом был в значительной степени больше (в некоторых клетках до 30% объема ядра вне зависимости от размера хромосомы). Это, по-видимому, объясняется тем, что в головном мозге наблюдается повышенная транскрипционная активность (Zhang, Meaney, 2010), которая, как известно, связана с увеличением объема, занимаемого хромосомной ДНК (деконденсацией) (Cremer, Cremer, 2010). Наиболее частыми областями, в которых локализовались хромосомы, являлась периферия и границы ядрышка, которые определялись, как область ядра, не окрашиваемая DAPI (краситель, взаимодействующий только с молекулами ДНК). В таблице 4 суммированы данные о локализации хромосом в интерфазных клетках головного мозга. Сравнительный анализ локализации аутосом по каждому типу расположения показал статистически недостоверные отличия (Р<0,05).

Таблица 4. Вариация расположения хромосом в интерафазных клетках головного мозга (n=300000).

Главной отличительной особенностью интерфазной организации генома на микроскопическом и субмикроскопических уровнях в тканях головного мозга явились ассоциации хромосомных участков (рис.9), которые в случаях некоторых локусов наблюдались в более чем 80% клеток.

Поскольку при анализе данного феномена, несмотря на высокую частоту ассоциаций хромосомных участков, нельзя было полностью исключить артефакты, связанные с фиксацией клеточных суспензий, был также проведен анализ расположения хромосом методами 3D FISH/ICS-MCB (рис.10). Данные 3D FISH/ICS-MCB подтвердили результаты МЦГ анализа с помощью ICS-MCB на клетках, фиксированных с помощью стандартных методик (Р<0,01). Таким образом, феномен ассоциации хромосомных участков был признан характерной особенностью организации генома в интерфазных клетках головного мозга. Перицентромерные участки ассоциировались в 38-61% случаев.

Суммарное количество ассоциированных коротких плеч составило 26-37%, длинных плеч -- 15-25%. Хромосома 19 ассоциировала короткими и длинными плечами в примерно одинаковой пропорции клеток, в совокупности составляя 30-49%. Перицентромерный гетерохроматин хромосомы 19 (также и хромосомы 5) демонстрировал ассоциации в 15% клеток. Исключение составляла хромосома Х, ассоциации участков которой наблюдались менее, чем в 3% клеток. В связи с этим, было признано, что ассоциации локусов хромосомы Х носят, по-видимому, случайный характер.

Рис.9. Ассоциации хромосомных участков в интерфазных ядрах клеток головного мозга. (А) ассоциация всех гетеро-хроматиновых участков генома; (Б) ассоциация гетерохроматинового участка хромосомы 9 (9qh) в ядре слева, (QFISH); (B) ассоциация гетерохроматинового участка хромосомы 16 (16qh) в ядре слева, (QFISH); (Г) ассоциация гетерохроматинового участка хромосомы 1 (1qh) и два сигнала сайт-специфических проб (участок 1р36); (Д и Е) ассоциации гетеро-хроматиновых участков классической сателлитной ДНК (1qh, 16qh и 9qh).

Проведен сравнительный анализ частот ассоциаций участков перицентромерного гетерохроматина в клетках крови, а также в нейронах (NeuN-положительных клетках) и глиальных (NeuN-отрицательных) клетках. Было обнаружено, что ассоциации хромосом с наибольшей частотой наблюдаются в нейронах (58%); в глиальных клетках она составила 25%, а в клетках крови -- 12%. При сравнении различия были статистически достоверными (Р<0,01). Таким образом, было показано, что геномная организация в высокодифференцированных и транскрипционно активных нейронах связана с увеличением частоты хромосомных ассоциаций. Следовательно, было обосновано предположить, что данный феномен несёт функциональную нагрузку.

Рис.10. 3D ICS-MCB на клетках головного мозга с ДНК пробами на хромосому 18: все участки, кроме одного(гетерохроматиновые участки хромосомы 18; справа) присутствуют в двух копиях, следовательно, в данной клетке наблюдается ассоциация гетерохроматинового участка хромосомы 18.

Учитывая, что поведение геномных локусов в интерфазных клетках влияют на активность генов (Osborne et al., 2004; Spilianakis et al., 2005; Goetze et al., 2007; Xu, Cook, 2008; Schoenfelder et al., 2010), а также тот факт, что специфика геномной организации (например, генонасыщенность) влияет на локализацию хромосом в ядре (Kьpper et al., 2007), исследования функционального значения этого феномена проводились в зависимости от специфики последовательности расположения генов на исследованных аутосомах (геномный анализ) и от вариации активности генов по длине хромосомы (эпигеномный анализ) с использованием оригинального биоиформатического метода. На рисунке 11 представлены результаты проведенного исследования на примере хромосом 18 и 19.

Было обнаружено, что частота ассоциаций хромосомных участков не коррелирует с генонасыщенностью (коэффициент Спирмена R=0,0246). При изучении эпигенетического статуса ассоциированных хромосомных участков была обнаружена корреляция с повышенной экспрессией генов этих локусов (коэффициент Спирмена R=0,8997). Таким образом, было продемонстрировано, что организация генома в интерфазных клетках головного мозга в виде ассоциаций хромосомных участков имеет функциональные последствия в виде увеличения экспрессии генов в нейронах. Следовательно, эпигенетический контроль транскрипционной активности генома в высокодифференцированных клетках происходит посредством изменения ядерной организации интерфазных хромосом. Необходимо отметить, что о данном феномене, выявленном с помощью изучения целых хромосом, а не специфических геномных локусов, сообщается впервые.

Рис.11. Корреляция частоты ассоциаций различных участков хромосом 18 и 19 (графики справа) с уровнем экспрессии генов и генонасыщенностью. Ассоциируют преимущественно участки, в которых содержатся гены с повышенной экспрессией в клетках головного мозга. Корреляции с генонасыщенностью не наблюдалось.

Поскольку в литературе постоянно отмечается возможная связь изменения эпигенетических процессов и патогенеза шизофрении (Abdolmaleky et al., 2006; Camargo et al., 2007; van Os, Kapur, 2009), было проведено изучение организации интерфазных хромосом в клетках головного мозга при этом заболевании. Методами MFISH/QFISH и ICS-MCB было продемонстрировано, что участки перицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, и 16 в 2-3 раза чаще ассоциируют в клетках головного мозга при шизофрении (Р<0,05), тогда как эти участки хромосом 15 и 18 имели практически одинаковую частоту (Р>0,1), а в случае хромосомы 17 было обнаружено троекратное увеличение числа клеток с ассоциированными участками перицентромерного гетерохроматина в контроле (Р<0,01). Эухроматиновые участки хромосом 1 и 18 в два раза чаще ассоциировали в клетках головного мозга при шизофрении (Р<0,05), а в случае хромосом 9 и 16 статистически достоверных различий обнаружено не было (Р>0,05). Таким образом, впервые было показано, что вариации функциональной организации генома на супрамолекулярном уровне в виде изменения организации хромосом в клетках головного мозга могут быть одним из механизмов патогенеза такого генетически и клинически гетерогенного заболевания, как шизофрения. Необходимо отметить, что до настоящего времени ни одно нервно-психическое заболевание не ассоциировалось с данным эпигенетическим феноменом. Исследование функциональной организации генома проводилось также и при нейродегенеративных заболеваний (БА и АТ). Сравнительный анализ показал, что при БА количество ассоциаций хромосомных участков значительно меньше по сравнению с контролем. Участки перицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, 15, 16, 17 и 18 варьировали в пределах от 4 до 20%, что в два-четыре раза меньше по сравнению с контролем (Р<0,01). Эухроматиновые участки при БА ассоциировали в 0,9-3%, являясь значительно меньше по сравнению с контролем (Р<0,001). Суммируя данные о функциональной организации хромосом в клетках головного мозга при психических и нейродегенеративных заболеваниях, был сделан вывод о том, что эпигенетические феномены, связанные с вариацией локализации хромосом в интерфазных клетках, являются одним из возможных механизмов патогенеза болезней мозга. Следует отметить, что при шизофрении в качестве одного из основных эндофенотипов отмечается повышенная функциональная активность головного мозга (van Os, Kapur, 2009), тогда как при БА и АТ она в значительной степени снижена (Dillen, Annaert, 2006; Swerdlow, 2007; Lavin, 2008). Это коррелирует с данными об интерфазной организации хромосом в клетках головного мозга при этих заболеваниях. Следовательно, изменения функциональной организации хромосом в клетках головного мозга представляет собой процесс, который может быть связан с дисфункциями ЦНС, характерными для нервно-психических заболеваний.

Онтогенетические вариации структурной и функциональной организации хромосом

В эмбриональных тканях соматические вариации генома выявлялись в 19-35% клеток, тогда как в постнатальном периоде в норме их частота составляла примерно 10%. Следовательно, существование структурных онтогенетических вариаций генома не вызывает сомнений. Было показано, что уровень вариаций генома снижается в три раза в ходе внутриутробного развития. Причем, это связано с элиминированием аномальных клеток, а не гибелью плодов, связанной с низкопроцентным хромосомным мозаицизмом. Однако в постнатальном периоде наблюдается рост количества анеуплоидных клеток в головном мозге (0,5-0,9% для аутосом и 1,9% для хромосомы Х -- в эмбриональном периоде и 1,7% для аутосом и 3,5% для хромосомы Х -- в постнатальном периоде; коэффициент Спирмена R=0,8121). Суммируя данные, можно сказать, что онтогенетические вариации генома представляют собой один из основных биологических процессов, регулирующих количество клеток в течение пренатального развития, а также связаны со старением. Причины увеличения уровня анеуплоидии могут быть связаны с нарушениями апоптоза, который приводит к уменьшению общего числа клеток в головном мозге, но, поскольку число анеуплоидных клеток значительно ниже «нормальных», то они значительно реже элиминируется за счет данного процесса. Помимо этого, предполагается, что нейрогенез в постнатальном мозге, по-видимому, связан с митотической нестабильностью, которая наблюдается в митотических клетках в процессе старения (Ly et al., 2000). Таким образом, соматические вариации генома в клетках головного мозга являются связанными не только с межклеточным разнообразием организации и патологическими изменениями при нервно-психических заболеваниях, но также и с процессами старения. Функциональные вариации организации генома на супрамолекулярном уровне, по-видимому, также изменяются в течение онтогенеза, поскольку существует исчерпывающее количество данных об изменении локализации хромосом (хромосомных участков) в зависимости от времени (Cook, Marenduzzo, 2009; Wu et al., 2009a; Cremer, Cremer, 2010). Сравнительный анализ организации хромосом в интерфазных клетках эмбрионального и постмортального мозга показал 5-7 кратное увеличение хромосомных ассоциаций в постнатальном периоде. Это коррелировало с увеличением транскрипционной активности генома клеток головного мозга в зависимости от стадии онтогенеза. Таким образом, показано, что вариация функциональной организации хромосом, которая коррелирует с уровнем экспрессии генов (эпигенетическим профилем) в исследованных тканях, является одним из определяющих факторов поведения генома.

Гипотеза о связи геномной нестабильности с патогенезом нервно-психических заболеваний

На основе полученных данных была предложена гипотеза о связи геномной нестабильности с патогенезом нервно-психических заболеваний. Она заключается в том, что соматические геномные вариации возникают в раннем пренатальном периоде, достигая наибольшей частоты в первом триместре (30-35%). Затем, за счет элиминации аномальных клеток, связанной с апоптозом, или другими процессами, ассоциированными с запрограммированной клеточной гибелью, происходит уменьшение уровня анеуплоидии до 10%. Однако, в позднем онтогенезе число анеуплоидных клеток увеличивается. Это, по-видимому, связано с процессами старения, что также подтверждается исследованием заболеваний аномального или ускоренного старения (БА и АТ, соответственно). При нервно-психических заболеваниях процесс элиминации аномальных клеток, по-видимому, нарушен. Из-за этого у детей с умственной отсталостью и аутистическими расстройствами мозаичная анеуплоидия наблюдается с повышенной частотой. Данное предположение также подтверждается картированием генов-кандидатов аутизма и последующим интерактомным/реактомным анализом, который указывает на то, что в клетках с данными геномными перестройками нарушаются регуляция клеточного цикла, сегрегация хромосом в митозе и запрограммированная гибель клеток. Подобный феномен, скорее всего, лежит в основе патогенеза шизофрении, БА и АТ. Наиболее вероятным механизмом формирования хромосомоспецифичной анеуплоидии и геномных перестроек является естественный отбор в клеточных популяциях в течение онтогенеза. Помимо этого, специфичность хромосом, вовлеченных в аномалию клеток головного мозга, определяет заболевание (например, анеуплоидия хромосомы 1 связана с шизофренией, а хромосомы 21 -- с БА). Молекулярные процессы, приводящие к патологии головного мозга, при этих заболеваниях можно проследить при изучении АТ, поскольку, как было показано в настоящей работе, в данном случае обнаружены разрывы хромосом в специфических геномных локусах. В связи с этим были проведены соответствующие интерактомные и реактомные исследования. С помощью анализа межбелковых взаимодействий (интерактомный анализ) и каскада метаболических цепочек (реактомный анализ) было обнаружено, что перестройки хромосомы 14 разрывают гены FOXG1B и NOVA1 (14q12), а в хромосомах 7 и Х -- разрывы располагались в ломких сайтах (FRA7C, FRAXB, FRAXC). По данным биоинформатического анализа разрывы сайтов ломкости связаны с тем, что ген АТ (АТМ) регулирует их стабильность. Геномные сети с участием FOXG1B и NOVA1 вовлекали метаболическую цепочку SMAD (гены SMAD2 и SMAD4 в участке 18q21.1), являющуюся ключевым элементом апоптоза и регуляции цикла клеток-предшественников нейронов, а также ген NOVA1, который регулирует альтернативный сплайсинг в нервных клетках. Вся цепочка внутриклеточных реакций вовлекала образование комплексов глобального регулятора генома p53 (регуляция транскрипции, сегрегации хромосом и апоптоза) и являлась компонентой каскада процессов, необходимых для репарации ДНК на стадиях клеточного цикла G1 и S. На рисунке 12 приведен пример такого исследования.

Рис.12. Интерактомная цепочка гена (белка) FOXG1.

Следовательно, патогенез нейродегенерации при АТ связан с нарушением репарации ДНК и сегрегации хромосом в клетках эмбрионального мозга, которые впоследствии не подвергаются апоптозу, за счет чего у детей с АТ в клетках мозжечка наблюдается нестабильность. Таким образом, патогенез нервно-психических заболеваний связан с соматической вариацией генома, вызванной нарушением регуляции клеточного цикла и запрограммированной гибелью клеток ЦНС. Следует отметить, что вариация функциональной организации генома также является фактором предрасположенности к нервно-психическим заболеваниям. Эпигенетические феномены, связанные с локализацией и ассоциацией геномных локусов в интерфазных ядрах клеток головного мозга, играют определенную роль в регуляции транскрипции генома. При условии их изменения, как было обнаружено при шизофрении, БА и АТ, могут наблюдаться патологические изменения в тканях головного мозга, приводящие к соответствующим нарушениям функциональной активности ЦНС. Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что структурная и функциональная вариация организации хромосом является механизмом межклеточной вариации, за счет которой достигаются межиндивидуальные различия функционирования головного мозга. Многообещающие перспективы исследований вариаций генома в клетках головного мозга человека позволяют сформулировать новое медико-биологического направление -- молекулярную нейроцитогенетику, цель которого заключается в выявлении структурных и функциональных особенностей организации хромосом в клетках ЦНС в норме и при нервно-психических болезнях. Исследования в этой области позволят определить роль, которую играют соматические вариации генома в клетках различных тканей, а также выявить их патогенетическую связь с наследственно обусловленной патологией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые проведено комплексное изучение структурной и функциональной организации хромосом в клетках головного мозга в норме, при нервно-психических заболеваниях и на разных стадиях онтогенеза. Помимо этого, также исследовалась вариабельность генома у детей с умственной отсталостью и/или ВПР и аутистическими расстройствами. Предложен комплекс оригинальных методов (QFISH и ICS-MCB), который лёг в основу создания оригинального подхода к выявлению соматических вариаций и организации генома в индивидуальных клетках. Последующее его применение позволило обнаружить такие ранее неизвестные феномены, связанные с внутриутробным развитием, как анеуплоидизация тканей плода, поражающая до 35% клеток мозга в каждом эмбрионе, а также то, что 25% спонтанных аборусов ассоциированы с хромосомным мозаицизмом. Далее, было показано, что низкопроцентная мозаичная анеуплоидия не является причиной внутриутробной гибели плода, и анеуплоидные клетки могут не подвергаться элиминации, приводя к патологии в постнатальном периоде. При умственной отсталости/ВПР мозаичные формы хромосомной патологии были обнаружены у 5,7% у детей. При аутизме низкопроцентная мозаичная анеуплоидия наблюдалась в 16% случаев. В этой группе также была определена частота вариаций гетерохроматиновых участков хромосом, которая в три раза выше по сравнению с контролем. Таким образом, патогенез аутизма может быть также связан с гетероморфизмом гетерохроматиновых участков генома. При анализе вариации эухроматиновых участков хромосом у детей с умственной отсталостью и аутистическими расстройствами методами высокоразрешающего сканирования генома и оригинального биоинформатического метода были выявлены гены-кандидаты. Дополнительные исследования с помощью интерактомного и реактомного анализа показали, что белки, кодируемые этими генами, вовлечены в критические внутриклеточные процессы регуляции клеточного цикла, сегрегации хромосом и запрограммированной клеточной гибели. Был сделан вывод о том, что при нервно-психических заболеваниях могут нарушаться эти процессы, приводя к хромосомному мозаицизму или нестабильности, подтверждая гипотезу, предложенную в настоящем исследовании. Исследования головного мозга показали, что до 10% клеток в норме могут иметь аномальный хромосомный набор, являясь, таким образом, следствием нормальной спорадической вариации генома. Нейроны и глиальные клетки в одинаковой степени подвержены этому процессу. Исследования хромосомного набора в клетках головного мозга при шизофрении показали связь с мозаичной анеуплоидией хромосом 1, 18 и Х в клетках коры головного мозга. Дополнительные исследования продемонстрировали, что при шизофрении наблюдается повышенный уровень спорадической анеуплоидии хромосомы 1. Изучение головного мозга при БА выявило мозаичную анеуплоидию, поражающую клетки головного мозга, которая является одним из механизмов нейродегенерации. Нарушения ЦНС при этом заболевании связаны с хромосомоспецифичной мозаичной анеуплоидией хромосомы 21, которая наблюдалась в 5-35% клеток. Данная хромосомная патология, была обнаружена только в тканях коры и гиппокампа (области головного мозга, подверженные дегенерации при БА). Таким образом, был предложен механизм БА, основанный на анеуплоидизации клеток коры головного мозга и гиппокампа, за счет которого в этих областях наблюдается повышенный уровень анеуплоидии хромосомы 21, являющейся причиной нарушений функционирования нейронов головного мозга и их последующей гибели. Для подтверждения ассоциации между нестабильностью генома и нейродегенерацией были исследованы клетки головного мозга при АТ. Анализ коры и мозжечка при этом заболевании впервые показал, что CIN может являться причиной нейродегенерации. Нестабильность генома при АТ была представлена в виде анеуплоидии и разрывов в специфических локусах на хромосомах 7, 14 и Х, селективно поражающей клетки определенных областей головного мозга (мозжечка). Анализ особенностей организации гомологичных хромосом в интерфазных ядрах клеток головного мозга в норме и при различной патологии ЦНС выявил, что соматические ассоциации хромосомных локусов, затрагивающие гетерохроматиновые и эухроматиновые участки хромосом, являются характерной особенностью дифференцированных нейрональных клеток. Определение частоты хромосомных ассоциаций показало, что этот феномен играет решающую роль в эпигенетической регуляции транскрипционной активности генома клетки. Обнаружены характерные особенности изменения ядерной организации генома (эпигенома) в клетках головного мозга при нервно-психических заболеваниях в виде вариации частоты ассоциации гетрохроматиновых и эухроматиновых участков хромосом в нервных клетках, которые могут быть одним из возможных механизмов патогенеза шизофрении и нейродегенеративных болезней. Увеличение частоты ассоциаций хромосомных участков наблюдалось при психических заболеваниях, связанных с повышенной функциональной активностью головного мозга (шизофренией), тогда как при нейродегенеративных заболеваниях, в которых функциональная активность головного мозга в значительной степени снижена, хромосомные ассоциации имели статистически достоверно сниженную частоту. Онтогенетические вариации структуры и функциональной организации генома в клетках головного мозга, по-видимому, связаны с процессами регуляции числа клеток в пренатальном периоде и старением. Таким образом, несмотря на то, что ЦНС человека, в основном, состоит из дифференцированных неделящихся клеток, старение головного мозга может быть связано с онтогенетической анеуплоидизацией в ходе нейрогенеза на поздних стадиях онтогенеза. Суммируя все данные настоящей работы, была сформулирована оригинальная гипотеза, рассматривающая генетическую нестабильность в соматических клетках в виде мозаичной анеуплоидии и неслучайных геномных перестроек, как один из основных механизмов патогенеза различных нервных и психических болезней (в частности, аутизма, шизофрении, БА и АТ), связанных с дифференциальной экспрессией нестабильности генома (эпигенома) в мозге. Предложенная комплексная схема патогенеза исследованных заболеваний ЦНС, основанная на данных о вариациях структурно-функциональной организации генома в разных отделах мозга, позволяет учитывать как наследственную предрасположенность к данным заболеваниям, так и факторы окружающей среды, которые имеют отрицательный эффект на сегрегацию хромосом в митозе, сохранение целостности хромосом в течение клеточного цикла и запрограммированную гибель аномальных клеток. В заключение необходимо отметить, что разработанный комплекс методов является эффективным для изучения структурной и функциональной организации хромосом в норме и при различных заболеваниях, а также для диагностики хромосомных аномалий и геномных перестроек. Данные настоящего исследования о структурно-функциональной вариации генома при нервно-психических заболеваниях имеют значение для фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований механизмов патогенеза, дифференциальной диагностики, медико-генетического консультирования и молекулярной терапии этих распространенных болезней мозга.

ВЫВОДЫ

1. Разработан оригинальный комплекс молекулярно-цитогенетических методов для выявления анеуплоидии и структурных перестроек интерфазных хромосом в клетках мозга человека, который включает в себя (1) многоцветовую интерфазную флюоресцентную гибридизацию in situ (МFISH), (2) количественную флюоресцентную гибридизацию in situ (QFISH), (3) интерфазную хромосомоспецифичную многоцветовую детекцию дифференциально маркированных по длине хромосом (ICS-MCB), (4) иммуно-FISH (Immuno-FISH).

2. Определен спонтанный уровень анеуплоидии в эмбриональных нервных клетках развивающегося мозга человека. Выявлены феномены повышенной хромосомной нестабильности и хромосомоспецифического мозаицизма в эмбриональном мозге, а также индуцированной мозаичной анеуплоидии в органотипических культурах эмбриональных и фетальных нервных клетках человека в условиях in vitro.

3. Частота хромосомных аномалий и геномных перестроек у детей с умственной отсталостью и/или ВПР составляет 13,1%. Показано, что соматический мозаицизм, связанный с митотической нестабильностью, наблюдается в 5,7%, а хромосомные аномалии, вызванные ошибками мейотического деления, -- в 7,4%, из которых 4,7% составили структурные хромосомные аномалии и геномные перестройки и 2,9% -- анеуплоидия.

4. Показано, что низкопроцентная мозаичная анеуплоидия встречается с повышенной частотой (до 16%) в культивируемых лимфоцитах у детей с идиопатическим аутизмом, причем до 10% мальчиков с аутизмом имеют низкопроцентные мозаичные клеточные клоны с дополнительной хромосомой Х в кариотипе. Частота хромосомных вариантов с вовлечением гетерохроматиновых участков хромосом 1, 9 и 16 достоверно выше при аутизме, чем в контроле.

5. Обоснован оригинальный биоинформатический метод анализа генного дисбаланса при несбалансированных хромосомных перестройках. Предложен алгоритм интерпретации последствий и определения причин возникновения структурной и функциональной вариации генома, который включает в себя биоинформатический геномный и эпигеномный анализ с последующей интерактомной и реактомной оценкой.

6. Определена частота спонтанной анеуплоидии в клетках нормального головного мозга взрослых индивидуумов без нарушений психики, которая составляет около 0,5% в расчете на индивидуальную пару гомологичных хромосом. Получены данные в пользу редукции мозаичной анеуплоидии в ходе развития ЦНС от 30-35% в эмбриональном до 10-12% во взрослом мозге. Показано, что мозаичная анеуплоидия, ведущая к структурной вариабельности генома нервных клеток, является одним из возможных генетических механизмов формирования межклеточного разнообразия в нормальном мозге на ранних стадиях онтогенеза.

7. Показано, что в головном мозге больных шизофренией (кора больших полушарий, хвостатое ядро и гиппокамп) анеуплоидия хромосом 1, 18 и Х имеет повышенную частоту. Обоснована гипотеза о том, что структурные вариации соматического генома, приводящие к нарушениям его функциональной активности в нервных клетках головного мозга, связаны с патогенезом этой психической болезни, и мозаичная анеуплоидия является возможным биологическим маркером нарушений ЦНС при шизофрении.

8. Определен уровень анеуплоидии в разных отделах мозга при болезни Альцгеймера (кора больших полушарий, гиппокамп, мозжечок). Показано, что геномная нестабильность при болезни Альцгеймера проявляется специфически в виде анеуплоидии с участием хромосомы 21 в клетках областей мозга, пораженных нейродегенерацией (гиппокамп и кора больших полушарий). Таким образом, соматическая нестабильность генома в клетках головного мозга является одним из возможных механизмов патогенеза этого нейродегенеративного заболевания позднего возраста. Подтверждена гипотеза о связи болезни Альцгеймера с трисомией по хромосоме 21, предполагающая общий механизм патогенеза при болезнях Дауна и Альцгеймера.

9. Определен уровень анеуплоидии и структурных хромосомных перестроек в клетках головного мозга (кора больших полушарий, мозжечок) при атаксии-телеангиектазии. Показано, что прогрессирующая мозжечковая дегенерация раннего возраста, характерная для этой болезни, связана с мозаичным эффектом хромосомной нестабильности в виде анеуплоидии и разрывов в специфических локусах на хромосомах 7, 14 и Х, селективно поражающей клетки определенных областей головного мозга (нейроны мозжечка). Предложена гипотеза о том, что мозаичная экспрессия геномной и хромосомной нестабильности в разных отделах ЦНС может лежать в основе патогенеза различных нейродегенеративных болезней.

10. Обнаружено, что соматические ассоциации (спаривание) гетерохроматиновых и эухроматиновых участков хромосом, являются характерной особенностью дифференцированных нейрональных клеток. Определены частоты соматического спаривания для разных хромосом и показано нарушение правила «хромосомных территорий» для определенных гомологичных хромосом в нейронах коры и мозжечка головного мозга человека.

11. При исследовании архитектоники интерфазного ядра клеток головного мозга показано, что характерные изменения ядерной организации генома (эпигенома) и нарушения соматического спаривания эухроматиновых участков хромосом в нервных клетках наблюдаются у больных с психическими заболеваниями, что может являться одним из вероятных эпигенетических механизмов патогенеза этих болезней.

12. На основе полученных данных предложена оригинальная гипотеза, рассматривающая генетическую нестабильность в соматических клетках как один из основных механизмов патогенеза нервных и психических болезней, связанных с дифференциальной экспрессией нестабильности генома (эпигенома) в головном мозге. Предложена комплексная схема патогенеза исследованных заболеваний ЦНС, включая аутизм, шизофрению, болезнь Альцгеймера и атаксию-телеангиектазию, основанная на данных о соматических вариациях и нестабильности структурно-функциональной организации генома на хромосомном уровне в разных отделах мозга.