Взаимоотношения чумного микроба (Yersinia pestis) и блох (Siphonaptera) (на примере сибирских природных очагов чумы)

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА (YERSINIA PESTIS) И БЛОХ (SIPHONAPTERA) (НА ПРИМЕРЕ СИБИРСКИХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ЧУМЫ)

Базанова Любовь Петровна

03.00.16 - экология

Иркутск - 2008

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Антропогенная трансформация ландшафтов, вовлечение территорий природной очаговости чумы в хозяйственную деятельность человека, существующая угроза террористических актов с использованием биологических объектов могут привести к пока непредсказуемым последствиям, что определяет необходимость усиления контроля за особо опасными инфекциями, в том числе, чумой (Anisimov et al., 2004; Смирнова, Кутырев, 2006; Eisen et al., 2006; Трухачев, Лебедева, 2006, 2007).

Природный очаг чумы - сложная экологическая система. Трофические связи в этой системе между чумным микробом (Yersinia pestis), носителями инфекции (теплокровными животными) и переносчиками (блохами - Siphonaptera) обеспечивают формирование трансмиссивного пути поддержания энзоотии (Bacot, Martin, 1914; Иофф, 1941; Бибикова, Классовский, 1974; Williams, Cavanaugh, 1983; Korenberg, 1989; Литвин, Коренберг, 1999; Иннокентьева и др., 1999; Атшабар, 1999; Анисимов и др., 2001).

Актуальность настоящей работы обусловлена следующим:

1. Сибирские природные очаги чумы (Забайкальский, Тувинский и Горно-Алтайский) в России являются северной окраиной Центрально-Азиатской зоны природной очаговости этой инфекции, основная часть которой расположена на территории Монголии и Китая (Сафонова, Саран, 1974; Голубинский и др., 1987; Попов и др., 2005). В Монголии и Китае ежегодно регистрируются вспышки заболевания людей чумой, и в последние годы прослеживается тенденция к увеличению числа заболевших (Tserennorov et al., 2003; Enkhbaatar.et al., 2003; Марамович и др. 2008).

На территории двух горных природных очагов Сибири (Тувинского и Горно-Алтайского) эпизоотии регистрируют ежегодно. При этом в Тувинском очаге с 1989 г. наблюдается трансформация сообществ носителей и переносчиков и расширение ареала чумного микроба (Галацевич, 1994; Вержуцкий, 2005). В Горно-Алтайском очаге происходит изменение структуры таксоценоза блох с возрастанием доли одних видов и сокращением численности других (Корзун, 2007).

2. Большинство культур чумного микроба, изолированных в сибирских очагах, получено от массовых видов блох. Так, в Тувинском очаге чумы на долю этих насекомых приходится 70,6 % штаммов возбудителя (Вержуцкий, 2005), Горно-Алтайском - 82,6 % (Корзун, 2007). Учитывая высокую естественную зараженность блох чумным микробом, считается более эффективным контролировать эпизоотическую ситуацию на территории природных очагов посредством борьбы с переносчиками, чем с носителями инфекции (Очиров и др., 1999; 2000; Вержуцкий и др., 2002; Матросов и др., 2004; Попов и др., 2004; Lorange et al., 2005; Никитин и др., 2005).

Результативность такого контроля зависит от глубоких знаний фауны, экологии, особенностей взаимоотношений блох с чумным микробом. Однако весь комплекс взаимоотношений чумного микроба и блох, влияющих на закономерность трансмиссии возбудителя в природных очагах Сибири, недостаточно исследован. Очевидна необходимость выявления таких особенностей, которые уточняют и расширяют наши представления о механизме энзоотии чумы. Изучение закономерностей системы паразит-хозяин, отношений между сочленами данной паразитарной системы (переносчик-чумной микроб) актуальны, поскольку напрямую связаны с проблемой эпидемиологического надзора и совершенствованием мероприятий по неспецифической профилактике этой инфекции.

Цель и основные задачи исследования

Цель работы - выявление особенностей взаимоотношений чумного микроба и блох, обеспечивающих трансмиссивный механизм поддержания энзоотии чумы в сибирских природных очагах.

Задачи:

1. Определить сезонную динамику процесса блокообразования у блох, их заражающей способности, роль самок и самцов этих эктопаразитов в трансмиссии чумного микроба.

2. Установить влияние абиотических факторов на алиментарную активность, смертность блох и их взаимоотношения с чумным микробом.

3. Рассмотреть возможность реализации и эпизоотологическую значимость второстепенных способов передачи чумного микроба блохами.

4. Оценить влияние межвидовых и межпопуляционных особенностей блох на их взаимоотношения с чумным микробом.

5. Установить особенности контактов между географически разобщенными популяциями чумного микроба и блох и исторически не контактировавшими с возбудителем чумы насекомыми и микробом.

6. Определить значение явления агрегированности чумного микроба в организме имаго блох для его передачи и сохранения насекомыми.

7. Выявить основные механизмы устойчивости сибирских природных очагов чумы, экологически связанные с блохами-переносчиками.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые для сибирских природных очагов чумы установлена сезонная динамика блокообразования у блох и передачи чумного микроба этими насекомыми. Максимальные значения данных показателей в экспериментах совпадали по времени с пиком эпизоотии в природном очаге. Выявлено, что при кровососании на лабораторных животных (белых мышах), не имеющих выраженных сезонных различий в чувствительности к возбудителю чумы, динамика заражающей способности насекомых реализуется аналогично отмеченной при питании на длиннохвостом суслике. Это может указывать на коэволюцию эктопаразитов и чумного микроба, ритм взаимоотношения которых сохраняется при смене прокормителя.

Впервые показано, что процессы распространения и сохранения чумного микроба блохами связаны с полом насекомого: первый лучше осуществляется самцами, второй - самками. У самцов большинства массовых видов блох чаще и в более короткие сроки возникает «блок» преджелудка, чем у самок, и они активнее осуществляют передачу микроба.

Выявлены межпопуляционные различия во взаимоотношениях переносчиков с чумным микробом в Тувинском природном очаге. Более активное взаимодействие (по частоте формирования в организме насекомых бактериальных «глыбок») отмечены в парах (блоха - чумной микроб), происходящих с одного участка очаговости, или обитающих на участках со сходными биоценотическими характеристиками.

Впервые обнаружена возможность установления функциональных контактов между чумным микробом и блохами исторически не контактировавшими с возбудителем (с неочаговых по чуме территорий, внутривидовыми гибридами). Выявлена связь между уровнем флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков у насекомых и их векторной активностью.

Впервые установлено, что инфицированные «неблокированные» особи Citellophilus tesquorum altaicus - основного переносчика в Тувинском природном очаге - способны более 600 суток сохранять чумной микроб и осуществлять его передачу длиннохвостым сусликам. При массовом питании «неблокированных» блох исходом такой передачи является развитие острой генерализованной формы инфекции у зверьков, или подострое течение заболевания с бактериемией, достаточной для заражения насекомых. У чувствительных к возбудителю чумы животных при укусах даже небольшого числа таких блох развивается острая форма инфекции с агональной септицемией.

Выявлено, что второстепенные способы передачи чумного микроба инфицированными насекомыми (внесение через поврежденную кожу зверька из раздавленных блох и их экскрементов, при поедании эктопаразитов грызуном) при определенных условиях могут быть не менее эффективными, чем укусы «блокированных» блох, приводить к заболеванию зверьков с генерализацией инфекции и обеспечивать дальнейшую трансмиссию возбудителя.

Впервые показано, что состояние агрегированности чумного микроба в организме переносчика, сопровождающееся изменением морфологии и ультраструктуры микроорганизма, обусловливает не только его способность к блокообразованию и дальнейшей трансмиссии, но и сохранение микроорганизма при неблагоприятных условиях окружающей среды.

На основании изложенных материалов могут быть обоснованы следующие теоретические положения. Первое - трансмиссия чумного микроба в природных очагах Сибири осуществляется преимущественно укусами «неблокированных» особей массовых видов блох, содержащих конгломераты микроба. Второе - агрегированная форма чумного микроба в организме блох - его особое состояние, определяющее как трансмиссию, так и сохранение микроорганизма в зимний сезон, что обеспечивает непрерывность его циркуляции в сибирских горных очагах чумы и их устойчивость.

Практическая значимость. Работа проведена в рамках выполнения семи научных тем Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока: «Разработка методов борьбы с носителями и переносчиками в плане оздоровления природных очагов Сибири» // № госрегистрации 81004192. - Иркутск, 1985; «Оценка современного состояния сибирских очагов чумы и изучение факторов их устойчивости при проведении оздоровительных мероприятий» // № госрегистрации 01860020801. - Иркутск, 1990; «Изучение роли Л-форм в персистенции чумного микроба в природных очагах Сибири» // № госрегистрации 01860020809. - Иркутск, 1990; «Оптимизация эпидемиологического надзора в сибирских природных очагах чумы» // № госрегистрации 01910033788. - Иркутск, 1995; «Совершенствование системы эпизоотологического мониторинга в сибирских очагах чумы в связи с обеспечением эпидемиологического благополучия населения» // № госрегистрации 01960000188. - Иркутск, 2001; «Оптимизация методов регуляции численности синантропных членистоногих (блохи, комары, тараканы) в условиях крупного города» // № госрегистрации 01980010186. - Иркутск, 2002; «Популяционно-экологические аспекты природной очаговости чумы в Сибири в связи с ее профилактикой» // № госрегистрации 012000113852. - Иркутск, 2005.

На основании выполненных экспериментальных работ рекомендовано применять противочумным станциям при проведении бактериологического исследования блох и клещей наряду со стандартными средами сухую питательную среду, предназначенную для выделения Л-форм чумного микроба (ЛС). Применение среды ЛС позволило повысить результативность эпизоотологического обследования сибирских очагов чумы на 25-30 %.

Материалы диссертации включены в нормативно-методические документы федерального и регионального уровня: «Методические рекомендации по повышению результативности исследований эктопаразитов в природных очагах чумы» (Иркутск, 1990), «Паспорт Тувинского природного очага чумы» (Иркутск, 2000), «Методические указания. Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций» (М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002), «Методические рекомендации по эпизоотологическому обследованию Тувинского природного очага чумы» (Иркутск, 2004), «Методические рекомендации по лабораторному разведению блох для научных исследований» (Саратов, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту

1. В сибирских горных природных очагах чумы, несмотря на их различные характеристики по гостальности и векторности, основным механизмом поддержания энзоотии является трансмиссия чумного микроба инфицированными «неблокированными» блохами.

2. Блокообразование как специфический способ передачи чумного микроба блохами имеет выраженную сезонную динамику, обусловленную половыми и возрастными особенностями эктопаразитов и адаптацией к ним возбудителя. Наиболее активен этот процесс в пик эпизоотии в природном очаге.

3. Второстепенные способы передачи чумного микроба блохами могут быть в определенных условиях эффективными и играть существенную роль в циркуляции микроба в природных очагах Сибири.

4. Возможно установление функциональных контактов между чумным микробом и переносчиками из географически разобщенных популяций (из разных природных очагов), а также между возбудителем и блохами, никогда не контактировавшими с чумным микробом (насекомые с неочаговых территорий и межподвидовые гибриды блох). Адаптация Yersinia pestis к экологическим особенностям блох увеличивает способность микроба приживаться в их организме, о чем свидетельствует связь уровня ФА билатеральных признаков насекомых с частотой блокообразования.

5. Агрегированность чумного микроба является функцией его адаптации к организму блох и отражает векторную способность переносчиков.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на научно-практической конференции «Профилактика природноочаговых инфекций» (Ставрополь, 1983); Х конференции Украинского общества паразитологов (Киев, 1986); X Съезде Всесоюзного энтомологического общества (Ленинград, 1989); региональном совещании противочумных учреждений по эпидемиологии, эпизоотологии и профилактике особо опасных инфекций (Уральск, 1989); межгосударственной научно-практической конференции «Организация эпиднадзора при чуме и меры ее профилактики» (Алма-Ата, 1992); региональной научно-практической конференции «Проблемы природноочаговых инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке» (Чита, 1993); научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 1998); IY международном симпозиуме по блохам (Казахстан, Алматы, 1999); Первой международной юбилейной конференции «Актуальные проблемы инфектологии и паразитологии» (Томск, 2001); юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе», посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ (Ставрополь, 2002); научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и YIII съезде Итало-Россйского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002); международной конференции «Проблемы современной паразитологии» и III съезде Паразитологического общества при РАН (Петрозаводск, 2003); конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра (Москва, 2004); YII межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ» (Оболенск, 2005); I Всероссийском совещании по кровососущим насекомым (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Синантропизация растений и животных» (Иркутск, 2007); YIII межгосударственной научно-практической конференции государств-участ-ников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007).

Личный вклад соискателя. Лабораторные эксперименты и полевые исследования, а также анализ материалов проведены при непосредственном участии автора. На полевые исследования затрачено 275 дней, на экспериментальные (работа с зараженным материалом) - 2006 дней, из них 739 непосредственно в природных очагах чумы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 72 работы, в том числе 32 в научных журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, 40 - в других журналах, научных трудах и материалах международных, всесоюзных, региональных конференций (на русском, английском, китайском и монгольском языках).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, семи глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 325 страницах, иллюстрирована 35 рисунками и 60 таблицами. Список использованной литературы включает 488 источников, из них 121 в иностранных изданиях.

Благодарности. Автор признателен за помощь и поддержку администрации и сотрудникам зоолого-паразитологического, эпидемиологического отделов, лаборатории экспериментальных животных Иркутского научно-иссле-довательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, специалистам Тувинской противочумной станции. Искренне благодарю Т.И. Иннокентьеву, А.Г. Трухину, Ю.Д. Очирова, М.П. Маевского, А.Я. Никитина, А.Ф. Попкова, В.Т. Климова, Д.Б. Вержуцкого, Е.А. Вершинина, В.М. Корзуна, Е.Г. Токмакову, Е.А. Чипанина, Г.А. Воронову за разнообразную помощь в проведении исследований и подготовке диссертации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

чумной микроб блоха

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ВЗАИМООТНОШЕНИЯХ ЧУМНОГО МИКРОБА И БЛОХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Рассмотрены представления о природном очаге чумы как экологической системе (Павловский, 1947, 1960, 1964; Беклемишев, 1956; Балашов, 1972; Korenberg, 1982, 1989; Коренберг, 1983, 1985, 1986; Леви, 1985; Литвин и др., 1998; Литвин, Коренберг, 1999; Атшабар, 1999), особенностях взаимоотношений чумного микроба и блох (Pollitzer, 1954; Иофф, 1941; Бибикова, Классовский 1974; Алексеев, 1989; Ващенок, 1999; Анисимов и др., 2002; Anisimov et al., 2004; Hinnebusch, 2005), состоянии агрегированности (биопленке) микроба в организме блохи, а также значении этого явления в трансмиссии (Burrows, Bacon, 1956; Акиев, 1970, 1991; Бурделов, 1987; Ващенок, 1988; Брюханова и др., 1989, 1999; Hinnebusch et al., 1998, 2002; Jarret et al., 2004; Duplantier et al., 2005; Erickson et al., 2006).

В 80-х годах прошлого века факты длительных межэпизоотических периодов в отдельных природных очагах чумы, одномоментности возникновения эпизоотий на разных участках, регистрации одиночных заражений носителей стали вступать в противоречие с традиционными представлениями о постоянном сохранении и непрерывной циркуляции чумного микроба в паразитарной системе. Это привело к обоснованию концепции «первичных» заражений, не связанных с трансмиссией (Попов и др., 1979; Солдаткин, Иванов, 1980; Мастюков и др., 1980; Солдаткин и др., 1984), и мысли о необходимости пересмотра традиционных взглядов на передачу чумы блохами как основного фактора поддержания энзоотии (Солдаткин, Руденчик, 1988). Кризис идеи трансмиссивного механизма породил большое количество гипотез, основанных как на внутривидовой изменчивости чумного микроба (Дунаев и др., 1981, 1982; Дятлов, 1988, 1989; Ларина и др., 1992), так и «непаразитарном» механизме энзоотии (Солдаткин, Руденчик, 1988; Домарадский, 1993; Слудский, 1998; Попов, 2002; Слудский и др., 2003). Факты зараженности нематодами личинок и имаго блох (Чумакова, Товканев, 1978; Чумакова, Козлов, 1983, 1984) привлечены для объяснения хранения и передачи возбудителя из почвенного биоценоза теплокровным животным по цепочке: матрикс биопленки чумного микроба - личинка нематоды - личинка блохи - грызун (Попов и др., 2006; Попов и др., 2007; Попов и др., 2008). Большинство гипотез, объясняющих длительные межэпизоотические периоды в отдельных очагах чумы нетрансмиссивными способами передачи возбудителя, до настоящего времени не получили прямого подтверждения или доказательства. Напротив, многочисленные экспериментальные данные, результаты эпизоотологических наблюдений в природных очагах свидетельствуют об определяющей роли блох в поддержании чумной энзоотии и обосновывает необходимость дальнейших исследований особенностей их взаимоотношений с чумным микробом (Леви, 1985; Бурделов, 1987; Сулейменов, 1995; Кокушкин, 1995; Анисимов и др., 2002; Eisen et al., 2006, 2007; Wilder et al., 2008).

Даны основные характеристики сибирских природных очагов чумы, особенности их биоценотической структуры и эпизоотических проявлений на очаговой территории (Голубинский и др., 1987; Вершинин, 1993; Иннокентьева, 1997; Вержуцкий, 2005; Корзун, 2007).

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Районы работ и объекты изучения. Полевые исследования проведены в 1974-1994 гг. на базе стационаров и эпидотрядов Читинской, Тувинской и Алтайской противочумных станций (ПЧС). Экспериментальные исследования выполнены в 1985-2007 гг. на базе паразитологического, эпидемиологического отделов и лаборатории экспериментальных животных Иркутского научно-исследовательского противочумного института (НИПЧИ). Основной объем работ в условиях природного очага выполнен на базе экспериментальной лаборатории Тувинской ПЧС вблизи пос. Мугур-Аксы Республики Тыва.

В экспериментах использованы лабораторные культуры блох и насекомые природных популяций. Блохи диких грызунов получены из биотопов долин рек Каргы и Барлык Тувы, природных стаций Юго-Восточного Забайкалья (падь Крементуй, район Торейских озер), Ольхонского района (Тажеранская степь), окрестностей пос. Усть-Орда Усть-Ордынского Бурятского автономного округа, Республики Бурятия (Тункинская долина, окрестности пос. Никольское). Опыты также проведены с Xenopsylla cheopis как классическим объектом экспериментальных исследований. Для заражения эктопаразитов, мелких млекопитающих и лабораторных животных использовали штаммы Y. pestis subsp. pestis, Y. pestis subsp. altaica, Y. pestis subsp. ulegeica из природных очагов Сибири (Тувинского, Горно-Алтайского, Забайкальского) и Монголии (Баян-Улэгейский и Хэнтейский аймаки). Поставлено 108 опытов, использовано 25500 блох 13 видов и подвидов, 1746 зверьков четырех видов и 13 штаммов чумного микроба.

Методы исследований взаимоотношений чумного микроба с блохами. Лабораторное разведение эктопаразитов для экспериментальных исследований осуществляли в инсектарии НИПЧИ и на базе Тувинской ПЧС (Методические рекомендации ..., 1983; Кондрашкина и др., 1984). В качестве прокормителей блох использовали золотистых хомячков и белых мышей.

В опыты брали в основном «молодых», питавшихся после выплода имаго. Применяли два способа заражения переносчиков чумным микробом. При естественном способе блох инфицировали на длиннохвостых сусликах, монгольских пищухах, плоскочерепных полевках, белых мышах в период развития у них агональной чумной бактериемии. При искусственном заражении на биомембране для кормления насекомых использовали смесь равных частей дефибринированной крови морской свинки и 2 млрд. взвеси чумного микроба из 48-часовой агаровой культуры, выращенной при 28є С. Между подкормками насекомых содержали в стерильном песке при соответствующей задачам опыта температуре и относительной влажности воздуха 80-93 %.

Взаимоотношения чумного микроба и блох оценивали по доле особей с «блоком» преджелудка от количества насекомых при первой подкормке, количеству всех особей за подкормку со сформировавшимися бактериальными «глыбками-конгломератами», частоте передачи чумного микроба животным, использованным для подкормок насекомых. Алиментарную активность определяли по доле пивших особей от числа живых, а смертность - по доле мертвых от общего количества эктопаразитов при каждой подкормке.

Сезонные особенности трансмиссии чумного микроба блохами изучали при разной температуре содержания насекомых, близкой к естественной температуре воздуха во время периода исследования. В опытах, поставленных при температуре от 5° до 27° С, использованы насекомые разных, условно выделенных календарных возрастов: «перезимовавшие», инфицированные летом или осенью предыдущего года и зимовавшие без прокормителя в условиях искусственной норы длиннохвостого суслика, и «молодые» - выплода и инфицирования текущего года. Преимущественно в эти эксперименты взяты особи II и III физиологических возрастов по шкале В.Н. Прокопьева (1958).

Активность трансмиссии оценивали по доле «блокированных» блох и всех особей, содержащих конгломераты микроба, относительному количеству инфицированных сусликов и среди них с генерализованной формой инфекции. Инфекциозность укусов «блокированных» блох определяли путем ежедневного кормления 1-3 таких особей на суслике в течение 1,5-2 часов, используя при каждой подкормке интактного зверька. В отдельном опыте эктопаразитов содержали в термостате при 25-27є С, исходя из данных О.Ф. Пауллер и В.Е. Мамаева (1954), что в центре жилого гнезда даурского суслика температура колеблется от 16є до 34є С, а в среднем равняется 26,7є С.

Изучение длительности сохранения чумного микроба C. tesquorum altaicus проводили по разработанной нами методике (Базанова, 1993). Зараженных имаго помещали в стаканчики-гильзы из органического стекла, дно и крышка которых выполнены из асбестового стерилизующего фильтра, обеспечивающего свободный доступ воздуха. «Гильзы» закладывали в ниши бункера, имитирующие гнездовую камеру суслика. Температуру и влажность воздуха измеряли перед началом опыта, в середине и в момент изъятия насекомых из «гнезда». За время проведения эксперимента температура колебалась от +2є С до -6є С. Между подкормками блох содержали: осенью и весной при 5-6є С, летом при 8-10є С. Общая продолжительность эксперимента составила 692 дня (с 14 сентября 1987 г. по 7 августа 1989 г.).

Заражение длиннохвостого суслика алиментарным способом проводили путем нанесения на слизистую рта зверька суспензии из 1-5 инфицированных блох. Возможность заражения суслика возбудителем чумы через поврежденную кожу устанавливали, втирая раздавленных насекомых или их экскременты в предварительно скарифицированную кожу зверька. Исследовали длительность сохранения чумного микроба в инфицированном экскрементами и трупами эктопаразитов субстрате гнезда. Для этого использовали смесь из равных частей песка и мелких опилок, где содержали зараженных насекомых в период между подкормками. Такой субстрат хранили в течение 8-9 месяцев в специальных нишах лаборатории-бункера, имитирующих нежилые гнезда суслика, а затем использовали для заражения сусликов в виде подстилки. Суспензии из трупов блох высевали на экспериментальные серии сред: УДС (универсальная диагностическая среда) и ЛС (среда для выделения Л-форм чумного микроба). Суспензию из субстрата высевали на среду УДС; этим же материалом заражали белых мышей подкожно или внутрибрюшинно.

Изучение межпопуляционных особенностей взаимоотношений переносчиков с чумным микробом. Исследование проведено на двух массовых видах блох длиннохвостого суслика C. tesquorum altaicus и Rhadinopsylla li transbaikalica из Каргинской и Барлыкской природных популяций Тувинского очага чумы. Взаимоотношения с чумным микробом оценивали по уровню инфицирования насекомых, накоплению в их организме микроба в агрегированном состоянии и образованию «блока» при заражении и подкормках на длиннохвостом суслике. Кроме того, изучали особенности взаимоотношений C. tesquorum altaicus лабораторной популяции, полученной от блох с Каргинского участка очаговости, и чумного микроба, изолированного в Саглинском и Каргинском участках Тувинского очага (штаммы Y. pestis И-3327 и И-3428) при искусственном заражении и подкормках блох на белых мышах.

При исследовании уровня флуктуирующей асимметрии (ФА) у C. tes-quorum внутри каждого варианта опыта сопоставляли две группы блох: одна - особи со сформировавшимся «блоком» преджелудка, другая - те, у которых в течение опыта «блок» не был отмечен. Оценивали признаки: число щетинок на эпистерне (1), метэпимере (2), наружной поверхности бедра (3), внутренней поверхности бедра (4), наружной поверхности голени (5) с правой и левой стороны тела имаго. Уровень ФА характеризовали через показатель дисперсии разности в проявлении признака с двух сторон тела (уd2), а также путем расчета доли асимметричных имаго в проанализированной выборке.

Изучение особенностей взаимоотношений блох и чумного микроба из географически разобщенных популяций проведено на массовых видах эктопаразитов монгольской пищухи, длиннохвостого суслика и штаммах возбудителя, полученных из разных природных очагов.

Изучение особенностей взаимоотношений чумного микроба с блохами, исторически не имевшими контакта с возбудителем, выполнено на имаго C. tesquorum и Frontopsylla luculenta с неочаговых территорий, а также гибридах F1, F3, F4 двух подвидов C. tesquorum (C. tesquorum altaicus и C. tesquorum sungaris). В серии экспериментов изучали способность насекомых к инфицированию, «блокированию» чумным микробом и его передаче зверькам.

Исследование инфицированных блох проводили:

1. Визуально путем микроскопирования после каждой подкормки на животном выявляли блох с бактериальными «глыбками», частичными и полными «блоками». Учет средней за подкормку доли насекомых, содержащих микроб в различной степени агрегированности, позволил провести сравнительный анализ динамики взаимоотношений переносчика и возбудителя.

2. Исследовали содержимое желудочно-кишечного тракта блох путем свето-оптического, фазово-контрастного и электронного микроскопирования. Мазки для исследования на светооптическом уровне готовили по методике А.П. Бейер с соавт. (1974). Ультратонкие срезы преджелудка, приготовленные согласно методическим рекомендациям (Волгоград, 1983) и (Саратов, 1989), просматривали в электронном микроскопе Jem 100 SX (JeOL, Япония). Проводили фильтрацию суспензии из содержимого желудков инфицированных блох через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и высев полученных фильтратов на стандартные питательные среды, а также среду для культивирования Л-форм чумного микроба.

3. Для детекции микроба в насекомых использованы бактериологический и молекулярно-биологический - постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) методы. Подробно методики подготовки блох к исследованию и постановки ПЦР изложены в работах (Балахонов и др., 1998, 1999, 2000).

4. Взаимоотношения блох и чумного микроба исследовали с учетом эколого-физиологических особенностей насекомых: сроков важнейших сезонных явлений в их жизни, возрастного и полового состава опытных групп, алиментарной активности, смертности, продолжительности жизни.

Исследование зверьков, использованных для кормления инфицированных насекомых. Манипуляции с животными проводили с соблюдением правил, принятых Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (Страсбург, 1986). Факты передачи чумного микроба животным устанавливали бактериологическим (посев органов на стандартные среды или среду для Л-форм чумного микроба), биологическим (заражение биопробы суспензией из органов животных) и серологическим (реакция пассивной гемагглютинации - РПГА, реакция нейтрализации антител - РНАт и реакция нейтрализации антигена - РНАг) методами исследования. Часть опытных животных, на которых кормили «перезимовавших» блох и без видимого «блока», дополнительно исследовали в иммунологических тестах: определяли показатель повреждения нейтрофилов (ППН) по методу В.А. Фрадкина (1962), исследовали органы с помощью радиоиммуного анализа (РИА).

Статистическая обработка экспериментальных данных. Статистическую обработку проводили с помощью стандартных методов (Рокицкий, 1967; Закс, 1976; Поллард, 1982; Боровиков, Ивченко, 2000; Боровиков, 2001; Никитин, Сосунова, 2003) с применением программы «Excel». Различия между двумя группами по средним показателям оценивались с применением критерия Стьюдента, по изменчивости - F критерия. Использованы методы регрессионного, дисперсионного и корреляционного анализов и метод множественных сравнений по Шеффе. В работе приняты стандартные уровни значимости: * - P<0,05; ** - P<0,01; *** - P<0,001.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ СЕЗОНА ГОДА И ПОЛОВЫХ РАЗЛИЧИЙ БЛОХ НА ВЗАИМООТНОШЕНИЯ С ЧУМНЫМ МИКРОБОМ

Сезонная динамика взаимоотношений чумного микроба и блох. Для Тувинского природного очага чумы свойственна сезонность эпизоотического процесса, связанная с эколого-физиологическими особенностями основного носителя - длиннохвостого суслика, (в том числе, с сезонным колебанием чувствительности зверька к чумному микробу) и основного переносчика - блохи C. tesquorum altaicus (Обухов, 1969; Устюжина и др., 1975; Крюков, 1984; Олькова и др., 1984; Равдоникас, 1985)

Изучена в эксперименте заражающая способность C. tesquorum altaicus в различные сезоны года при подкормках блох на суслике (рис. 1).

Рис. 1. Сезонная динамика заражающей способности C. tesquorum altaicus при питании на длиннохвостых сусликах:

1. Доля блох с «блоком»;

2. Частота заболевания зверьков;

3. Частота генерализации инфекции у зверьков.

При групповых подкормках доля «блокированных» особей (рис. 1) достоверно увеличивалась от весны к лету (по сравнению с началом лета t=2,09, P<0,05; с серединой лета t=2,86, P<0,01). Частота заболеваний грызунов весной и в начале лета была на одном уровне, но отмечена тенденция к ее увеличению от начала к середине лета. В июле-августе этот показатель по сравнению с весной значительно вырос (t=2,18, P<0,05). Частота генерализации инфекции у сусликов также возросла в июле-августе (в среднем 43,1 %) по сравнению с весенне-раннелетним периодом (в среднем 13,2 %).

Инфекциозность укусов единичных «блокированных» блох (отношение числа заболевших животных к общему числу зверьков, на которых кормили особей с «блоком») также изменялась в зависимости от сезона года (табл. 1).

Таблица 1

Инфекциозность укусов «блокированных» C.tesquorum altaicus в различные периоды эпизоотического сезона

Самые высокие значения данного показателя отмечены в III декаде июля-августе. Различия между результатами, полученными весной (май) и в середине лета, высоко достоверны (t=2,74, P<0,05 для первого опыта, t=2,34, P<0,05 для второго и t=2,85, P<0,01 для двух опытов). Кроме того, прослеживается тенденция к возрастанию инфекциозности укусов особей с «блоком» в июле-августе и по сравнению с началом лета (июнь-I декада июля) (табл. 1).

Сезонная динамика взаимоотношений чумного микроба с C. tesquorum altaicus исследована при подкормках на неспецифичном для этого вида блох прокормителе - белой мыши (рис. 2).

Блох, происходящих с Каргинского участка очаговости, инфицировали штаммами чумного микроба, изолированными на Каргинском (И-3327) и Саглинском (И-3428) участках Тувинского очага.

В данных экспериментах все показатели, характеризующие векторную способность блох, повышались от весны к лету (рис. 2) аналогично опытам на суслике (рис. 1). Однофакторный дисперсионный анализ выявил существенное значение сезона в частоте формирования конгломератов микроба в организме блох (F=13,84, P<0,001 для штамма И-3327; F=16,43, P<0,001 для штамма И-3428). Летом численность имаго, содержавших конгломераты возбудителя, выше, по сравнению с весной и осенью. Различия по этому показателю для штамма И-3428 существенны между весной и летом (t=5,50, P<0,001), а также летом и осенью (t=3,17, P<0,01). Для штамма И-3327 различия достоверны между весной и летом (t=5,08, P<0,001).

Рис. 2. Сезонная динамика векторной способности C. tesquorum altaicus при питании на белых мышах:

1. Доля блох с «блоком»;

2. Частота заболевания зверьков;

3. Частота генерализации инфекции у зверьков.

Частота передач микроба самками в течение опытов сохранялась примерно на одном уровне. Самцы передавали возбудителя летом чаще, чем весной (t=2,76, P<0,01), осенью эффективность передачи у них не снижалась (t=1,06, P>0,05). Достоверное возрастание частоты передач от весны к лету (t=2,06, P<0,05) выявлено для обоих полов. Очевидно, что передача чумного микроба C. tesquorum altaicus как сусликам, так и белым мышам, активизируется от весны к лету, в основном за счет векторной способности самцов.

Результаты опытов указывают, что на заражающую способность насекомых оказывает существенное влияние сезон года. При этом данная способность не всегда напрямую зависит от температурного режима содержания и частоты подкормок инфицированных эктопаразитов, и, возможно, обусловлена какими-то другими, не установленными биологическими факторами. В любом случае этот феномен свидетельствует об адаптации возбудителя, циркулирующего в Тувинском природном очаге, к жизненному циклу основного переносчика. Их взаимодействие имеет выраженную сезонную динамику, которая проявляется даже при питании блох на неспецифичном прокормителе.

Проанализированы особенности накопления конгломератов чумного микроба в организме Amphipsylla primaris primaris, блокообразования, алиментарной активности и смертности этих насекомых при питании на плоскочерепной полевке, а также влияния сезона года на эти показатели.

Всего «блокированных» A. primaris primaris без учета пола выявлено осенью 10,2 %, весной - 5,4 % (t=2,34; P<0,05). Осенью образование «блока» происходило у самок и самцов в одни и те же сроки. От общего количества взятых в опыт блох доля таких самок составила 11,6 %, самцов - 8,5 % (t=1,29; P>0,05). Весной у самцов блокообразование начиналось и заканчивалось раньше, чем у самок. Самцов с «блоком» отмечено 7,5 %, самок - 4,5 % (t=1,19; P>0,05). Осенью «глыбки» и «блоки» у блох формировались примерно в те же сроки, что и весной, но количество самок с «блоком» было выше (t=2,87; P<0,01). Частота «блокирования» самцов по сезонам не различалась.

Образование бактериальных «глыбок» осенью как у самок, так и у самцов отмечали примерно в два раза чаще, чем весной (табл. 2). Доля самцов с «глыбками» превысила долю самок в 1,5-2 раза в оба сезона. Но в среднем «блокированных» самцов весной отмечено почти в три раза больше, чем самок, а осенью - в два раза меньше. Среди блох с частичным «блоком» в оба сезона преобладали самки. В осеннем опыте таких самок в среднем выявляли почти в 6 раз больше, чем весной, а самцов отмечали исключительно осенью.

Таблица 2

Средняя доля A. primaris primaris, содержавших конгломераты чумного микроба, от числа пивших за подкормку особей (%)

Более частое разрушение полных «блоков» у самок, вероятно, связано с большим количеством насасываемой ими крови, по сравнению с самцами. Причем осенью эта тенденция усиливается у блох обоих полов. Видимо, осенью микробу более «выгодна» адаптация к организму блохи для сохранения в холодный период, чем образование «блока» и дальнейшая трансмиссия.

На алиментарную активность и смертность A. primaris primaris оказывали влияние сезон года и пол насекомого. Активность кровососания весной была более стабильна (у самок у2=103,9, у самцов 68,7), чем осенью (у самок у2=247,4, F=2,38, P<0,05, у самцов 262,6, F=3,82, P<0,01). Весной гибель самцов выше, чем самок (t=5,32; P<0,001), а по сравнению с осенью, она увеличилась вдвое (t=3,51; P<0,001). Гибель самок в эти сезоны не различалась.

Таким образом, способность чумного микроба к блокообразованию у A. primaris primaris разного пола от весны к осени может изменяться противоположным образом, что обусловлено различиями в сезонных изменениях физиологических показателей блох - активности кровососания и смертности.

Влияние пола блох на их взаимоотношения с чумным микробом. Предполагалось, что выраженный половой диморфизм у блох должен отражаться на способности к сохранению и распространению чумного микроба самками и самцами. Для выявления таких половых различий проведен анализ данных многолетних экспериментальных исследований.

Частота и динамика образования «блока» преджелудка. Во всех опытах с X. cheopis «блоки» у самцов формировались чаще, чем у самок (рис. 3).

Рис. 3. Блокообразование у самок и самцов X. cheopis

Необходимо отметить, что смешанные группы X. cheopis (самки + самцы) заражали алтайскими (И-3160 и И-3321) и тувинским (И-2638) штаммами чумного микроба. В опытах с забайкальским штаммом (И-1986) группы формировали раздельно по полу. При разных условиях опытов более активно образование «блоков» происходило у самцов X. cheopis.

У самцов большинства исследованных видов блох из природных популяций Тувинского очага выявлено аналогичное с самками или более активное формирование «блоков» (рис. 4).

Представляет интерес, что доля «блокированных» самцов C. tesquorum altaicus при подкормках на суслике в июле-августе значительно превышала долю таких самок. В одном опыте выявили 13,8 % самцов и 5,4 % самок с «блоком», во втором - 7,7 % и 1,3 %, в третьем - 24,7 % и 3,7 %. Половые различия по этому признаку достоверны (для первого и второго опытов t=1,97, P<0,05, для третьего t=4,34, P<0,001). Кроме того, во всех проведенных на суслике опытах процесс блокообразования у самцов начинался и заканчивался раньше, что говорит о более коротком его периоде у этого пола.

Рис. 4. Блокообразование у самок и самцов массовых видов блох из Тувы

При подкормках C. tesquorum altaicus на мышах в среднем за все опыты (без учета сезона и штамма Y. pestis) доля «блокированных» самок составила 11,4 %, самцов - 2,5 % (t=3,03, P<0,01). Летом процесс блокообразования активизировался у особей обоих полов, однако доля самцов с «блоком» была меньше, чем самок. То есть наблюдали ситуацию прямо противоположную отмеченной при кормлении блох на суслике, что связано с использованием неспецифичного для блох прокормителя - белой мыши.

Исследования показали, что у блох существуют явные половые различия, как в частоте, так и динамике процесса блокообразования. Эти показатели существенно зависят не только от видовых особенностей эктопаразитов и используемых прокормителей, но и сезона года, а также условий содержания самок и самцов в эксперименте (совместно или раздельно). Так, в опытах с C. tesquorum altaicus, проведенных в сроки, совпадающие с активизацией эпизоотического процесса в очаге (июль-август) и на естественном для данного вида прокормителе (длиннохвостый суслик), «блок» преджелудка отмечали у самцов значительно чаще, чем у самок. В то время как среди самцов, подкармливаемых кровью белых мышей, ни в одном случае не обнаружено больше «блокированных» особей, чем среди самок. На естественном прокормителе у самцов C. tesquorum altaicus зарегистрированы и более ранние сроки формирования «блоков», что в большинстве случаев характерно для особей этого пола и других видов. При совместном содержании полов значительно уменьшается продолжительность жизни блох, особенно, самцов (Цэрэнноров, 1999), что, видимо, снижает способность последних противостоять неблагоприятным факторам, в том числе и инфицированию чумным микробом. Видимо, блокообразование у самцов более зависимо от условий среды, и отражает меньшую степень адаптации микроба к особям этого пола.

Частота передачи чумного микроба. Различия между полами в частоте трансмиссии у C. tesquorum altaicus, F. luculenta luculenta, Х. cheopis изучали в опытах, где экспериментальные группы насекомых формировали раздельно из самок и самцов (табл. 3).

Таблица 3

Передача чумного микроба самками и самцами блох (без учета сезона года)

При подкормках C. tesquorum altaicus на суслике в июле-августе несколько большую заражающую способность наблюдали у самцов, но различия между полами в передаче возбудителя недостоверны. В опытах с белыми мышами (без учета сезона), наоборот, самки более активно передавали возбудителя. Существенные половые различия в передаче чумного микроба мышам выявлены весной (самки в 51,6 % случаев, самцы - в 14,3 %), летом и осенью они незначительны. Летом самцы передавали возбудителя достоверно чаще (43,2 %), чем весной (t=2,76, P<0,01), осенью (55,6 %) по сравнению с летом их эффективность как переносчиков не снижалась (t=1,06, P>0,05).

Из приведенных данных следует, что подкормки на неспецифичном прокормителе оказывают значительное влияние на взаимоотношения монозоидных видов блох с чумным микробом. Поэтому различия в передаче возбудителя чумы самками и самцами, установленные в опытах на мышах, в природе могут проявляться по-другому. Тем не менее, они характеризуют определенные тенденции сезонной динамики трансмиссии чумного микроба.

Самки F. luculenta luculenta передали чумной микроб мышам в пяти (35,7 %), а самцы - в 11 (78,6 %) случаях из 14 (табл. 3). Половые различия по этому показателю достоверны (t=2,3, P<0,05), самцы передавали возбудителя чумы вдвое чаще самок. Половые различия у X. cheopis в трансмиссии недостоверны, однако прослеживается тенденция к увеличению данного показателя в группе, сформированной из самцов (табл. 3).

Таким образом, половые различия в трансмиссии чумного микроба выявлены у всех исследованных видов блох и они довольно значительны. Особенности штаммов, используемых в опытах, оказывали влияние на количественные (больше или меньше доля насекомых с «блоком» и число передач ими чумного микроба животным), но не на качественные характеристики этих показателей (тенденция к большим значениям у самцов по сравнению с самками). Приведенные данные свидетельствуют, что взаимоотношения чумного микроба с самцами блох обеспечивают в основном распространение возбудителя. Это связано с более высокой частотой кровососания самцов (Новокрещенова и др., 1968), их большей подвижностью (Кондрашкина, Дудникова, 1962) и склонностью к смене прокормителя (Rust, 1994).

Влияние абиотических факторов на алиментарную активность, смертность блох и их взаимоотношения с чумным микробом. Температура содержания зараженных насекомых является одним из мощных факторов, влияющих на частоту и скорость образования «блока» у любого вида блох (Козлов, 1979; Алексеев, Кондрашова, 1985; Ващенок, 1988; Hinnebusch et al., 1998). Наиболее интенсивен процесс блокообразования при температурах, благоприятных для жизни конкретного вида этих насекомых (Бибикова, Классовский, 1974). Представляет интерес исследование взаимоотношений чумного микроба и блох в зависимости от температуры, наблюдаемой в период активного проявления эпизоотического процесса в природном очаге.

Исследована векторная способность С. tesquorum altaicus при различной температуре с учетом активности кровососания и смертности насекомых. Имаго, инфицированных осенью и перезимовавших в условиях искусственной норы, содержали весной и летом следующего года при 2-10є С (с постепенным повышением температуры от весны к лету). Температура содержания оказывала существенное влияние на алиментарную активность «перезимовавших» насекомых (F=5,01, P<0,05). При низкой температуре (2-3є С) активность кровососания у самцов и самок не различалась, а при 9-10є С пивших самцов было больше: средняя за подкормку доля таких самцов составила 100±0,0 %, самок - 99,2±0,36 %. Необходимо уточнить, что наблюдения проведены над выжившими после зимовки особями, среди которых преобладали самки с остаточной зараженностью 50-64,3 % (при исходной 80-100 %).

С «молодыми» блохами опыты поставлены при более широком диапазоне температуры (от 5 до 27є С). По результатам однофакторного дисперсионного анализа (без учета пола имаго) температура содержания оказывала значительное влияние на активность кровососания «молодых» блох (F=4,50, P<0,01). Менее активно они питались при 7-8є С и 24-27є С. Сравнение данного показателя при трех промежуточных значениях температуры (7-8є, 9-10є и 16-18є С), показало, что наиболее предпочтительна как для самок, так и самцов температура 9-10є С. При 7-8є С алиментарная активность выше у самок (94,9±0,90), чем у самцов (90,0±2,20), а при 16-18є С различий между полами не выявлено. При дальнейшем повышении температуры этот показатель снижался как у самок, так и у самцов. Так, при 22є С среди самок отмечено 98,9±0,83 % пивших особей, среди самцов - 100±0,0 %. При 24-27є С доля пивших самок составила 93,2±1,77 %, а самцов - 97,3±1,27 %.

Повышение температуры от 7-8є до 16-18є С влияло на смертность блох (F=4,56, P<0,01). Доля погибших за подкормку особей увеличивалась от 1,4±0,94 % до 8,3±2,03 %. При температуре 22-27є С относительное количество погибших в среднем за подкормку самцов (3,2±0,67 %) было выше, чем самок (1,2±0,46 %), почти в три раза.

Сравнительный анализ алиментарной активности «перезимовавших» и «молодых» блох при температуре 9-10є С показал, что она выше у переживших зиму особей (99,2±0,81 %), по сравнению с «молодыми» (92,6±1,14 %). Различия в смертности между этими группами насекомых незначительны (5,1±1,10 % для «молодых» блох, 4,7±1,72 % для «перезимовавших»).

Проанализировано влияние температуры на блокообразование и векторную способность насекомых. В первой серии экспериментов «перезимовавших» имаго содержали при температуре от 2 до 10є С, максимальное относительное количество особей с «блоком» (4,8 %) выявлено при 9-10є С. Формирование «блоков» отмечено при первой подкормке блох на сусликах, но в отдаленные после их заражающего кормления сроки (на 230-278 сутки).

Во второй серии экспериментов имаго выплода текущего года содержали при температуре от 5 до 27є С. Наибольшая доля «блокированных» особей (15,7 %) отмечена при 22-27є С, а формирование первых «блоков» происходило на 3-6 сутки после заражения блох.

У «перезимовавших» имаго существенных различий в частоте «блокообразования» при 2є-10є С не выявлено, но отмечена тенденция к увеличению данного показателя с повышением температуры. При этом число передач чумного микроба зверькам достоверно возрастало (t=2,06, P<0,05).

У имаго выплода текущего года частота блокообразования достоверно увеличивалась с повышением температуры (t=2,69, P<0,01). Число передач при повышении температуры от 5-6є до 16-18є С несколько возросло, но различия недостоверны. При этом доля зверьков с генерализованной формой инфекции значительно увеличилась (t=2,25, P<0,05).

Необходимо отметить, что при максимальной температуре содержания насекомых (22-27є С) у них наблюдали высокий уровень блокообразования (15,7 %). Однако доля заболевших сусликов и среди них с генерализацией инфекции была ниже (10,5±7,03 %), чем в опытах с менее высокой температурой, но проведенных в пик эпизоотии в очаге, в июле-августе (46,2±13,83).

Таким образом, оптимальной для блокообразования и эффективной передачи С. tesquorum altaicus чумного микроба является температура от 9-10є до 16-18є С; более высокие или низкие значения приводят к снижению активности переносчика. Полученные экспериментальные данные позволяют прогнозировать характер изменения векторной способности блохи в исследованном диапазоне температур на энзоотичной территории Тувинского очага.

Влияние температуры и влажности на элиминацию и питание блох изучено достаточно хорошо (Брюханова, 1973; Бибикова, Классовский, 1974). В то же время даже на благоприятном гигротермическом фоне наблюдаются значительные суточные колебания гибели и активности кровососания имаго. Для установления возможных причин этого явления предпринято сравнительное изучение величины колебаний атмосферного давления, алиментарной активности и частоты гибели блох в разные сезоны (весна-лето-осень).