Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК

Размещено на http://allbest.ru

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК

02.00.10 - биоорганическая химия

Сергиев Петр Владимирович

Москва - 2008 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, чл-корр. РАН Цетлин В.И.

доктор химических наук, профессор Лаврик О.И.

доктор биологических наук, профессор Гарбер М. Б.

Ведущая организация: Институт Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 26 февраля 2008 г. в 16 часов на заседании совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус “А”, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 января 2008 г.

Ученый секретарь совета,

кандидат химических наук Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосома это молекулярное устройство, осуществляющее синтез белков из аминокислот, приносимых транспортной РНК (тРНК), согласно инструкциям, закодированным в последовательности нуклеотидов матричной РНК (мРНК). Рибосома состоит из большой (50S) и малой (30S) субчастиц и имеет три участка связывания тРНК - А, Р и Е. В ходе своей работы она взаимодействует с несколькими десятками различных лигандов и координирует работу своих функциональных центров, разнесенных в пространстве. Основную структурную и функциональную роль в рибосоме выполняет рибосомная РНК (рРНК). Основу 30S субчастицы составляет 16S рРНК, основу 50S субчастицы - 23S и 5S рРНК. Малая субчастица образует декодирующий центр, в котором происходит проверка соответствия (комплементарности) кодона мРНК и антикодона аминоацил-тРНК (аа-тРНК).

Связывание аа-тРНК осуществляется при помощи комплекса фактора элонгации Tu и GTP (аа-тРНК*EF-Tu*GTP). После гидролиза GTP, который происходит в случае соответствия кодона мРНК и антикодона тРНК, аа-тРНК перемещается в А участок. При этом 3'-конец аа-тРНК, несущей аминокислоту проникает в пептидилтрансферазный центр (peptidyltransferase center, PTC) большой субчастицы рибосомы. В этом каталитическом центре происходит перенос синтезируемого рибосомой пептида с 3'-конца тРНК, связанной с Р участком рибосомы, на аминокислоту, связанную с тРНК, находящейся в А участке.

После переноса пептида возникает необходимость переместить молекулы тРНК из А и Р участков в Р и Е участки, чтобы освободить А участок для связывания следующей аа-тРНК. Вместе с тем, необходимо переместить мРНК на три нуклеотида, чтобы можно было считать следующий кодон. Согласно гипотезе, сформулированной Спириным и Бретшером, а затем подтвержденной Моазедом и Ноллером, перемещение тРНК (транслокация) происходит сначала на большой субчастице, а затем на малой. Транслокация катализируется фактором элонгации G (EF-G) в комплексе с GTP, который в ходе транслокации гидролизуется.

В начале 21 века изучение рибосомы вышло на качественно новый уровень. С помощью рентгеноструктурного анализа были определены с высоким разрешением структуры рибосомных субчастиц, а затем и всей рибосомы. Появилась возможность формулировать вопросы и предположения о назначении тех или иных “деталей” рибосомы и подвергать их экспериментальной поверке. Методы изучения структуры рибосомы - рентгеноструктурный анализ и криоэлектронная микроскопия помогли выявить несколько изменений структуры рибосомы в ходе биосинтеза белка. Однако, функциональная роль этих изменений не может быть установлена исключительно с помощью определения строения рибосом. Направленное изменение тех или иных элементов пространственной структуры с помощью мутаций и анализ мутантных рибосом позволяет понять роль этих элементов в процессе трансляции. В настоящее время изучение взаимосвязи структуры и функции рибосомы - это чрезвычайно динамично развивающаяся область биоорганической химии и молекулярной биологии. Более того, без понимания механизмов работы таких молекулярных устройств, как рибосома, невозможно представить себе дальнейший прогресс в создании искусственных молекулярных машин нанометровых размеров.

Цель работы. Понять роль ряда элементов рибосомной РНК в функционировании рибосомы.

Задачи:

1. Найти неизвестные ранее гены ферментов, проводящих модификацию рРНК, и определить роль модификаций рРНК в клетке.

2. Определить функциональную роль элементов 16S рРНК, участвующих в формировании структуры декодирующего центра.

3. Установить функциональную роль формы желоба 50S субчастицы, по которому аа-тРНК поступает в А участок.

4. Выяснить функциональную роль Е и Р/Е участков связывания тРНК в рибосоме.

5. Установить, какие элементы 23S рРНК обеспечивают аллостерическую связь Р/Е участка и участка связывания факторов элонгации. Определить, как происходит выбор между связыванием EF-G и EF-Tu при их конкуренции за общий участок связывания с рибосомой.

Научная новизна и практическая значимость. Все результаты работы получены впервые и не описаны ранее в научной литературе. В ходе выполнения работы впервые определены гены рРНК метилтрансфераз, модифицирующих основания G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК E. coli. Показано, что субстратом для метилтрансферазы YhhF, метилирующей NH₂ группу нуклеотида G966 16S рРНК, служит 30S субчастица. На основе пространственных структур 30S субчастицы и белка YhhF построена модель их комплекса. Предположено, что метилтрансфераза связывается с малой субчастицей в том месте, где в ходе функционального цикла рибосомы расположена антикодоновая петля тРНК, находящейся в Р участке. Субстратом метилтрансфераз YgjO и YcbY, модифицирующих нуклеотиды G1835 и G2445 23S рРНК, служит, как было показано, депротеинизированная рРНК. Метилированные нуклеотиды m²G1835 и m²G2445 23S рРНК расположены в области контакта субчастиц и в пептидилтрансферазном центре. Метилтрансфераза YbiN проводит монометилирование нуклеотида А1618 23S рРНК. Субстратом для нее служит промежуточный комплекс сборки 50S субчастицы, сходный с рибонуклеопротеидом, образующимся при частичной депротеинизации 50S субчастицы. Хотя отсутствие любой из обнаруженных в работе метилтрансфераз приводит к замедлению роста клеток, оно не нарушает работу рибосомы in vivo.

В работе разработана методология изучения функции рибосомной РНК с помощью мутагенеза. Впервые в мире разработан метод выделения рибосом, несущих аптамер в рРНК, с помощью аффинной хроматографии. В результате стало возможным выделять и изучать рибосомы, несущие летальные мутации. Собраны в одну систему методы изучения структуры рРНК и способы определения эффективности отдельных стадий трансляции.

Впервые получены мутации нуклеотидов 16S рРНК, участвующих в третичных взаимодействиях спирали 34 16S рРНК. Обнаружено, что мутации влияют на точность трансляции и предложено объяснение этого эффекта. Впервые доказано экспериментально, что нуклеотидные остатки U2492, C2556 и C2573 23S рРНК, образующие сужение на пути перемещения аа-тРНК в А участок не важны для скорости этого перемещения.

Детально изучен механизм аллостерической связи между Р/Е участком и участком связывания факторов элонгации. Впервые показано, что не отсутствие пептидной группы на тРНК, находящейся в Р участке, а способность этой тРНК перемещаться в Р/Е участок способствует связыванию EF-G и многократному не сопряженному с транслокацией гидролизу GTP. С помощью мутаций проверена возможность передачи аллостерического сигнала через спирали 38, 39, 89, 91, 95 (SRL) и 42 23S рРНК. Показано, что спираль 38 и петли спиралей 89 и 91 не участвуют в передаче сигнала. Мутации в спирали 39 способствовали стабилизации такой конформации 23S рРНК в составе рибосомы, при которой защищены от химической модификации нуклеотиды 23S рРНК, взаимодействующие с тРНК, связанной с Р участком. С помощью мутации в спирали 95 23S рРНК (SRL) было обнаружено, что гидролиз GTP не требует прочного взаимодействия EF-G с SRL. В тоже время, это взаимодействие необходимо для транслокации. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что гидролиз GTP элонгационным фактором G предшествует транслокации. Движение спиралей 43-44 23S рРНК (GAC), наблюдаемое при связывании с рибосомой факторов элонгации, было вызвано нами искусственно, вне зависимости от присутствия лигандов рибосомы, с помощью мутации в спирали 42 23S рРНК. Впервые показано, что движение GAC в сторону SRL не мешает связыванию аа-тРНК*EF-Tu*GTP с рибосомой и декодированию, но препятствует связыванию EF-G*GTP и транслокации. С помощью химической модификации выявлена сеть третичных взаимодействий, связывающая пептидилтрансферазный центр с центром связывания факторов элонгации. Предложена модель селективного связывания факторов элонгации с рибосомой в зависимости от того, какое положение занимает в ней GAC.

Результаты работы опубликованы в виде 10 статей в отечественных и 23 статей в зарубежных научных журналах, а также глав в 3 книгах и 2 методических разработках.

Уникальные методы, разработанные в работе, такие, как метод детекции протонированных оснований в рРНК и метод аффинной хроматографии рибосом могут быть использованы в институтах, занимающихся исследованиями в области биоорганической химии и молекулярной биологии как в нашей стране, так и за рубежом. Разработанная нами система выделения рибосом с помощью аффинной хроматографии уже была успешно использована в Университете Брауна, США. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, отвечают на многие вопросы о механизме функционирования сложных молекулярных машин и имеют фундаментальную научную ценность. Кроме того, выявленные в работе участки рРНК, необходимые для функционирования рибосомы, могут быть использованы как мишени для разработки новых видов антибиотиков.

Работа была поддержана грантами: РФФИ, HHMI, Fogarty, CRDF.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на нескольких десятках международных конференций, в том числе на ключевых международных конференциях по функции РНК и трансляции:

-The Ribosome: Structure, Function, Antibiotics, and Cellular Interactions, June 13-17, 1999, Helsingor, Denmark

- RNA2001, 6^th Annual meeting of the RNA society, May 29 -June 3, 2001, Banff, Canada

-Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, The Ribosome, May 31- June 5, 2001, Cold Spring Harbor, USA

- The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, 21-26 июнь, 2001, Москва-Ярославль-Москва, Россия

-International conference in honour of Alexander Spirin, Protein synthesis, 27 августа - 1 сентября, 2001, Пущино, Россия

-The Dynamics of Ribosome Structure and Function, January 27 - February 1, 2002, Queenstown, New Zealand

- RNA2003, 8^th Annual meeting of the RNA society, July 1-6, 2003, Vienna, Austria

- RNA2006, 11^th Annual meeting of the RNA society, June 20-25, 2006, Seattle, USA

- The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA - Protein Interactions", 19-24 августа, 2006, Московская обл., Россия

-Ribosomes: Form and Function, June 3-8, 2007, North. Falmouth, USA

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 286 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 85 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 405 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящее время определена структура комплексов рибосомы, находящейся на различных этапах ее функционального цикла, однако функциональная роль конформационных изменений рРНК в этих комплексах не очевидна. Целью работы было изучение функциональной роли потенциально важных элементов рРНК и их наблюдаемых или предполагаемых конформационных изменений в ходе работы рибосомы. Стратегия, выбранная нами для изучения рибосомы это сочетание направленного мутагенеза компонентов рибосомы и анализа функциональных последствий внесенных мутаций.

Поиск генов рРНК-метилтрансфераз, ответственных за метилирование нуклеотидов G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК

Рибосомные РНК E. coli содержат 36 модифицированных нуклеотидов. Модификацию этих остатков проводят 32 фермента, из которых 10 до сих пор неизвестны. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы крайне неравномерно. Большинство из них находятся в функциональных центрах рибосомы - декодирующем, пептидилтрансферазном и в местах контакта субчастиц. Отдельная группа модифицированных оснований сближена с туннелем, проходящим через большую субчастицу. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы еще более неравномерно относительно участков связывания лигандов. Большинство модифицированных нуклеотидов сближены с тРНК, находящимися в А и Р участках. Особенно богато минорными остатками окружение Р участка. Понять функциональную роль модификаций рРНК можно, только получив клетки и рибосомы, в которых та или иная модификация не происходит. Для этого необходимо определить гены, ответственные за модификацию нуклеотидов и инактивировать их.

В нуклеотидной последовательности генома E. coli нами был произведен поиск открытых рамок считывания, кодирующих белки, гомологичные известным РНК метилтрансферазам. Штаммы, в которых соответствующие участки ДНК были заменены на ген устойчивости к канамицину, были любезно предоставлены нам проф. Х. Мори (Япония). Из штаммов, в которых предполагаемые рРНК-метилтрансферазы были инактивированы, была выделена суммарная клеточная РНК, большинство из которой составляла рРНК. Для того, чтобы понять, привела ли инактивация генов к отсутствию той или иной модификации, мы использовали метод обратной транскрипции.

Нуклеотид m²G966 16S рРНК напрямую взаимодействует с нуклеотидом 34 антикодоновой петли тРНК (Рис. 1а). Метилтрансфераза, проводящая модификацию этого нуклеотида была неизвестна. Обратная транскрипция рРНК, выделенной из клеток дикого типа, останавливалась за один нуклеотид до m²G966 (Рис. 1б, дорожка 1). Остановка обратной транскрипции не происходила, если использовалась рРНК, выделенная из клеток, в геноме которых ген yhhF был заменен на ген устойчивости к канамицину (Рис. 1б, дорожка 2). При инактивации генов других рРНК метилтрансфераз (Рис. 1б, дорожки 3, 4) остановка обратной транскрипции за один нуклеотид до G966 по-прежнему наблюдалась. Необходимо было доказать, что именно инактивация гена yhhF, а не изменение его окружения в геноме, послужила причиной отсутствия модификации. Мы трансформировали штамм, в котором ген yhhF на хромосоме был заменен на ген устойчивости к канамицину, плазмидой, в которой был закодирован ген yhhF. Экспрессия гена yhhF , содержавшегося на плазмиде, компенсировала отсутствие гена yhhF в геноме (Рис. 1б, дорожка 5). Для того, чтобы показать, что белок YhhF без каких-либо дополнительных белков способен модифицировать G966, мы провели метилирование in vitro. Для этого нами были выделены 30S рибосомные субчастицы и 16S рРНК из штамма, в котором ген yhhF был инактивирован. Также, с помощью металлохелатной хроматографии на Ni-NTA агарозе был выделен рекомбинантный белок YhhF, содержащий гексагистидиновый “довесок”. Рекомбинантный YhhF метилировал G966 в составе 30S субчастиц (Рис. 1б, дорожка 6), но не был способен метилировать 16S рРНК (Рис. 1б, дорожка 8). Модификации не наблюдалось в отсутствии S-аденозил-L-метионина (SAM) (Рис. 1б, дорожки 7, 9), что позволяет отбросить маловероятную возможность того, что yhhF кодирует не метилтрансферазу, а специфическую рибонуклеазу.

Рисунок 1. Метилирование нуклеотида G966 16S рРНК и влияние этого метилирования на жизнеспособность E. coli.

А. Расположение m²G966 в пространственной структуре малой субчастицы. Красная лента - тРНК, оранжевая мРНК. Зеленым показан нуклеотид m²G966 (на него указывает стрелка), синим -m⁵C967, фиолетовым -m²G1207 16S рРНК. Б. Модификация нуклеотида G966 16S рРНК с помощью обратной транскрипции. A, C, G, U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 16S рРНК: (1) дикого типа; (2) штамма, в котором yhhF инактивирован; (3) штамма, в котором ygjO инактивирован; (4) штамма, в котором ycbY инактивирован; (5) штамма, в котором yhhF кодируется только плазмидой; (6) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF и SAM in vitro.; (7) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF in vitro; (8) обработанной белком YhhF и SAM in vitro; (9) обработанной YhhF in vitro; Нуклеотиды 16S рРНК подписаны слева. Использовали олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 995-1011 16S рРНК. В. Скорость вытеснения клеток штамма без yhhF, клетками дикого типа. По оси ординат - доля клеток без yhhF. По оси абсцисс - количество циклов разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток.

Рисунок 2. Пространственная структура YhhF (А) и модель структуры комплекса YhhF с рибосомой (Б).

Для оценки влияния модификации G966 на конкурентоспособность клеток, мы оценили эффективность вытеснения мутантного штамма из культуры клеток при совместной культивации с клетками дикого типа. Использовались различные среды и температуры культивации. Оказалось, что образование m²G966 дает клеткам небольшое преимущество при росте на богатой среде (Рис. 1в). Поскольку фенотип клеток, лишенных метилирования G966 был практически неотличим от дикого типа, мы сделали вывод о том, что маловероятна важная роль метильной группы, присоединенной к G966, в базовых стадиях трансляции. Возможно, метилирование G966 важно для регуляции работы рибосомы в каких-либо специфических, например, стрессовых условиях.

В нашей совместной работе с лабораторией проф. А. Йохимяка из Центра Структурной Геномики, США, была определена структура белка YhhF (Рис. 2а). Этот небольшой однодоменный белок имел пространственную укладку Россмана, сходную со структурами многих других метилтрансфераз. Интересно было сопоставить структуру этого фермента со структурой его субстрата, 30S субчастицы (Рис. 2б). Нуклеотидный остаток m²G966 расположен в углублении, образующем часть Р участка. В комплексе рибосомы с тРНК, m²G966 контактирует с наиболее далеко выступающим нуклеотидом антикодоновой петли тРНК и расположен практически в самом “глубоком” месте “щели”, в которой происходит связывание мРНК и антикодонов тРНК. Удивительно, как метилтрансфераза может контактировать со столь малодоступным нуклеотидным остатком. Возможно, именно этим обстоятельством объясняются малые размеры YhhF. Белок не содержит характерных для других ДНК и РНК метилтрансфераз дополнительных узнающих доменов. Напротив, сама форма YhhF способствует его связыванию с Р участком рибосомы, как это было показано при помощи созданной нами компьютерной модели (Рис. 2б). В отличие от большинства ферментов, в которых субстрат связывается во “впадине” активного центра белка, здесь фермент связывается в “активном центре” субстрата. субчастица хроматография рибосома мутагенез

Рисунок 3. Метилирование нуклеотидов G1835 и G2445 23S рРНК и влияние этого метилирования на жизнеспособность E. coli.

А. Модификация G1835 23S рРНК. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности.

Цифры соответствуют 23S рРНК: (1) штамма, в котором ygjO инактивирован; (2) дикого типа; (3) 50S субчастиц обработанных YgjO и SAM in vitro; (4) обработанная YgjO и SAM in vitro; (5) также, как (1); (6) штамма, в котором ygjO кодируется плазмидой; Полоса, соответствующая m²G1835, отмечена стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1874-1893 23S рРНК.

Б. Модификация G2445 23S рРНК. Обозначения дорожек, как для панели А, только для выделения рРНК использовали штамм, в геноме которого был инактивирован ген ycbY.

Этот же ген, закодированный на плазмиде использовали в опытах по комплементации. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2480-2496 23S рРНК.

В. Скорость вытеснения клеток штамма без ygjO клетками дикого типа. Показана доля клеток без ygjO. По оси абсцисс - количество циклов последовательного разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток.

Г. Тоже, что и на панели В, только использовали штамм без ycbY.

С помощью обратной транскрипции рРНК, выделенной из штаммов, в которых были инактивированы гены предполагаемых метилтрансфераз, были установлены гены, ответственные за модификацию нуклеотидов G1835 и G2445 23S рРНК. Ими оказались ygjO (Рис. 3а, дорожки 1 и 2) и ycbY (Рис. 3б, дорожки 1 и 2), соответственно.

Экспрессия генов метилтрансфераз, закодированных на плазмиде (Рис. 3а,б, дорожки 6), компенсировала отсутствие функциональных генов в геноме. В отличие от метилтрансферазы YhhF, субстратом которой служила 30S субчастица, метилтрансферазы YgjO и YcbY использовали депротеинизированную 23S рРНК в качестве субстрата (Рис. 3а,б, дорожки 4). Отсутствие генов ygjO и ycbY в геноме замедляло рост клеток и приводило к преимущественному размножению клеток дикого типа при совместном культивировании (Рис. 3в,г).

Особенно выраженным преимуществом обладали клетки дикого типа при выращивании на минимальной среде.



Рисунок 4. Метилирование нуклеотида А1618 23S рРНК.

А. Модификация нуклеотида А1618 23S рРНК. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности.

Цифры соответствуют 23S рРНК: (1) дикого типа; (2) штамма, в котором ybiN инактивирован; (3) штамма, в котором ybiN кодируется на плазмиде; (4) обработанной YbiN и SAM in vitro; (5) обработанной YbiN in vitro; (6) из частиц, депротеинизированных LiCl и обработанных YbiN и SAM in vitro. (7) из частиц, депротеинизированных LiCl, и обработанных YbiN in vitro. (8) из частиц, депротеинизированных NH₄Cl/EtOH, и обработанных YbiN и SAM in vitro. (9) из частиц, депротеинизированных NH₄Cl/EtOH и обработанных YbiN in vitro. (10) из 50S субчастиц, обработанных YbiN и SAM in vitro. (11) из 50S субчастиц, обработанных YbiN in vitro. Нуклеотид m⁶А1618, отмечен стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1760-1780 23S рРНК.

Б. Проверка наличия модификации нуклеотида А1618 23S рРНК с помощью MALDI-MS продуктов гидролиза фрагмента 23S рРНК с 1590 по 1620 нуклеотид РНКазой Т1.

Нуклеотид А1618 входит в состав олигонуклеотида ¹⁶¹⁴ACACAG¹⁶¹⁹p. Спектры соответствуют: (ybiN) штамм без ybiN; (WT) дикий тип; (ybiN pYbiN) штамм, в котором ybiN закодирован только на плазмиде;

Г. Скорость вытеснения клеток без ybiN клетками дикого типа. Показана пропорция клеток без ybiN. По оси абсцисс отложено количество циклов последовательного разведения культуры.

Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток. Условия культивирования (среда и температура), соответствующие представленным кривым, приведены справа.

Метилтрансфераза, осуществляющая модификацию нуклеотида m⁶A1618 23S рРНК, была выявлена с помощью обратной транскрипции (Рис. 4а) и масс-спектрометрии MALDI (Рис. 4б).

Эта метилтрансфераза была закодирована в гене ybiN E. coli. Примечательно, что эта метилтрансфераза использовала в качестве субстрата не депротеинизированную рРНК (Рис. 4а, дорожка 4) и не 50S субчастицу (Рис. 4а, дорожка 10), а исключительно частично депротеинизированную 3.5М LiCl частицу (Рис. 4а, дорожка 6), сходную с рибонуклеопротеидными комплексами, служащими промежуточным звеном при сборке большой субчастицы.

Особенностью YbiN было образование ковалентного соединения с рРНК в случае, когда субстрат подвергался обработке избытком фермента in vivo (Рис. 4а, дорожка 3) или in vitro (Рис. 4а, дорожка 6).

Наличие ковалентного соединения было показано с помощью со-выделения YbiN с 23S рРНК в денатурирующих условиях.

Рисунок 5. Расположение m⁶А1618 в пространственной структуре большой субчастицы. Показан “срез” структуры большой субчастицы, как если бы на нее смотрели от пептидилтрансферазного центра через туннель и удалили ее верхнюю, ближайшую к наблюдателю часть. Участки связывания белков L7 и белок L9 обозначены. Зелеными лентами показаны белки L22 и L34 (подписаны). Нуклеотид m⁶А1618 показан красным.

Отсутствие гена ybiN в геноме E. coli приводит к потере конкурентоспособности по отношению к клеткам дикого типа при совместном культивировании (Рис. 4в), особенно при росте на богатой среде.

Расположение нуклеотида m⁶A1618 в непосредственной близости от туннеля 50S субчастицы (Рис. 5) позволяет предположить, что метильная группа, переносимая YbiN, может быть необходимой для взаимодействия с туннелем регуляторных пептидов.

Тем не менее, среди четырех изученных в работе рРНК метилтрансфераз, мы не выявили ни одной, функционирование которой было бы необходимо для трансляции.

Идентификация генов рРНК метилтрансфераз служит непременным первым шагом на пути установления функции модифицированных оснований в рРНК. Скорее всего, эта функция связана с процессами регуляции трансляции или адаптации к стрессовым условиям.

Изучение функции элементов рРНК с помощью мутагенеза

Изменение элементов рРНК, не связанное с нарушением метилирования, возможно с помощью направленного мутагенеза. Для того, чтобы изучить, как та или иная мутация нарушает работу рибосомы, необходимо иметь возможность выделять мутантные рибосомы в чистом виде.

Получение мутантных рибосом в чистом виде возможно с помощью штаммов, лишенных рДНК оперонов в геноме, однако, таким образом можно изучать только рибосомы, сохраняющие функциональную активность.

Создание метода выделения рибосом, несущих летальные мутации

Изучение рибосом, несущих летальные мутации, таким способом невозможно. Мы создали метод выделения таких рибосом с помощью аффинной хроматографии.

сновой метода служит введение в рРНК участка, с высокой аффинностью взаимодействующего со смолой-носителем.

Подобный метод уже повсеместно используется для выделения белков, но только начинал применяться для выделения нескольких небольших РНК.

О применении аффинной хроматографии для очистки объектов масштаба рибосомы от практически идентичных рибонуклеопротеидов, отличающихся лишь коротким фрагментом РНК, не сообщалось.

Мы выбрали спирали 9, 25, 45, 63 и 98 23S рРНК для вставки аптамеров, поскольку в различных организмах длины этих спиралей варьируются.

В качестве аффинной вставки использовали участок связывания белка оболочки фага MS2, стрептомицин-связывающий аптамер и стрептавидин-связывающий аптамер.

Для выделения рибосом с помощью участка связывания белка оболочки фага MS2 нам был нужен гибрид белка оболочки фага MS2 с доменом, который мог бы прочно связываться с каким-либо аффинным сорбентом.

Была создана плазмида, кодирующая гибрид двух мономерных молекул белка оболочки и двух Z доменов белка А Staphylococcus aureus (Рис. 6а). Z домены белка А были нужны для связывания этого гибридного белка с IgG сефарозой. Участки связывания с РНК и с IgG сефарозой были разделены аминокислотной последовательностью, содержащей участок узнавания протеиназой TEV.

К сожалению, одновременного связывания гибридного белка и с рибосомой и с IgG сефарозой не наблюдалось. Возможно, это объясняется слишком коротким участком аминокислотной последовательности, соединяющим две части белка, РНК-связывающую и IgG-связывающую.



Рисунок 6. Схема аффинного связывания 50S субчастиц, содержащих различные аффинные довески, с соответствующим сорбентом.

А. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания белка оболочки фага MS2, с рекомбинантным белком и IgG сефарозой.

Б. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания стрептомицина со стрептомицин-сефарозой.

В. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания стрептавидина со стрептавидин - сефарозой.

Аптамер, связывающий стрептомицин, был присоединен к уже сделанной вставке в спираль 98 23S рРНК (Рис. 6б). Рибосомы, содержащие аптамер, связывали стрептомицин той областью 23S рРНК, которая содержала вставку. Об этом свидетельствовала защита нуклеотидов, входящих в состав аптамера, от химической модификации при связывании стрептомицина. Тем не менее, специфичного взаимодействия рибосом, несущих стрептомицин-связывающий аптамер со стрептомицином, иммобилизованном на агарозе, не удалось. Аминогруппы иммобилизованного стрептомицина превращали агарозу в анионообменную смолу, прочно и неспецифично взаимодействующую с рибосомами как содержащими аптамер, так и с рибосомами дикого типа.

Использование аптамера, взаимодействующего со стрептавидином (Рис. 6в), привело к желаемому результату. Для внедрения аптамера были выбраны спирали 9, 25 и 45 23S рРНК. Известно было, что вставки участка узнавания белка оболочки MS2 в эти спирали не сказывается на функциональной активности рибосом. Чтобы избежать проблем с отталкиванием такого крупного лиганда, как рибосома, от стрептавидин-сефарозы, была увеличена длина спирального участка, отделяющего аптамер от тех нуклеотидов 23S, где до вставки находились петли этих спиралей. Плазмиды pLK1192U, несущие вставки аптамеров в спирали 9, 25 и 45 могли служить единственным источником рРНК в клетках. Опыты показали, что чистые рибосомы дикого типа не связываются со стрептавидин-сефарозой. Рибосомы, несущие стрептавидин-связывающий аптамер, присоединенный к спиралям 25 и 45, связывались с аффинным сорбентом и элюировались биотином. Связывание с сорбентом рибосом, имеющих вставку аптамера в спираль 25, было на 30% лучше, чем связывание рибосом, содержащих вставку в спирали 45. Рибосомы, в которых стрептавидин-связывающая последовательность была введена в спираль 25 23S рРНК, были использованы для дальнейших опытов по аффинной очистке рибосом, содержащих летальные мутации 23S рРНК.

Изучение значимости для трансляции третичных взаимодействий спирали 34 16S рРНК

Спираль 34 это один из основных структурных элементов декодирующего центра рибосомы. Еще до определения структуры 30S субчастицы с помощью РСА функциональная важность спирали 34 в декодировании и терминации трансляции была выявлена с помощью мутагенеза. Опыты по фотоаффинному сшиванию, проведенные в нашей лаборатории, показали, что спираль 34 находится в контакте с частью мРНК, расположенной от 6 до 9 нуклеотидов к 3'-концу от кодона в Р участке. Взаимодействие спирали 34 с EF-G, было выявлено в ходе экспериментов по химической модификации, проведенных в лаборатории Винтермайера-Родниной.

Рисунок 7. Анализ влияния мутаций в спирали 34 на структуру и функционирование рибосомы.

А. Влияние мутаций на ассоциацию рибосомных субчастиц. Представлена пропорция 30S/70S. Wt - дикий тип, мутантные субчастицы подписаны. Черные столбцы соответствуют [Mg²⁺] 7 мМ, серые - 14 мМ, белые - 21 мМ.

Б. Влияние мутаций на частоту ошибок декодирования (черные столбцы) и сдвига рамки считывания -1 (белые столбцы) и +1 (серые столбцы). Высота столбцов соответствует частоте ошибок трансляции по сравнению с диким типом.

В. Влияние мутаций на частоту ошибочного прочтения терминационных кодонов, как смысловых. Черные столбцы соответствуют ошибочному прочтению кодона UGA, серые - UAA, белые - UAG.

Г. Анализ изменения структуры 16S рРНК, вызванного мутациями в спирали 34. A, C, G, U дорожки определения нуклеотидной последовательности. Wt - 16S рРНК дикого типа. DMS - обработка диметилсульфатом. Мутации подписаны. Для обратной транскрипции использовали олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 995-1011 16S рРНК.

Спираль 34 связана со спиралью 31 16S рРНК помощью третичного взаимодействия нуклеотидов U961 - A974 - A1201. Положение спирали 34 в пространстве, по-видимому, определяется структурой узла спиралей 34/35/38 16S рРНК.

По предсказанию Гутелла, основанном на сравнительном анализе последовательностей, нуклеотид С1109 находящийся в месте соединения спиралей 34/35/38 16S рРНК образует третичный контакт с парой оснований G933-C1384 16S рРНК.

Это взаимодействие также может фиксировать положение узла спиралей. Мы сделали мутации U961A, A1201U, и двойную компенсаторную мутацию U961A/A1201U чтобы определить, какую роль играет взаимодействие этих нуклеотидов в цикле трансляции.

Мутация C1109G должна была предотвратить взаимодействие нуклеотида в этом положении с парой оснований G933-C1384, если это взаимодействие действительно реализуется когда-либо в ходе трансляции. Замены A1191U, A1191C должны были ослаблять, а мутация A1191G разрушать структуру узла соединения спиралей 34/35/38.

Разрушение контакта U961 - A974 - A1201 как с помощью замены U961A, так и с помощью мутации A1201U приводило к нарушению ассоциации субчастиц рибосомы (Рис. 7а).

Восстановление взаимодействия с помощью двойной мутации U961A/A1201U возобновляло способность субчастиц к ассоциации. Скорее всего, разрушение контакта U961 - A974 - A1201 влияло на положение “головы” субчастицы относительно ее “тела” и эффективность образования межсубчастичных мостиков В1 группы. Мутация U961A приводила к большей точности декодирования (Рис. 7б) и меньшей эффективности терминации (Рис. 7в). Уровень точности декодирования восстанавливался при компенсаторной мутации U961A/A1201U (Рис. 7б), а эффективность терминации нет (Рис. 7в).

Скорее всего, это объясняется восстановлением при компенсаторной мутации лишь взаимодействия между нуклеотидами 961 и 1201, но не их взаимодействия с нуклеотидом 974. Об этом свидетельствует химическая модификация А974 диметилсульфатом (DMS) во всех трех мутантах (Рис. 7г). Измерение константы скорости транслокации, как однократной (перемещение тРНК), так и многократной (весь цикл работы EF-G) показало, что взаимодействие нуклеотидов U961 - A974 - A1201 для транслокации несущественно.

Рисунок 8. Предполагаемое влияние мутаций на конформацию головы малой субчастицы. Нуклеотиды, которые были мутированы показаны красным.

А. Мутация U961A может сдвигать спираль 34 16S рРНК (синяя) вниз.

Б. Мутации A1191C и A1191U могут приводить к движению головы к большой субчастице. Мутация A1191G может приводить к движению головы от большой субчастицы.

Мы объясняем эффект разрушения триады оснований U961 - A974 - A1201 на трансляцию механически. Из-за оппозиции двух аденозинов (961 и 1201) на 1-3Е увеличивается расстояние между спиралью 34 и верхней частью головы 30S субчастицы (Рис. 8а).

В свободных 30S субчастицах это приводит к сдвигу белка S13, вместе со всей верхней частью головы, и препятствует взаимодействию S13 с ASF и L5 большой субчастицы, т.е. образованию мостиков группы В1.

В рибосомах, стабилизированных тРНК, связанной с Р участком, образование мостиков происходит, но спираль 34 вынуждена “опуститься” на 1-3 Е “глубже” в декодирующий центр (Рис. 8а).

Это приводит к более “тесному” окружению антикодона тРНК в А участке, меньшему сродству тРНК к А участку и большей точности декодирования.

То же изменение структуры декодирующего центра препятствует проникновению в декодирующий центр доменов II/IV факторов терминации.

Фенотип мутаций A1191C и A1191U отличался от фенотипа мутации A1191G. Мутации A1191C и A1191U повышали частоту +1 сдвига рамки считывания и препятствовали терминации, в то время как A1191G - повышала частоту -1 сдвига рамки и не препятствовала терминации (Рис. 7б).

Пиримидиновые основания, меньшее объемные, чем аденин, могли вызывать компактизацию узла соединения спиралей 34/35/38. Гуанин, напротив, “раздвигал” укладку этого узла. В результате могло меняться положение всей спирали 34.

В случае компактизации узла соединения спиралей 34/35/38, спираль 34 сдвигалась по направлению к большой субчастице, а в случае увеличения размеров этого узла, от большой субчастицы. Вероятность -1 и +1 сдвига рамки считывания увеличивалась из-за того, что спираль 34 определяет 3'-границу А участка.

При перемещении в сторону большой субчастицы, эта спираль будет стремиться сдвинуть антикодон тРНК на один нуклеотид в сторону 5'-конца мРНК.

При возможности образования кодон-антикодоновых взаимодействий в -1 рамке считывания это приведет к сдвигу рамки.

Отклонение спирали 34 от большой субчастицы будет позволять антикодону тРНК, если это позволяет нуклеотидная последовательность мРНК, образовать кодон-антикодоновый дуплекс в +1 рамке.

Таким образом, положение спирали 34, фиксированное с помощью ее третичных взаимодействий, определяет размер декодирующего центра и, таким способом, минимизирует вероятность ошибок декодирования и сдвига рамки считывания.

Определение функциональной роли “желоба”, по которому аа-тРНК попадает в А участок.

На поверхности 50S субчастицы, между пептидилтрансферазным центром и участком связывания трансляционных факторов GTPаз проходит желоб, образованный спиралями SRL, 91, 90 и 89 23S рРНК “сверху” и L14 и спиралью 92 23S рРНК “снизу”.

По этому “желобу” движется аминоацилированный конец аа-тРНК, когда она перемещается от EF-Tu*GDP к PTC.

Перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок было подвергнуто компьютерному моделированию Санбонматсу и коллегами. Согласно компьютерной модели, аминоацилированный конец тРНК движется неравномерно.

Временная остановка перемещения аа-тРНК происходит перед сужением, образованном нуклеотидными остатками U2492, C2556 и C2573 спиралей 89, 91 и 90 23S рРНК, соответственно (Рис. 9а,б).

На основе компьютерной модели возникла гипотеза, что задержка перемещения аа-тРНК в А участок, вызванная этими “воротами”, необходима для повышения точности трансляции, поскольку при замедлении перехода аа-тРНК из А/Т в А/А участок аа-тРНК, несоответствующая кодону мРНК, будет иметь дополнительное время для ухода из рибосомы.

Мы сконструировали плазмиды, в которых в ген 23S рРНК были внесены замены С2573 на A, G и U, а также проведена делеция этого нуклеотида и соседнего нуклеотида А2572.

Предположительно, замена цитидина на более объемные пуриновые основания должна “сужать” коридор, через который проходит аа-тРНК. Мутации нуклеотида U2492 и его окружения планировались так, чтобы изменить вторичную структуру спирали 89, которой принадлежит этот остаток.

Для этой спирали можно предложить два варианта вторичной структуры (Рис. 9в). Тот вариант, который был определен методом РСА (Рис. 9в, слева), содержит три неспаренных основания.

Альтернативный, гипотетический вариант (Рис. 9в, справа) содержит лишь одно неспаренное основание.

Мы внесли в спираль 89 23S рРНК ряд мутаций, UUU2491-3UC, A2459G, U2491C, U2491C/A2459G, G2458C, U2491C/G2458C, каждая из которых влияла на предполагаемый переход между двумя альтернативными структурами.



Рисунок 9. “Ворота”, через которые происходит перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок.

А. Расположение “ворот” (показаны красным) в структуре 50S субчастицы.

Б. Нуклеотиды U2492, C2556 и C2573 во фрагменте вторичной структуры 23S рРНК.

В. Варианты вторичной структуры спирали 89 23S рРНК.

Слева - вариант вторичной структуры, определенный с помощью РСА.

Слева -, предсказанный на основе ковариационного анализа.

Г. Предполагаемое влияние мутаций в спирали 89 на ее вторичную структуру. Нуклеотиды, измененные с помощью мутагенеза, показаны красным.

Светло-серым показан тот вариант структуры, который, предположительно, дестабилизируется мутацией; черным - вариант структуры, который стабилизируется.

Среди введенных в 23S рРНК мутаций летальными оказались делеции нуклеотидов C2573 и А2572, а также замена UUU последовательности 2491-2493 на UC.

Остальные мутации в разной степени замедляли рост клеток, но не были летальными, даже если все рибосомы в клетке содержали мутацию. Измерение скоростей роста клеток позволило заключить, что мутации, дестабилизирующие “альтернативную” вторичную структуру не влияют на процесс трансляции.

Напротив, мутации, дестабилизирующие вторичную структуру, наблюдаемую при помощи РСА, приводили к замедлению роста клеток.

Мутация UUU2491-3UC, полностью исключающая образование вторичной структуры, наблюдаемой при помощи РСА, была летальна.

На основании этих наблюдений можно сделать вывод о том, что “альтернативная” вторичная структура не реализуется в ходе трансляции.

В чем причина летальности, вызываемой мутацией UUU2491-3UC?

Проверка эффективности связывания fMet-тРНК_f^Met с Р участком и Phe-тРНК^Phe с А участком показала, что мутация UUC2491-3UC приводит к снижению степени связывания тРНК на 20% с Р-участком и на 50% с А участком.

Эффективность переноса пептида, катализируемого мутантными рибосомами, была проверена с помощью гидролиза пептидил-тРНК, выделенной из комплекса с рибосомами, содержащими мутацию UUC2491-3UC и разделения продуктов гидролиза с помощью ВЭЖХ.

Оказалось (Рис. 10а), что эта мутация полностью ингибирует пептидилтрансферазную реакцию.

Полученный результат уникален, поскольку ни одна из изученных до сих пор мутаций не приводила к полному ингибированию переноса пептида на аминоацил-тРНК.

В литературе описаны лишь мутации, предотвращающие перенос пептида на пуромицин.

Поддержание вторичной структуры спирали 89 23S рРНК оказалась важным для пептидилтрансферазной реакции.

Рисунок 10. Влияние мутаций в элементах вторичной структуры, образующих “ворота”, через которые происходит перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок, на функционирование рибосомы.

А. Влияние мутации UUC2491-3UC в спирали 89 23S рРНК на пептидилтрансферазную реакцию. Доля тРНК, вступившей в реакцию транспептидации. Синие столбики - fMet-тРНК_f^Met, зеленые столбики - Phe-тРНК^Phe.

В. Зависимость доли Phe-тРНК^Phe переместившейся в А участок рибосомы от времени.

Нумерация кривых соответствует рибосомам дикого типа (1) и рибосомам, несущим мутации A2572U (2), C2573A (3), ?2573 (4) и ?2572 (5).

Можно было предположить, что мутации нуклеотидов С2572 и А2573 будут влиять на размер “ворот”, через которые проходит аа-тРНК.

В сотрудничестве с лабораторией Винтермайера-Родниной мы измерили константы скорости перемещения аа-тРНК в А участок рибосом, содержащих мутации A2572U, C2573A, ?2573 и ?2572.

Мы ожидали, что в соответствии с моделью Санбонматсу, мутация C2573A будет уменьшать, а ?2573 увеличивать скорость перемещения аа-тРНК в А участок.

Для измерения констант скоростей перемещения аа-тРНК в А участок использовали взаимодействие комплекса рибосом, содержащего fMet-тРНК_f^Met в Р участке с комплексом Phe-тРНК^Phe*EF-Tu*GTP.

Скорость перемещения аа-тРНК в А участок оценивали по образованию дипептида, поскольку скорость пептидилтрансферазной реакции на 2 порядка превышает скорость перемещения аа-тРНК.

Кинетические кривые, описывающие процесс перемещения Phe-тРНК^Phe в А участок рибосом и соответствующие константы скорости представлены на рисунке 10б.

Оказалось, что константы скорости перемещения аа-тРНК в А участок рибосом изменяются несущественно в результате мутаций A2572U, C2573A, ?2573 и ?2572 в 23S рРНК.

Это значит, что гипотеза Санбонматсу о важности размера “ворот”, образованных нуклеотидами С2573, U2492 и С2556, как фактора, определяющего скорость перемещения аа-тРНК не подтверждается.

Изучение роли Е участка в работе рибосомы с помощью мутации С2394G, препятствующей связыванию тРНК с Р и Р/Е участками

После переноса пептида с пептидил-тРНК, связанной с Р участком, на аминоацильный остаток тРНК, находящийся в А участке, комплекс рибосомы с мРНК и двумя тРНК должен претерпеть самую значительную конформационную перестройку в функциональном цикле рибосомы, транслокацию, катализируемую EF-G*GTP.

Первой стадией транслокации, не требующей гидролиза GTP, служит переход тРНК в гибридные участки.

Пептидил-тРНК переходит из А/А участка в А/Р участок, а деацилированная тРНК из Р/Р в Р/Е участок.

Присутствие деацилированной тРНК, связанной с Р участком способствует связыванию EF-G и увеличивает скорость цикла его работы, измеренную по скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP.

Оставалось неясным, что же служит сигналом для стимуляции связывания EF-G - отсутствие пептида, присоединенного к ССА концу тРНК, находящейся в Р участке или возможность перехода тРНК в гибридный Р/Е участок?

Кроме функциональной роли гибридного Р/Е участка оставалась неясной и роль самого Е участка.

Согласно представлениям группы Витермайера-Родниной, роль Е участка сводится к понижению энергетического барьера транслокации.

Согласно аллостерической модели рибосомы, предложенной Ниерхаусом, роль Е участка состоит также в поддержании рамки считывания и снижении числа ошибок декодирования.

Кроме того, считается, что связывание тРНК с Е участком прочное и разрушается только при взаимодействии с А участком следующей аа-тРНК в комплексе с EF-Tu*GTP.



Рисунок 12. Взаимодействие нуклеотидов А76 тРНК и С2394 23S рРНК и его влияние на связывание тРНК с рибосомой.

А. Пространственное окружение нуклеотида A76 тРНК.

Б. Зависимость степени связывания тРНК^Phe с рибосомами от соотношения тРНК/рибосома. Обозначение кривых указано справа. WT соответствует рибосомам дикого типа, G соответствует рибосомам, несущим мутацию C2394G. Присутствие или отсутствие полиуридиловой кислоты обозначено. тРНК, лишенные 3'-концевого остатка адениловой кислоты обозначены, как tRNA 3'-A.

В. Оценка эффективности отдельных стадий элонгационного цикла. Дорожки соответствуют: (1) рибосома, мРНК, кодирующая MFK пептид, fMet-тРНК_f^Met. Комплекс (2) образован из (1) добавлением Phe-тРНК^Phe*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Комплекс (3) образован из (2) с помощью добавления EF-G*GTP. Комплекс (4) образован из (3) с помощью добавления Lys-тРНК^Lys*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Цифры соответствуют расстоянию места остановки обратной транскрипции от А в инициаторном AUG кодоне. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 от инициаторного кодона. Рибосомы дикого типа - WT, несущие мутацию - C2394G.

Реакционная способность нуклеотида С2394 по отношению к DMS снижается при связывании тРНК с Е участком. С другой стороны, модификация этого нуклеотида DMS приводит к ингибирования связывания тРНК с Е участком. Недавно взаимодействие нуклеотида С2394 с 3'-концевым аденозином тРНК было прямо показано с помощью РСА (Рис. 12а). Известно, этот остаток аденозина необходим для связывания тРНК с Е участком.

Плазмида, несущая мутацию C2394G в гене 23S рРНК могла служить единственным источником рРНК в клетках. Время удвоения числа клеток получившегося штамма при росте на богатой среде при 37^оС было 1032 минуты. Штамм, трансформированный плазмидой, не несущей мутации С2394G, имел время удвоения 852 минуты. Мы решили проверить, действительно ли замена С2394G нарушает связывание тРНК с Е участком рибосомы? Мы определили число молекул деацилированной тРНК способное связаться с мутантными рибосомами (Рис. 12б).

Связывание транспортной РНК как с рибосомами дикого типа, так и с мутантными рибосомами в отсутствии мРНК ограничивается Р участком. В присутствии полиуридиловой кислоты (polyU) в качестве мРНК две молекулы тРНК^Phe, лишенной 3'-концевого аденозина, связывалась с рибосомами дикого типа и рибосомами, несущими мутацию С2394G. Значит, связывание тРНК с А и Р участками мутантных рибосом проходило нормально. Полноразмерная деацилированная тРНК^Phe в присутствии polyU связывалась с А, Р и Е участками рибосом дикого типа. Мутантные рибосомы могли связать только две молекулы тРНК, что свидетельствовало о нарушении связывания с Е участком.

Для прямого связывания тРНК с Е участком мы использовали комплекс рибосом с мРНК, кодирующей дипептид fMet-Phe (MF). Связывание AcPhe-тРНК^Phe с Р участком рибосомы, запрограммированной MF-мРНК (Табл. 1), приводило к тому, что AUG кодон, кодирующий метионин, оказывался в Е участке. Прямое связывание тРНК_f^Met могло проходить только с Е участком. Деацилированная тРНК хорошо связывалась с Е участком рибосом дикого типа. Е участок мутантных рибосом связывал в 4 раза меньше деацилированной тРНК (Табл. 1).

Таблица 1. Связывание деацилированной тРНК_f^Met с Е участком рибосом, запрограммированных мРНК, кодирующей MF пептид

Порядок добавления тРНК	Степень связывания тРНК (на рибосому)
	Рибосомы дикого типа	Рибосомы, несущие мутацию C2394G
	AcPhe-tRNAPhe (P-участок)	tRNAfMet (E-участок)	AcPhe-tRNAPhe (P-участок)	tRNAfMet (E-участок)
AcPhe-tRNAPhe	0.77 ± 0.04		0.95 ± 0.06
AcPhe-tRNAPhe, tRNAfMet	0.76 ± 0.03	0.44 ± 0.05	0.91 ± 0.06	0.11 ± 0.03

Чтобы проверить, насколько прочно тРНК связывается с Е участком мутантных рибосом после транслокации мы провели пошаговую трансляцию модельной мРНК, кодирующей пептид fMet-Phe-Lys (MFK). Эффективность прохождения отдельных шагов трансляции мы оценивали с помощью тоупринтинга (Рис. 12в).

...