123±8

121±10

119±11

122±9

Количество эритроцитов, 1012/л

4,2±0,3

3,8±0,3

3,6±0,3

4,2±0,4

Количество тромбоцитов, 1012/л

280±38

180±22

145±18*

170±21

Количество лейкоцитов, 109/л

6,3±0,4

4,8±0,4*

3,5±0,3*

3,6±0,3*

Количество нейтрофилов, 109/л

4,1±0,3

3,5±0,2

2,0±0.2*

2,4±0.2*

Количество лимфоцитов, 109/л

1,6±0.3

0,9±0,2*

0,9±0,2*

0,6±0,1*

* - р < 0,05 по сравнению с уровнем до облучения

лучевая терапия рак орофарингеальный

Таким образом, лучевая терапия больных раком орофарингеальной области сопровождается развитием как местных проявлений радиоэпителиита (более чем у 80% пациентов), так и общими сдвигами гемопоэза, проявляющимися в виде умеренной нейтро - и лимфопении, тромбоцитопении и увеличении СОЭ.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для оценки возможности профилактики и лечения осложнений лучевой терапии рака орофарингеальной области( лучевых стоматитов и гемодепрессии) с помощью глутоксима возникла необходимость в проведении экспериментальных исследований по изучению основных механизмов фармакологической активности препарата, применяемого в качестве раннего лечения радиационных поражений организма.

4.1. Влияние глутоксима на состояние рецепторов к эпидермальному фактору роста и активность митогенактивируемой протеинкиназной системы

Согласно существующим в настоящее время представлениям целостность слизистой полости рта при воздействии механических, химических и физических (лучевых) раздражителей, во многом, определяется состоянием систем пролиферации и дифференцировки клеток эпителия. К определяющим в первую очередь следует отнести ростовые факторы, такие как эпидермальный фактор роста (ЭФР) и интерлейкины. Учитывая тот факт, что в литературе практически отсутствуют данные о динамике уровня эпидермального фактора роста, у больных с опухолями орофарингеальной области, подвергающихся лучевой терапии, одной из задач настоящего исследования явилось изучение влияния фракционированного облучения на содержание эпидермального фактора роста и интерлейкина 1b (IL - 1b) в крови.

Как видно из таблицы 9, облучение больных контрольной группы (без введения глутоксима) сопровождалось дозозависимым увеличением в крови содержания ЭФР и IL-1b. Так, в плазме крови больных, облученных в дозе 40-60 Гр, содержание ЭФР увеличивалось по сравнению с уровнем исходных величин в среднем в 2-3 раза, а значения показателя IL-1b, более чем на 80 %.

Казалось бы, повышение уровня регуляторных пептидов (эпидермального фактора роста и интерлейкина 1в) в крови онкологических больных, подвергшихся лучевой терапии, является благом для организма и может свидетельствовать об активации репаративных процессов. Однако клинические наблюдения свидетельствуют об обратном. Как видно из данных, представленных в табл. 9, параллельно с ростом в крови больных концентрации исследуемых цитокинов увеличивается выраженность проявлений лучевых стоматитов и гемодепрессии.

Таблица 9

Влияние глутоксима на содержание эпидермального фактора роста и интерлейкина 1b в крови больных раком орофарингеальной области, подвергавшихся лучевой терапии

Показатели	Группы наблюдений	До облучения (лечения)	После облучения, доза, Гр
			20	40	60
ЭФР, пг/мл	ЛТ	3,5±0,47	5,8±0,391	7,8±1,11	8,9±1,11
	ЛТ+Гл		4,3±0392	5,4±0,512	4,9±0,432
IL-1b, пг/мл	ЛТ	49,4±3,8	67,5±5,31	128,8±12,61	92,5±13,21
	ЛТ+Гл		59,8±4,62	68,1±5,72	67,4±6,52

Примечание: 1 - р < 0,05 по сравнению с уровнем до облучения; 2 - то же по сравнению с контролем

Применение в качестве средства сопровождения лучевой терапии глутоксима значительно уменьшает частоту развития лучевых стоматитов и способствует нормализации концентрации изучаемых пептидов. Какова же причина столь ярких противоречий? Для ответа на поставленный вопрос необходимо обратить внимание на состояние рецепторов к эндогенным лигандам и в первую очередь на активность рецептора эпидермального фактора роста, так как, согласно данным литературы, биологическая активность многих эндогенных цитокинов определяется рецепцией эпидермального фактора роста (Михайлов В.В., 2001). В связи с этим, исследования последующих разделов были посвящены изучению влияния глутоксима на активность рецепторов эпидермального фактора роста.

Для изучения фармакологической активности исследуемого препарата применялась модель "in vitro" с использованием специализированной клеточной культуры А431. Клетки линии эпидермоидной карциномы человека А431 имеют экстраординарно высокий уровень экспрессии рецептора эпидермального фактора роста, что позволяет с высокой степенью достоверности интерпретировать получаемые результаты по статусу активации рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) и ЭФР-зависимых сигнальных систем.

Характер активации рецептора эпидермального фактора роста препаратом глутоксим представлен на рис. 1 и 2. Во всех исследованных концентрациях глутоксима (1 и 10 мкг/мл) выявлена выраженная активация процессов фосфорилирования изучаемого рецептора (8-10 раз) на длительных сроках воздействия (1-8 часов). Так, при обработке клеточной культуры препаратом в концентрации 1 мкг/мл активность фосфорилирования рецепторов возрасла к концу 1 часа наблюдения в среднем в 4 раза по сравнению с интактным контролем. В последующем выраженность изучаемого процесса продолжала расти и достигла к 8 часам уровня, который был выше контрольной группы почти в 9 раз. Следует отметить, что в данные сроки наблюдения выявлена отчетливая зависимость между дозой вносимого в инкубационную среду препарата и активностью процессов фосфорилирования рецепторов эпидермального фактора роста. Подтверждением тому может служить тот факт, что при концентрации глутоксима в 10 мкг/мл уровень активации возрастал в 16 раз. Необходимо отметить, что стимуляция рецептора ЭФР глутоксимом во всех исследованных концентрациях максимальна через 8 часов воздействия.

В ранние сроки наблюдения выявлена выраженная активация глутоксимом рецептора эпидермального фактора роста (3-4 раза) как через 5 мин, так и через 30 мин воздействия препарата во всех исследованных концентрациях. Характер активации рецептора выражался в небольшом повышении уровня фосфорилирования в течение первых 5 мин (первая волна), снижении до контрольного значения к 10 мин, с последующим возрастанием активации через 30 мин (вторая волна), сильном увеличении через 1 час, которое несколько снижаясь через 4 часа достигает максимума через 8 ч.

Рис. 1. Влияние глутоксима в концентрации 10 мкг/мл на активность фосфорилирования рецептора ЭФР

По оси абсцисс - время наблюдения; по оси ординат - величина показателя в %х10 от исходного уровня



Рис. 2. Влияние глутоксима в концентрации 1 мкг/мл на активность фосфорилирования рецептора ЭФР

По оси абсцисс - время наблюдения; по оси ординат - величина показателя х10 в % от исходного уровня

Таким образом, на основании этих данных можно утверждать, что существует волнообразная зависимость эффекта глутоксима по активации рецептора ЭФР от времени воздействия. Аналогичная динамика выявлена при всех исследованных концентрациях глутоксима (1 и 10 мкг/мл).

Другой задачей исследования явилось изучение влияния глутоксима на активность митогенактивируемых протеинкиназ (МАР-киназ рERK1,2), которые, по - мнению ряда авторов играют одну из ключевых ролей в процессах клеточной пролиферации (Гусев Н.Б.,2000; Потехина Е.С., Надеждина Е.С., 2002; Аdachi M. et al., 2000; Coutant A. et al., 2002).

Анализ результатов, представленных на рис.3 и 4 показал, что динамика активации экстраклеточно регулируемых киназ 1,2 (рERK 1,2) в клетках А431 при действии глутоксима носила волнообразный характер и была аналогична изменению выраженности процессов фосфорилирования рецепторов эпидермального фактора роста. Глутоксим в концентрациях 10 и 1 мкг/мл вызывал отчетливую активацию рERK 1,2 через 5 мин и 10 мин (в 5-10 раз) и максимальную - через 8 часов (в10 и 30 раз, соответственно). В остальные сроки наблюдения (30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч) повышение активности рERK 1,2 не выявлено. Можно сделать вывод, что глутоксим в вышеперечисленных концетрациях оказывал стимулирующее влияние на рецептор эпидермального фактора роста, что приводило к активации процессов фосфорилирования сигналпередающих белков, в частности, митогенактивируемых протеинкиназ (МАР-киназ рERK1).

Рис.3. Влияние глутоксима в концентрации 10 мкг/мл на активность MAP-киназ рERK 1,2 в клетках А 431

По оси абсцисс- время наблюдения; по оси ординат - величина активности х 10 в % от исходного уровня.



Рис.4. Влияние глутоксима в концентрации 1мкг/мл на активность MAP-киназ рERK 1,2 в клетках А 431

По оси абсцисс- время наблюдения; по оси ординат - величина активности х 10 в % от исходного уровня.

Таким образом, анализ полученных результатов позволяет заключить, что исследованный препарат - глутоксим оказывал активирующее воздействие на рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР), которое выражается в многократном повышении уровня фосфорилирования этого рецептора. Наблюдалось две волны активации, первая на ранних строках воздействия препарата на клетку, а вторая - через несколько часов инкубации. Аналогичный волнообразный характер выявлен и в стимуляции глутоксимом митогенактивирующих киназ ERK1,2 (МАР-киназ ERK1,2) в клетках А431: активация через 5-10 мин, далее снижение величины показателя до уровня нормы и появление второй волны через 8 часов после воздействия.

Максимальная (до 29 раз) степень активации препаратом глутоксим МАР-киназ ERK1,2 выявлена при длительных (в течение 8 ч) сроках инкубации клеток. В опытах продемонстрировано совпадение динамики активации рецептора ЭФР и МАР-киназ ERK1,2 при действии изучаемого соединения.

Следующей задачей исследования стало изучение влияния глутоксима на активность гемоксигеназы-1. Выбор данного фермента в качестве объекта исследования был обусловлен данными литературы о его ключевой роли в детоксикации. То есть гемоксигеназа-1 наряду с глутатионпероксидазой определяет активность второй фазы детоксикации (Гуляева Л.Ф., 2000; Зенков Е.Б., 2001), что является важным фактором снижения выраженности осложнений лучевой терапии онкологических больных.

Исследование проведено на клеточной культуре А431, на которой ранее нами было изучено действие препарата глутоксим на ЭФР-зависимую систему передачи сигнала, а так же на клетках HeLa.

Проведенные исследования показали (рис. 5), что при действии на клетки аденокарциномы человека HeLa глутоксима в концентрации 1 мкг/мл наблюдалось заметное повышение экспрессии гемоксигеназы 1 в интервале 6 - 11 часов). Денситометрический анализ полученных результатов показал, что наиболее значительная экспрессия гемоксигеназы 1 происходила через 9 часов (более 2 раз по отношению к контрольному значению). В более поздний период наблюдения (11-22 часа) активность фермента практически не отличалась от уровня контрольных величин. Второй пик повышения (в среднем в 2 раза) активности гемоксигеназы 1 выявлен лишь через 24 часа.

На основании вышеизложенного можно заключить, что глутоксим в концентрации 1 мкг/мл, вносимый в среду инкубации клеток HeLa вызывает экспрессию ключевого фермента II фазы детоксикации гемоксигеназы 1, что проявляется в значительном увеличении ее активности через 9 и 24 часа после начала воздействия препарата.



Рис.5. Влияние глутоксима в концентрации 1,0 мкг/мл на активность гемоксигеназы 1 в клетках аденокарциномы человека HeLa

По оси абсцисс- время наблюдения; по оси ординат - величина активности х 10 в % от исходного уровня.

Анализ результатов, представленных в разделе 4.1 позволяет заключить, что воздействие препарата глутоксим на клетки сопровождается стимуляцией каскада биохимических и молекулярно-биологических реакций, приводящих к активации рецепторов эпидермального фактора роста с последующей стимуляцией сигнал-опосредованных внутриклеточных процессов таких как: повышение активности митоген-активированных киназ ERK 1, 2, посредством которых может активироваться система сигнал-трансформирующего белка STAT 3. А это в свою очередь приводит, согласно данным литературы к стимуляции пролиферативных процессов в клетках (Bromberg J., Chen X., 2001).

Кроме того, опосредованная стимуляция глутоксимом гемоксигеназы 1 может способствовать повышению активности процессов детоксикации ксенобиотиков (Гуляева Л.Ф., 2000; Зенков Е.Б., 2001). Все вышеперечисленные эффекты, обнаруженные у глутоксима, по-мнению (Стромская Т.П., Рыбалкина Е.Ю. , 2003) могут приводить к повышению устойчивости нормоцитов к неблагоприятным воздействиям и, в частности, к ионизирующим излучениям. Для уточнения правомочности данного предположения были проведены радиобиологические исследования на экспериментальных животных.

4.2 Противолучевая эффективность глутоксима

В табл. 10 представлены результаты изучения влияния профилактического и лечебного внутрибрюшинного применения глутоксима в дозе 10 мг/кг на выживаемость облученных животных. Препарат использовали в трех сериях экспериментов: в профилактическом варианте введения - за 24 ч до облучения; в лечебном - через 1, 24, 48, 72 ч после воздействия, а также в комбинированном - профилактически-лечебном варианте - за 24 ч до и 1, 24, 48, 72 ч после облучения. Из таблицы следует, что во всех группах опытов имело место увеличение выживаемости облученных животных на 20-30 % по отношению к контрольной группе. Следует отметить стабильность радиозащитного действия глутоксима как при профилактическом, так и лечебном вариантах его применения.

Таблица 10

Влияние профилактического и лечебного применения глутоксима (10 мг/кг) на выживаемость мышей, облученных в дозе 7,3 Гр (n=80)

Группа животных	Время введения, ч	Выживаемость, %
Контроль облучения	-	30
	-24	55
Облучение + глутоксим	+1, 24, 48 и 72	60
	-24, +1, 24 и 48	50

Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований, позволяющих уточнить возможные механизмы радиозащитного действия глутоксима. С этой целью была выбрана доза облучения 3,5 Гр, не вызывающая гибель экспериментальных животных и позволяющая провести гематологические исследования в течение длительного срока наблюдения.

4.3 Влияние глутоксима и интерлейкина 1 бета на пролиферативную активность клеток костного мозга

По существующим представлениям эффективность лечебных мероприятий при остром лучевом поражении в значительной степени определяется их способностью активизировать процессы постлучевого восстановления кроветворной ткани. Речь идет о влиянии средств терапии на пролиферацию и дифференцировку костномозговых клеток и на восполнение дефицита полноценных зрелых клеточных форм в периферической крови.

Представляло интерес оценить влияние глутоксима и интерлейкина 1 бета, исследуемых в качестве средств ранней терапии, на процессы биосинтеза ДНК в костном мозге облученных животных. Об интенсивности пролиферации судили по включению ³Н-тимидина в ДНК клеток костного мозга.

Средства ранней терапии вводили облученным мышам по следующим схемам: глутоксим - в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно через 1, 24 и 48 ч после облучения; интерлейкин-1 бета - в дозе 5 мкг/кг подкожно спустя 30 мин радиационного воздействия.

Как следует из данных, представленных на рис. 5, у облученных контрольных животных на 3 сут лучевой травмы интенсивность включения ³Н-тимидина в ДНК клеток костного мозга существенно ниже уровня необлученного контроля. Однако, на 9 и 12 сут острого лучевого поражения этот показатель превышал (в среднем в 3 раза ) значения биоконтроля.

Интенсивность включение метки в ДНК клеток костного мозга животных, леченых глутоксимом, возрастало (почти на 50%) на 9 сут наблюдения и к 12 сут после облучения величина этого показателя была выше (в среднем в 1,5-2 раза) уровня облученного контроля. Что касается интерлейкина 1-бета, то усиление включения ³Н-тимидина под действием этого препарата (по сравнению с облученным контролем) было выявлено лишь на 3 сут после радиационного воздействия, причем уровень биосинтеза ДНК хотя и возрастал, но не достигал нормальных значений. На 9 и 12 сут острой лучевой болезни у животных, леченых интерлейкином - 1 бета, включение метки было примерно таким же, как у облученных контрольных животных.

В целом, проведенные эксперименты показали, что препараты, исследуемые в качестве средств ранней терапии, оказывают влияние на интенсивность биосинтеза ДНК в костном мозге у облученных животных. При введении препаратов наблюдалось увеличение интенсивности включения ³Н -тимидина в ДНК, что свидетельствовало об усилении пролиферативных процессов в костном мозге у облученных мышей. Наибольший эффект в отношении исследуемого процесса был выявлен у глутоксима. Так, к 9 суткам после радиационного воздействия интенсивность включения ³Н -тимидина в ДНК клеток костного мозга возрасла почти на 50% по сравнению с уровнем облученного контроля. В это же время интерлейкин - 1 бета, вводимый облученным животным обладал меньшим активирующим действием на процессы на процессы биосинтеза ДНК в кроветворных клетках, чем глутоксим. Аналогичная динамика отмечена и к 12 суткам. Включение радиоактивной метки в ДНК возросло в группе применения глутоксима почти в 2 раза по сравнению с уровнем облученного контроля.



Рис. 6. Влияние глутоксима и IL-1b на интенсивность включения ³Н-тимидина в ДНК костного мозга мышей, облученных в дозе 7.3 Гр

По оси ординат - интенсивность биосинтеза ДНК, % от нормы; по оси абсцисс - время после облучения, сут.

4.4 Эффективность глутоксима по восстановлению кроветворения у облученных животных

Глутоксим вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг через день в течение 10 сут после радиационного воздействия. Гематологические исследования проводили унифицированными стандартными методами.

Из приведенных данных (табл. 11-14), следует, что лечебное применение глутоксима приводит к изменению характера гемо-иммунопоэза, проявляющемуся в первую очередь в достоверном увеличении содержания числа лейкоцитов в периферической крови и ядросодержащих клеток в костном мозге голени на 3, 10, 15 сут после воздействия у животных всех групп. Данные изменения могут быть связаны с влиянием глутоксима на процессы митотической активности белого ростка костного мозга, так как, согласно полученным данным, число митозов на 3 и 10 сут наблюдения у животных с применением глутоксима достоверно выше, чем в облученном контроле.

Следует отметить, что глутоксим оказывал значительное влияние и на процессы гемопоэза в красном ростке крови. Хотя облучение и не вызвало существенных сдвигов в количестве эритроцитов и гемоглобина в периферической крови, уже к 3 суткам наблюдения в костном мозге животных выявлено существенное (в 2 раза ) снижение числа эритробластов и митозов в красном ростке (табл.14). В последующий срок (на 10 сут после радиационного воздействия) в периферической крови выявлено снижение (в среднем в 2,2 раза) содержания тромбоцитов на фоне радиационно обусловленного угнетения митотических процессов в клетках красного ростка костного мозга. На 15 сут наблюдения выявлено восстановление угнетенного кроветворения. Применение глутоксима способствовало уменьшению выраженности выявленных гематологических нарушений.

Таблица 11

Влияние глутоксима на показатели периферической крови крыс на 3 сут после облучения (3,5 Гр)

Показатель	Величина показателя
	Биологический контроль	Облучение	Облучение + глутоксим
Гемоглобин, г/л	15,20?0,16	13,0?0,2	12,90?0,22
Эритроциты, 1012/л	6,70?0,16	6,20?0,19	6,20?0,23
СОЭ, мм/ч	2,50?0,85	2,00?0,37	3,3?0,8
Тромбоциты, 10 9/л	368,0?21,5	370,0?35,3	387,0?17,4
Ретикулоциты,%	1,8?0,2	0,080?0,005	0,3+0,1*
Лейкоциты,10 9/л	9,20?0,35	0,580?0,026	1,38?0,11*
Палочкоядерные нейтрофилы,%	0,3?0,1	0	2,5?0,3
Сегментоядерные нейтрофилы,%	16,0?2,5	18,7?2,4	42,0?1,6
Эозинофилы,%	2,0?0,3	0	0
Моноциты,%	5,7?0,5	11,6?0,6	10,3?0,5
Лимфоциты,%	75,5?1,4	71,0?1,8	45,0?1,6
* - различия достоверны (Р < 0,05) по сравнению с контролем облучения

Таблица 12

Влияние глутоксима на показатели периферической крови крыс на 10 сут после облучения (3,5 Гр)

Показатель	Величина показателя
	Биологический контроль	Облучение	Облучение + глутоксим
Гемоглобин, г/л	15,20?0,16	13,80?0,56	14,20?0,68
Эритроциты, 1012/л	6,70?0,16	6,00?0,25	6,20?0,18
СОЭ, мм/ч	2,50?0,85	1,80?0,31	2,2?0,8
Тромбоциты, 10 9/л	368,0?21,5	167,00?19,3	226,0?10,0
Ретикулоциты,%	1,8?0,2	1,0?0,1	1,5?0,2*
Лейкоциты,10 9/л	9,20?0,35	2,50?0,15	4,41?0,09*
Палочкоядерные нейтрофилы,%	0,3?0,1	0	2,0?0,3
Сегментоядерные нейтрофилы,%	16,0?2,5	32,0?1,9	50,4?0,6*
Эозинофилы,%	2,0?0,3	1,7?0,3	1,7?0,2
Моноциты,%	5,7?0,5	8,7?0,4	5,3?0,5
Лимфоциты,%	75,5?1,4	57,7?1,1	41,0?0,9*
* - различия достоверны (Р < 0,05) по сравнению с контролем облучения

Таблица 13

Влияние глутоксима на показатели периферической крови крыс на 15 сут после облучения (3,5 Гр)

Показатель	Величина показателя
	Биологический контроль	Облучение	Облучение + глутоксим
Гемоглобин, г/л	15,20?0,16	13,30?0,68	11,60?0,63
Эритроциты, 1012/л	6,70?0,16	5,70?0,17	5,70?0,26
СОЭ, мм/ч	2,50?0,85	2,30?0,61	2,70?0,49
Тромбоциты, 10 9/л	368,0?21,5	273,0?56,9	290,0?38,3
Ретикулоциты,%	1,8?0,2	1,2?0,2	1,7?0,3
Лейкоциты,10 9/л	9,20?0,35	2,90?0,04	6,60?0,22*
Палочкоядерные нейтрофилы,%	0,3?0,1	0	0
Сегментоядерные нейтрофилы,%	16,0?2,5	14,3?1,6	20,3?2,4*
Эозинофилы,%	2,0?0,3	0	0,6?0,2
Моноциты,%	5,7?0,5	12,3?0,6	6,2?0,8
Лимфоциты,%	75,5?1,4	73,4?1,8	72,5?1,4*

* - различия достоверны (Р < 0,05) по сравнению с контролем облучения

Таблица 14

Влияние глутоксима на показатели костного мозга у крыс после облучения (3,5 Гр)

Показатель	Значение на 3 сут после облучения
	Биологичес-кий контроль	Облучение	Облучение + глутоксим
Количество ядросодержащих клеток в голени, 10 6	10,00?0,49	0,70?0,08	2,60?0,64*
Эритробласты, %	0,80?0,05	0,40?0,02	0,50?0,02
Миелобласты, %	2,4?0,2	1,10?0,09	1,40?0,06
Число митозов в белой крови, %	0,50?0,01	0,10?0,004	0,20?0,006*
Лимфоциты, %	8,20?0,08	7,60?0,18	7,2?0,1
Ретикулоциты, %	2,5?0,2	0,40?0,06	0,40?0,05
10 сут после облучения
Количество ядросодержащих клеток в голени, 10 6	10,00?0,49	0,90?0,08	4,20?0,46*
Эритробласты, %	0,80?0,05	0,60?0,03	0,60?0,03
Число митозов в красной крови, %	0,50?0,02	0,30?0,01	0,40?0,006
Миелобласты, %	2,4?0,2	1,60?0,07	2,50?0,04
Промиелоциты, %	4,30?0,21	2,00?0,06	3,10?0,03
Число митозов в белой крови, %	0,50?0,01	0,20?0,009	0,51?0,004*
Лимфоциты, %	8,20?0,08	7,90?0,19	8,20?0,09
Ретикулоциты, %	2,5?0,2	1,40?0,05	1,40?0,08
15 сут после облучения
Количество ядросодержащих клеток в голени, 10 6	10,00?0,49	1,0?0,1	6,2?1,4*
Эритробласты, %	0,80?0,05	0,70?0,01	0,80?0,03
Число митозов в красной крови, %	0,50?0,02	0,40?0,006	0,40?0,04
Миелобласты, %	2,4?0,2	2,30?0,07	3,00?0,04
Промиелоциты, %	4,30?0,21	4,20?0,05	4,50?0,05
Число митозов в белой крови, %	0,50?0,01	0,30?0,07	0,50?0,04*
Лимфоциты, %	8,20?0,08	8,30?0,12	8,10?0,03
Ретикулоциты, %	2,5?0,2	2,10?0,18	2,50?0,03*
* - различия достоверны (Р < 0,05) по сравнению с контролем облучения

Таким образом, анализ данных настоящего раздела позволяет заключить, что глутоксим восстанавливает чувствительность рецепторов к эндогенным лигандам пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток, что приводит к активации радиационно угнетенных процессов кроветворения, а это в свою очередь способствует восполнению пула полноценных клеток периферической крови облученного организма.

Глава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ГЛУТОКСИМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ ОРОФАРИНГЕАЛЬНОЙ ОБЛАСТИ, ПОЛУЧАВШИХ ЛУЧЕВУЮ ТЕРАПИЮ

5.1 Эффективностъ глутоксима как средства сопровождения лучевой терапии рака орофарингеальной области

Для оценки эффективности глутоксима примененяемого в качестве средства сопровождения лучевой терапии рака орофарингеальной области была выделена группа больных из 24 человек ( II гр). Этим больным на протяжении всего периода радикальной лучевой терапии вводили внутримышечно фармакопийный иммуномодулятор - препарат глутоксим по 2,0 мл 3%-ного раствора через день 3 раза в неделю (понедельник, среда, пятница) через 30 - 60 мин после каждой фракции лучевого лечения.

Проведенные исследования показали, что процент положительных ответов на лучевое лечение по показателю полной и частичной ремиссии в группе больных, получавших препарат глутоксим (табл.15), был существенно выше (р<0,05), чем в контрольной группе (83,4% и 61,5%, соответственно). Не наблюдалось ответа на терапию в группе, получавшей глутоксим, у 3 больных (12,5%), в контрольной группе - у 7 (27,9%) больных. Прогрессирование опухолевого процесса отмечено у 1 (4,1%) больного из основной группы, а у получавших только лучевую терапию - у 3 пациентов (11,5%).

Однако, обращает на себя внимание тот факт, что применение глутоксима практически не влияет на продолжительность ремиссии при рецидиве опухоли. Так средняя продолжительность ремиссии у больных раком орофарингеальной области с рецидивом заболевания в группе с глутоксимом оказалась равной 11, 9±1,4 месяца , а в контрольной группе - 9,2±1,1 месяца (различия статистически недостоверны).

Таблица 15

Влияние глутоксима на частоту различных видов непосредственных результатов радиотерапии рака орофарингеальной области

Группы больных	Число больных	Непосредственный результат
		Полная ремиссия	Частичная ремиссия	Стабилизация	Прогрессирование
		абс. число	% ?m	абс. число	% ?m	абс. число	% ?m	абс. число	% ?m
ЛТ + Гл	24	16	66,7±5,23	4	16,7±4,26	3	12,5 ?3,28	1	4,1±0,56
ЛТ	26	9	34,6±6,86	7	26,9±5,23	7	26,9±6,34	3	11,5±1,98

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таким образом, применение глутоксима при проведении лучевой терапии больных раком орофарингеальной области позволяет достоверно улучшить непосредственные результаты лечения рака ротоглотки и гортани III - IV стадии.

5.2. Влияние глутоксима на качество жизни больных раком орофарингеальной области, получавших лучевое лечение

Влияние глутоксима на качество жизни онкологических больных, получавших лучевую терапию, нами определено с помощью индекса Карновского.

Так уже при суммарной очаговой дозе облучения в опухоли 20 Гр величина индекса Карновского у больных основной группы возрастает до 70 баллов (при уровне данного показателя в контроле в 50-60 баллов). К концу лучевой терапии и достижении СОД в опухоли 60 Гр , глутоксим также способствовал восстановлению качества жизни онкологических больных. При этом индекс Карновского возрастал до 90 баллов ( в контрольной группе его величина была равна 60 баллам) (табл. 16).

Таким образом, анализ полученных данных свидетельствует о том, что с помощью глутоксима представляется возможным умеренно повысить эффективность радикальной лучевой терапии рака ОФО при сохранении высокого качества жизни онкологических больных. Напомним, что качество жизни больных раком ОФО определяется выраженностью таких осложнений лучевой терапии как лучевые эпителииты (стоматиты) и гемодепрессивный синдром. Поэтому дальнейшие исследования были посвящены изучению возможности профилактики и лечения осложнений радикальной лучевой терапии с помощью препарата глутоксим.

Таблица 16

Влияние глутоксима на качество жизни пациентов (индекс Карновского, в баллах) с опухолями орофарингеальной области, получавших лучевую терапию

Показатель	Группы наблюдений	До облучения (лечения)	После облучения, доза, Гр
			20	40	60
индекс Карновского	ЛТ	70	50-60	50	50-60
индекс Карновского	ЛТ+ Гл	70	60-70	70-80*	90*

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с контрольной группой (ЛТ)

5.3 Влияние глутоксима на выраженность клинических проявлений лучевого стоматита и гематологические нарушения

5.3.1 Клинические проявления стоматита

Как указывалось выше, наиболее характерными субъективными симптомами у пациентов, получавших лучевую терапию по поводу рака орофарингеальной области, являлись жалобы на першение в горле, загустение слюны, сухость во рту, периодическую или постоянную боль при глотании, общую слабость, головную боль, повышенную нервную возбудимость и нарушение вкуса.

Из данных, представленных в таблице 17 видно, что к числу наиболее ранних субъективных симптомов, возникающих уже после облучения орофарингеальной области в суммарной дозе 20 Гр, относились: першение в горле, сухость во рту, боль при глотании и повышенная нервная возбудимость. К моменту завершения курса лучевой терапии (суммарная доза 60 Гр) такие симптомы как першение в горле, изменения вкуса и консистенции слюны, сухость во рту и боль при глотании, отмечались у 80 - 90 % пациентов.

Применение глутоксима способствовало значительному (в 2-3 раза по сравнению с контрольной группой) снижению выраженности субъективных проявлений радиоэпителиита. Наиболее существенно это проявлялось в отношении таких симптомов, как боль при глотании, изменение вкуса и повышенная нервная возбудимость: они отмечались у 20-22 пациентов из 26 (в контрольной группе) и практически отсутствовали у пациентов, получавших глуктоксим. Частота возникновения других симптомов (першение в горле, головная боль и др.) также уменьшалась при применении данного лекарственного препарата.

Объективные симптомы радиоэпителиита у обследованных больных характеризовались гиперемией и отеком слизистой оболочки полости рта, кровоточивостью десен, очаговым или сливным эпителиитом, эрозивными и язвенно-некротическими процессами.

Как видно из таблицы 18, наиболее ранними проявлениями радиомукозита являлись гиперемия и отек слизистой оболочки после облучения в дозе 20 Гр у 60-70% пациентов. Остальные симптомы отмечались, как правило, после облучения орофарингеальной области в дозах 40-60 Гр. Чаще всего (в 70-100 % случаев) наблюдалось продолжение развития отека слизистой оболочки, эрозий единичных мелкоочаговых, реже - сливных крупноочаговых, кровоточивость десен. Явления очагового или сливного эпителиита, появление эрозий и язв выявлены у 40 - 50% больных.

Таблица 17

Влияние глутоксима на частоту жалоб при лучевой терапии больных раком орофарингеальной области

Жалобы пациентов	Группы пациентов	Частота жалоб в % при дозе облучения, Гр
		20	40	60
Першение в горле	ЛТ	83±8	92±12	100+11
	ЛТ + Гл	65±3	65±3	75±3
Густая слюна	ЛТ	23±4	84+5	92±5
	ЛТ + Гл	0	33±3*	30±2*
Сухость во рту	ЛТ	46±5	65+5	77±5
	ЛТ + Гл	17±2*	30±*	38±4*
Боль при глотании	ЛТ	27±2	69±2	81±4
	ЛТ + Гл	0	24±1*	8±1*
Общая слабость	ЛТ	23±4	62±5	79±5
	ЛТ + Гл	0	17±2	13±2
Головная боль	ЛТ	12±3	35±5	46±5
	ЛТ + Гл	0	0	12±2*
Повышенная нервная возбудимость	ЛТ	50±5	81±4	88±4
	ЛТ + Гл	0*	17±3*	0*
Изменения вкуса	ЛТ	12±2	38±5	85+4
	ЛТ + Гл	0	23±4*	23±4*

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

Таблица 18

Влияние глутоксима на частоту местных проявлений радиоэпителиита при лучевой терапии больных раком орофарингеальной области

Объективные симптомы	Группы пациентов	Частота местных проявлений в % при дозе облучения, Гр
		20	40	60
Гиперемия слизистой	ЛТ	65±8	92±7	100±4
	ЛТ+ Гл	12±3	27±6*	38+4*
Ксеростомия	ЛТ	12±3	38+4	65±5
	ЛТ + Гл	0	12±3*	12±3*
Отек	ЛТ	54±4	77±5	100±4
	ЛТ + Гл	0	38+4*	38+4*
Кровоточивость десен	ЛТ	8+2	46±5	76+5
	ЛТ + Гл	0	8±2*	25±3*
Очаговый эпителиит	ЛТ	8±3	24±5	69±4
	ЛТ + Гл	0	8±2*	8±2*
Сливной эпителиит	ЛТ	0	12±3	69±4
	ЛТ + Гл	0	0*	0*
Эрозии	ЛТ	0	65±3	76±4
	ЛТ + Гл	0	0	0*
Язвы	ЛТ	0	46±3	65±3
	ЛТ + Гл	0	0*	0*
Некрозы	ЛТ	0	4±1	8±2
	ЛТ + Гл	0	0	0
Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

При применении глутоксима существенно снижались частота появления кровоточивости десен, эрозий и язв слизистой оболочки полости рта. Так, геморрагические проявления орофарингеального синдрома наблюдались в 3 - 4 раза реже, чем в контрольной группе. При этом эрозии, язвы, некрозы и сливной эпителиит не возникли ни у одного из леченных глутоксимом пациентов (табл.18).

Таким образом, применение глутоксима при лучевой терапии больных раком орофарингеальной области способствовало существенному снижению выраженности как субъективных, так и объективных симптомов лучевого стоматита.

5.3.2. Изменения гематологических показателей

Наиболее чувствительными к действию противоопухолевой терапии оказались показатели, характеризующие лейкопоэз и тромбоцитопоэз. Это отразилось в абсолютной лимфо - и нейтропении и уменьшении содержания тромбоцитов в периферической крови. Кроме того, одним из ранних изменений гематологических показателей явилось увеличение СОЭ. Как видно из таблицы 19, после облучения в суммарной дозе 40 Гр СОЭ увеличилось по сравнению с исходным уровнем почти вдвое. В дальнейшем значение показателя несколько снижалось, однако и при окончании курса лечения СОЭ превышала исходные значения на 30%.

Количество лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови больных прогрессивно снижалось в ходе проведения лучевой терапии и к её окончанию составляло менее 50% от исходных значений.

При применении глутоксима эти изменения не возникали: в течение всего периода облучения количество лимфоцитов и нейтрофилов у пациентов этой группы сохранялось на таком же уровне, как при поступлении в стационар. Введение онкологическим больным глутоксима на протяжении всего курса лучевой терапии предотвращало развитие тромбоцитопении.

Проведение лечения глутоксимом почти полностью предупреждало вызванное облучением изменение СОЭ: на протяжении всего периода проведения противоопухолевой терапии значения этого показателя не отличались от исходного уровня.

Таблица 19

Влияние глутоксима на показатели периферической крови у больных, подвергавшихся лучевой терапии по поводу рака орофарингеальной области

Показатели	Группы наблюдений	До облучения (лечения)	Величина показателей при дозе облучения, Гр
			20	40	60
СОЭ, мм/ч	ЛТ	19±2	21±2	36+41	25±31
	ЛТ + Гл		16±3	20±32	14±22
Гемоглобин, г/л	ЛТ	123±8	121±10	119±11	122±9
	ЛТ + Гл		132±11	136±15	141±11
Эритроциты, 1012/л	ЛТ	4,2 ±0,3	3,8±0,4	3,6±0,3	4,2±0,2
	ЛТ + Гл		4,3±0,2	4,1±0,4	3,9±0,3
Тромбоциты 106/л	ЛТ	280±38	180±221	145±181	170±21
	ЛТ + Гл		240±312	210±232	245±26
Лейкоциты, 109/л	ЛТ	6,3±0,4	4,8±0,41	3,5±0,31	3,6±0,3
	ЛТ + Гл		4,6±0,3	5,5±0,42	5,8±0,32
Нейтрофилы 109/л	ЛТ	4,1±0,3	3,5±0,2	2,0±0,2	2,4±0,2
	ЛТ + Гл		3,8±0,2	3,8±0,22	4,5±0,22
Лимфоциты, 109/л	ЛТ	1,6±0,2	0,9±0,21	0,9±0,2 1	0,6±0,11
	ЛТ + Гл		1,2±0,3	1,4±0,22	1,2±0,22

Примечание: 1 - р < 0,05 по сравнению с уровнем до облучения; 2 - то же по сравнению с контрольной группой

Таким образом, применение глутоксима в качестве средства сопровождения лучевой терапии рака орофарингеальной области способствовало нормализации пострадиационных гематологических сдвигов у больных основной группы по сравнению с контрольной. Это положение свидетельствуют о том, что глутоксим целесообразно назначать с целью профилактики всем больным раком орофарингеальной области, которым проводится лучевая терапия.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе представлены результаты исследований, посвященных изучению использования препарата глутоксим в качестве средства сопровождения лучевой терапии рака орофаренгиальной области для профилактики и лечения лучевых стоматитов и гемодепрессии. Несмотря на кажущуюся теоретическую и практическую «простоту» этой цели, её решение потребовало выполнения довольно многоплановых исследований, как клинических, так экспериментальных.

На первом этапе научно-исследовательской работы возникла необходимость в изучении эффективности лучевой терапии рака орофарингеальной области в конкретных условиях радиологического отделения (установка «РОКУС-АМ»). Получение подобных данных было продиктовано необходимостью оценки выбранной нами схемы лечения и профилактики лучевых стоматитов и гемодепрессии на течение опухолевого процесса. Несмотря на довольно значительное количество работ, посвященных анализу вероятности развития радиоэпителиитов у онкологических больных и эффективности терапевтических мероприятий при этом виде патологии, необходимость дальнейших исследований в этом направлении очевидна хотя бы в силу двух обстоятельств: постоянного совершенствования методов лучевой противоопухолевой терапии и разработки новых средств и методов профилактики и лечения лучевых стоматитов.

В связи с изложенным, одной из задач нашей работы явилось изучение влияния радикальной терапии рака орофаренгиальной области на частоту развития эпителиита при различных суммарных очаговых дозах облучения на фоне существующей (стандартной) профилактики и терапии этого патологического процесса (полоскание и протирание слизистой оболочки рта слабым раствором антисептиков, витаминотерапия, противовоспалительные средства, стимуляторы репаративных процессов, анальгетики).

Проведенные исследования показали, что, несмотря на проводимое медикаментозное лечение, у подавляющего большинства больных лучевая терапия сопровождалась развитием воспалительных изменений в полости рта. Первые субъективные проявления (першение в горле, сухость во рту. и др.), а также такие объективные признаки, как отек и гиперемия слизистой оболочки полости рта, появлялись после суммарной очаговой дозы на опухоль орофарингеальной области 20 Гр. По мере возрастания суммарной очаговой дозы увеличивалась как частота перечисленных симптомов, так и выраженность клинической симптоматики эпителиита, достигавшая своего максимума к окончанию курса лучевой терапии (до СОД= 60 - 66 Гр)

Превалирующими признаками радиоэпителиита оказались: из субъекивных - изменение вкуса, сухость во рту, повышенная нервная возбудимость, першение в горле и загустение слюны, боль в горле при глотании; из объективных - отек и кровоточивость десен, десквамация эпителия, ксеростомия, а также мелко - и крупноочаговые эрозии.

Параллельно с возникновением клинических проявлений эпителиита у больных раком орофарингеальной области после суммарной дозы 20 Гр были выявлены признаки гемодепрессии в виде умеренной лимфопении и нейтропении. Хотя гематологические изменения были довольно умеренными, они (особенно лимфопения) прогрессировали с увеличением дозы облучения. После облучения пациентов в СОД=40 Гр в крови выявлена умеренная преходящая тромбоцитопения. К концу периода лучевой терапии количество тромбоцитов увеличивалось, но не достигало уровня исходных величин. Полученные данные полностью соответствуют современным представлениям о важной роли угнетения гемопоэза, как фактора, способствующего поражению слизистой оболочки полости рта при облучении рака орофарингеальной области.

Результаты, характеризующие клиническую симптоматику радиоэпителиита, практически полностью соответствуют данным литературы и подтверждают известное положение о дозовой зависимости выраженности клинических проявлений воспалительного процесса в слизистой полости рта облученного организма. Полученные данные о дозовом пороге развития наиболее ранних проявлений радиоэпителиита практически не отличаются от опубликованных в литературе.

Анализ результатов наших исследований позволяет сделать заключение, что эффективность проводимых в современных условиях терапевтических мероприятий по санации полости рта у больных, подвергающихся лучевой терапии по поводу новообразований орофарингеальной области проявляется, главным образом, в «отодвигании» дозового порога развития эпителиита, но отнюдь не предупреждает и даже не снижает его тяжести при проведении всего курса необходимого лучевого лечения. Эти данные со всей очевидностью указывают на необходимость изменения подхода к проблеме профилактики и лечения радиоэпителиитов и гемодепрессии, который до настоящего времени является эмпирическим.

Анализ литературы, результаты которого изложены в главе 1 диссертации, дают основания предполагать, что эффективность терапии пострадиационных поражений полости рта может быть значительно повышена при применении иммуноориентированных препаратов, обладающих иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами. Кроме того, применение подобных препаратов должно способствовать активации процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток и клеток слизистой оболочки полости рта и ослаблению тем самым выраженности осложнений лучевой терапии. Обоснованность этого предположения подтверждается, в частности, данными литературы о положительном влиянии на течение общих и местных радиационных поражений ряда витаминов, различных тиоловых соединений, некоторых аминокислот (Золотарева Н.Н. и соавт., 1998).

Изучение возможности получения эффекта при профилактике и лечении лучевых эпителиитов и гемодепрессии с помощью дисульфидсодержащего гексапептида - фармакопейного препарата глутоксим явилось основной задачей настоящей работы.

Клинические наблюдения полностью подтвердили представление о возможной эффективности глутоксима в ...