Размещено на http://www.allbest.ru/

1

16

ПРОЦЕССЫ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ В МЕХАНИЗМЕ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЗАГРЯЗНЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ ТЕХНОГЕННОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03.00.16 - экология 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

САРАТОВСКИХ Елена Анатольевна

Москва 2009

Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН и Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор О.Ф. Филенко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю.П. Козлов

доктор физико-математических наук, профессор Е.В. Веницианов

доктор биологических наук Л.В. Семеняк

Ведущая организация: Московский государственный университет технологий и управления

Защита диссертации состоится «____» _____________2009 г. в _________ часов на заседании Специализированного Совета Д 501.001.55 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова, биологический факультет по адресу: 119992, г. Москва. Ленинские горы. МГУ. Биологический факультет, ауд. № 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «____» __________ 2009 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета,

кандидат биологических наук Н.В. Карташева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Опасность химического загрязнения окружающей среды проявляется в прямом и опосредованном токсическом действии на живые организмы значительных количеств веществ техногенного происхождения. Техногенные загрязняющие вещества приводят к возникновению химических реакций - в объектах окружающей среды и изменению биохимических реакций, протекающих в организмах. В результате экосистемы теряют способность к самоочищению. Накопление токсикантов в природных объектах обусловливает прогрессирующие темпы сокращения объемов и ухудшения качества ресурсов жизнеобеспечения человечества - запасов питьевой воды, промысловых организмов, почв, пригодных для сельскохозяйственного использования.

При существующих технологиях, рост промышленного производства и энергетики связаны с образованием отходов пропорционально объёму произведённой продукции, что вызывает соответствующий рост загрязнения биосферы. Кардинальное решение проблемы состоит в переходе на безотходные технологии и реутилизацию материалов в производстве и потреблении, оборотные схемы водопользования и комплексное использование ресурсов.

В области сельского хозяйства (с/х) опасность применения пестицидов и других химических средств защиты растений (ХСЗР) обусловлена их прямой токсичностью по отношению к почвенным микроорганизмам, формирующим плодородие почв. Зачастую, ХСЗР отличаются высокой устойчивостью к биотрансформации, из-за блокирования окислительных процессов, и характеризуются низкой способностью к разложению под действием солнечной радиации; поэтому аккумулируются в почве, воде, в живых организмах. В результате может снижаться продуктивность с/х культур и ухудшаться качество продукции; возникновение мутаций приводит к появлению более токсикорезистентных видов сорной растительности. Переход химических загрязняющих веществ (ЗВ) с продуктами питания в организмы животных и человека является причиной возникновения практически всех форм хронических заболеваний у населения, а так же таких тяжёлых нарушений, как онкологические или патологии у новорождённых.

Решение совокупности этих сложных проблем в значительной степени определяется успехами фундаментальных исследований в области физической химии, биохимии, химической экологии. Раскрытие молекулярных механизмов биологического действия экотоксикантов на структурно-функциональные системы клетки - ферментные системы, биомембраны, генетический аппарат - необходимы для успешной борьбы за чистоту окружающей среды и безопасность существования человека. Без понимания химических механизмов формирования токсичности невозможно создавать методы контроля состояния окружающей среды, прогнозировать возможную токсичность, отдалённые последствия применения препаратов, предотвращать возникновение вредных продуктов трансформации исходных соединений, разрабатывать эффективные и экологически безопасные способы переработки отходов промышленных и с/х-производств, стоков коммунально-бытового хозяйства.

Огромные объёмы выбросов ЗВ в объекты окружающей среды; биоаккумуляция, в сочетании с биотрансформацией поллютантов, приводящей к появлению более персистентных и токсичных соединений, чем исходные, - привели к высокому уровню загрязнения биосферы: санитарно-эпидемиологические станции (СЭС) выполняют более сотни измерений каждой отобранной пробы. Поэтому необходимы новые интегральные методы биотестирования. Разработка способов детоксикации, очистки объектов природы от промышленных, с/х- и коммунальных стоков, с целью охраны биосферы, как среды обитания человека - задача, в которой новые решения могут возникать только на базе фундаментальных исследований и на стыке нескольких научных дисциплин.

На защиту выносится новая научная гипотеза об определяющей роли процессов комплексообразования техногенных токсикантов с компонентами структурно-функциональных систем клетки в механизме токсического поражения организма.

Цель работы. Изучение роли процессов комплексообразования в механизме действия токсикантов на структурно-функциональные системы клетки и их значения для общебиологических проявлений интоксикации и экологических эффектов.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

Исследование механизма химического действия экотоксикантов (пестицидов, комплексов металлов, хлорорганических соединений (ХОС), в частности, хлор фенолов) на микроэлементы, нуклеотиды; мембрано-связанные металлсодержащие окисляющие ферменты; липиды мембранных структур. экологический токсикант загрязнитель разложение

Установление корреляции между процессами комплексообразования ЗВ, протекающими в организме, энергодефицитом клетки и физиологическими эффектами in vivo. Создание интегрального метода экспресс-контроля токсикологического состояния водных объектов окружающей среды.

Исследование продуктов разложения ЗВ. Разработка технологии детоксикации и очистки питьевой и сточной вод, вытяжек из твёрдых объектов или промышленных отходов от ЗВ с использованием процессов комплексообразования, обработки ультрафиолетом (УФ), в комплексе с биологическими методами.

Выявление связи между результатами, полученными в ходе целенаправленного мониторинга водного объекта (на наличие пестицидов, металлов, ХОС) и технологией очистки сточных вод на городских очистных сооружениях.

Научная новизна. Впервые показано, что техногенные токсиканты, относящиеся к соединениям различных химических классов, а также образованные ими комплексы с рядом металлов проявляют высокую способность к дальнейшему комплексообразованию с такими компонентами живой клетки, как моно - и динуклеотиды. Создана математическая модель, позволяющая количественно оценить степень комплексообразования токсикантов с нуклеотидами. Определены константы устойчивости образующихся комплексов.

Впервые проведено сравнение ингибирования активности окислительной металлсодержащей ферментной системы - НАДН-оксидоредуктазы, восьмью пестицидами различного химического строения, комплексами гербицида лонтрел с восьмью разными металлами, и солями этих металлов. Определены кинетические параметры и тип ингибирования. Выявлен порядок изменения антиредуктазной активности ЗВ в зависимости от величины их константы ингибирования фермента. Показано, что в активном центре фермента соли металлов конкурируют за место связывания с акцептором электронов, а лиганды и комплексы - с донором. Прочность связи ЗВ с ферментом (и токсические свойства этого ЗВ) возрастает при переходе от иона металла к лиганду и к комплексу.

Создана новая математическая модель процесса переноса токсикантов через липосомальные мембраны, впервые доказывающая, что комплексообразование с липидами является лимитирующей стадией процесса переноса через мембраны и причиной биоаккомуляции ЗВ. Рассчитанные коэффициенты массопереноса имеют обратную корреляцию с константами комплексообразования.

Выявлено, что причиной возникновения мутаций (типа сдвига рамки считывания), при действии ЗВ (ХОС, пестицидов и металлокомплексов) на многоклеточный организм является образование комплексов с ДНК и РНК, приводящих к нарушению нативности двойной спирали, гидролизу фосфодиэфирных связей. Определены константы устойчивости комплексов ЗВ с полинуклеотидами. Показана корреляция констант комплексообразования с физиологическими эффектами токсичности, проявляемыми in vivo: влиянием на рост численности почвообитающих микроорганизмов и гидробионтов, со степенью генотоксичности изученных ЗВ.

Впервые установлено, что образование комплекса техногенного токсиканта с аденозинтрифосфорной кислотой (АТФ) приводит к энергодефициту клетки, который является важной причиной развития интоксикации, приводит к гибели клетки и целого организма. Характеристикой энергодефицита является константа комплексообразования, которая коррелирует с количественными параметрами биологического действия ЗВ: подавлением прорастания семян, ростом вегетирующих растений, жизнедеятельностью организмов, подавлением ферментативной активности, индуцированием генных мутаций.

Показано, что гербицид лонтрел и его комплексы с металлами трудно поддаются биологической деградации. Впервые установлены продукты, образующиеся при разложении гербицида лонтрел под действием УФ составляющей солнечного света. Выявлена повышенная токсичность продуктов разложения гербицида лонтрел по сравнению с исходным соединением.

Практическая значимость. Получены новые данные о существовании в растворе устойчивых бидентатных комплексов пестицидов с ионами металлов. Показана экологическая опасность возможного возникновения подобных комплексных соединений в открытых водоёмах и клетках живых организмов, включая теплокровных высших трофических уровней, из-за повышенных токсических свойств комплексов.

Установлена корреляция между константой комплексообразования пестицидов с АТФ и эффектом подавления прорастания семян, гербицидным действием на вегетирующие растения, содержанием хлорофилла в листьях, что может быть использовано в качестве экспресс-теста на этапе первичного скрининга пестицидов с АТФ-зависимым механизмом действия.

Исследованы кинетические закономерности УФ разложения гербицида лонтрел, которые могут быть использованы при очистке стоков промышленных производств, разработке технологий очистки почв, вод, утилизации запасов ХСЗР.

Показана потенциальная канцерогенная и мутагенная опасность ЗВ (пестицидов: лонтрел, зенкор, базагран, раундап, кузагард, сетоксидим, тачигарен, тилт; металлокомплексов гербицида лонтрел; хлорсодержащих фенолов), обусловленная их комплексообразованием с ДНК и РНК.

Доказано, что техногенные ЗВ ингибируют действие окисляющих ферментных систем в организмах, что снижает способность к самоочищению водоёмов и почв.

Предложен новый метод определения интегральной токсичности объектов окружающей среды: воды, почв, продуктов питания.

Проводившийся в течение нескольких лет целенаправленный мониторинг среднего течения реки Волги, показал, что причиной наличия хлорорганических ЗВ в концентрациях, значительно превышающих ПДК, является хлорирование сточных вод на городских очистных сооружениях.

Разработаны способы очистки вод (питьевого водоснабжения, технологического цикла, сточных вод) с применением УФ излучения. На основании проведённого мониторинга состояния очистных сооружений и питьевого водоснабжения г. Казани, предложены методы интенсификации очистки и увеличения их пропускной способности. Замена хлорирования на УФ обработку сточных вод и циркуляция их - значительно улучшит экологическую обстановку водных бассейнов.

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включённые в диссертацию, состоит в формировании направления, постановке общей задачи, личном участии во всех этапах работы: в ходе экспериментального исследования, в анализе и интерпретации полученных данных, в планировании на их основе новых перспективных направлений научных исследований и технологических разработок.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XIX и XVI международном Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2007, 2004); на международном Конгрессе «Вода: экология и технология» (Москва, 2000, 1996, 1994); на международной конференции «Высокоорганизованные каталитические системы» (Москва, 2004); на XI международной конференции «Химия органических и элементорганических пероксидов» (Москва, 2003); на международном семинаре «Активация малых молекул комплексами металлов» (Ленинград, 1989); на IV Всесоюзном совещании по кристаллохимии неорганических и координационных соединений (Бухара, 1986); на Всесоюзном координационном совещании по пестицидам (Черноголовка, 1988); на Всесоюзном совещании по химии и технологии пиридин содержащих пестицидов (Черноголовка, 1988), и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа в реферируемых журналах, 3 отчёта по программе Минэкологии РФ «Экологическая безопасность России», 7 отчётов по научно-практическим хоздоговорным работам.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы; главы, посвящённой материалам и методам; 6 глав собственных исследований; заключения; выводов; списка литературы, охватывающего 585 источника, из них - 50% иностранных. Работа изложена на 485 страницах машинописного текста, включает 80 рисунков, 56 таблиц, 11 схем, 6 фотографий, 2 чертежа.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ. Литературный обзор

В этой главе собраны и обобщены литературные данные по воздействию техногенных токсикантов на окружающую природу. Сопоставлены различные точки зрения на механизм действия пестицидов. Освещена роль микроэлементов в жизнедеятельности живых организмов, с которыми, главным образом, связываются процессы комплексообразования в биологических системах. Проведённый анализ литературных данных показывает, что, несмотря на многочисленные исследования молекулярных механизмов действия различных токсикантов, как на модельных системах, так и на реальных биологических объектах, многое в этом вопросе остаётся не ясным. На момент начала исследований, вплоть до настоящего времени, данные о роли процессов комплексообразования в механизме действия ЗВ, и формировании токсичности ограничены и связываются исключительно с ролью металлов. С другой стороны, вопросы, связанные с молекулярными взаимодействиями ЗВ в метаболических процессах так же рассматриваются весьма узко, ограничиваясь, как правило, одной ферментной системой. На основе критического анализа литературных данных нами были сформулированы конкретные задачи исследования, определена последовательность их решения.

Глава 2. СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЗВ НА МОЛЕКУЛЯРНОМ УРОВНЕ НА КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ И ВОДНЫЕ ОБЪЕКТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ. Объекты и методы исследований

В качестве объекта исследования взяты действующие вещества восьми широко используемых пестицидов различного химического строения (гербициды: раундап, базагран, кузагард, сетоксидим, лонтрел, зенкор; фунгициды: тачигарен, тилт); хлорпроизводное фенола - 2,4,6-трихлорфенол; красители - бенгальский розовый и метиленовый голубой; соли и бидентатные комплексы лонтрела с ионами 8 металлов (Cu, Co, Mo, Mn, Mg, Fe, Zn, Ni).

Состав и строение синтезированных комплексов исследовали методами элементного анализа, ЭПР, ИК и электронной спектроскопии, рентгенографии. Образование комплексов с нуклеотидами изучали флуоресцентным методом, при концентрации ЗВ от 10^-8 до 10^-2 М. Определение температуры плавления ДНК проводили спектроскопически в термостатируемой кювете.

В работе использовалась выделенная из мембранных структур клеток метанокисляющих бактерий Methylococus capsulatus (штамм М, КФ 1.6.99.25), дополнительно очищенная НАДН-оксидоредуктаза, молекулярная масса 180 кДа. Кинетические параметры и тип ингибирования определяли по методике Михаэлиса-Ментен. Проникновение ЗВ через мембраны изучали на бислойных липосомах из фосфатидилхолина и холестерина. В качестве флуоресцентной метки использовалось этенопроизводное аденозинтрифосфорной кислоты (е-АТФ): спектр возбуждения л=312 нм, максимум флуоресценции л=420 нм.

Анализ влияния пестицидов и комплексов на прорастание семян, рост растений и содержание хлорофилла, проводили на однодольных (озимая пшеница «Мироновская 80») и двудольных (горох «Улановский юбилейный») растениях. Жизненные циклы и популяционную динамику микроартропод испытывали на почвообитающих коллемболах видов Folsomia candida (Isotomidae) и Ceratophysella denticulate. Токсикологическую оценку водных растворов экотоксикантов выполняли на культуре инфузорий Tetrahymena pyriformis и светящихся бактериях Benekea harvey (штамм В 1 7) по стандартным методикам. Генотоксичность определяли на модифицированном тесте Эймса Salmonella/микросомы.

Биохимическое поведение лонтрела и Сu(лонтрел)₂ изучали в лабораторном аэротенке, на активном иле очистных сооружений, подвергнутом мутагенной обработке нитрозометилмочевиной. Фотохимическое разложение проводили в кварцевом реакторе; использовали лампы марок ДРШ-1000, ДРБ-8 и БРА-15 с длинами волн излучения в диапазоне 250-600 нм и барботированием кислородом, озоном, воздухом, аргоном. Продукты фоторазложения лонтрела установлены газовым хроматомасс-спектрометрическим методом. Определение ЗВ в процессе мониторинга Волги выполняли высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Глава 3. ХЕЛАТИРОВАНИЕ МЕТАЛЛОВ, КАК ОДНА ИЗ ПРИЧИН УВЕЛИЧЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ КСЕНОБИОТИКОВ

Пестициды и металлы являются в настоящее время преобладающими ЗВ окружающей среды; с другой стороны - микроэлементы входят в состав клеток живых организмов. Естественно, что изучение процессов комплексообразования были начаты с исследования взаимодействия металлов и пестицидов.

§1. Синтез и свойства бидентатных комплексов ЗВ

Изучалась комплексообразующая способность лонтрела (3,6-дихлорпиколиновой кислоты - 3,6-ДХПК = L) и 3,4,5-ТХПК с металлами: Со(II), Mn(II), Cu(II), Ni(II), Mg(II), Мо(IV), Zn(II), Fe(II). Комплексы получены при взаимодействии спиртового раствора лонтрела с водными растворами различных солей: хлоридами, карбонатами, сульфатами, аммиакатами. Во всех случаях происходит образование комплексов соотношения 1:2. В ИК спектрах всех комплексов присутствуют полосы поглощения (п.п.) в пределах 1610-1590 см^-1, соответствующие н(С=О) координированной. Появление в спектрах комплексов новой п.п.

в области 1620 см^-1 указывает на существование координированной группы СОО^- по типу О-М-О, т.е. на образование прочной ковалентной связи металл-кислород. Интенсивная п.п. 920 см^-1 в спектре лонтрела принадлежит н(С-N). А её отсутствие в спектрах комплексов указывает на перераспределение энергии данной связи при образовании новых соединений. Вновь появляющуюся во всех спектрах п.п. в области 460 см^-1 можно идентифицировать как н(М-N). Соответственно установлены п.п., принадлежащие д(O-М-О) и д(N-М-N).



Рис. 1 Строение комплекса CuL₂

Анализ ИК спектров синтезированных комплексов показал следующий порядок н(COO^-): Ni=Fe<Мо=Со<Сu<Мn<Zn<Мg. Известно, что частота валентного колебания карбонила уменьшается симбатно увеличению константы устойчивости комплекса, т.е. NiL₂ и FeL₂ наиболее прочные, а МnL₂, ZnL₂ и МgL₂ - наименее.

Данные рентгеноструктурного анализа трёх медных комплексов показали, что они имеют октаэдрическое строение с разной степенью искажения координационного полиэдра. В центросимметричном комплексе (рис. 1) хлорпиколиновые фрагменты связаны с металлом атомами азота и одного из атомов кислорода карбоксильной группы с образованием пятичленных металлоциклов. Кристаллы СuL₂ имеют полимерную цепочечную структуру. До октаэдрической координации атом Сu дополняется двумя атомами кислорода карбоксильной группы соседней молекулы, c образованием 4-х членного хелатного металлоцикла. В результате один из лигандов является концевым, а второй - мостиковым. При этом образуется полимерная цепь - Сu-O-Сu- с расстояниями Сu-O 2,13 и 2,74⁰А.

§2. Поведение металлокомплексов в водных растворах

Мелкодисперсные образцы комплексов CuL₂ имеют аксиально-симметричный спектр ЭПР. Существенное отличие g-фактора от чисто спинового и форма спектра свидетельствуют о значительной примеси орбитального магнитного момента в суммарном магнитном моменте неспаренного электрона, что свидетельствует об октаэдрическом искажении кристаллического поля лигандов. Из сравнения спектров ЭПР замороженных растворов следует, что при растворении в воде все комплексы сохраняют координационное окружение центрального ядра. Слабое уширение сигналов растворённых в воде образцов при 300 К свидетельствует о частичном спаривании электронов, т.е. объединении двух и более молекул в полимерные цепочки, аналогичные [Сu(L)₂]_n.

Таким образом, в нативных условиях рассмотренные комплексы существуют как единое целое в недиссоциированном состоянии. Они способны участвовать в дальнейшем комплексообразовании с биоактивными лигандами за счёт заполнения координационной сферы металла. В водной экосистеме с широким набором ЗВ, возможно образование комплексных соединений, аналогичных рассмотренным.

Глава 4. НУКЛЕОТИДЫ КАК ОБЪЕКТ АТАКИ КСЕНОБИОТИКОВ

Состав биологических макромолекул прост в своей основе. Все живые организмы состоят из одних и тех же молекул, используемых как строительные блоки. Такими «блоками», в частности, являются нуклеотиды, играющие одну из ключевых функций в метаболизме и репликации, выполняют энергетические и регуляторные процессы, участвуют в биосинтезе. Клетки организмов улавливают, сохраняют и передают энергию в химической форме, главным образом в виде энергии, заключённой в молекулах мононуклеотида АТФ. Поэтому мы исследовали образование комплексов с нуклеотидами пестицидов и их комплексов с металлами.

§1. Комплексование техногенных токсикантов с АТФ

Тушение флуоресценции -АТФ наблюдается при концентрации пестицида от 10^-7 до 10^-2 М, что свидетельствует о возникновении комплексов -ATФ-пестицид.

Таблица 1

Значения констант комплексообразования нуклеотидов с пестицидами и металлокомплексами гербицида лонтрел (К_к/обр, М^-1)

Соединение	Кк/о·10-3, M-1 е-АТФ рН = 6,8	Кк/обр·10-3, M-1 е-НАДН	Сое-динение	Кк/обр·10-3 М-1 е-АТФ рН = 6,8	Кк/о·10-3, М-1 АТФ рН = 1,68	Кк/обр·10-3, M-1 е-НАДН
Базагран Зенкор Кузагард Лонтрел Раундап Сетоксид Тачигрен Тилт	4,7±0,4 26,5±3,3 9,7±0,5 15,0±2 8,2±1,2 5,0±0,3 1,1±0,04 0,8±0,06	- 21,33±1,5 2,51±0,04 11,70±0,4 2,20±0,41 2,84±0,71 1,80±0,39 0,46±0,06	MgL2 MnL2 FeL2 CoL2 NiL2 CuL2 ZnL2 MoL2	0,8±0,02 2,2±0,1 8,8±0,4 600±200 21,6±0,5 851,4±82 1,6±0,06 3,6±0,4	21,1±14,6 40,4±14,8 47,2±20,3 32,2±0,6 105,8±54 296,6±90 86,3±18 -	- - 0,55±0,06 3,05±0,14 4,74±0,34 4,56±0,16 - 2,15±0,07

Для уточнения механизма образования, и оценки констант устойчивости комплексов нами была создана математическая модель процесса. Предполагалось, что взамодействие пестцидов (Р) с -АТФ (Е) происходит по схеме:

,

где П - комплекс; n - стехиометрический коэффициент; К_к/обр = k⁺/k^- - константа



Рис. 2 Зависимость изменения относительной флуоресценции от концентрации пестицида или металлокомплекса: 1 - лонтрел с е-АТФ; 2 - лонтрел с АТФ; 3 - CuL₂ с е-АТФ; 4 - CuL₂ с АТФ

Сплошная линия - теоретическая кривая, точки - данные эксперимента. Концентрации: е-АТФ=1·10^-5M; АТФ=2·10^-4M. комплексообразования:

Определённый стехиометрический коэффициент n для всех изученных соединений равен 1±0,2, т.е. с одной молекулой -АТФ взаимодействует лишь одна молекула пестицида. По найденным значениям К_к/обр и n рассчитывали теоретические кривые титрования. Все рассчёты проводили на ЭВМ БЭСМ-6. На рис. 2 приведены экспериментальные зависимости изменения относительной флуоресценции (I/I₀) от исходной концентрации пестицида (Р₀) и соответствующие им теоретические кривые для гербицида лонтрел и комплекса СuL₂, рассчитанные по найденным значениям n и константы комплексообразования (К_к/обр). Наиболее прочные комплексы c -АТФ образуют зенкор и лонтрел, а наиболее слабые - тилт и тачигарен. Величина К_к/обр изученных пестицидов изменяется в ряду: зенкор > лонтрел> кузагард > раундап > сетоксидим > базагран >тачигарен>тилт (табл. 1).



Рис. 3 Строение тройного комплекса е-АТФ с металлокомплексами гербицида лонтрел = [е-АТФ-Cu(L)₂]

Рис. 4 Кривые плавления ДНК: 1. - контроль. В присутствии: 2. - лонтрел 3. - Fe(L)₂

В случае комплексов Сu-, Со-, NiL₂ - К_к/обр c -АТФ выше, чем у исходного лонтрела; у комплексов других металлов, на один - два порядка ниже. Прочность комплексов -АТФ с комплексами М(L)₂ = [-АТФ-М(L)₂] изменяется в ряду: Сu > Co > Ni > Fe > Мo > Мn > Zn > Mg.

Структура комплекса -АТФ с металлокомплексами лонтрела представлена на рис. 3. Тушение флуоресценции АТФ, как и в случае -ATФ, происходит без изменения положения максимума возбуждения и эмиссии флуоресценции. Комплекс [АТФ-ЗВ] образуется за счёт протонирования атома азота N-7 аденинового гетероцикла, одновременно атом азота терминальной NH₂- группы может связываться с молекулой ЗВ за счёт образования водородной связи. Прочность комплексов с АТФ в 5 - 10 раз выше, чем с е-АТФ (табл. 1).

§2. Взаимодействие ЗВ с ди- и полинуклеотидами

Результатом тушения флуоресценции этенопроизводного динуклеотида НАДН (е-НАДН) является образование ковалентной связи с адениновым фрагментом. С одним модифицированным звеном взаимодействует лишь одна молекула пестицида. Константы комплексообразования, рассчитанные на одно звено представлены в табл. 1. По величинам К_к/обр пестициды выстраиваются в гипотетический ряд активности, идентичный, полученному при взаимодействии с ATФ: наибольшей К_к/обр обладает зенкор, наименьшей тачигарен и тилт. Комплексы лонтрела с Сu, Со, Ni, Fe, Мо образуют прочные комплексы с динуклеотидом (табл. 1). При взаимодействии с ДНК и РНК СuL₂, СоL₂, NiL₂, МоL₂ имеют К_к/обр выше, чем лонтрел (табл. 2).

Для выяснения влияния пестицидов на вторичную структуру нуклеиновых кислот проводили термическую денатурацию ДНК. Вещества с высокими К_к/обр образуют наиболее прочные комплексы с аденином и оказывают глубокое воздействие на структуру ДНК. Под их влиянием плавление ДНК становится не кооперативным (рис. 4), гиперхромный эффект (ГЭ) значителен (40% в контроле; 6-7% у зенкора и лонтрела). Кузагард, сетоксидим, металлокомплексы имеют высокую константу связывания, но из-за больших размеров и разветвлённого строения не в состоянии внедриться в двойную спираль и полностью нарушить нативность. Плавление ДНК остаётся кооперативным. Однако, температура плавления уменьшается на несколько градусов, интервал плавления увеличивается (почти в два раза для СоL₂), ГЭ значителен - до 10% у MoL₂. Таким образом, идёт процесс отщепления от ДНК низкомолекулярных продуктов в результате гидролиза фосфодиэфирных связей.

§3. Изменение структуры ДНК под действием ксенобиотиков

ХОС, в частности 2,4,6-трихлорфенол (ТХФ) в концентрации 10^-7 - 10^-6 М не нарушают нативности двойной спирали ДНК, оказывая на неё не глубокое воздействие. При плавлении Т⁰_нач.пл., интервал плавления и Т_пл ⁰С - близки к контролю, лишь ГЭ уменьшается в два раза (табл. 2). При возрастании концентрации ТХФ от 10^-6 - 10^-2 М, Т⁰_нач.пл. снижается, интервал Т_пл⁰С возрастает. В результате комплек сования молекул ТХФ с адениновыми основаниями ДНК, происходит интеркаляция ТХФ между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, перекомплексование, приводящее к гидролизу фосфодиэфирных связей и выщеплению оснований - к образованию низкомолекулярных алкилированных продуктов.

По мере роста концентрации ТХФ, ГЭ монотонно снижается (рис. 5) до 11,3% - почти в 3 раза по сравнению с контролем. Для максимальной из исследовавшихся концентраций ТХФ = 10^-2 М, Т_пл ⁰С существенно ниже, чем у чистой ДНК. Однако, характер плавления во всём диапазоне рассмотренных концентраций остаётся кооперативным - плавление одного участка приводит к плавлению другого, т.е. ТХФ в большей степени взаимодействует с концами полимерной молекулы, «отрезая» от неё низкомолекулярные куски. Молекулы лонтрела (3,6-ДХПК) и ТХФ, имеющие аналогичную пространственную структуру, образует комплексы с имидным водородом аденина или карбоксильным кислородом цитозина в цепи: гуанин-цитозин,

Таблица 2

Структурные изменения ДНК в присутствии токсикантов

Название	е-ДНК Кк/о·10-3М-1	е-РНК Кк/о·10-3М-1	Тпл 0С	ГЭ, %	ТХФ, М	Тпл 0С	ГЭ, %
Контроль Лонтрел Зенкор Раундап Кузагард Тачигарен Тилт Сетоксидим CuL2 CoL2 NiL2 FeL2 MoL2	1,4±0,2 7,0±0,7 0,54±0,02 1,5±0,1 0,12±0,01 0,10±0,01 3,6±0,5 1,5±0,4 4,1±0,2 3,3±0,2 0,43±0,03 5,4±0,3	2,0±0,2 10,8±1,3 1,00±0,05 1,47±0,05 0,83±0,07 0,20±0,04 5,9±1,1 2,3±0,3 4,6±0,2 4,8±0,2 0,48±0,02 7,3±0,5	74,6 н/к -“- -“-“- 72,6 72,5 73,2 74,3 67,2 73,6 71,0 72,8 74,5	40,10 6,30 7,60 10,00 24,17 37,83 15,00 13,15 16,50 36,49 22,50 35,40 10,75	Конт 10-2 10-3 6·10-4 3·10-4 10-4 5·10-5 10-5 10-6 10-7 - - -	61 60,5 57,5 56,5 56,5 58 56,5 57 60 62 - - -	37,0 19,0 18,4 15,5 20,5 18,7 14,7 15,8 11,3 17,7 - - -

аденин-тимин, согласно схеме 1. По мере роста концентрации токсиканта растёт количество таких комплексов на одной молекуле ДНК. За счёт образования комплексов ЗВ происходит нарушение вторичной и первичной структур ДНК.

Рис. 5 Кинетика изменения гиперхромного эффекта и температуры плавления ДНК под действием 2,4,6-трихлорфенола: 1, 5 - ТХФ без облучения (расчёт); 2, 4 - ТХФ при облучении л = 313 нм; 3, 6 - ТХФ + бенгальский розовый, л = 540 нм

Правая шкала: кривые 1 - 3.

Левая шкала: кривые 4 - 6.

Судя по влиянию на ДНК, продукты, образующиеся при фотолизе ТХФ, не зависят от длины волны облучения (УФ - 254, 313; VIS - 540 нм), но сильно изменяются при увеличении времени экспозиции. По мере увеличения концентрации продуктов разложения ТХФ - дибензофенола (ДБФ) и дибензофурана (ДБФур), происходит понижение Т_пл ⁰С, Т⁰_нач.пл, увеличение интервала плавления. К максимальному гидролизу фосфодиэфирных связей ДНК приводит смесь ТХФ и продуктов его 50-60%-ной трансформации. Продукты полного разложения ТХФ (100% превращения) в большей степени воздействуют на вторичную структуру ДНК (рис. 5, кривая 2), чем сам ТХФ. Об этом свидетельствует значительное уменьшение величины ГЭ - до 10,6%. Мы считаем, что образуемые ДБФ и ДБФр комплексы с тимином, аденином, гуанином и цитозином приводят к разрыву водородных связей между пуриновыми основаниями, и к нарушению нативности двойной спирали, и, в конечном итоге, - разделению двух комплементарных полинуклеотидных цепей.

Схема 1

Такие ЗВ, как красители, ведут себя по отношению к ДНК по - разному: бенгальский розовый (БР) не оказывает влияния на плавление ДНК. При сенсибилизированном фотолизе БР и ТХФ, между ними образуются комплексы, которые в меньшей степени воздействуют на ДНК, чем чистый ТХФ. Метиленовый голубой (МГ), самостоятельно без ТХФ вызывает серьёзные нарушения вторичной структуры ДНК. Под его влиянием плавление ДНК становится не кооперативным, ГЭ = 5,7%. Столь существенный ГЭ, даёт нам основание считать, что происходит полное нарушение нативности двойной спирали. Таким образом, МГ образует комплексы с пуриновыми основаниями, что приводит к разрыву пептидных связей и нарушению комплементарности спирали ДНК.

Глава 5. ТЕХНОГЕННЫЕ ТОКСИКАНТЫ КАК ИНГИБИТОРЫ
ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ

Хорошо известно, что все окислительные процессы в клетке катализируются ферментами. Очевидно, что вещество, в следовых количествах оказывающее биологическое действие, влияет на какую-либо ферментную реакцию. В качестве примера нами было изучено ингибирование техногенными токсикантами НАДН-оксидоредуктазы (НАДН-OP), обладающей широкой субстратной специфичностью. В частности, НАДН-OP участвует в окислении метана и его галлогензамещённых до формальдегида; СО до СО₂; алканов до спиртов; алкенов до эпоксисоединений; NH₃ до гидроксиламина, катализирует включение атома кислорода по С-Н, N-H, C=C и C=O связям.

§1. Ингибирование экотоксикантами НАДН-оксидоредуктазной реакции

Наибольшей ингибирующей активностью обладают зенкор и лонтрел. Концен- трации, приводящие к инактивации фермента на 50% (I₅₀), у них наименьшие (табл. 3). Ингибирующая способность Сu-, Мо-, FеL₂ выше, чем у исходного лонтрела. Константа Михаэлиса по донору электронов НАДН составила K_m(НАДН) =0,66·10^-3 М; по акцептору электронов неотетразолию хлористому - K_m(НТ) = 2,47·10^-3М.

Лонтрел, зенкор, кузагард, тачигарен, Сu-, Fе-, Mn-, МоL₂ конкурентно ингибируют редуктазу по донору электронов (рис. 6), видимо, являясь его структурным аналогом, пестицид связывается с ферментом в месте присоединения НАДН с образованием непродуктивного комплекса. Сетоксидим, раундап, тилт, Мg-, Ni-, Zn-, СоL₂ - неконкурентно ингибируют фермент по НАДН (рис. 7). Причём, при постоянном значении K_m величина V_max уменьшилась по сравнению с опытом без ингибитора с 7,4·10^-6 лМ^-1с^-1 до (2,0; 2,0; 2,2)·10^-6, соответственно. Ряд активности соединений, выстроенный по величинам константы ингибирования (К_i) по НАДН: CuL₂<МоL₂<зенкор<лонтрел<FeL₂<MnL₂<ZnL₂<NiL₂<MgL₂<базагран< СоL₂ < кузагард<тачигарен<раундап<тилт<сетоксидим.

Таблица 3

Влияние токсикантов на НАДН-оксидоредуктазу

Пестицид или комплекс - без ингибитора: V_max = 7,4010^-6 Мсек^-1; S₁ = 6,5810^-3 M; S₂ = 2,6510^-3M. Соль - без ингибитора: V_max = 2,75·10^-6Мсек^-1; S₁=1,54·10^-4М; S₂ = 3,30·10^-4 М. Тип ингибирования (Т/и): к - конкурентный; н - неконкурентный; б - бесконкупнтный; с - смешанный

Ингибитор	I50, M	Vmax, Мсек-1	S1, M НАДН,	Кi·104М НАДН	Т/и	Vmax, Мсек-1	S2, M (НT)	Кi104 M НT	Т/и
лонтрел	1,110-3		1,2310-3	1,00	к	1,8810-6	6,9810-4	7,42	б
зенкор	5,010-4		4,9310-3	0,25	к	0,2310-6	3,3910-4	8,94	б
базагран	6,010-4	1,8210-6	1,8310-4	12,80	б	0,2610-6	2,5510-4	8,40	б
раундап	1,710-3	3,3310-6	6,1710-4	22,00	н	0,2110-6	2,0010-4	42,9	б
кузагард	2,710-2		9,8610-3	14,00	к		5,7210-3	159	к
сетокс.	1,710-2	2,0010-6	7,5910-4	397,5	н		11,0010-3	8,04	к
тачигар.	2,710-3		2,4710-3	21,00	к		5,3010-3	4,55	к
тилт	2,210-3	1,2510-4	5,9810-4	23,00	н		13,0010-3	1,52	к
MgL2	2,010-3	1,6610-6	8,9710-4	12,67	н		23,8310-3	3,55	к
MnL2	3,010-3		4,9310-3	3,80	к	1,7210-6	1,8110-3	22,3	c
ZnL2	1,0 10-3	2,0010-6	8,2210-4	10,19	н	1,110-6	1,7210-3	2,46	c
CuL2	3,310-4		32,910-3	0,06	к	0,4410-6	9,3710-4	4,01	н
CoL2	1,510-3	2,2010-6	7,8910-4	13,73	н	1,6810-6	1,4010-3	13,1	с
NiL2	2,010-3	1,8010-6	1,2310-3	12,36	н	1,110-6	3,1110-3	11,7	н
FeL2	1,110-3		8,9710-3	1,13	к	1,5410-6	2,2010-3	11,7	н
MoL2	8,510-4		19,710-3	0,13	к		47,6210-3	0,41	к
Cu(ас)2	3,3·10-5	1,1·10-6	3,92	1,15	с		13,19	0,67	к
Mo(ам)	3,3·10-4	1,39·10-6	3,03	8,83	с		6,60	4,40	к
Mn(ас)2	1,3·10-6	9,66·10-7	1,15	0,014	б		8,80	0,02	к
Fe(ас)2	3,3·10-4	2,75·10-6	4,55	14,23	к		4,40	4,13	к
Ni(ас)2	3,3·10-5	7,66·10-7	3,17	0,88	с		14,66	0,70	к

В отношении ингибирования по акцептору электронов: кузагард, тачигарен, сетоксидим, тилт, MgL₂, МоL₂ могут быть отнесены к конкурентным ингибиторам. Зенкор, лонтрел, базагран, раундап проявили бесконкурентное ингибирование редуктазы. Можно допустить, что ингибитор и акцептор электронов связываются с разными местами в активном центре фермента.

В отличие от пестицидов, у металлокомплексов лонтрела встречается смешанное ингибирование по акцептору электронов: ZnL₂, СоL₂, MnL₂. Возможно, образуется комплекс фермент-ингибитор, к которому присоединяется субстрат. Комплексы NiL₂, СuL₂, FeL₂ проявили себя как неконкурентные ингибиторы НАДН-ОР по НТ. Данный тип ингибирования наблюдается при аллостерическом присоединении ингибитора, которое снижает активность фермента, а не его сродство к субстрату. При этом может происходить присоединение функциональных групп субстрата и ингибитора к различным местам активного центра фермента.

Рис. 6 Зависимость ингибрования НАДН-ОР лонтрелом (координаты Лайнуивера-Бэрка): 1. - без ингибитора

Лонтрел: 2. - 0,3'10^-4 М; 3. - 1,0'10^-4М

С_НТ = 2,47'10^-3М; C_{НАДН-ОР} =1,010^-6 М; C_НАДН = 1,010^-4 ч 1,510^-3 М.

Рис. 7 Зависимость ингибрования НАДН-ОР раундапом (координаты Лайнуивера-Бэрка): 1. - без ингибитора

Раундап: 2. - 1,2'10^-3М; 3. - 2,5'10^-3М.

С_НТ = 2,47'10^-3 М; C_{НАДН-ОР}=1,010^-6 М; C_НАДН = 2,010^-4 ч 1,510^-3 М.

§2. Действие солей металлов на процессы окисления,
осуществляемые ферментными системами

Сравнение ингибирования НАДН-OР солями металлов и соответствующими комплексами лонтрела показало, что соли Mg(II), Zn(II) и Mn(II) - не ингибирует фермент (10^-2 М), не зависимо от аниона. Комплексы этих металлов не взаимодействуют с НАДН (табл. 1).

Рис. 8 Кинетические кривые зависимости скорости окисления НАДН-ОР от концентрации НАДН при постоянной концентрации НТ: 1. - без ингибитора; Ni(ас)₂: 2. - 3,3'10^-6М; 3. - 3,0'10^-5 М; 4. - 1,7'10^-4 М

С_НТCl = 2,67'10^-3М; C_ОР=2,83·10^-7 М; C_НАДН = 1,010^-4± 1,510^-3М.

Рис. 9 Зависимость ингибирования НАДН-ОР Co(ас)₂ (координаты Лайнуивера-Бэрка): 1. - без ингибитора; Mn(ас)₂: 2. - 1,3'10^-6 М; 3. - 3,0'10^-6 М

С_НТ = 2,67'10^-3 М; C_ОР = 2,83·10^-7 М; C_НАДН=(1,010^-4 - 1,510^-3) М.

Соли Fe(II), Mo(VI), Cu(II), Ni(II), Co(II) обратимо ингибируют НАДН-OP в концентрациях от 3,3·10^-6 М (рис. 8). Комплексы с лонтрелом этих металлов проявляют высокую антиредуктазную активность (I₅₀), которая возрастает в ряду: Fe(асас)₂= Mo(ам)₆ <Ni(ас)₂= Cu(ас)₂ < Со(ас)₂ (табл. 3). Соли ингибируют фермент в концентрации на один - три порядка меньше, чем соответствующие комплексы. Наибольшая разница у иона Co(II) и СоL₂: I₅₀ = 1,3310^-6 и 1,510^-3 М, соответственно. Минимальная разница - у иона Mo(VI): I₅₀ = 3,310^-4 М; MoL₂ имеет I₅₀ = 8,510^-4 М. Порядок возрастания величины I₅₀ в случае комплексов обратен ряду для солей металлов: CuL₂<MoL₂<ZnL₂<FeL₂=L<CoL₂<NiL₂= MgL₂ <MnL₂.

При переходе от солей к комплексам (за исключением Fe - по НАДН и Mo - по НТ) изменяется характер ингибирования: СоL₂ ингибирует фермент неконкурентно, а соль - бесконкурентно (рис. 9), вероятно, в результате неспецифического взаимодействия с белковой матрицей вне активного центра фермента. Такое взаимодействие вызывает конформационные изменения на участке транспорта электрона, что ведёт к уменьшению скорости ферментативной реакции.

Комплексы CuL₂, MoL₂ и FeL₂ конкурируют с НАДН за место связывания на ферменте (табл. 3). CuL₂ ингибирует окисление НАДН почти в 20 раз менее интенсивно, чем Cu(II), тогда как MoL₂ - в 80 раз, по сравнению с Mo(VI). Наблюдаемые отличия обусловлены различиями в структуре соединений, изменением характера связи металл-лиганд. В составе комплекса с лонтрелом металл не способен действовать как свободный катион. Ингибирующим компонентом здесь служит сам комплекс, либо один или оба лиганда, связанные в комплекс. Величины K_i по НАДН изменяется в ряду: соль > лиганд > комплекс. Следовательно, антиредуктазная активность возрастает при переходе от соли к лиганду и к комплексу. В случае Со и Ni, наоборот, прочность связи фермента с ингибитором возрастает при переходе: соль < лиганд < комплекс.

Соли металлов конкурентно ингибируют НАДН-ОР по акцептору электронов. По величинам константы ингибирования они располагаются в ряд: Mo(VI) Fe(II) Ni(II) Cu(II) Со(II). Для комплексов в ряду активности по K_i: MnL₂ CoL₂ FeL₂ = NiL₂ CuL₂ MgL₂ ZnL₂ MoL₂ наблюдается практически та же закономерность: прочность связывания токсиканта-ингибитора возрастает при переходе: соль < лиганд < комплекс. В поведении солей определяющим фактором является ион металла и строение его электронных оболочек, поэтому рассмотренные соли металлов не конкурируют с НАДН за место связывания. В комплексах металлов доминирующим влиянием обладает лигандное окружение. Пиридиновое кольцо имеет строение близкое к НАДН, т.е. способно занять место субстрата на белке, а атом азота может отдать неподелённую пару электронов. Изменение координационной сферы металла (лигандного окружения), приводит к кардинальным изменениям в характере ингибирования. Выше нами показано, что металлы в комплексах проявляют высокие степени координации могут образовывать полимерные цепочки, где лиганд выполняет роль «мостика»: L-M-L-Fe-ОР, согласно схеме 2.

Схема 2

Коэффициет Хилла h = 1 для рассмотренных солей металлов - к ферменту присоединяется только один ион. У комплексов и токсикантов - ингибиторов - потенциальных лигандов, h = 1,5 ч 2,0. Две молекулы токсиканта или его металлокомплекса связываются с одной молекулой фермента. Поскольку токсиканты легко взаимодействуют с металлами, видимо, одним местом присоединения их на ферменте является ион металла, входящий в состав активного центра (в форме 2Fe -2S кластера), а вторым - аминокислоты белковой матрицы.

Глава 6. ВЛИЯНИЕ ЭКОТОКСИКАНТОВ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

Мембраны клеток специально созданы природой для сохранения внутриклеточного химического состава, и для защиты организмов от ксенобиотиков, находящихся в окружающей среде. Транспорт ЗВ через мембраны является первичной и лимитирующей стадией, предшествующей химическому взаимодействию токсиканта с биологическими молекулами.

§1. Кинетика переноса токсикантов через липосомальные мембраны

Процесс массопереноса ЗВ через мембрану внутрь клетки изучался нами на липосомах, начинённых -АТФ (рис. 10) по тушению флуоресценции. Для количественной характеристики нами была создана математическая модель процесса, согласно которой концентрация -АТФ внутри липосом [E] связана с экспериментально измеряемой интенсивностью флуоресценции I(t) соотношением: [E]=[E₀]I(t)/I(0), где I(0) - начальная величина свечения в ячейке до прибавления токсиканта - тушителя. Скорость переноса пестицида через липидную мембрану j(t), описывается уравнением:

в котором, - K_к/о - константа комплексообразования ЗВ с е-АТФ.

Расчёт удовлетворительно описывает экспериментальные данные. Скорость переноса пестицида через липидную мембрану не зависит от градиента концентраций (j = const), не зависит от исходной концентрации, оставаясь посто янной при изменении концентрации от 10^-2 до 10^-4М, определяется исключительно свойствами липидного бислоя и строением молекулы ксенобиотика. Токсиканты, характеризующиеся высокими значениями констант комплексообразования обладают меньшей скоростью проникновения через мембраны клеток.

Рис. 10 Изменение интенсивности флуоресценции инкапсулированной е-АТФ от времени воздействия лонтрела (точки 1-3) и CoL₂ (точки 4-6)

Концентрация е-АТФ = 1·10^-4 М. Концентрация гербицидов в рабочей кювете: 1?10^-4 (1, 4); 1·10^-3 (2, 5); 1·10^-2 (3, 6) М. Точки - данные эксперимента. Сплошная линия - расчёт.

Наибольшую скорость переноса проявили сетоксидим (j=41,2·10^-8 Мс^-1) и кузагард (j=14,7·10^-8 Мс^-1) (табл. 4). Эти соединения обладают сложным строенем, имеют в своём составе значительные по размерам органические жирные фрагменты. Близкими оказываются скорости переноса базаграна и лонтрела. Зенкор - самый активный комплексообразователь, имеет наименьшую скорость переноса. Значения констант массопереноса имеют обратную корреляцию со значениями К_к/о с -АТФ - с их способностью к образованию комплексов с функциональными молекулами живой клетки: АТФ, НАДН, ДНК, РНК. По величинам К_к\о с -АТФ ряд активности выглядит: CuL₂ = CoL₂ зенкор NiL₂ лонтрел кузагард FeL₂ раундап сетоксидим базагран MoL₂ тачигарен тилт. По величине скорости массопереноса, рассмотренные соединения выстраиваются в ряд: зенкор лонтрел базагран CoL₂ раундап кузагард CuL₂ сетоксидим.

Таблица 4

Значения констант массопереноса ЗВ через липосомальную мембрану

Названия веществ	J·10-8, М·с-1	cр. J·10-8, М·с-1	Koct/H2O	Koct/H2O
	исходные концентрации
	10-2, М	10-3, М	10-4, М		20 мин	18 мес
зенкор	2,1	7,6	2,8	2,1433,4	66,57	100,4
лонтрел	4,1	5,2	2,8	4,131,6	2,56	3,38
кузагард	14,7	14,7	14,5	14,673,0	0,30	0,77
раундап	10,9	13,8	9,7	10,871,2	0,46	2,27
сетоксид.	41,2	41,2	41,2	41,181,4	7,83	25,00
базагран	5,9	6,1	5,1	5,92,76	52,19	70,43
CuL2	18,0	15,6	21,2	18,041,1
CoL2	7,0	6,2	8,0	7,035,6

Причиной обратной зависимости является высокая комплексообразующая способность рассмотренных пестицидов: в процессе диффузии внутри липидного бислоя происходит их химическое взаимодействие с фосфатидилхолином, которое определяет скорость переноса ЗВ внутрь липосомы. Видимо, пестицид образует комплекс с фосфатидилхолином состава 1:1 (а) или 1:2 (b), согласно схеме 3:

Схема 3

Важно, что скорость проникновения комплексов металлов через биологическую мембрану значительно выше, чем у исходного пестицида: у CoL₂ почти в 2 раза, а у CuL₂ почти в 5 раз.

§2. Кинетика процесса биоаккумуляции ЗВ в модельных системах

...