Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК

Количество деацилированной 5'-[³²P]-тРНК_f^Met, находящейся в комплексе с рибосомами, измеряли с помощью связывания рибосом с нитроцеллюлозными фильтрами. Связывание деацилированной тРНК_f^Met с Р участком (Рис. 12в, дорожки 1; Табл. 2) и AcPhe-тРНК^Phe с А участком (Рис. 12в, дорожки 2) проходило одинаково эффективно для рибосом дикого типа и мутантных рибосом.

Транслокация (Рис. 12в, дорожки 3) не приводила к уходу деацилированной тРНК из комплекса с рибосомами дикого типа, которая оставалась связанной с Е участком. Транслокация деацилированной тРНК в Е участок мутантных рибосом приводила к диссоциации комплекса тРНК и рибосомы (Табл. 2). Только связывание Lys-тРНК^Lys*EF-Tu*GTP с А участком рибосом дикого типа (Рис. 12в, дорожки 4) приводило к диссоциации комплекса деацилированной тРНК с Е участком рибосомы (Табл. 2). Таким образом, мутантные рибосомы не были способны удерживать деацилированную тРНК в Е участке.

Таблица 2. Количество деацилированной тРНК_f^Met , связанной с рибосомой, на различных стадиях трансляции мРНК, кодирующей MFК пептид

Стадия трансляции in vitro	Степень связывания тРНКfMet (на рибосому)
	Рибосомы дикого типа	Рибосомы, несущие мутацию C2394G
Связывание tRNAfMet с P-участком	0.82 ± 0.01	0.83 ± 0.10
Связывание AcPhe-tRNAPhe с A-участком	0.76 ± 0.03	0.69 ± 0.05
Транслокация, катализируемая EF-G*GTP	0.70 ± 0.10	0.45 ± 0.08
Связывание Lys-tRNALys*EF-Tu*GTP с A-участком	0.45 ± 0.05	0.40 ± 0.04

Используя метод тоупринтинга для того, чтобы оценить эффективность отдельных шагов трансляции мы обратили внимание на то, что транслокация AcPhe-Lys-тРНК^Lys из А в Р участок мутантных рибосом происходит менее эффективно, чем транслокация AcPhe-Lys-тРНК^Lys из А в Р участок рибосом дикого типа (Рис. 12в, дорожки 4). Среди продуктов транслокации мутантных рибосом виден комплекс, сигнал тоупринтинга которого свидетельствует о произошедшем сдвиге рамки считывания (+22 нуклеотид от AUG кодона). Очевидно, что неспособность тРНК связываться с Е участком приводит к понижению эффективности транслокации и повышению вероятности сдвига рамки считывания.

Таблица 3. Частота ошибок трансляции в клетках дикого типа и клетках, несущих мутацию C2394G в 23S рРНК.

Плазмида, кодирующая ген-репортер	Тип ошибки трансляции, компенсирующей мутацию в гене lacZ	Клетки дикого типа	Клетки, несущие мутацию C2394G
pSG 853	Прочтение UAA, как смыслового	2.2 ± 0.6	7.3 ± 0.6
pSG 12-6	Прочтение UAG, как смыслового	7 ± 0.4	12 ± 0.5
pSG ѕ	Прочтение UGA, как смыслового	43 ± 2	64 ± 3
pSG lac7	Сдвиг рамки считывания +1	41 ± 2	74 ± 4
pSG 12DP	Сдвиг рамки считывания -1	44 ± 2	84 ± 5
f'CSH 103	Встраивание глютаминовой кислоты вместо глютамина	0.6 ± 0.1	0.6 ± 0.1
pSG25	Эффективность трансляции без ошибок	4280 ± 70	5990 ± 80
Приведены значения активности -галактозидазы в единицах Миллера. Чем выше активность, тем выше частота ошибок трансляции.

Наблюдается ли повышенная частота сдвига рамки считывания в клетках, экспрессирующих rrnB оперон, несущий мутацию C2394G? Для оценки частоты сдвига рамки считывания в клетках мы воспользовались набором плазмид, каждая из которых несла ген lacZ с мутацией. Получение ферментативно активной -галактозидазы могло произойти только если при трансляции происходила ошибка, компенсирующая мутацию в мРНК. Как показали результаты опыта (Табл. 3), мутация C2394G приводила к умеренному, примерно в 2 раза, повышению частоты как +1, так и -1 сдвига рамки считывания и не приводила к изменению частоты ошибок декодирования.

За счет чего рибосомы, несущие мутацию C2394G, оказались менее эффективны в реакции транслокации тРНК и мРНК, чем рибосомы дикого типа? Мы сравнили эффективность взаимодействия EF-G с рибосомами, имеющими мутацию C2394G, и рибосомами дикого типа. Связывание EF-G с рибосомами и их функциональными комплексами детектировали по защитам нуклеотидов А1067 (Рис. 13а) и А2661 23S рРНК от модификации DMS. Эффективность связывания EF-G с рибосомой падает в результате мутации C2394G. Влияние мутации C2394G на связывание EF-G можно объяснить только аллостерическим эффектом, поскольку расстояние между нуклеотидом 2394 23S рРНК и участком связывания EF-G равно примерно 100Е.

Рисунок 13. Оценка влияния мутации C2394G 23S рРНК на связывание и функционирование EF-G.

А. Влияние мутации С2394G 23S рРНК на взаимодействие EF-G с GAC. A, C, G, U дорожки определения нуклеотидной последовательности. К - немодифицированная 23S рРНК. WT - дикий тип, C2394 - рибосомы, несущие мутацию. Цифрами обозначены модифицированные DMS комплексы рибосомы: (1) без лигандов; (2) с мРНК, fMet-тРНК_f^Met, Phe-tRNA^Phe*EF-Tu*GTP, EF-G*GMPPNP; (3) с мРНК, fMet-tRNA_f^Met, Phe-tRNA^Phe*EF-Tu*GTP, EF-G*GTP и фусидовой кислотой; (4) с EF-G*GMPPNP; (5) с EF-G*GTP и фусидовой кислотой. Нуклеотид А1067 отмечен стрелкой справа. Для обратной транскрипции использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23S рРНК.

Б. Зависимость степени не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G от времени. Гидролиз стимулировали рибосомами дикого типа (серые круги), рибосомами, несущими мутацию C2394G (серые треугольники), комплексами рибосом дикого типа с polyU и тРНК^Phe (черные круги) и комплексами рибосом, несущими мутацию C2394G, с polyU и тРНК^Phe (черные треугольники).

Чтобы оценить влияние мутации C2394G 23S рРНК на суммарную скорость цикла работы EF-G, мы измерили скорость не сопряженному с транслокацией гидролиза GTP. В этом модельном опыте рибосомы или их комплекс с мРНК и деацилированной тРНК смешиваются с EF-G и с избытком GTP. Скорость обмена GDP на GTP для EF-G велика по сравнению со скоростью цепочки превращений, происходящих с EF-G при связывании с рибосомой.

Поэтому, скорость гидролиза GTP в выбранной экспериментальной системе отражает только суммарную скорость связывания рибосомы с EF-G, гидролиза GTP, конформационных превращений комплекса рибосомы с EF-G*GDP*Pi, выхода фосфат-иона, конформационных превращений комплекса рибосомы с EF-G*GDP и диссоциации этого комплекса. Таким методом не удается определить ту стадию функционального цикла EF-G, на которую влияет мутация C2394G 23S рРНК, но удается оценить влияние мутации на общую эффективность взаимодействия рибосомы с EF-G. Когда в Р участке рибосом находится деацилированная тРНК, суммарная скорость функционального цикла EF-G значительно возрастает. В претранслокационном комплексе, который служит естественным субстратом EF-G, в Р участке как раз находится деацилированная тРНК, в то время, как А участок занят пептидил-тРНК. Как это ни удивительно, для функционирования EF-G оказывается важным, что деацилированная тРНК занимает Р участок, даже если А участок свободен. Подобный вывод подтверждается также тем, что EF-G может катализировать транслокацию, только когда в Р участке находится полноразмерная тРНК. При этом достаточно, что в А участке находится только антикодоновая петля тРНК.

В соответствии с данными литературы, мы обнаружили, что деацилированная тРНК, связанная с Р участком рибосом дикого типа, оказывает стимулирующее влияние на скорость не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G (Рис. 13б). Рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК, слабо стимулировали не сопряженную с транслокацией GTPазную активность EF-G вне зависимости от того, была тРНК связана с Р участком или нет (Рис. 13в). Таким образом, нарушение связывания тРНК с Е участком нарушает взаимодействие EF-G с модельным комплексом, имитирующим претранслокационное состояние рибосомы.

Как мутация, ингибирующая связывание тРНК с Е участком, может препятствовать формированию комплекса рибосомы с деацилированной тРНК в Р участке, узнаваемому EF-G? Известно, что если с Р участком рибосомы связана деацилированная тРНК, ее акцепторный конец может перемещаться в Е участок большой субчастицы. Такая тРНК оказывается связанной с гибридным Р/Е участком. Для того, чтобы определить, с каким участком мутантных рибосом связана деацилированная тРНК, мы использовали метод химической модификации. В первую очередь подтверждено, что рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК не могут связывать тРНК в Е участок. На радиоавтографах, интенсивность полос, соответствующих модификации нуклеотидов G2112 и G2116 кетоксалем, практически не изменялась при связывании тРНК с Е участком мутантных рибосом (Рис. 14а, дорожки 1 и 4). Для рибосом дикого типа защита нуклеотидов G2112 и G2116 от модификации кетоксалем наблюдалась уже при связывании деацилированной тРНК с Р участком (Рис. 14а, дорожка 2). Взаимодействие тРНК с Е участком 50S субчастицы дикого типа сохранялось и при связывании двух тРНК (деацилированной тРНК_f^Met в Р участок и AcPhe-тРНК^Phe в А участок) (Рис. 14а, дорожка 3) и при последующей транслокации (Рис. 14а, дорожка 4). Защита нуклеотида U2585 23S рРНК дикого типа от модификации СМСТ возникала при связывании с рибосомой двух тРНК (деацилированной тРНК_f^Met в Р участок и AcPhe-тРНК^Phe в А участок) (Рис. 14б, дорожка 3). После транслокации, когда в Р участке рибосом оказывалась не деацилированная, а AcPhe-тРНК^Phe пониженный уровень модификации U2585 сохранялся (Рис. 14б, дорожка 4). Наши опыты свидетельствовали о связывании деацилированной тРНК в гибридный Р/Е участок как в комплексе рибосом дикого типа с одной тРНК, так и в претранслокационном комплексе рибосом дикого типа. Напротив, рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК, связывали деацилированную тРНК в “классический” Р/Р участок. Защита нуклеотидных остатков G2112 и G2116 от модификации кетоксалем, характеризующая взаимодействие с Е участком при связывании деацилированной тРНК, не наблюдалась (Рис. 14а, дорожка 2). Нуклеотид U2585 23S рРНК мутантных рибосом оказывался защищенным от модификации 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимидметил-п-толуолсульфонатом (CMCT) при связывании деацилированной тРНК (Рис. 14б, дорожка 2), что свидетельствовало о взаимодействии ССА конца тРНК с Р участком 50S субчастицы.

Связывание деацилированной тРНК происходит с Р участком рибосом, несущих мутацию C2394G в 23S рРНК, а не с Р/Е участком, как это наблюдается для рибосом дикого типа. Нарушение связывания тРНК с гибридным участком, вызванное мутацией, коррелирует с отсутствием стимуляции не сопряженной с транслокацией GTPазной активности EF-G связыванием деацилированной тРНК. Теперь мы можем утверждать, что не само отсутствие пептидной группы, а именно способность деацилированной тРНК перемещаться в гибридный Р/Е участок важно для функциональной активности EF-G в комплексе с рибосомами.

Рисунок 14. Оценка влияния мутации C2394G 23S рРНК на связывание тРНК с Е (А) и Р (Б) участками. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. К - немодифицированная 23S рРНК. WT - 23S рРНК дикого типа, C2394 - 23S рРНК, несущая мутацию. Цифры соответствуют комплексам рибосомы: (1) без лигандов; (2) с мРНК и тРНК_f^Met; (3) с мРНК, тРНК_f^Met и AcPhe-tRNA^Phe; (4) с мРНК, тРНК_f^Met, AcPhe-tRNA^Phe и EF-G*GTP. Нуклеотиды G2112, G2116 и U2585 отмечены стрелками. Использовали модификацию кетоксалем (А) и СМСТ (Б) и олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2281-2301 23S рРНК (А) и 2649-2667 23S рРНК (Б).

Гибридный Р/Е участок находится на расстоянии около 100Е от места связывания EF-G (Рис. 15). Как информация о переходе тРНК в Р/Е участок может влиять на EF-G? Между Р/Е участком и EF-G расположен пептидилтрансферазный центр, D петля 5S рРНК, спирали 80, 39, 42, 89, 91 23S рРНК и сам участок связывания EF-G, состоящий из GAC и SRL. Аллостерическая связь между Р/Е участком и EF-G должна осуществляться с помощью изменения конформации одного или нескольких из этих элементов структуры 50S субчастицы. Внося мутации в эти элементы, мы искали путь передачи аллостерического сигнала исходя их нескольких соображений.

Рисунок 15. Возможные участники конформационных перегруппировок, аллостерически связывающих Р/Е участок и участок связывания факторов элонгации. Разными цветами показаны и обозначены стрелками элементы 50S субчастицы, расположенные между Р/Е участком и участком связывания факторов элонгации. Расстояние от Е участка на большой субчастице до участка связывания факторов элонгации показано зеленой стрелкой.

Во-первых, структура 50S субчастицы, определенная с помощью РСА, выглядит монолитной (за исключением L1 пальца и GAC) и не позволяет точно идентифицировать подвижные элементы. Мы предполагаем существование нескольких конформаций элементов 50S субчастицы между Р/Е участком и участком связывания EF-G. Вносимые в 23S рРНК мутации могут влиять на конформационное равновесие и делать более стабильной ту конформацию, которая реализуется в процессе передачи аллостерического сигнала при функционировании EF-G, транслокации. В пользу такой интерпретации говорит сходный характер изменений структуры 23S рРНК, вызываемых мутациями в различных, удаленных друг от друга участках рРНК.

Во-вторых, мы ожидаем, что внося мутации в 23S рРНК на пути передачи аллостерического сигнала, мы нарушим эту передачу. Это значит, что EF-G перестанет различать, находится ли тРНК в Р/Е участке или нет. Теоретически, возможно создание мутаций 23S рРНК, вследствие которых EF-G будет либо все время взаимодействовать с рибосомой так, как если бы она содержала тРНК в Р/Е участке, либо наоборот, даже если тРНК и находится в Р/Е участке, EF-G слабо взаимодействует с таким комплексом, как будто тРНК в Р/Е участке нет. Дальнейшие разделы работы посвящены изучению с помощью мутагенеза функциональной роли элементов 23S рРНК между PTC и участком связывания EF-G.

Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В1а: укорочение ASF

Спираль 38 23S рРНК (Рис. 16а) образует длинный выступ большой субчастицы, так называемый “палец А участка” (ASF). Этот выступ достигает “головы” малой субчастицы и образует контакт с С-концевым доменом белка S13. При связывании EF-G*GDPNP, согласно литературным данным, субчастицы рибосомы поворачиваются друг относительно друга и ASF, вместо белка S13, начинает взаимодействовать с белком S19. Заманчиво было предположить, что разрыв В1а мостика будет способствовать спонтанной и ускорять EF-G зависимую транслокацию.

Для изучения функциональной роли мостика В1а мы провели делецию нуклеотидов 872-905 23S рРНК, составляющих оконечность ASF, взаимодействующую с 30S субчастицей. Мутация не была летальной. Клетки, все рибосомы которых были лишены В1а мостика, росли со скоростью одно удвоение в 1168 мин, в то время как клетки того же штамма, не содержащие мутации, удваивались каждые 878 мин. Измерение точности трансляции с помощью тестовых плазмид, кодирующих ген lacZ с мутациями, показало, что разрушение мостика В1а практически не влияет ни на прочтение стоп-кодонов как смысловых, ни не сдвиг рамки считывания, ни на ошибки декодирования.

Поскольку мы разрушили межсубчастичный мостик, сначала логично было проверить, влияет ли такая мутация на ассоциацию субчастиц? Оказалось, что рибосомные 50S субчастицы с делецией части спирали 38 требуют более высоких концентраций ионов магния, чтобы ассоциировать с малыми субчастицами. При концентрации Mg²⁺ 5мМ 70% 50S субчастиц дикого типа и 95% мутантных субчастиц не образовывали 70S рибосом. При концентрации Mg²⁺ 14мМ 85% 50S субчастиц дикого типа, но лишь 50% мутантных субчастиц находились в составе 70S рибосом. Даже при концентрации Mg²⁺ 21мМ, когда 90% субчастиц дикого типа ассоциировали с 30S субчастицами, лишь 60% субчастиц с укороченной спиралью 38 23S рРНК ассоциировали с малыми субчастицами. Таким образом, мы показали, что разрушение В1а мостика нарушает ассоциацию субчастиц.

Известно, что структура В1а мостика меняется при взаимодействии с EF-G. Скажется ли разрушение этого мостика на эффективность работы EF-G? С помощью тоупринтинга мы проверили, влияет ли укорочение спирали 38 23S рРНК на эффективность отдельных стадий цикла элонгации (Рис. 16в). Оказалось, что связывание fMet-тРНК_f^Met с Р участком рибосом (Рис. 16в дорожки 1), Phe-тРНК^Phe*EF-Tu*GTP с А участком рибосом (Рис. 16в дорожки 2) и транслокация, катализируемая EF-G*GTP (Рис. 16в дорожки 3,4) происходили с одинаковой эффективностью в случае рибосом дикого типа и рибосом с делецией нуклеотидов 872-905 23S рРНК. Можно сделать вывод о том, что все стадии элонгационного цикла рибосомы с нарушенным В1а мостиком выполняют с той же эффективностью, что и рибосомы дикого типа.

Рисунок 16. Делеция “пальца А участка” (ASF) и ее влияние на функционирование рибосом.

А. Фрагмент вторичной структуры 23S рРНК. В черный прямоугольник обведены нуклеотиды 872-905, удаленные с помощью мутагенеза.

Б. Расположение мостиков В1а (образованный ASF), В1b и B1c в пространственной структуре большой субчастицы рибосом.

В. Пошаговая трансляция in vitro.

Дорожки соответствуют функциональным комплексам рибосомы: (1) с мРНК и fMet-тРНК_f^Met. Комплекс (2) образован из (1) добавлением Phe-тРНК^Phe*EF-Tu*GTP+EF-Ts.

Комплекс (3) образован из (2) с помощью добавления EF-G*GTP. Комплекс (4) образован из (3) с помощью добавления Lys-тРНК^Lys*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Цифры соответствуют расстоянию от А в инициаторном AUG кодоне.

Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона. WT - дикий тип, 872-905-мутантные рибосомы.

Г. Зависимость от концентрации EF-G скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP, стимулированного рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, лишенными ASF (серые квадраты), комплексами рибосом дикого типа с polyU и тРНК^Phe (черные круги) и комплексами рибосом, лишенными ASF с polyU и тРНК^Phe (серые круги).

Рисунок 17. Влияние делеции ASF на структуру 23S и 5S рРНК.

A, C, G, U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Wt - дикий тип, - рибосомы, несущие делецию ASF Модификация проводилась DMS, котоксалем (Ket) и CMCT.

Un - без модификации. Нуклеотиды, меняющие реакционную способность, показаны стрелками.

Использовали олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1104-1120 (А), 2281-2301 (Б), 2591-2611 (В), 2886-2903 (Г) 23S рРНК и 102-120 (Д) 5S рРНК.

Для того, чтобы определить влияние делеции нуклеотидов спирали 38 23S рРНК на скорость функционирования EF-G, мы измерили скорость не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP элонгационным фактором G, стимулированным рибосомами дикого типа и мутантными рибосомами (Рис. 16г), а также комплексами рибосом с polyU и деацилированной тРНК^Phe.

За исключением несколько меньшей скорости гидролиза GTP, стимулированной комплексом мутантных рибосом с polyU и деацилированной тРНК^Phe, по сравнению с тем же комплексом рибосом дикого типа, никаких существенных отличий найдено не было. Этот результат свидетельствует против того, что В1а мостик и его изменения в ходе транслокации существенны для работы EF-G.

Для нас было интересным оценить, как отсутствие мостика В1а сказывается на структуре рибосомы. Мы повели химическую модификацию рибосом, у которых спираль 38 содержала делецию нуклеотидов 872-905 DMS, кетоксалем и CMCT (Рис. 17).

Спираль 38 взаимодействует с Е петлей 5S рРНК и спиралью 81 23S рРНК. Спираль 81, в свою очередь, связана со спиралью 80, т.н. Р петлей 23S рРНК. Между спиралями 80 и D-петлей 5S рРНК расположена спираль 39 23S рРНК.

Весь этот узел третичной структуры 23S рРНК оказался измененным под влиянием делеции конца спирали 38 23S рРНК. Нуклеотиды U2249, G2250 и G2255 Р петли (спирали 80), U89 D петли 5S рРНК и G956 спирали 39 23S рРНК стали более реакционноспособными по отношению к химическим реагентам (Рис. 17 а,б,д).

Некоторые из этих нуклеотидных остатков вовлечены в третичные взаимодействия сами, некоторые соседствуют с нуклеотидами, вовлеченными в третичные взаимодействия с нуклеотидами спиралей 42 и 89.

Две последние спирали расположены между PTC и центром связывания трансляционных факторов GTPаз, состоящим из GAC и SRL (Рис. 15). Очевидно, что эти спирали несколько изменили свое положение в пространстве как единое целое.

Этим можно объяснить влияние делеции нуклеотидов 872-905 на реакционную способность нуклеотидов G2529 и G2751, участвующих в третичных взаимодействиях со спиралями 89 и 42, соответственно.

Изучение роли взаимодействия между спиралями 39 23S рРНК и D петлей 5S рРНК в формировании структуры PTC и участка предполагаемой передачи аллостерического сигнала

Петля спирали 39 расположена между Р петлей 23S рРНК, взаимодействующей с ССА концом тРНК, находящейся в Р участке, и D петлей 5S рРНК (Рис. 15).

Спираль 39 расположена таким образом, что может участвовать в передаче аллостерического сигнала от Р/Е участка к месту взаимодействия с EF-G. Делеция части ASF привела к усилению степени модификации нуклеотида G956 петли спирали 39 кетоксалем (Рис. 17в). Спираль 39 привлекла наше внимание еще до определения пространственной структуры 50S субчастицы рибосомы. В нашей лаборатории, с помощью фотоаффинного сшивания, было обнаружено, что D петля 5S рРНК соединяет спирали 39, 42 и 89 23S рРНК.

Эти спирали сближены с GAC и PTC во вторичной структуре 23S рРНК. Именно тогда, еще до определения структуры большой субчастицы рибосомы с атомарным разрешением, в нашей лаборатории была сформулирована гипотеза о передаче аллостерического сигнала между PTC и участком связывания EF-G. Замены нуклеотида А960 на G, C и U оказались не летальными. Рибосомы, несущие эти мутации могли поддерживать жизнь клеток, в которых не было рибосом дикого типа.

Замены A960G и А960U практически не меняли времени удвоения клеток, составляющему 1191 минута для клеток дикого типа, 1078 минут для клеток, несущих мутацию А960G в 23S рРНК и 1253 минуты для мутанта А960U. Замена нуклеотида А960 на цитидин (А960С) замедляла рост клеток (время удвоения 1754 минуты).

Мы использовали химическую модификацию рибосом DMS, кетоксалем и CMCT для определения нуклеотидных остатков 23S и 5S рРНК, изменяющих свою конформацию в результате мутаций нуклеотида А960. Как и ожидалось, мутации изменяли структуру петли спирали 39 и D петли 5S рРНК (Рис. 18 а,б).

Степень изменения реакционной способности коррелировала со степенью влияния мутаций на скорость роста клеток.

Наибольшее отличие от дикого типа имели рибосомы, несущие мутацию А960С. Кроме нуклеотидов, непосредственно взаимодействующих со спиралью 39, мы обнаружили еще несколько нуклеотидов 23S рРНК, которые меняли свою реакционную способность по отношению к DMS, кетоксалю или CMCT при мутациях А960 (Рис. 18 в-ж). Эти нуклеотиды были расположены вблизи, либо входили в состав PTC. Наиболее удивительным было то, что нуклеотиды G2251, G2252, U2506, U2585, защищаемые от химической модификации при связывании тРНК с Р участком рибосом, также оказывались защищены в рибосомах, несущих мутации А960 (Рис. 18 г,е,ж).

Рисунок 18. Влияние мутаций нуклеотида А960 на структуру 23S. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Нуклеотид 960 23S рРНК обозначен над дорожками. RNA - депротеинизированная рРНК дикого типа. Обработка проводилась DMS, кетоксалем (Kethoxal) и CMCT. Un -без обработки. Нуклеотиды, изменяющие реакционную способность, показаны стрелками. Использовали олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2591-2611 (А, Б), 1049-1059 (В), 2886-2903 (Г), 2281-2301 (Д) 2730-2749 (Ж) 23S рРНК.

Особенно сильным было изменение реакционной способности нуклеотидов PTC при замене А960С. Нарушение структуры спирали 39 23S рРНК приводит к конформационному изменению ПТЦ, делающему недоступными для химической модификации нуклеотиды, взаимодействующие с тРНК в Р участке.

Рисунок 19. Расположение нуклеотидов, степень модификации которых уменьшалась (синие) или увеличивалась (красные) при мутациях нуклеотида А960 23S рРНК. Зеленым показана спираль 89 23S рРНК.

Можно было предположить, что подобное изменение структуры, также делает эти нуклеотиды недоступными для взаимодействия с тРНК. В таком случае мы можем иметь дело со стабилизацией конформации 50S субчастицы, при которой нарушено взаимодействие тРНК с Р участком большой субчастицы. Эта конформация может реализовываться в ходе транслокации, при перемещении тРНК в участки А/А + Р/Е.

Пространственное расположение нуклеотидов, которые меняют конформацию в результате мутации А960С представлено на рисунке 19. Эти нуклеотиды образуют третичные взаимодействия между спиралями 39, 89, 91, 92 23S рРНК и D петлей 5S рРНК. Изучение рибосом, несущих мутации нуклеотида А960, подтвердило, что 50S субчастица имеет участки конформационной подвижности между PTC и местом связывания EF-G. Необходимо было определить, какой из элементов большой субчастицы, расположенных между двумя ее функциональными центрами, необходим для передачи аллостерического сигнала.

Изучение роли взаимодействия между спиралями 89 и 91 23S рРНК в функционировании факторов трансляции - GTPаз

Петли спиралей 89 и 91 23S рРНК находятся между GAC и SRL, двумя участками связывания факторов трансляции, имеющих GTPазную активность (Рис. 15). Хотя реакционная способность нуклеотидов спиралей 89 и 91 по отношению к химическим модифицирующим реагентам не меняется при связывании EF-G с рибосомой, IF2 защищает нуклеотиды A2476 и A2478 спирали 89 23S рРНК от модификации DMS.

Участок 23S рРНК, изменяющий свою реакционную способность по отношению к DMS при связывании фактора, участвует в третичных взаимодействиях со спиралью 91 23S рРНК. Эти две спирали связывает неканоническая, так называемая обращенная Уотсон-Криковская пара C2475 - G2529. Для изучения функциональной важности этих взаимодействий в 23S рРНК были введены мутации: C2475G, двойная мутация C2475G/G2529C и делеция пары A2471 - U2479.

Мутация C2475G, не разрушала взаимодействие спирали 89 с петлей спирали 91. Псевдокомпенсаторная мутация C2475G/G2529C наоборот, приводила к разобщению спиралей 89 и 91. Делеция A2471/U2479 приводила к тому, что петля спирали 89 смещалась от участка взаимодействия с трансляционными факторами GTPазами к PTC.

Взаимодействие со спиралью 91 также нарушалось. Все мутации оказались не летальными, и соответствующие мутантные рибосомы могли осуществлять трансляцию в клетках, в которых отсутствовали рибосомы дикого типа. Скорость роста клеток штамма, в котором все рибосомы имели мутацию C2475G (время удвоения 878 мин) не отличалась от скорости роста штамма, в котором функционировали только рибосомы дикого типа (время удвоения 858 мин).

Мутация C2475G/G2529C приводила к увеличению времени удвоения клеток до 13410 мин. Укорочение спирали 89 (A2471/U2479) приводило к самому сильному замедлению роста (время удвоения 22016 мин).

Для оценки роли взаимодействия петель спиралей 89 и 91 в поддержании точности трансляции мы использовали систему плазмид, в которых был закодирован ген lacZ.

Мутации, внесенные в этот ген, могли быть компенсированы ошибками при трансляции считанной с него мРНК.

Оказалось, что взаимодействие петель спиралей 89 и 91 не важно для поддержания точности декодирования.

Эффективность отдельных стадий трансляции, осуществляемой мутантными рибосомами, мы оценивали с помощью метода тоупринтов. Для этих опытов использовали мРНК, кодирующую пептид MFK.

Связывание fMet-тРНК_f^Met с Р участком, связывание Phe-тРНК^Phe*EF-Tu*GTP с А участком и транслокация проходили одинаково эффективно с рибосомами дикого типа и мутантными рибосомами.

Кроме того, все типы мутантных рибосом были способны стимулировать не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP элонгационным фактором G в той же степени, что и рибосомы дикого типа.

Получив подобные результаты, мы пришли к заключению, что взаимодействие спиралей 89 и 91 не важно для функционирования ни EF-Tu, ни EF-G и вообще для элонгации трансляции.

Согласно литературным данным, петля спирали 89 взаимодействует с инициаторным фактором 2. Этот фактор, как EF-Tu и EF-G, связывает GTP, однако, катализирует другой процесс - отбор fMet-тРНК_f^Met и ассоциацию субчастиц при инициации. Связывание IF2*GDPNP с рибосомами мы детектировали, наблюдая за защитой оснований 23S рРНК от химической модификации (Рис. 20а).

Поскольку было известно, что IF2 E. coli связывается с рибосомой слабо и не способен защищать нуклеотиды 23S рРНК от химической модификации, мы использовали IF2 T. thermophilus. Как было известно, взаимодействие IF2 с рибосомой приводит к уменьшению реакционной способности нуклеотида А2665 и повышению реакционной способности нуклеотида А2660 23S рРНК по отношению к DMS.

Все мутантные рибосомы были способны связывать IF2*GDPNP, однако степень связывания отличалась у рибосом, несущих мутации.

Оценка степени связывания IF2*GDPNP проводилась с помощью сравнения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 по отношению к DMS.

Мы использовали такой своеобразный “внутренний контроль”, чтобы небольшие отличия в интенсивности дорожек радиоавтографа соответствующего полиакриламидного геля, в котором разделяли продукты обратной транскрипции, минимально влияли на результаты нашей оценки. Мутация A2471/U2479 не влияла на связывание с рибосомой IF2*GDPNP (Рис. 20а).

Одиночная замена C2475G немного (примерно на 20%) ухудшала взаимодействие IF2 с рибосомой (Рис. 20а). Двойная мутация C2475G/G2529C приводила к снижению эффективности изменения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 23S рРНК на 60% (Рис. 20а).

Ни одна из изученных мутаций не приводила к полному ингибированию связывания IF2 с рибосомой, что вполне согласуется с тем, что мутации не были летальными.



Рисунок 20. Влияние мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК на инициацию трансляции.

А. Оценка взаимодействия IF2 с SRL и влияние на нее мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК. A, C, G и U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Для модификации использовали DMS. Un- 23S рРНК без модификации. WT-дикий тип, 89 -мутация C2475G, 89/91 - мутации C2475G/G2529C, - делеция A2471/U2479. Дорожки, находящиеся справа в отделенных вертикальными лилиями столбцах соответствуют рибосомам без лигандов; Дорожки, находящиеся слева в отделенных вертикальными лилиями столбцах соответствуют комплексам рибосом и IF2*GDPNP. Нуклеотиды А2660 и А2665 отмечены стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК.

Б. Зависимость от концентрации рибосом скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP инициаторным фактором 2, стимулированного рибосомами дикого типа (квадраты), рибосомами, несущими мутацию C2475G (ромбы), рибосомами, несущими мутацию C2475G/G2529C (треугольники) и рибосомами, несущими делецию пары нуклеотидов A2471/U2479 (круги).

В. Оценка с помощью тоупринтинга влияния IF2 на образование инициаторного комплекса. Дорожки соответствуют: (К) мРНК; (-) комплексам рибосомы, мРНК, fMet-тРНК_f^Met, IF1 и IF3; (+) комплексам рибосомы, мРНК, fMet-тРНК_f^Met, IF1, IF2 и IF3. Полоса, соответствующая инициаторному комплексу, отмечена цифрой +16. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона. Подписи дорожек - как на панели (А).

Рисунок 21. Влияние мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК на структуру 23S.

A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили DMS, кетоксалем (Ket) и CMCT. Un - без модификации.

Подписи дорожек, как для рис. 20. Нуклеотиды, степень модификации которых зависела от мутаций, показаны стрелками. Для обратной транскрипции использовали олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2591-2611 (А, Б), 1049-1059 (В), 2886-2903 (Г) и 2281-2301 (Д) 23S рРНК.

Опыты по изучению связывания IF2 с рибосомой были дополнены измерением GTPазной активности IF2, индуцируемой рибосомами (Рис. 20б). Рибосомы, несущие укороченную спираль 89 (A2471/U2479) хуже, чем рибосомы дикого типа, способствовали гидролизу GTP инициаторным фактором 2.

Рибосомы, несущие мутации C2475G и C2475G/G2529C, были более эффективны в стимуляции GTPазной активности IF2. Кажущееся противоречие между результатами измерения связывания с рибосомами и GTPазной активности IF2 можно объяснить.

Сходный феномен наблюдался в лаборатории Далберга при изучении связывания и не сопряженной с транслокацией GTPазной активности EF-G. Объяснение подобных результатов состоит в том, что фактор трансляции может связаться с рибосомой, гидролизовать GTP, и покинуть рибосому, не выполнив свою функцию - то или иное изменение конформации функционального комплекса рибосомы.

Прочное связывание, необходимое для выполнения функции, препятствует “холостому” гидролизу GTP.

Как же мутации в спиралях 89 и 91 влияют на выполнение фактором IF2 своей функции - сборке комплекса рибосом с мРНК, содержащего fMet-тРНК_f^Met в Р участке?

Для ответа на этот вопрос мы использовали метод тоупринтов. Для определения влияния IF2 на сборку инициаторных комплексов сравнивали интенсивности сигналов тоупринтинга, соответствующих инициаторным комплексам, собранным в присутствии всех трех инициаторных факторов и в присутствии только IF1 и IF3 (Рис. 20в).

Все мутантные рибосомы были способны образовывать инициаторный комплекс, и для всех мутантных рибосом присутствие IF2 способствовало сборке этого комплекса.

Количественные оценки показали, что для мутации A2471/U2479 23S рРНК, активность IF2 в сборке инициаторного комплекса снижена на 30%. Мутации C2475G и C2475G/G2529C 23S рРНК снижали эффективность работы IF2 вдвое.

Эти результаты хорошо согласуются с интерпретацией результатов оценки связывания IF2 с рибосомой и измерения GTPазной активности IF2, стимулируемой рибосомами.

Мутации C2475G и C2475G/G2529C 23S рРНК приводят к тому, что возрастает вероятность диссоциации комплекса IF2*GDP с рибосомой без образования инциаторного комплекса.

Такое “холостое” связывание приводит к перерасходу GTP и снижению эффективности инициации трансляции. Слишком прочное связывание IF2, характерное для рибосом, несущих делецию пары оснований в спирали 89, также замедляет инициацию, препятствуя уходу IF2.

Петли спиралей 89 и 91 находятся на предполагаемом пути передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка большой субчастицы к EF-G (Рис. 15). Хотя мутации, нарушающие взаимодействие этих петель, не сказываются на функционировании EF-G, нам показалось интересным выяснить, какие изменения они вызывают в конформации 23S рРНК?



Рисунок 22. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК во вторичной (А) и пространственной (Б) структуре 50S субчастицы. Черные линии соединяют те нуклеотиды, которые участвуют в третичных взаимодействиях. Красными треугольниками (А) и черными сферами (Б) отмечены нуклеотиды, реакционная способность которых повышается при мутациях в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК. Черные прямоугольники - места мутаций.

Возможно, не прервав цепь передачи аллостерического сигнала полностью, мутации могли сместить равновесие конформеров 23S рРНК. Обнаружение нуклеотидов 23S рРНК, которые изменили свою реакционную способность в результате мутаций в спиралях 89 и 91, позволило бы выявить подвижные элементы 23S рРНК, расположенные между PTC и участком, взаимодействующим с факторами элонгации.

Химическая модификация рибосом, несущих мутации C2475G, C2475G/G2529C и A2471/U2479 23S рРНК, проводилась с помощью DMS, кетоксаля и CMCT. Степень модификации тех или иных оснований 23S рРНК определялась с помощью обратной транскрипции. Были обнаружены несколько нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых по отношению к используемым реагентам менялась в результате мутаций (Рис.21). Степень изменения конформации рРНК, вызванная мутациями, коррелировала с замедлением скорости роста клеток. Замена C2475G 23S рРНК практически не вызывала изменений реакционной способности нуклеотидов 23S рРНК (Рис. 21). Двойная мутация C2475G/G2529C привела к изменению реакционной способности нуклеотидов G2472, G2475(место мутации), A2476, U2477, C2529(место мутации), A2534 23S рРНК в спиралях 89 и 91 (Рис. 21 а,б). Очевидно, что двойная мутация привела к нарушению взаимодействия между спиралями 89 и 91. Кроме нуклеотидов, сближенных с местом мутации, изменили конформацию несколько нуклеотидов 23S рРНК, расположенных на расстоянии. Так, стали более доступны для реакции с кетоксалем нуклеотиды G956 (Рис. 21в) и G2751 (Рис. 21г), принадлежащие петлям спиралей 39 и 97 23S рРНК. Обе эти петли участвуют в третичных взаимодействиях с удаленными во вторичной структуре 23S рРНК участками (Рис. 22 а).

Возможно, что эти третичные взаимодействия могут нарушаться в ходе передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка к EF-G. Нуклеотид G956 расположен в непосредственной близости от PTC (Рис. 22 а,б), а нуклеотид G2751 образует третичный контакт со спиралью 42 23S рРНК (Рис. 22 а,б), соединяющей GAC с оставшейся частью 23S рРНК. Делеция нуклеотидов A2471/U2479 23S рРНК приводит к изменению реакционной способности тех же нуклеотидов 23S рРНК, что и мутация C2475G/G2529C, но дополнительно изменяет конформацию еще нескольких нуклеотидов (Рис. 21). В спирали 89 оказываются реакционноспособными по отношению к кетоксалю нуклеотиды G2470 и G2481 (Рис. 21 а). Это наблюдение свидетельствует о разрушении части вторичной структуры спирали 89. Неожиданным было обнаружить, что мутация A2471/U2479 23S рРНК приводит к усилению модификации нуклеотида А2225 23S рРНК DMS (Рис. 21 д). Нуклеотид А2225 расположен в основании L1 пальца большой субчастицы, с противоположной стороны от GAC и спиралей 89 и 91. Хотя петлю спирали 89 и нуклеотид А2225 разделяет значительное расстояние (Рис. 22 б), они связаны двумя длинными спиралями 89 и 75, симметрично расположенными относительно PTC (Рис. 22 а,б). Можно предположить, что участок связывания факторов элонгации и L1 палец аллостерически связаны спиралями 89 и 75. К этому выводу можно также прийти, в результате анализа структуры комплекса рибосомы с EF-G*GDPNP, определенной методом криоЭМ. Два самых подвижных элемента большой субчастицы, GAC и L1 палец, подвержены в этом комплексе скоординированному перемещению в сторону центрального протуберанца большой субчастицы.

Изучение роли нуклеотида G2655 SRL 23S рРНК в связывании EF-G и транслокации

Элонгационный фактор G взаимодействует с двумя элементами 23S рРНК - SRL и GAC. Сарцин-рициновая петля абсолютно необходима для взаимодействия рибосомы с элонгационными факторами. Апуринизация А2660 рицином и разрезание связи между нуклеотидами G2661 и А2662 сарцином приводит к инактивации рибосом. Нуклеотидный остаток G2655 защищается от модификации кетоксалем при связывании с рибосомой факторов элонгации. Мутации этого нуклеотида G2655C и G2655U были описаны как летальные. Применение криоЭМ позволило определить, что SRL взаимодействует с участком связывания GTP элонгационными факторами. Можно было предположить, что это взаимодействие необходимо для гидролиза GTP.

Мы провели замены нуклеотида G2655 23S рРНК на A, C и U. Мутация G2655U, в отличие от ранее опубликованных данных, оказалась не летальной, замена G2655А не влияла на функционирование рибосом. Однако, мутация G2655C была летальной, и мы использовали рибосомы, несущие эту мутацию в дальнейших опытах.

Рисунок 23. Оценка влияния мутации G2655С 23S рРНК на связывание и функционирование EF-G.

А. Оценка взаимодействия EF-G с GAC и влияние на нее мутации G2655С 23S рРНК. A, G -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили DMS, Unmod -немодифицированная 23S рРНК WT - дикий тип, G2655С - рибосомы, несущие мутацию. Дорожки: (-EF-G) рибосомы без лигандов; (EF-G) комплекс рибосом и EF-G*GTP; (EF-G+Fus) комплекс рибосом, EF-G*GTP и фусидовой кислоты. Нуклеотид А1067 отмечен стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23S рРНК.

Б. Оценка взаимодействия EF-G с SRL и влияние на нее мутации G2655С 23S рРНК. Обозначения соответствуют таковым для панели A. Нуклеотиды А2660 и G/С2655 отмечены стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК.

В. Зависимость степени не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G от времени. Гидролиз стимулировали рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, несущими мутацию G2655С (черные треугольники), рибосомами дикого типа в присутствии фусидовой кислоты (серые квадраты) и рибосомами, несущими мутацию G2655С в присутствии фусидовой кислоты (серые треугольники).

Г. Изучение влияния мутации G2655С 23S рРНК на эффективность транслокации. Белые столбцы соответствуют функциональным комплексам рибосом дикого типа, черные - комплексам рибосом, несущих мутацию G2655С 23S рРНК. (1) рибосомы, polyU и AcPhe-тРНК^Phe; (2) комплекс (1) + AcPhe-тРНК^Phe; (3) комплекс (2) + EF-G*GTP.

Мы оценивали связывание EF-G с рибосомами по степени модификации нуклеотидов А1067 (Рис. 23а) и А2660 DMS (Рис. 23б). Основание А1067 принадлежит GAC, а А2660 - SRL. Оценивая степень модификации этих нуклеотидов, можно было получить ответ на вопрпос, взаимодействует ли EF-G с GAC и взаимодействует ли он с SRL. Оказалось, что связывание EF-G с GAC не было подвержено влиянию мутации G2655C (Рис. 23а). В то же время, заимодействие EF-G с SRL в результате этой мутации было значительно ослаблено (Рис. 23б).

Было известно, что SRL взаимодействует именно с той частью EF-G, которая связана с GTP. Влияет ли мутация G2655C 23S рРНК на стимуляцию GTPазной активности EF-G рибосомами? Мы использовали не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, для оценки способности EF-G взаимодействовать с рибосомами и осуществлять гидролиз гуанозин - 5'- трифосфата (Рис. 23в).

Оказалось, что рибосомы, несущие мутацию G2655C 23S рРНК, стимулируют не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, осуществляемый EF-G, в той же степени, что и рибосомы дикого типа (Рис. 23в). Может быть, эта мутация вообще не влияет на функционирование EF-G?

Для оценки эффективности транслокации, катализируемой EF-G, мы использовали пуромициновую реакцию (Рис. 23г). Способность мутантных рибосом к транслокации была значительно, примерно в 3 раза, снижена. В этом опыте мы не измеряли скорость транслокации, а лишь выход этой реакции за 10 минут.

Такой низкий уровень транслокации в течении длительного для элонгационного цикла рибосомы времени свидетельствовал о том, что в клетке рибосомы, несущие мутацию G2655C должны быть практически неактивны в трансляции, что и объясняет летальность мутации. За те же 10 минут мутантные рибосомы стимулировали количественный гидролиз 100-кратного избытка GTP, осуществляемого EF-G. Значит, рибосомы, имеющие мутацию G2655C 23S рРНК, связывают EF-G*GTP и стимулируют гидролиз трифосфата, после чего комплекс рибосомы с EF-G*GDP диссоциирует без прохождения конформационных изменений, необходимых для транслокации.

Сходное явление было описано в литературе для EF-G, в котором домены I и V были сшиты дисульфидной связью. Такой, “конформационно-ограниченный” EF-G взаимодействовал с GAC 50S субчастицы дикого типа и не взаимодействовал с SRL. Отсутствие взаимодействия с SRL не препятствовало гидролитической активности EF-G, но делало транслокацию невозможной. Мы наблюдали практически такой же эффект, нарушая взаимодействие EF-G с SRL с помощь мутации G2655C. Основываясь на результатах этих опытов, можно предложить, в какой последовательности происходят конформационные превращения комплекса EF-G с рибосомой. Взаимодействие EF-G с GAC (или GAC-связывающими белками L11 и L7/L12) первично. Для него не требуется “разгибания” субдоменов I-III и IV-V. Взаимодействие EF-G с GAC приводит к гидролизу GTP. Затем, для катализа транслокации, необходимо изменить взаиморасположение субдоменов EF-G. Это изменение конформации EF-G требует стабилизации, достигаемой дополнительно возникающим взаимодействием EF-G с SRL. GAC и SRL оказываются не просто двумя частями участка связывания EF-G, но и элементами, активно участвующими в изменении конформации EF-G, и в транслокации.

Изучение движения GAC как основного конформационного изменения, необходимого для связывания EF-G. Роль GAC в связывании EF-G и EF-Tu.

Факторы элонгации EF-G и EF-Tu взаимодействуют с двумя участками 50S субчастицы - GAC и SRL. По данным криоэлектронной микроскопии, в комплексе рибосомы с EF-G*GDPNP GAC сдвинут в сторону центрального протуберанца. Затем, после гидролиза GTP, рибосома принимает ту конформацию, которую она имела до связывания EF-G. В структуре комплекса рибосомы с аа-тРНК*EF-Tu*GDPNP, GAC немного смещается в сторону спирали 89 23S рРНК, принимая “полузакрытую” конформацию, которая затем, после гидролиза GTP, превращается в “закрытую”. Изменение положения GAC можно наблюдать также, сравнивая пространственные структуры 50S субчастиц H. marismortui и D. radiodurans. Очевидно, что GAC это подвижная структура и ее положение относительно других компонентов 50S субчастицы зависит от функционального состояния рибосомы.

Рисунок 24. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от перемещений GAC.

А. Фрагмент вторичной структуры 23S рРНК. Стрелками показаны нуклеотиды 23S рРНК, реакционная способность которых изменяется при вставке в спираль 42 23S рРНК. Нуклеотид G2655 становится менее доступным для модификации кетоксалем. Все остальные нуклеотиды, отмеченные стрелками увеличивают свою реакционную. Прямоугольник- вставка пары нуклеотидов.

Б. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от перемещений GAC 23S рРНК в пространственной структуре 50S. Красным показаны нуклеотиды, которые увеличивают свою реакционную при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК.

Синим показан нуклеотид G2655, который уменьшат свою реакционную способность при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК.

В. Элементы вторичной структуры 23S рРНК, которые меняют конформацию при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Обозначения те же, что и для панели А. Элементы вторичной структуры 23S рРНК подписаны. Зеленой стрелкой показано направление движения.

Почему GAC может перемещаться относительно других элементов большой субчастицы? Дело в том, что GAC представляет собой разветвленную шпильку, соединенную с оставшейся частью 23S рРНК одной спиралью 42.

Эта спираль взаимодействует со спиралью 89 в своем начале и имеет изгиб, образованный т.н. К-поворотом. Мы решили проверить, насколько важен поворот спирали 42 23S рРНК, ведущий к “закрытой” конформации GAC для связывания и функционирования факторов трансляции. Было интересно также выяснить, сопровождается ли переход в эту конформацию другими изменениями структуры 50S субчастицы.

Для того, чтобы зафиксировать GAC в “закрытой” конформации вне зависимости от функционального состояния рибосомы, мы ввели в спираль 42 вставку С-G пары после пары оснований C1030-G1124 23S рРНК (Рис. 24а).

Вставка пары оснований в спираль РНК приводит к удлинению спирали на 3-3.5Е и повороту нуклеотидов спирали, следующих за вставкой на 30-36^о. В случае спирали 42, имеющей изогнутую Г-образную форму, вставка пары оснований будет приводить к смещению GAC в стороны спирали 89 и образованию “закрытой” конформации (Рис. 24в).

Перемещение GAC в сторону спирали 89 23S рРНК и образование контакта с этой спиралью должно было сопровождаться изменением реакционной способности нуклеотидов спирали 89 и, возможно, тех элементов структуры 50S субчастицы, которые образовывали третичные взаимодействия с этой спиралью.

Для проверки этого предположения мы провели химическую модификацию мутантных рибосом DMS, кетоксалем и CMCT. Степень модификации нуклеотидов 23S рРНК определяли с помощью обратной транскрипции (Рис. 25).

Множество нуклеотидов 23S рРНК в результате мутации InsC1030/G1124 изменяли свою реакционную способность по отношению к модифицирующим реагентам (Рис. 25). Эти нуклеотиды была рассеяны во вторичной структуре 23S рРНК (Рис. 24а), но оказались сгруппированы в пространственной структуре 50S субчастицы (Рис. 24б,в). Большинство оснований, степень модификации которых химическими реагентами зависела от присутствия мутации InsC1030/G1124, сгруппированы вокруг спирали 89 23S рРНК.

Одни нуклеотиды этой группы напрямую участвуют в образовании третичных взаимодействий с этой спиралью, другие участвуют в третичных взаимодействиях со спиралями 23S рРНК, в свою очередь, находящихся в контакте со спиралью 89 23S рРНК (Рис. 24б,в). Область изменения конформации рРНК, вызванная переходом GAC в “закрытое” состояние находится между PTC и участком взаимодействия с факторами элонгации (Рис. 24б,в). Интересно, что изменение положения GAC вызвало, в свою очередь, изменение конформации SRL (Рис. 24, 25).



Рисунок 25. Влияние вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК на структуру 23S. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. wt - дикий тип; I - вставка пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Модификацию проводили DMS, кетоксалем (Kethoxal) и CMCT. Unm - без модификации. Нуклеотиды, степень модификации которых зависела от мутации, показаны стрелками. Для обратной транскрипции использовали олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1104-1120 (А, Б), 1190-1210 (В), 2081-2100 (Г), 2281-2301 (Д), 2591-2611 (Е, Ж), 2730-2749 (З, И), 2886-2903 (К, Л) 23S рРНК.

...