Молекулярная генетика

Присутствие в геноме полиморфных сайтов рестрикции обусловливает вариацию (полиморфизм) длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). В геноме человека такие полиморфные сайты рестрикции встречаются во всех хромосомах с частотой приблизительно 1 : 300 - 500 п.н.

Этот метод используется для предварительного уточнения локализации мутации при наличии в амплифицированном фрагменте известных сайтов рестрикции и для выявления уже известных точковых замен, меняющих сайт узнавания рестриктаз. Для этого продукты амплификации разрезают соответствующей рестриктазой и на электрофореграмме сравнивают длину изучаемых рестрикционных фрагментов с контролем. При необходимости полученные фрагменты идентифицируют, используя метод блот-гибридизации по Саузерну.

ПДРФ-анализ можно использовать для диагностики гетерозиготного носительства мутаций. При наличии точковых мутаций в гетерозиготном состоянии по данному сайту рестрикции на электрофореграмме будут выявляться три фрагмента: один - исходной длины и два- полученные после рестрикции. При наличии делеций в гетерозиготном состоянии наряду с фрагментами нормальной длины будут присутствовать и необычные по размеру. Выявление полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии позволяет отличить мутантный аллель от нормального, те. осуществить его молекулярную маркировку. Однако первичная идентификация полиморфного сайта рестрикции, сцепленного с определенным геном, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зондов.

ПДРФ-анализ применяют как для прямой (определяют уже известные нуклеотидные замены), так и для косвенной ДНК-диагностики. Косвенная диагностика проводится по полиморфным точкам, расположенным, как правило, в некодирующих областях либо в третьей букве вырожденного кодона, что позволяет различать материнскую и отцовскую хромосомы при семейном анализе в случае гетерозиготности по данному полиморфизму. С другой стороны, такие маркеры являются диаллельными, что приводит к невысокой гетерозиготности по данному локусу особей в популяции (не более 50%), что накладывает существенные ограничения на их использование (в связи с их низкой информативностью).

Контрольные вопросы

1 Что такое ДНК полиморфизм?

2 Какие существуют методы идентификации мутантных фрагментов ДНК?

3 Какой метод позволил использовать параметры митохондриальной ДНК для характеристики популяций человека и изучения филогенетически закономерностей в процессах развития?

4 Что означает термин «тератогенные факторы»?

5 Для чего используется анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ)?

Литература

1 Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. - Из-во Новосиб. Университета, 2002.

2 Айала Ф., Кайгер Д. Современная генетика. М., Мир. 1988.

3 Инге-Вечтомов С.Г. Введение в молекулярную генетику. Высшая школа. 1983.

4 Льюин Б. Гены. М. Мир. 1987.

5 Сингер М. Берг П. Гены и геномы. М., Мир. 1998.

6 Патрушев Л.И. Экспрессия генов. - М.: Мир, 2000.

Лекция 5

Тема: Практическое применение молекулярной генетики

Цели:

- изучить, в каких областях биологии и медицины применяется молекулярная генетика.

План:

1 Практическое применение молекулярной генетики

1. Практическое применение молекулярной генетики

Молекулярная генетика своими замечательными открытиями оказала плодотворное влияние на все биологические науки. Она явилась той основой, на которой выросла молекулярная биология, значительно ускорила прогресс биохимии, биофизики, цитологии, микробиологии, вирусологии, биологии развития, открыла новые подходы к пониманию происхождения жизни и эволюции органического мира. Вместе с тем молекулярная генетика, позволившая глубоко проникнуть в природу важнейших жизненных процессов и успешно продолжающая их исследование, отнюдь не претендует на решение многих, в том числе и генетических, проблем, касающихся целостного организма, а тем более совокупностей организмов - популяций, видов, биоценозов и т. д., где преобладают закономерности, изучение которых требует иных методов, чем те, какие использует молекулярная генетика.

Достижения молекулярной генетики, внёсшие огромный теоретический вклад в общую биологию, несомненно будут широко использованы в практике сельского хозяйства и медицины (т. н. генная инженерия путём замены вредных генов полезными, в том числе искусственно синтезированными; управление мутационным процессом; борьба с вирусными болезнями и злокачественными опухолями путём вмешательства в процессы репликации нуклеиновых кислот и опухолеродных вирусов; управление развитием организмов посредством воздействия на генетические механизмы синтеза белка и т. д.). Перспективность практического применения достижений молекулярной генетики подтверждается успехами, достигнутыми на модельных объектах. Так, у наиболее изученных в генетическом отношении видов бактерий удаётся получать мутации любого гена, лишать клетку какого-либо гена или привносить в неё желаемый ген извне, регулировать функции многих генов. Несмотря на то что генетические свойства клеток эукариотов изучены на молекулярном уровне ещё недостаточно, увенчались успехом первые попытки введения некоторых генов в клетки млекопитающих с помощью вирусов, осуществлена гибридизация соматических клеток и др. Например, в 1971 американский учёный С. Меррилл с сотрудниками, культивируя вне организма клетки человека, больного галактоземией (такие клетки неспособны вырабатывать один из ферментов, необходимых для утилизации молочного сахара, что и является причиной этой тяжёлой наследственной болезни), ввели в эти клетки неинфекционный для них бактериальный вирус, содержащий ген, кодирующий данный фермент. В результате клетки «излечились» - стали синтезировать недостающий фермент и передавать эту способность последующим клеточным поколениям. Уже сейчас данные молекулярной генетики используют при создании медикаментов, применяемых для профилактики и лечения новообразований, лейкозов, вирусных инфекций, лучевых поражений, при изыскании новых мутагенов и т. д.

Основные достижения молекулярной генетики, особо отразились в бурном развитии генной инженерии. Генетическая (генная) инженерия - область молекулярной биологии и генетики, ставящая своей задачей конструирование генетических структур по заранее намеченному плану, создание организмов с новой генетической программой. Основные методы генной инженерии были разработаны в 60-70-х годах нашего века. Они включают три основных этапа:

получение генетического материала (искусственный синтез гена или выделение природных генов);

включение этих генов в автономно реплицирующуюся генетическую структуру (векторную молекулу) и создание рекомбинантной молекулы ДНК;

введение векторной молекулы (с включенным в нее геном) в клетку-реципиент, где она встраивается в хромосомный аппарат. Экспериментальный перенос генов в другой геном называется трансгенезом.

В настоящее время раскрыта тонкая структура гена. Известно, что ген содержит информацию на первичную структуру одного полипептида. Число кодонов в гене не может быть меньше числа аминокислот в белке. Средний размер гена 1000-1200 нуклеотидов. Существуют разные подходы выявления последовательности нуклеотидов в гене.

Принципиально возможно познание структуры гена путем изучения последовательности аминокислот в белке. Но это длинный путь, если учесть, что одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими триплетами.

Другой подход более реальный: путем анализа последовательностей нуклеотидов в информационных РНК, которые какое-то время существуют в цитоплазме и могут быть выделены.

Гены для пересадки могут быть либо искусственно синтезированы, либо выделены из ДНК прокариот и хромосом эукариот. В настоящее время выделение высокомолекулярной ДНК проводят на ультрацентрифугах в градиенте плотности хлористого цезия. Известно два пути искусственного синтеза гена: химический и ферментативный. Для химического синтеза необходимо иметь полностью расшифрованную последовательность нуклеотидов. Впервые в 1970 году индийским ученым Корана Г. (США) был осуществлен искусственный синтез гена. Он синтезировал последовательность нуклеотидов в ДНК, специфическую для структуры гена транспортной аланиновой РНК в клетках пекарских дрожжей. Более двух лет затратили на этот синтез гена. Последовательность нуклеотидов в нити ДНК определялась по информационной РНК. Но этот ген был не способен работать in vitro. Причиной являлся синтез только структурной части гена, в нем не было регуляторных участков. Для транскрипции необходимо, чтобы фермент РНК-полимераза "узнавала" место промотора, где локализована точка инициации синтеза, и в этом месте "садилась" на матрицу. В 1976 г, в той же лаборатории был синтезирован ген тирозиновой тРНК бактерии кишечной палочки, состоящий не только из структурного участка (126 нуклеотидных пар), но и регуляторных частей - промотора и терминатора. Этот искусственно созданный по специальной программе ген был выведен в бактериальную клетку и функционировал как природный.

Другим примером химического синтеза гена является синтез гена, кодирующего фермент, расщепляющий лактозу. Синтезированный ген в пробирке был встроен в плазмиду и введен в бактерию; кишечная палочка приобрела способность усваивать лактозу. Однако, химическим путем можно синтезировать небольшие по размеру гены прокариот, синтез сложных генов эукариот, состоящих из тысячи и более нуклеотидов, путем химического синтеза пока создать не удается.

Кроме того, химический синтез очень трудоемкий и в настоящее время практически не используется. Наиболее успешным оказался ферментативный синтез гена.

Центральная догма молекулярной генетики утверждает, что считка информации происходит в направлении: ДНК>РНК>белок. Но ряд авторов, начиная с 1948 года, выступали с соображениями, что РНК может быть предшественником ДНК. Подобное наблюдается у онкогенных РНК - содержащих вирусов. С РНК-вируса, попавшего в клетку, синтезируется провирус (ДНК - копия РНК) с помощью фермента обратная транскриптаза (ревертаза), а сам процесс называется обратной транскрипцией. Этот фермент был открыт в 1970 году Теминым, Мазутани, Балтимором. Клонирование (размножение) кДНК по известной иРНК было разработано Г.Бойером, С.Коэном и П.Бергом в 1973 году. На 1 этапе на основе иРНК по принципу комплементарности синтезируют односпиральную кДНК. На 2-3 этапах удаляют иРНК и достраивают вторую часть кДНК. Деполимеризацию исходной РНК-цепочки осуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНК устойчивы к обработке щелочью, а РНК полностью деполимеризуется. Двуцепочечную кДНК получают путем достраивания одноцепочечной кДНК под действием фермента ДНК-полимеразы. После такой обработки кДНК можно встраивать в вектор. Такая кДНК не имеет вставок - интронов, т. е. схема ее строения в этом смысле не отличается от бактериального гена. Ген, полученный путем ферментативного синтеза, может функционировать в бактериальной клетке, на нем синтезируется иРНК, а затем белок. Таким путем под руководством академика В. А.Энгельгардта был получен ген, определяющей синтез фермента галактозидазы, введенный в фаг. При размножении фага в клетке получили множество копий, что обеспечило синтез большого количества фермента. Это имеет не только теоретическое, но и практическое значение, так как галактозидаза применяется в пищевой промышленности.

Следовательно, если иметь в пробирке выделенные молекулы иРНК, принадлежащие данному гену, то он может быть синтезирован с помощью фермента. Матрицей служит иРНК, ее выделяют, добавляют нуклеотиды, затравку, ферменты. На основе этих данных в 1972-1973 гг. во многих лабораториях мира были синтезированы гены глобина человека, кролика, голубя, мыши, утки, гены митохондрии печени крыс и другие. Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют регулярной части и промотора. Отсутствие регуляторных участков препятствует функционированию этих искусственных генов в животных клетках. При переносе в микробную клетку к структурным генам присоединяют промотор, извлеченный из микробной клетки.

Ферментативный синтез гена имеет большие возможности: принципиально осуществимо проводить искусственный синтез любых индивидуальных генов путем транскрибирования их с соответствующих матричных РНК. Основным затруднением является синтез не структурных, а регуляторных генов, необходимых для их нормальной работы. Это в ряде случаев ограничивает использование искусственно синтезированных генов. Кроме этого, иРНК в клетках содержится в очень незначительном количестве и она обладает нестойкостью.

В настоящее время получают рекомбинативные (гибридные) молекулы ДНК путем гибридизации in vitro фрагментов ДНК вирусного, бактериального и в меньшей степени эукариотного происхождения.

Нахождение условий функционирования генов эукариот в бактерии позволяло бы решить проблему получения многих биологически активных веществ (гормонов). Одним из достижений является синтез гормона соматостатина, полученный в результате введения этого гена в кишечную палочку. Соматостатин регулирует поступление в кровь гормона роста, образуется он в гипоталамической области. Плазмиды, содержащие этот ген, были введены в бактерию и состыкованы с имеющимся в ее геноме регуляторным геном бетагалактозидазы. Наличие регуляторного участка обеспечило процесс транскрипции и трансляции.

Однако создание искусственных генов, получение рекомбинантных молекул ДНК и введение их в клетки, в частности прокариот, может привести к появлению новых организмов с признаками, никогда ранее не имевшимися на Земле. Так, в США пересадили гены стафилококка кишечной палочки. В результате образовался гибридный штамм, обладающий свойствами обоих микроорганизмов. При манипуляции с геномом этой бактерии возникшие новые организмы могут приобрести патогенные свойства, быть устойчивыми к известным лекарственным препаратам и оказаться особо опасными для человека, поскольку в ходе предыдущей эволюции человеческий организм никогда не встречался с такими формами и может оказаться безоружным,

В связи с этим на Международной конференции в США в 1974 г. были выработаны определенные правила, обязательные при манипуляциях с генетическим материалом и предложен ряд мер, которые должны сделать практически невозможным случайный выход из лабораторий в природу патогенных рекомбинантных микроорганизмов. Успехи молекулярной генетики должны быть использованы на благо человека: в борьбе против наследственных болезней, для создания новых микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ, синтеза растительных и животных белков и др. Молекулярная генетика развивается стремительно и уже располагает достаточными средствами и методами воздействия на наследственные заболевания.

Контрольные вопросы

1 Какое количество нуклеотидов включает средний размер гена?

2 Какие существуют подходы выявления последовательности нуклеотидов в гене?

3 Когда и кем впервые был осуществлен искусственный синтез гена?

4 Для профилактики и лечения каких заболеваний используются данные молкулярной генетики?

5 Перечислите основные достижения в молекулярной генетике.

Литература

1 Газарян К.Г., Тарантул В.3. Геном эукариот. - М.: МГУ, 1983.

2 Франк-Каменецкий М.Д. Самая главная молекула. - Библиотечка "Квант", вып. 25, Наука, 1983.

3 Льюин Б. Гены. М. Мир. 1987.

4 Сингер М. Берг П. Гены и геномы. М., Мир. 1998.

5 Патрушев Л.И. Экспрессия генов. - М.: Мир, 2000.

Размещено на Allbest.ru