Молекулярная генетика

Материалом для выделения ДНК могут быть образцы крови, соскобы слизистой оболочки, биоптаты тканей, осадок клеток мочи, любые клетки, которые имеют ядра. Количество материала для выделения ДНК достаточно незначительно - на одну манипуляцию выделения ДНК благодаря применению современных реактивов нужно 100 микролитров крови, 25 микрограммов тканей и т.п.

Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преимущественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последующем значительно облегчает их секвенирование.

Секвенирование ДНК. Обратная транскриптаза ДНК

Для обнаружения нуклеотидных замен в анализируемом участке гена возникает необходимость проведения секвенирования, т.е. определения точной нуклеотидной последовательности продуктов ПЦР. На практике наиболее широкое распространение получило секвенирование по классическому методу Сэнгера.

Изучаемый фрагмент ДНК (например, продукт ПЦР) играет роль матрицы, на которой при участии праймера, дезоксирибонуклеотид-трифосфатов и ДНК-полимеразы инициируется направленный комплементарный синтез новых молекул ДНК, осуществляемый одновременно в 4 параллельных реакциях. Смысл метода в том, что в каждую из реакций добавляется один из 4 химически измененных дезоксирибонуклеотид-трифосфатов (терминаторов). В качестве таких терминаторов выступают дидезоксирибонуклеотид-трифосфаты (ddGTP, ddATP, ddTTP и ddCTP), которые при встраивании в состав молекулы ДНК обрывают дальнейший синтез полинуклеотидной цепи. В результате этого в каждой из пробирок накапливается набор дочерних молекул ДНК различной длины, оканчивающихся строго на один и тот же нуклеотид.

После электрофореза продуктов этих реакций в 4 соседних дорожках проводится считывание информации от более коротких фрагментов к более длинным, при этом выявляемый пошаговый порядок удлинения цепей и отражает последовательность нуклеотидов в составе анализируемой ДНК-матрицы. Одномоментно может быть секвенирован участок ДНК, не превышающий 500 п.о., поэтому для исследования более длинных участков гена они должны быть амплифицировапы в виде совокупности и коротких перекрывающихся фрагментов, каждый из которых секвенируется отдельно. Обычно для обнаружения мутаций секвенируются отдельные экзоны изучаемого гена вместе с примыкающими к ним интронными последовательностями (областями сплайсинга).

В некоторых случаях в качестве объекта исследования удобнее использовать не геномную ДНК, а более компактную и информационно «насыщенную» кДНК, получаемую после соответствующей обработки образцов тканей, например биопсийного материала или клеточных линий лимфоцитов, фибробластов и т.д. Для этого используется методика обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR): проводится обратная транскрипция мРНК, и получаемые молекулы кДНК служат матрицей для полимеразной цепной реакции.

В последующем кДНК подвергается секвенированию и другим методам мутационного скрининга, прямому электрофоретическому исследованию (выявление делеций, вставок и т.д.) либо встраиванию в экспрессионную систему с целью получения белкового продукта и его непосредственного анализа. Последний метод особенно эффективен для детекции мутаций, ведущих к синтезу «усеченного» белка (нонсенс-мутации, мутации сплайсинга, крупные делеции) - так называемый РТТ-анализ.

РТТ-анализ обычно используется при исследовании протяженных мультиэкзонных генов, таких как ген мышечной дистрофии Дюшенна/Бекера, атаксии-телеангиэктазии или нейрофиброматоза 1-го типа.

Контрольные вопросы

1 Что изучает молекулярная генетика?

2 Когда молекулярная генетика выделилась в самостоятельное направление науки?

3 В каком году Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили модель структуры ДНК?

4 Какие виды азотистых оснований содержится в ДНК?

5 Какие виды азотистых оснований содержится в РНК?

6 Что подразумевает принцип комплементарности?

7 Какую роль в организме играют нуклеиновые кислоты?

8 В каких органоидах содержатся нуклеиновые кислоты?

Литература

Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. - Из-во Новосиб. Университета, 2002.

Айала Ф., Кайгер Д. Современная генетика. М., Мир. 1988.

Инге-Вечтомов С.Г. Введение в молекулярную генетику. Высшая школа. 1983.

Лекция 2

Тема: Проблема стабильности генетического материала. Типы структурных повреждений в ДНК

Цели:

- ознакомиться с понятием «генетический материал»;

- изучить основные свойства генетического материала;

- изучить типы структурных повреждений в ДНК.

План

1 Генетический материал.

2 Типы структурных повреждений в ДНК.

1. Генетический материал- это компоненты клетки, обеспечивающие хранение, реализацию, воспроизводство и передачу при рaзмножении генетической (наследственной) информации; свойства Г.м. - дискретность (наличие обособленнных групп сцепления - хромосом), непрерывность (физическая целостность хромосомы), линейность (одномерность “записи” генетической информации), относительная стабильность (передача потомству с небольшими изменениями).

Основная единица генетической информации - ген, представляющий собой отрезок ДНК, который кодирует РНК или полипептидную цепь. Белки, состоящие из одной или нескольких полипептидных цепей, могут играть структурную или регуляторную роль, служить рецепторами для других молекул, выполнять транспортную функцию, катализировать определенную метаболическую реакцию (если белок-фермент) или как-то иначе участвовать в жизнедеятельности клетки или организма.

Общая черта строения про- и эукариотических генов - наличие кодирующей области и, расположенных по ее флангам, регуляторных последовательностей. Кодирующие области большинства эукариотических генов имеют экзон-интронную структуру. Исключение составляют, например, гены гистонов и интерферонов, которые не имеют интронов. Экзоны - кодирующие последовательности - чередуются с некодируюшими последовательностями - интронами. Размеры и число экзонов и интронов индивидуальны для каждой мРНК.

Как правило, нитроны по размерам значительно превышают экзоны. Ранее считалось, что интроны - варианты некодирующей, «эгоисгичной» ДНК. Однако открытие альтернативного сплайсинга, в процессе которого с одного гена транскрибируется несколько вариантов мРН К, за счет различных комбинаций экзонов и интронов, изменило наше представление о функции интронов. Оказалось, что в некоторых случаях интроны могут функционировать как экзоны, а экзоны - как интроны. Установлено, что в интронах могут находиться промоторы - участки, с которых начинается транскрипция. Неожиданно выяснилось, что в одном из интронов гена фактора VIII расположен другой (гены в генах). Таким образом, по мере изучения функций «некодирующей» ДНК «ее эгоистичность» часто оказывается мнимой.

Экзоны или их сочетания могут кодировать аминокислотные последовательности, являющиеся структурными и функциональными доменами белка. Каждый эукариотический ген имеет с обеих сторон от кодирующей области основные регуляторные последовательности, выполняющие функции инициации и терминации транскрипции. Однако регуляторные участки, повышающие и понижающие уровень транскрипции (экхансеры и сайленсеры), могут быть расположены как внутри гена, так и на значительном расстоянии от него.

Некоторые эукариотические гены организованы в кластеры, но у них отсутствуют общие регуляторные участки, как в оперонах прокариот. К ним относятся, например, гены а- и р-цепей гемоглобина НЬА. Однако во многих случаях родственные гены расположены в разных хромосомах, например, ген лактатдегидрогеназы LDHA -на хромосоме II, а ген LDH В- на хромосоме 12.

Наряду с функциональными генами у эукариот есть псевдогены, которые, как правило, не транскрибируются из-за мутаций в регуляторных областях или вследствие изменений в их кодирующей области. При этом белок, если и образуется, является дефектным, не функциональным. Один из вариантов псевдогенов - так называемые процессированные псевдогены, в которых отсутствуют интроны. Последнее обстоятельство еще раз подчеркивает значение интронов для образования пре-мРНК и синтеза нормально функционирующего белка.

Наличие нескольких промоторов в одном гене обусловливает альтернативную транскрипцию, т.е. образование различных изоформ мРНК. Так в гене миодистрофии Дюшенна имеется 8 промоторов, с которых происходит альтернативная транскрипция в разных тканях (сердечных и скелетных мышцах, эмбриональных нейронах, коре мозга, сетчатке глаз), что приводит к образованию в этих тканях различных изоформ дистрофина.

Помимо альтернативной транскрипции существует и альтернативный сплайсинг. Так ген кальцитонина млекопитающих кодирует две изоформы мРНК; одна отвечает за кальцитонин щитовидной железы и состоит из первых четырех экзонов из 6. Во второй мРНК, кодирующей белок, родственный CGRP мозга, отсутствует экзон 4. Альтернативный сплайсинг с пре-мРНК гена а-тропомиозина, в результате которого в зрелой мРНК отсутствуют экзоны с 5' и 3'-концов и середины гена, представлен на рисунке. Эти различные формы мРНК были обнаружены в мышцах, мозге и фибробластах.

2. Типы структурных повреждений в ДНК

ДНК может повреждаться разнообразными мутагенами, к которым относятся окисляющие и алкилирующие вещества, а также высокоэнергетическая электромагнитная радиация -- ультрафиолетовое и рентгеновское излучение. Тип повреждения ДНК зависит от типа мутагена. Например, ультрафиолет повреждает ДНК путём образования в ней димеров тимина, которые возникают при образовании ковалентных связей между соседними основаниями. Оксиданты, такие как свободные радикалы или перекись водорода, приводят к нескольким типам повреждения ДНК, включая модификации оснований, в особенности гуанозина, а также двухцепочечные разрывы в ДНК. Среди разных типов повреждений наиболее опасные -- это двухцепочечные разрывы, потому что они трудно репарируются и могут привести к потерям участков хромосом (делециям) и транслокациям. Многие молекулы мутагенов вставляются (интеркалируют) между двумя соседними парами оснований. Большинство этих соединений, например, этидий, даунорубицин, доксорубицин и талидомид имеют ароматическую структуру. Для того чтобы интеркалирующее соединение могло поместиться между основаниями, они должны разойтись, расплетая и нарушая структуру двойной спирали. Эти изменения в структуре ДНК мешают транскрипции и репликации, вызывая мутации. Поэтому интеркалирующие соединения часто являются канцерогенами, наиболее известные из которых -- бензопирен, акридины, афлатоксин и бромистый этидий. Имеются 3 ферментные системы, ведущие репарацию -- прямая, эксцизионная и пострепликативная. Прямая репарация. Прямая репарация наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Так действует, например, O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина. Эксцизионная репарация. Эксцизионная репарация включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы. Пострепликативная репарация. Tип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей поврежденные участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной рекомбинации при помощи белка RecA. Считается, что нарушение механизмов репарации ДНК в целом приводит к различным патологическим процессам, в число которых входят канцерогенез, дефекты развития и старение. На сегодняшний день известен ряд наследственных заболеваний, причиной которых служат нарушение репарации ДНК. Дефекты системы эксцизионной репарации нуклеотидов приводят к возникновению пигментной ксеродермы, синдрома Кокейна и трихотиодистрофии . Наследственный неполипозный рак толстой кишки может вызываться мутациями некоторых генов системы репарации гетеродуплексов. Многие синдромы предрасположенности к онкологическим заболеваниям - ретинобластома , семейный аденоматозный полипоз ит.п. - связаны с нарушениями систем ответа на повреждение ДНК. Мутации возникают тогда, когда репарационный механизм по каким-то причинам не работает или не справляется с устранением повреждений. Мутации, возникающие в генах, кодирующих белки, ответственные за репарацию, могут приводить к многократному повышению (мутаторный эффект) или понижению (антимутаторный эффект) частоты мутирования других генов. Так, мутации генов многих ферментов системы эксцизионной репарации приводят к резкому повышению частоты соматических мутаций у человека, а это, в свою очередь, приводит к развитию пигментной ксеродермы и злокачественных опухолей покровов.

Контрольные вопросы

1 Что такое генетический материал?

2 Какими свойствами обладает генетический материал?

3 Что означает свойство генетического материала - дискретность?

4 Что означает свойство генетического материала - непрерывность?

5 Что означает свойство генетического материала - линейность?

6 Что означает свойство генетического материала - относительная стабильность?

7 Какие мутагены способны повреждать молекулу ДНК?

Литература

Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. - Из-во Новосиб. Университета, 2002.

Айала Ф., Кайгер Д. Современная генетика. М., Мир. 1988.

Инге-Вечтомов С.Г. Введение в молекулярную генетику. Высшая школа. 1983.

Льюин Б. Гены. М. Мир. 1987.

Сингер М. Берг П. Гены и геномы. М., Мир. 1998.

Патрушев Л.И. Экспрессия генов. - М.: Мир, 2000.

Лекция 3

Тема: Система регуляции биосинтеза гистидина: генетический анализ системы, роль тРНК

Цели:

- изучить процесс биосинтеза белков;

- изучить роль нуклеиновых кислот в биосинтезе белка;

- ознакомиться с биосинтезом гистидина в клетке.

План

1 Биосинтез белка

2 Регуляция биосинтеза белка

3 Генетический код и его свойства

4 Смысл кодонов

4. Колинеарность гена и продукта

5 Аминокислоты

6 Транспортная РНК

7 Матричная РНК

8 Аминоацил - тРНК синтетазы

9 Биосинтез гистидина

1. Биосинтез белка

Одной из задач современной биологии и ее новейших разделов - молекулярной биологии, биоорганической химии, физико-химической биологии - является расшифровка механизмов синтеза молекулы белка, содержащей сотни, а иногда и тысячи остатков аминокислот. Механизм синтеза должен обладать точной кодирующей системой, которая автоматически программирует включение каждого аминокислотного остатка в определенное место полипептидной цепи Кодирующая система определяет первичную структуру, а вторичная и третичная структуры белковой молекулы определяются физико-химическими свойствами и химическим строением аминокислот.

Первоначальные представления, согласно которым синтез белка могут катализировать те же протеолитические ферменты, что и вызывающие его гидролиз, но путем обратимости химической реакции, не подтвердились. Оказалось, что синтетические и катаболические реакции протекают не только различными путями, но и в разных субклеточных фракциях. Не подтвердилась так же гипотеза о предварительном синтезе коротких пептидов с их последующим объединением в единую полипептидную цепь. Более правильным оказалось предположение, что для синтеза белка требуются источники энергии, наличие активированных свободных аминокислот и несколько видов нуклеиновых кислот.

В современные представления о механизме синтеза белка большой вклад внесли советские биохимики. Так, в лаборатории А.Е. Браунштейна было впервые указано на участие АТФ в синтезе квазипептидных связей. В. Н. Ореховичем еще 50-е годы было показано, что перенос аминоцильных или пептидильных группировок на NH2 группу аминокислот может осуществляться не только с амидной или пептидной, но и со сложноэфирной связи. Как будет показано ниже, именно этот механизм лежит в основе реакции транспептидирования в 50S рибосоме в стадии элонгации синтеза белка.

Значительно позже были получены доказательства, что в синтезе белка, протекающем в основном в цитоплазме, решающую роль играют нуклеиновые кислоты, в частности ДНК. После того как было установлено, что ДНК является носителем и хранителем наследственной информации, был поставлен вопрос о том, каким образом эта генетическая информация, записанная (зашифрованная) в химической структуре ДНК, трансформируется в фенотипические признаки и функциональные свойства живых организмов, передающиеся по наследству. В настоящее время можно дать однозначный ответ на этот вопрос: генетическая информация программирует синтез специфических белков, определяющих в свою очередь специфичность структуры и функции клеток, органов и целостного организма. В природе, как известно, существуют два типа биополимерных макромолекул, так называемые неинформативные биополимеры и информативные биополимеры, несущие первичную генетическую информацию и вторичную генетическую, точнее фенотипическую информацию. Эти общие представления могут быть выражены следующей последовательностью событий (поток информации):

2. Регуляция биосинтеза белка

Биосинтез белка, хотя непосредственно и регулируется рибонуклеиновыми кислотами, опосредованно связан с контролирующим влиянием ДНК ядра и что РНК сначала синтезируется в ядре, затем поступает в цитоплазму, где выполняет роль матрицы в синтезе белка. Полученные значительно позже экспериментальные данные подтвердили гипотезу о том, что основной функцией нуклеиновых кислот является не только хранение генетической информации, но и реализация этой информации путем программированного синтеза специфических белков.

Однако в этой последовательности ДНК-РНК-Белок недоставало сведений о том, каким образом происходят расшифровка наследственной информации и синтеза специфических белков, определяющие многообразие признаков живых существ. В настоящее время выяснены основные процессы, посредством которых осуществляется передача наследственной информации: они включают репликацию, т. е. Синтез ДНК на матрице ДНК, транскрипцию, т. е. Перевод языка и типа строения ДНК на молекулу РНК, и трансляцию - процесс, в котором генетическая информация, содержащаяся в молекуле мРНК, направляет синтез соответствующей аминокислотной последовательности в белке. Многие тонкие механизмы транскрипции окончательно не выяснены.

Получены экспериментальные доказательства наличия ДНК также в митохондриях. Она не гомологичная и не комплементарна ядерной ДНК. Предполагается, что митохондриальная ДНК кодирует синтез части структурных белков самих митохондрий.

Значительный вклад в современные представления о месте, факторах и механизме синтеза белка внесли исследования Т. Касперсона, П. Берга, П. Замечника, С. Очоа, А.А. Баева, А.С. Спирина и др.

3. Генетический код и его свойства

Необходимость кодирования структуры белков линейной последовательности нуклеотидов мРНК и ДНК продиктованы тем, что в ходе трансляции:

Нет соответствия между числом номеров в матрице мРНК и продукте - синтезируемом белке;

Отсутствует структурное сходство между мономерами РНК и белка.

Это исключает комплиментарное взаимодействие между матрицей и продуктом - принцип, по которому осуществляется построение новых молекул ДНК и РНК, в ходе репликации и транскрипции.

Отсюда становится ясно, что должен существовать «словарь», позволяющий выяснить, какая последовательность нуклеотидов мРНК обеспечивает включение в белок аминокислот в заданной последовательности. Этот «словарь» получил название генетического, биологического, нуклеотидного или аминокислотного кода. Он позволяет шифровать аминокислоты, входящие в состав белков, с помощью определенной последовательности нуклеотидов в ДНК и мРНК. Для него характерны определенные свойства.

Триплетность. Одним из основных вопросов при выяснении свойств кода был вопрос о числе нуклеотидов, которое должно определять включение в белок одной аминокислоты. Сразу было понятно, что это число не может быть равным 1 или 2, так как в этом случае количество кодирующих элементов будет недостаточно для шифрования 20 аминокислот в белках. Число кодирующих последовательностей из четырех нуклеотидов по три равно 43=64, что более чем в 3 раза превышает минимальное количество, которое необходимо для кодирования 20 аминокислот. В дальнейшем было установлено, что кодирующими элементами в шифровании аминокислотной последовательности действительно являются тройки нуклеотидов или триплеты, которые получили название «кодоны».

4. Смысл кодонов

Смысл кодонов стал понятен в 60-х г. XX столетия, когда, используя безклеточную систему синтеза белков и синтетические полирибонуклеотиды и заданной последовательностью нуклеотидов в качестве матрицы, М. Ниренберг и Г. Маттей синтезировали полипептиды определенного строения. Так, на матрице поли-У, состоящей только из остатков УМФ, был получен полифенилаланин, а на матрице поли-Ц -полипролин. Из этого следовало, что триплет - UUU кодирует Фен, а триплет -ССС - Про.

В последующих экспериментах использовали смешанные синтетические полирибонуклеотиды с известным составом. В результате этой работы удалось установить, что из 64 кодонов включения аминокислот в синтезирующуюся полипептидную цепь шифрует 61 триплет, а 3 остальных UAA, UAG, UGA не кодируют включение в белок аминокислот и первоначально были названы бессмысленными, или нонсенкодоном. Однако в дальнейшем было показано, что эти триплеты сигнализируют о завершении трансляции, и поэтому их стали называть терминируюшими, или стоп-кодонами.

Кодоны мРНК и триплеты нуклеотидов в кодирующей нити ДНК с направлением от 5 к 3 - концу имеют одинаковую последовательность азотистых оснований, за исключением того, что в ДНК вместо урацила (U), характерного для мРНК, стоит тимин (Т).

Специфичность

Каждому кодону соответствует только одна определенная аминокислота. В этом смысле генетический код строго однозначен.

Выраженность

В мРНК и ДНК имеет смысл 61 триплет, каждый из которых кодирует включение в белок одну из 20 аминокислот. Из этого следует, что в информационных молекулах включения в белок одной и той же аминокислот определяет несколько кодонов. Это свойство биологического кода получило название вырожденности.

У человека одним кодоном зашифрованы только 2 аминокислоты - Мет и Три, тогда как Лей, Сер и Арг - шестью кодонами, а Ала, Вал, Гли, Про, Тре - четырьмя кодонами.

Избыточность кодирующих последовательностей - ценнейшее свойство когда, так как она повышает устойчивость информационного потока к неблагоприятным воздействиям внешней и внутренней среды. При определении природы аминокислоты, которая должна быть заключена в белок, третий нуклеотид в кодоне не имеет столь важного значения, как первые два. Для многих аминокислот замена нуклеотида третьей позиции кодона не сказывается на его смысле.

Линейность записи информации

В ходе трансляции кодоны мРНК «читаются» с фиксированной стартовой точки последовательно и не перекрываются. В записи информации отсутствуют сигналы, указывающие на конец одного кодона и начала следующего.

Кодон AUG является инициирующим и прочитывается только в начале, так и в других участках мРНК как Мет. Следующие за ним триплеты читаются последовательно без каких либо пропусков вплоть до стоп-кодона, на котором синтез полипептидной цепи завершается.

Универсальность

До недавнего времени считалось, что код абсолютно универсален, т. е. смысл кодовых слов одинаков для всех изученных организмов: вирусов, бактерий, растений, земноводных, млекопитающих, включая человека. Однако позднее стало известно одно исключение, казалось, что митохондриальная МРНК содержит 4 триплета, имеющих другое значение, чем в мРНК ядерного происхождения. Так, в мРНК митохондрий триплет UGA кодирует Три, AUA -Мет, а AGA и AGG причитываются как дополнительные стоп-кодоны.

4. Колинеарность гена и продукта

У прокариотов обнаружено линейное соответствие последовательности кодонов гена и последовательности аминокислот в белковом продукте, или, как говорят, существует колинеарность гена и продукта.

У эукариотов последовательности оснований в гене, колинеарные аминокислотной последовательности в белке, прерываются интронами. Поэтому в эукариотических клетках аминокислотная последовательность белка колинеарна последовательности экзонов в гене или зрелой МРНК после постранскрипционного удаления интронов.

Основные компоненты белоксинтезирующей системы

Для синтеза полипептидной цепи необходимо большое количество компонентов, совместное и согласованное взаимодействие приводит к образованию белка.

5. Аминокислоты

Все 20 аминокислот, входящих в структуру белков организма человека, должны присутствовать в достаточном количестве. Это требование прежде всего относится к незаменимым (т. е. не синтезирующимся в организме) аминокислотам, так как недостаточное снабжение клетки хотя бы одной незаменимой аминокислотой приводит к снижению, а иногда и полной остановке синтеза белка на кодоне, требующем включения этой аминокислоты в белок.

6. Транспортная РНК

В лаборатории Хогланда было выяснено, что при инкубации 14С -аминокислоты с растворимой фракцией цитоплазмы в присутствии АТФ и последующим добавлением трихлоруксусной кислоты в образовавшемся белковом осадке метка не открывается. Было сделано заключение, что меченая аминокислота не включается в белковую молекулу. Метка оказалась связанной ковалентно с РНК, содержащейся в белковом фильтрате. Показано, что РНК, к которой присоединяется меченая аминокислота, имеет небольшую молекулярную массу и сосредоточена в растворимой фракции, поэтому ее сначала назвали растворимой, а позже адаптерной или транспортной РНК. На долю тРНК приходится около 10-15% общего количества клеточной РНК. К настоящему времени открыто более 60 различных тРНК. Для каждой аминокислоты в клетке имеется по крайней мере одна специфическая РНК( для ряда аминокислот открыто более одной, в частности для серина - 5 разных тРНК, для лизина и глицина - по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК связана со специфической аминоацил-тРНК-синтетазой). Молекулярная масса большинства тРНК колеблется от 24000 до 29000 Да. Они содержат от 75 до 85 нуклеотидов. Аминокислоты присоединяются к свободной 3-ОН-группе концевого мононуклеотида, представленного во всех тРНК АМФ, путем образования эфирной связи. Интересно, что почти все тРНК обладают не только индивидуально сходными функциями, но и очень похожей трехмерной структурой.

Установлена первичная структура почти всех 60 открытых тРНК; знание последовательности нуклеотидов и, следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК оказалась также нативная конформация, установленная методом рентгеноструктурного анализа и названная первоначально названная конформацией клеверного листа; на самом деле эта конформация имеет неправильную, Г-образную, форму.

Определение структуры тРНК позволило выявить ряд отличительных участков; так, 3-гидроксильном конце располагается одинаковая для всех тРНК последовательность триплета ЦЦА -ОН, к которой присоединяется посредством эфирной связи специфическая аминокислота. Связывание в основном происходит через 3-ОН-группу концевого аденилового нуклеотида, хотя получены доказательства возможности присоединения аминокислоты и через 2-ОН-группу. Тимидин-псевдоуридин-цитидиловая петля, по-видимому, обеспечивает связывание аминоацил-тРНК с поверхностью рибосомы. Имеется кроме того, добавочная петля, состав которой варьирует у разных типов молекул тРНК; ее назначение неизвестно. Дигидроуридиловая петля, с другой стороны, оказалась необходимой как сайт (место) для узнавания специфическим ферментом -аминоацил-тРНК-синтетазой. Имеется также антикодоновая петля, несущая триплет, названный антикодоном, и расположенная на противоположной стороне от того конца, куда присоединяется аминокислота. Антикодон является антипараллельными в своей комплементарности.

Тщательный анализ нуклеотидной последовательности разных тРНК показал, что все они содержат одинаковый 5-концевой нуклеотид - ГМФ со свободной 5-фосфатной группой. Адапторная функция молекул тРНК заключается в связывании каждой молекулы тРНК со своей специфической функциональной аминокислотой. Но поскольку между нуклеиновой кислотой и специфической функциональной группой аминокислоты не существует соответствия и сродства, эту функцию узнавания должна выполнять белковая молекула, которая узнает как молекулу специфической тРНК, так и специфической аминокислоты.

7. Матричная РНК

Выше было указано на необходимость участия предобразованной молекулы РНК для правильной расстановки аминокислот в полипептидной цепи. Было высказано мнение, что предобразованная РНК, необходимая для изменения типа синтезируемого белка, должна обладать высокой скоростью обновления своего состава, т. е. молекула такой РНК должна синтезироваться и распадаться с такой скоростью, чтобы обеспечить быструю обновляемость нуклеотидного состава. Фактически же рРНК сказалась метаболически весьма стабильно, поэтому становилась очевидным, что она не может служить в качестве матрицы.

В ряде лабораторий были получены данные о существовании в клетках в соединении с рибосомами короткоживущей РНК, названной информационной РНК; сейчас она обозначается как матричная РНК, потому что ее роль заключается в переносе информации от ДНК в ядре до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой происходит синтез белка.

Эти опыты открыли прямую дорогу для экспериментальной расшифровки кода, при помощи которого информация от РНК передается на синтезируемый белок. Последовательность нуклеотидов РНК реализуется в специфической последовательности аминокислот синтезируемой полипептидной цепи. Опыты Ниренберга свидетельствуют также о том, что не рибосома и не рРНК являются матрицей, на которой синтезируются специфические белки, а эту роль выполняют поступающие извне матричные РНК. Итак, ДНК предает информацию на РНК, которая синтезируется в ядре и затем поступает в цитоплазму. Здесь РНК выполняет матричную функцию для синтеза специфической белковой молекулы. Матричная гипотеза синтеза белка, как и других полимерных молекул ДНК и РНК, получила в настоящее время полное подтверждение. Ее правильность была доказана в экспериментах, которые обеспечивали точное воспроизведение первичной структуры полимерных молекул; причем этот синтез в отличии от беспорядочного химического синтеза отличался не только высокой скоростью и специфичностью, но и направленностью самого процесса, в строгом соответствии с программой, записанной в линейной последовательности молекулы матрицы.

8. Аминоацил - тРНК синтетазы

В цитозоле клеток 20 различных аминокислот присоединяются -карбоксильной группой к 3-гидрофильному акцепторному концу соответствующих тРНК с образованием сложноэфирной связи. Эти реакции катализирует семейство ферментов, носящее название аминоацил - тРНК синтетаз. Каждый член этого семейства узнает только одну определенную аминокислоту и те тРНК, которые способны связываться с этой аминокислотой. Из этого следует, что в группу тРНК синтетаз входит 20 различных ферментов. Они осуществляют активацию аминокислот в 2 стадии: на первой стадии аминокислота присоединяется к ферменту и реагирует с АТФ с образованием богатого энергией промежуточного соединения - аминоацил АМФ. На второй стадии аминоацильный остаток аминоациладенилата, оставаясь связанным с ферментом, взаимодействует с молекулой соответствующей тРНК с образованием аминоацил тРНК.

Для каждой аминокислоты существует свой фермент -- своя аминоацил тРНК синтетаза: для глутамата -- глутамил-тРНК синтетаза, гистидина -- гистидил-тРНК синтетаза и т.д.

Аминокислоты присоединяются к 3'- или 2'-ОН группам рибозы на З'-конце тРНК, где все тРНК имеют общую нуклеотидную последовательность -ССА.

Энергия, заключённая в макроэргической сложноэфирной связи аминоацил-тPHK, впоследствии используется на образование пептидной связи в ходе синтеза белка.

Пирофосфат, выделяющийся в ходе этой реакции, гидролитически расщепляется с образованием двух молекул ортофосфата и выделением энергии, что делает реакцию активации аминокислот необратимой.

Чрезвычайно высокая специфичность аа-тРНК синтетаз в связывании аминокислоты с соответствующими тРНК лежит в основе точности трансляции генетической информации. В активном центре этих ферментов есть 4 специфических участка для узнавания: аминокислоты, тРНК, АТФ и четвёртый -- для присоединения молекулы Н20, которая участвует в гидролизе неправильных аминоациладенилатов. За счёт существования в активном центре этих ферментов корректирующего механизма, обеспечивающего немедленное удаление ошибочно присоединённого аминокислотного остатка, достигается поразительно высокая точность работы: на 1300 связанных с тРНК аминокислот встречается только одна ошибка.

Аминокислота, присоединяясь к тРНК, в дальнейшем не определяет специфических свойств аа-тРНК, так как её структуру не узнаёт ни рибосома, ни мРНК. Участие в синтезе белка зависит только от структуры тРНК, а точнее, от комплиментарного взаимодействия антикодона аминоацил-тРНК с кодоном мРНК.

Антикодон расположен в центральной (антикодоновой) петле тРНК. Узнавание тРНК аа-тРНК синтетазами не всегда происходит по антикодоновой петле. Активный центр некоторых ферментов обнаруживает комплиментарное соответствие другим участкам пространственной структуры тРНК.

9. Биосинтез гистидина

Биосинтез гистидина тесно связан с обменом пуринов. С высшими растениями проведено очень мало исследований по биосинтезу гистидина. Все сведения о биосинтезе гистидина почерпнуты из опытов на микроорганизмах. Броквист и Снелл нашли, что различные бактерии могут превращать р-имидазолпировиноградную кислоту в гистидин при наличии в среде пиридоксальфосфата. Эти данные показывают, что имидазолпировиноградная кислота является предшественником гистидина, но в настоящее время при истолковании этих наблюдений следует учитывать и другие возможности. Взаимная связь между пуринами и гистидином, отмеченная в ранних исследованиях, теперь выяснена, по крайней мере частично, в результате изотопных исследований; они показали, что атом С-2 имидазольного ядра имеет источником муравьиную кислоту. Последняя может возникать в процессе обмена пуринов.

При избытке гистидина в бактериальных клетках синтез всех ферментов биосинтеза гистидина репрессируется.

С-глюкоза распадается на более мелкие фрагменты, которые затем используются в биосинтезе гистидина. Немеченый гисти-дин действует как ингибитор по обратной связи, блокируя путь, по которому происходит синтез гистидина. 

Хартман с сотрудниками провел генетический анализ нескольких сотен мутантов Salmonella typhimurium, которым для роста необходим гистидин, и показал, что структурные гены ферментов биосинтеза гистидина собраны вместе в гистидиновом опероне хромосомы Salmonella. Такое сочетание методов биохимического и генетического анализов оказалось очень эффективным и, как мы увидим, сыграло большую роль в развитии теории биосинтеза и регуляции ферментов у бактерий. 

Штамм ТА 1530 содержит мутацию G46 в гисти-диновом опероне, которая включает замену пар оснований, изменяющую один кодон в мРНК гена, кодирующего первый энзим в биосинтезе гистидина. 

Уже после того как было сформулировано это предположение, слияние генов было продемонстрировано экспериментально на клетках Salmonella, у которых индуцировали две последовательные мутации со сдвигом рамки между двумя генами биосинтеза гистидина ( гл. Из-за сдвига рамки считывания сигнал к окончанию синтеза белка считывается неправильно, и организм синтезирует одну длинную белковую цепь, соответствующую двум генам. 

Забегая немного вперед, включим сюда шикимовую кислоту ( ключевое соединение в биоситезе феноло-кислот), из которой образуются фени-лаланин, тирозин, триптофан. Можно сказать, особняком стоит и биосинтез гистидина, который выпадает из общего комплекса реакций, ведущих к аминокислотам. 

Напомним, что в случае координированной репрессии группы ферментов отношение количества одного из них к количеству любого другого должно оставаться постоянным независимо от степени репрессии или индукции. Эймса и сотрудников, показавших, что четыре фермента, участвующих в биосинтезе гистидина, репрессируются координирование. 

Синтезы группы ароматических аминокислот ( триптофана, фенилаланина и тирозина) начинаются с конденсации ФЕП из гликолитического пути и эритрозо-4 - фосфата из пентозофосфатного пути. Другие интерме-диаты гликолиза - 3 - ФГК и пируват - дают начало реакциям, приводящим к синтезу аминокислот группы серина ( серии, глицин, цистеин) и группы пировиноградной кислоты ( аланин, валин, лейцин) соответственно. Биосинтез гистидина сильно отличается от синтеза других аминокислот и тесно связан с путями образования пуринов. Два атома углерода пятичленного имидазольного кольца и три атома углерода боковой цепи происходят из фосфорибозилпи-рофосфата. Фрагмент С-N этого кольца образуется из пуринового ядра АТФ, а другой атом азота - из глутамина. 

Таким образом, в состав оперона входит группа функционально связанных друг с другом структурных генов, которые могут координирование включаться и выключаться, и их оператор. Одним из наиболее сложных оперонов является гистидиновый оперон. Он состоит из девяти структурных генов, кодирующих набор ферментов, необходимых для биосинтеза гистидина. Регуляторный ген / iis - оперона кодирует белок-репрессор, который присоединяется к / zis - оператору и тем самым препятствует транскрипции всех девяти белков оперона в условиях, когда в среде присутствует достаточное количество гистидина. 

Поскольку популяция клеток продолжает расти и делиться, удельная активность оставшихся гистидинсинтези-рующих ферментов снижается. Выключение синтеза ферментов, ответственных за образование гистидина, вызванное добавлением гистидина, называется репрессией ферментов. Репрессия, так же как и индукция, представляет собой отражение принципа клеточной экономии: как только ферменты биосинтеза гистидина больше не требуются, они перестают вырабатываться. В большинстве случаев репрессия ферментов затрагивает ферменты, участвующие в биосинтезе, особенно в биосинтезе аминокислот.

Сходным образом осуществляется регуляция О.в. на уровне биосинтеза ферментов. Примером регуляции при помощи положит, прямой связи может служить в данном случае управление расщеплением лактозы. Появление в среде лактозы инактивирует у бактерии ЕзсЬепсЫа соП соответствующий репрессор и тем самым разрешает транскрипцию оперона, кодирующего ферменты, катализирующие расщепление лактозы. Пример регуляции при помощи отрицат. Избыток гисти-дина активирует репрессор, ингибирующий транскрипцию оперона, кодирующего ферменты биосинтеза гистидина. Если репрессор и белки, синтез к-рых он подавляет, кодируются одним опероном, то отрицат. Такой механизм регуляции позволяет синтезировать белок в строгом соответствии с потребностью в нем на данном этапе существования организма. 

Мутант Salmonella typhimurium быстро растет в присутствии гистидина, но его рост сильно замедляется, если не добавлять эту аминокислоту в среду извне. Но как только количество гистидина в среде падает и рост клетки замедляется, начинается синтез относительно больших количеств всех четырех ферментов, осуществляющих биосинтез гистидина. В то же время количество глутамат-дегидрогеназы, непосредственно не связанной с метаболизмом гистидина, остается неизменным. В предыдущих примерах катаболические ферменты индуцировались добавлением бензойной кислоты или лактозы; в этом же случае репрессия анаболических ферментов осуществляется в присутствии гистидина, а дерепрессия - в его отсутствие. 

Биосинтез белков является объектом генетического контроля. В бактериях, во всяком случае, он проявляется на уровне синтеза информационной РНК посредством взаимодействия особого ( ре-гуляторного) белка со специфическим участком ДНК ( см. часть 22 и разд. Детали этих механизмов контроля не важны и контексте данного раздела. Важным моментом является факт, что существуют механизмы регуляции концентрации ферментов на определенном метаболитическом пути посредством конечного продукта этого пути. Так, в бактериальных системах хорошо изучены индуцируемые ферменты. Пока субстраты этих ферментов присутствуют в среде, биосинтеза ферментов не происходит. Часто синтез нескольких ферментов какого-либо одного метаболи-тического пути индуцируется присутствием субстрата первого фермента этого пути. Индукция субстратом, таким образом, представляет собой механизм повышения концентрации системы ферментов по мере появления рабочей необходимости. Соответствующий механизм, понижающий избыточную концентрацию фермента, если последний или система ферментов производит слишком большие количества определенного метаболита, получил название репрессии по принципу обратной связи. Классическим примером этого механизма является ингибирование биосинтеза гистидина в Salmonella typhimurium высокими концентрациями гистидина. 

Контрольные вопросы

1 Какие советские биохимики внесли большой вклад в современные представления о механизме синтеза белка?

2 Где в клетке протекает синтез белка?

3 Что регулирует биосинтез белка?

4 Что такое кодон?

5 Какую функцию выполняет тРНК?

6 Что происходит в бактериальных клетках при избытке гистидина?

Литература

1 Шишкин О.С., Калинин В.И. Медицинские аспекты биохимической и молекулярной генетики. М. ГНТП «Геном человека». 1992.

2 Газарян К.Г., Тарантул В.3. Геном эукариот. - М.: МГУ, 1983.

3 Франк-Каменецкий М.Д. Самая главная молекула. - Библиотечка "Квант", вып. 25, Наука, 1983.

Лекция 4.

Тема: Полиморфизм митохондриальной ДНК и его использование в популяционно-генетических исследованиях

Цели:

- Ознакомиться с понятием «ДНК полиморфизм»;

- Изучить полиморфизм митохондриальных ДНК в популяциях человека, а также полиморфизм уникальных последовательностей ДНК;

- Ознакомиться с использованием ДНК полиморфизма в популяционно-генетических исследованиях.

План

1 ДНК полиморфизм

2 Полиморфизм митохондриальных ДНК в популяциях человека

3 Полиморфизм уникальных последовательностей ДНК

4 Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ).

нуклеиновый генетика белок код

1. ДНК полиморфизм (DNA polymorphism) [греч. poly много, многое и morphe -- вид, форма, образ] -- существование в популяции двух или большего числа альтернативных форм (аллелей) определенного локуса хромосомы (гена), которые различаются нуклеотидной последовательностью или различным числом повторяющихся нуклеотидных последовательностей. В отличие от мутаций (см. Мутация) ДНК п. называют те случаи, когда определенный вариант нуклеотидной последовательности (аллель) встречается более чем у 1 % особей в популяции. ДНК п. используется для решения различных научных и практических задач, в частности при типировании ДНК

Последовательности ДНК человека идентичны между собой на 99,8%, однако, оставшиеся 0,2% генома человека характеризуются значительной вариабельностью. Исследования генома, позволившие установить наличие вариабельных участков, а также широкое внедрение метода ПЦР, позволили разработать более легкие методы идентификации фрагментов ДНК, основанные на полиморфизме генома. Эти методы имеют ряд преимуществ: 1) можно использовать один и тот же (универсальный) набор праймеров, 2) нет необходимости в ДНК-зондировании, гибридизации и т.д., 3) возможность автоматизации анализа результатов. Все это позволяет быстро охарактеризовать большое количество образцов.

Как известно, полиморфизм генома обусловлен, главным образом, наличием полиморфных локусов, представляющих собой нейтральные мутации, не проявляющиеся фенотипически и не влияющие на жизнеспособность и репродуктивные свойства особей. Такие локусы сконцентрированы в некодируюших областях генома человека, более подверженных изменчивости, чем кодирующие участки. Наследование полиморфных локусов подчиняется менделевским закономерностям. Информативность полиморфных локусов определяется уровнем их генетической изменчивости в различных популяциях.

С помощью молекулярных методов анализа наиболее просто выявляются два типа геномного полиморфизма: I) количественные изменения мини- и микросателлитных последовательностей ДИК (уменьшение или увеличение числа повторов), создающие целую серию уникальных по характеру и частоте аллелей для каждого вариабельного локуса, и 2) качественные замены отдельных нуклеотидов, обусловливающие появление полиморфных сайтов рестрикции. Эти типы полиморфных локусов представляют собой наиболее удобные генетические маркеры. Анализируя родословные можно проследить наследование аллелей этих маркеров в ряду поколений, определить сцепление друг с другом, с известными генами и с анонимными последовательностями ДНК, что широко используется как для картирования геномов, так и для косвенной диагностики наследственных заболеваний.

Феномен ДНК-полиморфизма лежит в основе двух распространенных в настоящее время методов идентификации мутантных фрагментов ДНК: анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и анализа микросателлитных маркеров.

2. Полиморфизм митохондриальных ДНК в популяциях человека

Анализ рестриктов митохондриальной ДНК показал, что различные человеческие популяции отличаются друг от друга их составом. Это явление получило название полиморфизма митохондриальных ДНК в популяциях человека. Использование еще одного нового метода в исследованиях митохондриальной ДНК -- ДНК-полимеразной реакции, -- позволило использовать параметры митохондриальной ДНК для характеристики популяций человека и изучения филогенетически закономерностей в процессах развития. Оказалось также, что митохондриальная ДНК способна сохраняться в ископаемых останках на протяжении многих веков. В этом случае ее характеристики могут служить веским научным доказательством родства, как между популяциями, так и между индивидами.

Так, идентификация царской семьи Николая II по ископаемым останкам была осуществлена на базе анализа именно митохондриальной ДНК (рис. 4.20). В процессе исследования установили общность митохондриальной ДНК из клеток крови здравствующего принца Филиппа герцога Эдинбургского и митохондриальной ДНК, выделенной из останков царицы Александры Федоровны и трех ее дочерей. Все перечисленные лица являются родственниками по материнской линии -- потомками принцессы Алисы, дочери королевы Виктории. Родословная этой семьи представлена на рисунке. Индивидуальное развитие организма начинается с момента оплодотворения. Сначала зигота делится митотически, затем следуют этапы пренатального развития: бластула, гаструла, нейруляция, имплантация в стенку матки, закладка и формирование органов и их систем, рост плода. Пренатальный период сменяется перинатальным, который начинается с 28 недели беременности, включает роды и заканчивается через 7 дней после рождения. Далее идет постнатальный период, вмещающий в себя всю жизнь человека до смерти. В процессе индивидуального развития имеется ряд критических периодов, когда организм наиболее уязвим по отношению к действию различных факторов. В литературе, посвященной оценке токсического воздействия окружающей среды на человека, достаточно редко рассматривается проблема возникновения пороков развития, связанных с тератогенными факторами.

Так называются факторы, которые, действуя в период беременности, приводят к возникновению врожденных пороков развития у детей, не вызывая нарушения наследственных структур. По современным данным, не менее 182 тыс. веществ, искусственно введенных в окружающую среду человеком, в том числе и лекарственные препараты, обладают токсическим эффектом.

3. Полиморфизм уникальных последовательностей ДНК

Уникальные последовательности ДНК включают в себя все гены организма, т.е. участки ДНК, в нуклеотидной последовательности которых закодирована определенная генетическая информация. Полиморфизм уникальной ДНК генома обусловлен различиями в последовательности нуклеотидов разных аллелей одного локуса. Такой вид полиморфизма называют полиморфизмом нуклеотидной последовательности.

Данным видом полиморфизма обладают участки ДНК, кодирующие признаки генетических маркеров, которые в экспертной практике исследуют серологическими методами (например, хорошо известная и широко применяемая система группы крови АВО), методами изоэлектрофокусирования (например, система группоспецифического компонента GC).

Одним из наиболее изученных в настоящее время генетических маркеров, обладающих полиморфизмом нуклеотидной последовательности, является комплекс белков антигенов лейкоцитов человека HLA

(Human Leukocyte Antigen). Исследование генетических признаков системы HLA имеет большое значение в медицинской практике, так как гены этой системы обусловливают признаки гистосовместимости органов и тканей при их трансплантациях, а также связаны с болезнями иммунной системы и некоторыми другими болезнями. Гены HLA-D (класс II) локализованы на шестой хромосоме и состоят из трех регионов HLA-DP, -DQ и -DR, каждый из которых кодирует б- и в- гликопептиды [7, 8]. Локус HLA DQA1, содержащий ген, кодирующий б-частицу белка DQ, исследуют в криминалистическом ДНК-анализе. Дня этого локуса установлены нуклеотидные последовательности всех восьми известных аллелей, которые в соответствии с международной

номенклатурой разделяются на 4 типа: А1, А2, A3 и А4; а типы А1 и А4 -- соответственно на подтипы: А1.1, А1.2, А1.3, А4.1, А4.2 и А4.3.

Для исследования локусов, обладающих полиморфизмом нуклеотидной последовательности, обычно применяют метод гибридизации с аллель-специфичными зондами. Для создания таких зондов должна быть определена нуклеотидная последовательность всех аллелей. Процессы секвенирования ДНК (т.е. определения нуклеотидной последовательности), синтеза аллель-специфичных зондов и оптимизации условий гибридизации являются сложными и дорогостоящими. Это является существенным недостатком исследования уникальных последовательностей в криминалистическом ДНК-анализе.

Исследование полиморфизма нуклеотидной последовательности путем непосредственной расшифровки изучаемых последовательностей (т.е. методом секвенирования) также имеет ряд сложностей (например, при исследовании гетерозиготного образца ДНК, содержащего смесь двух различных последовательностей ДНК). Перед этапом секвенирования ДНК последовательности каждого аллеля

должны быть выделены из смеси ДНК образца, что бывает нелегко выполнить на практике.

Указанные недостатки сужают возможности использования локусов уникальных последовательностей в криминалистическом ДНК-анализе, поэтому направление по их исследованию в настоящее время не является перспективным.

4. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ)

...