Размещено на http://www.allbest.ru/

Державна установа „інститут гематології та трансфузіології академії медичних наук України“

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

14.01.31 - Гематологія та трансфузіологія

Значення імуногенетичних маркерів крові для відбору донорів антистафілококової плазми

Ходаковський Олександр Васильович

Київ 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на базі Державної установи „Науковий центр радіаційної медицини АМН України”

НАУКОВИЙ КЕРІВНИК - доктор біологічних наук інченко Жанна Миколаївна, державна установа „Науковий центр радіаційної медицини АМН України”, завідувач лабораторії імуногенетики відділу гематології та трансплантології інституту клінічної радіології, м.Київ

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ: - доктор медичних наук Назарчук Лідія Василівна, Державна установа „Інститут гематології та транс-фузіології АМН України”, головний науковий спів-робітник відділу організації трансфузіологічної та гематологічної допомоги, м.Київ

- доктор медичних наук, професор Видиборець Станіслав Володимирович, Національна медична академія післядипломної освіти ім.П.Л.Шупика МОЗ України, професор кафедри гематології та трансфузіології, м.Київ

Захист відбудеться ”16 ” жовтня 2007 р. о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 у Державній установі „Інститут гематології та трансфузіології АМН України” ( 04060, м. Київ, вул. М.Берлинського, 12).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи „Інститут гематології та трансфузіології АМН України” ( 04060, м. Київ, вул. М.Берлинського, 12).

Автореферат розісланий ”4 ” вересня 2007 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради Г.П.Гащук

1. Загальна характеристика роботи

донор стафілокок антитілоутворення інфекційний

Актуальність теми. На сучасному етапі розвитку медицини в нашій державі злободенним залишається питання боротьби з інфекційними хворобами, збудниками яких є патогенні стафілококи (А.К.Акатов1980; В.Ф.Москаленко,2001.),Тому потреба в антистафілококових препаратах, які можуть бути виготовлені тільки з крові спеціально імунізованої людини не тільки не знижується (О.О.Федоровська.1988; П.М.Перехрестенко, Л.В. Назарчук, 2004, 2006, 2007.), але і набуває особливого змісту. Разом з тим, отримання достатньої кількості якісних антистафілококової плазми та імуноглобуліну від донорів, імунізованих сорбованим стафілококовим анатоксином (ССА) на сьогодні є достатньо проблематичним. Пов'язане це з декількома факторами як медичного, так і соціального характеру: з порушеннями в імунному гомеостазі внаслідок чорнобильської аварії (В.Г.Бебешко,1997; Д.А.Базика і співавт.,2002.), поширенням СНІДу та збудників інших трансмісійних інфекцій (Ю.Л.Шевченко,2000.); медикаментозною резистентністю багатьох клінічних штамів патогенних стафілококів (В.В.Смірнов,1988); різким зниженням престижу донорства (П.Н.Гриза, 2007).

Зменшення загальної кількості донорів і, відповідно, - імунних донорів, - ставить гостро актуальне науково - практичне завдання пошуків компенсації відпливу донорських кадрів шляхом відбору серед них найбільш активних, генетично здатних до сильної імунної відповіді на антигенні препарати стафілококу для отримання антистафілококової плазми з високим вмістом антиальфастафілолізину.

Серед генетичних маркерів найбільш стабільними і доступними для дослідження є групи крові - антигенні системи клітин крові. Для аналізу вибрано системи лейкоцитарних антигенів HLA - локуси А, В, С, DR, - і еритроцитарні антигени систем АВ0, Резус (обов'язкові для визначення в трансфузіології), Levis, MNSs, Kell.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках науково-дослідної роботи Державної установи „Науковий центр радіаційної медицини АМН України” за темою АМН України „Визначення ролі генетичних систем крові та деяких молекулярно-генетичних маркерів пухлинних клонів в комплексній оцінці ефективності трансплантації стовбурових гемопоетичних клітин у хворих на лейкемії, лімфоми та солідні пухлини” (№ Державної реєстрації 0103U001408, 2003-2006 рр.).

Мета роботи. Визначити ступінь значущості імуногенетичних факторів крові як чинників прогнозу ефективності направленої імунізації донорів ССА на основі дослідження антигенного поліморфізму генетичних систем крові для покращення селекції активних донорів і отримання антистафілококової плазми з високим вмістом антиальфастафілолізину.

Задачі дослідження.

Вивчити поліморфізм HLA антигенів I і II класу головного комплексу гістосумісності та трансфузійно значущих антигенних систем крові ( AB0; Rh-Hr; Lewis; MNSs; Kell) у донороздатного населення Південно-Східної геногеографічної зони України.

2. Вивчити асоційованість еритроцитарних антигенів ізосерологічних систем AB0; Rh-Hr; Lewis; MNSs; Kell, а також ізольованих антигенів системи HLA, їх фенотипів і гаплотипів з активністю антитілопродукції антиальфастафілолізину у донорів імунізованих ССА.

3. Порівняти структуру представництва антигенів різних систем крові серед ?мунізованих ССА донорів з різним вмістом антиальфастафілолізину в плазмі крові.

4. Шляхом статистичного аналізу поширеності і асоціацій ізольованих еритроцитарних і HLA-лейкоцитарних антигенів, фенотипів і гаплотипів при направленій ССА імунізації визначити імуногенетичні маркери, для виявлення донорів, генетично схильних до високої імунної відповіді.

5. На підставі асоціативних зв'язків розробити критерії індивідуального підходу при проведенні імунізації ССА для формування контингентів донорів імунної антистафілококової плазми з високим вмістом антиальфастафілолізину.

Об'єкт дослідження: імуногенетична структура донороздатного населення, та донорів, імунізованих ССА, які мешкають у Південно-Східній геногеографічній зоні Укра?ни.

Предмет дослідження: Імуногенетичні чинники клітин крові. Вміст антистафілококових антитіл у плазмі крові донорів після активної імунізації ССА.

Методи дослідження: імуногенетичні (визначення еритроцитарних антигенів ізосерологічних систем AB0; Rh-Hr; Lewis; MNSs; Kell; HLA-типування), серологічні (визначення активності антитілопродукції антиальфастафілолізину), статистичні.

Наукова новизна. Вперше визначена генетична структура донороздатного населення Південно-Східної геногеографічної зони України, що є підґрунтям для генетичної селекції активних імунних донорів крові і складає контрольну популяцію для вивчення імуногенетичної схильності до захворювань на індивідуальному і популяційному рівнях даного регіону.

Вперше встановлено асоціативний зв'язок між HLA- імуногенетичними чинниками I і II класів та імунологічною відповіддю на активну імунізацію організму людини ССА і визначені імуногенетичні маркери інтенсивності антитілопродукції, як прогностичні критерії ефективності імунізації донорів. Встановлено, що доцільно проводити імунізацію донорів з генетичними маркерами активної імунної відповіді (антитіла в межах 10,0 - 16,0 МО/мл): гаплотипами HLA-А2В27, HLA-А9В22 та HLA-А9В27; з середньої сили антитілоутворенням (антитіла в межах 6,0 - 8,0 МО/мл) HLA-А3В7 ; не доцільно залучати до імунізації ССА ос?б з слабкою імунною відповіддю (антитіла в межах ? 4,0 МО/мл)- носії гаплотипів HLA-А1В8, HLA-А2В14.

Вперше встановлено залежність імуногенетичної рефрактерності імунної відповіді від активності ССА у одиницях зв'язування в 1мл ?мун?зуючого агента.

Розширення спектру типованих антигенів за рахунок визначення “мінорних” антигенів систем Резус і Келл суттєво вдосконалює генетичну характеристику донорів і підвищує трансфузійну безпеку препаратів крові і гемокомпонентів в аспекті попередження імунних конфліктів в організмі реципієнта.

Встановлено, що за ступенем значущості при формуванні сили гуморальної імунної відповіді на активну імунізацію ССА фенотипічні характеристики антигенів різних систем крові неоднозначні і розташовані у наступній послідовності HLA; AB0; Rh-Hr; MNSs; Lewis; Kell.

Практичне значення одержаних результатів. Визначені прогностичні імуногенетичні маркери активної антитілопродукції антиальфастафілолізину при імунізації ССА для відбору донорів з високою імунною відповіддю, що дозволило на Донецькій обласній станції переливання крові, не зважаючи на зменшення кількості донорів, отримано доз антистафілококового імуноглобуліну в 2,53 (1999 рік), в 2,92 (2001 рік), в 2,7 (2003 рік) разів більше, ніж в середньому по Україні; досвід розширеного типування донорів за рахунок визначення антигенів Lewis, Kell, MN впроваджено на станціях переливання крові міст Макіївки, Маріуполя, Краматорська, Єнакіева, Запоріжжя та Луганська, що дозволило підвищити трансфузійну безпеку гемокомпонентів; впровадження результатів дисертаційного дослідження на Донецькій ОСПК забезпечило створення панелі рідкісних груп крові, організацію банку довгострокового їх зберігання; типування еритроцитарних і лейкоцитарних антигенів за методиками дисертаційного дослідження створює умови підвищення якості індивідуального підбору гемокомпонентів (еритромаси і тромбоконцентрату); видано інформаційний лист „Отбор доноров для иммунизации адсорбированным столбнячным и стафилококковым анатоксином”. //Информационное письмо. Киев. РПК №12 Гематология и трансфузиология. 19.10.1988г.3с.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом проведено патентно-інформаційний пошук, визначені мета і задачі дослідження, особисто виконані дослідження з розширеного визначення еритроцитарних та лейкоцитарних HLA антигенів, проведена триразова (за схемою) імунізація стафілококовим сорбованим анатоксином, а також обстежені немовлята хворі на стафілококовий сепсис, їхні батьки і контрольна група здорових дітей. Проаналізовано отримані дані і визначено коефіцієнти кореляції індивідуальних антигенів, фенотипів і гаплотипів з концентрацією антистафілококових антитіл, сформульовані основні положення і висновки.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень за темою дисертації були оприлюднені: на V міжнародному конгресі по імунології та імунореабілітації , Тенерифе, Іспанія 1999; на ІV з'їзді гематологів та трансфузіологів України, Київ 2001; на розширеному засіданні Вченої Ради Наукового Центру радіаційної медицини АМН України , Київ 2002; на ІІ-му Всесвітньому конгресі по імунопатології та алергії, Москва 2004; на розширеному засіданні Республіканської проблемної комісії з гематології та трансфузіології, Київ 2006.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 робіт, з яких 7 статей у фахових виданнях, які рекомендовані ВАК України, із них - 3 одноосібно. Видано 1 інформаційний лист, 4 тези доповідей, отримано 2 авторські свідоцтва СССР SU №1504596 A1 от 01.05.89г. та SU № 1627989 A1 от 15.10.1990г.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 147 сторінках друкованого тексту (з яких 98 сторінок основного тексту) і складається із вступу, огляду літератури, матеріалу та методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, додатків, списку використаних літературних джерел у кількості 170. Робота ілюстрована 34 таблицями, додатками (А,Б,В та Д).

2. Основний зміст роботи

Матеріал і методи дослідження. Робота базується на вивченні імуногенетичної характеристики 1225 донорів Донецької обласної станції переливання крові, а також 61 немовляти (віком до одного місяця), хворих на стафілококовий сепсис, їхніх батьків у кількості 122 осіб і контрольної групи здорових дітей із 104 осіб. Серед донорського контингенту виділена група імунізованих ССА донорів (дослідна група - 603 особи віком від 20 до 40 років) та контрольна (622 неімунізовані особи аналогічного віку). В усіх групах досліджувались еритроцитарні та лейкоцитарні антигени крові (табл. 1).

До донації крові і імунізації допускались особи, які пройшли клініко-лабораторне обстеження відповідно до нормативних документів, плазму крові отримували методом плазмаферезу. Переважну більшість донорів складали чоловіки (78%).

Для дослідження питання генетичної схильності осіб до захворювань, індукованих стафілококом, з різними еритроцитарними та лейкоцитарними групами крові (AB0; Rh-Hr; HLA) вибрано групу новонароджених, які перехворіли на стафілококовий сепсис, і під час захворювання в комплексному лікуванні отримували імуноглобулін антистафілококовий людини. Частоту антигенів крові вивчали у них порівняно з аналогічним розподілом серед груп контролю (табл. 1).

Групи крові ізосерогічної системи АВ0 встановлювали методом ізогемаглютинації прямим і зворотним способом на площині, керуючись вказівками інструкції „Визначення груп крові за системами АВ0, Резус та імунних антитіл” МОЗ України №164 від 05.07.1999 року.

В якості реагентів були використані алоімунні сироватки виробництва Донецької обласної станції переливання крові, рідкі діагностичні моноклональні реагенти анти-А, анти-В і анти-АВ виробництва асоціації „Ридан” (Київ) та НТК „Тест” (Харків) для прямого способу.

В зворотному варіанті використовувався набір тест-еритроцитів виробництва Донецької ОСПК, за допомогою якого визначали специфічність ізогемаглютининів.

Таблиця 1 Матеріал і методи дослідження

Фенотип за системою резус (за необхідністю) визначали в пробірках методом конглютинації з додаванням 10% розчину желатину та за допомогою моноклональних антитіл виробництва асоціації „Ридан” (Київ) та НТК „Тест” (Харків), а також імунних сироваток антирезус анти-Е, анти-с, анти-е, виготовлених Донецькою ОСПК.

Антигени ізосерологічної системи Lewis визначали методом аглютинації в мікропробірках на еритроцитах попередньо оброблених трипсином сироватками анти-Le виробництва Санкт-Петербурзького науково-дослідного інституту вакцин та сироваток.

Антигени МN визначали методом аглютинації на площині імунними сироватками анти-М і анти-N виробництва Санкт-Петербурзького науково-дослідного інституту вакцин та сироваток.

Антиген К (КЕLL-1) визначали імунною сироваткою анти-К виробництва фірми „Діатест” (Харків, Україна).

Лейкоцитарні антигени системи НLА локуси A, B, C та DR визначали мікролімфоцитотоксичним методом з використанням панелей №-29, 30, 31, 32 гістотипуючих сироваток, вироблених у АТ „Гісанс” Санкт-Петербург, Росія. У зазначені панелі включались 62 специфічності локусів А, В, Сw, DR.

Вміст антистафілококових антитіл (антиальфастафілолізину) визначали методом титрування з б-токсином виробництва Науково-дослідного інституту вакцин та сироваток ім.Л.А. Тарасевича (Москва) з еритроцитами кроликів без участі комплементу, для чого сироватка крові досліджуваної особи інактивувалась при 56°С впродовж 30 хвилин. Вміст антитіл виражали в МО/мл. Облік реакції здійснювали за 100% гемолізом еритроцитів кролика.

Метод імунізації ССА виконувався за схемою згідно з „Инструкцией по иммунизации доноров стафилококковым анатоксином и проведению плазмафереза для получения антистафилококковой плазмы” (Москва, 1977г.) шляхом триразового підшкірного введення ССА з активністю 10 одиниць зв'язування в 1мл серій 209; 218; 219, які мали відповідні контрольні номери 1092; 1816; 1817 або 20 одиниць зв'язування в 1мл серій 219; 223; 224 з контрольними номерами 1818; 2040; 2041 в нижній квадрант шкіри лопатки в дозі 1,0 мл - 1,0 мл - 2,0 мл з інтервалом між введеннями 7 днів. Плазмаферез проводили після першої і третьої ін'єкцій і в подальшому через кожні 14 днів після закінчення курсу імунізації.

При проведені плазмаферезу у донора забирали 400 мл крові в пластикатну тару з наступним поверненням в кровообіг клітинної маси.

В отриманій плазмі при кожному плазмаферезі визначали вміст антистафілококових антитіл.

Статистичні дослідження включали: обчислення критерію Ст'юдента (t); точковий метод Фішера (Ф); визначення RR- критерію та критерію Пірсона (ч2).

РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика донороздатного населення Донецької області, як частини Південно-Східної геногеографічної зони України за розподілом лейкоцитарних та еритроцитарних антигенів крові є надзвичайно важливою в кількох аспектах. Основне значення її полягає в можливості створення банку даних як для підбору гемокомпонентів, так і їх обміну з трансплантаційними центрами в інших регіонах України.

Гістотипування формених елементів крові обумовлено необхідністю тканинної сумісності донора-реципієнта при проведенні гемокомпонентної терапії для попередження сенсибілізації ї у реципієнтів, а особливо у випадках коли реципієнти мають антитіла від попередніх гемотрансфузій або вагітностей. Враховуючи, що на тромбоцитах представлені еритроцитарні антигени системи АВ0, антигени гістосумісності - HLA - і власне тромбоцитарні антигени HPA, підбір сумісного донора вимагає типування зазначених антигенів. Клінічний досвід показує, що трансфузії гемоконцентрату часто супроводжуються саме анти-HLA-алоімунізацією, яка превалює над анти-HPA- алоімунізацією (Goodn, Zimm, 1999). Тому для трансфузій тромбоцитів використовують донорів, клітини яких типовані за HLA- антигенами (Brond, 1997).

Типування HLA-антигенів локусів HLA-А, HLA-В, HLA-С проведено у 1225 донорів, HLA-DR - у 216 донорів.

Дослідженням встановлено, що повний набір антигенів локусів HLA-А, HLA-В, HLA-С (шість антигенів) зустрічається у 11,09% донорів, п'ять антигенів - у 34,08%, чотири - у 37,29%, три - у 14,95%, два - у 2,09%, один - у 0,16% обстежених. Не виявлено жодного антигена - у 0,32% (шість випадків). Отже, значна частина наших донорів може бути охарактеризована за окремими антигенами досить повно, що дає підставу порівнювати популяцію Південно-Східної геногеографічної зони України з аналогічними за репрезентативністю вибірками інших регіонів.

Проведений аналіз поширеності антигена (гена) показав, що в локусі HLA-А переважають антигени А2, А9, А1, А3 та А10. Щодо локусу HLA-В в обстеженій популяції найбільш частими є антигени HLA-В7, В12, В5, В35, в локусі HLA-С - антигени Сw4, Cw6, Cw2, в локусі HLA-DR - DR2, DR7, DR1. Сума зустрічаємості генів А1, А2, А3, А9 і А10 дорівнює 0,742.

В ході дослідження виявлено антигени, які трапляються рідко: HLA-А30, А31, Аw36, А26, В38,В39, Вw41, В42, Вw49, В51, В60, - їхня частота зустрічуваності ?1%, Сw1 - 5,2%, DR14 - 4,8%.

Отримані нами дані співпадають з результатами інших дослідників (Зотиков Е.А., 1982; Зарецкая Ю.М., 1983; Мінченко Ж.М., 1994, 2007) і дають підставу вважати населення Донецької області як частини Південно-Східної генографічної зони України за розподілом антигенів HLA окремих локусів і за їх значним поліморфізмом близьким до крупних промислових центрів Європейського регіону (Снелл Р., Доссе Ж., 1979).

Характеристика регіону за фенотипами показала, що найбільш поширеними є такі: в локусі HLA-А - А2,2 (9,4%); А1,2 (6,4%); А2,10 (5,9%), А2,3(5,5%); в локусі HLA-В - В7,7 (4,3%); В5,7 (3,2%); в локусі С - Сw2,4 (9,3%); Сw2,3 (7,4%); Сw3,4 (3,1%). Отримані нами дані несуттєво відрізняються від теоретично очікуваних результатів, які було розраховано за законом Харді-Вайнберга, і підтверджуються критерієм Персона ч2, що складає для частоти фенотипів в локусі HLA-А, В і С відповідно: 3,140; 6,034; 6,081 при ступенях свободи 16,29 і 7.

Аналіз розподілу сполучень антигенів HLA (між локусами А, В, С) проведений у відповідності до коефіцієнтів нерівновагомого зчеплення, показав надзвичайну різноманітність сполучень між антигенами локусів HLA -А і В; А і С; В і Сw. При цьому найбільше значення мають сполучення: А1В8; А1В17; А1В7; А1В16; А2В12; А2В8; А3В7; А9В13; А10В16; А32В5; А2Сw2; А2Сw3; В16Сw2; В27Сw2; В13Сw3; В35Сw4; В17Сw6; В8Сw7.

Вказані гаплотипи розподілялись з однаковою частотою серед населення Донецької області, що значно полегшує підбір пар “Донор-реципієнт” при гемотрансфузіях лейко- та тромбоконцентрату.

Отримані нами дані щодо поширення антигенів системи Резус серед донороздатного населення нашого регіону, свідчать про однакове співвідошення резус-позитивних (85%) і резус-негативних (15%) осіб як в українській змішаній популяції, так і в європейських країнах, зокрема у Франції, яка відповідає Україні і за кількістю населення і за географічними ознаками.

Частота груп крові систем АВ0, Kell, MNSs, Levis відповідає панмікстичній популяції і практично не відрізняється від таких у сере-ньоєвропейській популяції.

Другим завданням нашої роботи було встановити асоційованість антигенів Rh-Hr, Levis, MN, Kell з активністю антитілопродукції антиальфастафілолізину у імунізованих ССА осіб.

Слід зазначити, що на станціях переливання крові (Центрах крові) у виробничій трансфузіології використовується для імунізації донорів препарат ССА з різною активністю, а саме у 10 ОЗ/мл і 20 ОЗ/мл. У нашому дослідженні застосовували: препарат з активністю 10 ОЗ/мл для імунізації 301 донора; препарат з активністю 20 ОЗ/мл для імунізації 302 донорів. Групи донорів були одинакові як за чисельністю, так і за віком і статтю.

Всі донори розподілені за максимальним вмістом антитіл, при цьому вміст антитіл до 4,0 МО/мл відображав низьку імунну відповідь, в межах 6,0 - 8,0 МО/мл - середню, 10,0 - 16,0 МО/мл - високу, 18,0 - 30,0 МО/мл - надвисоку.

При імунізації ССА з активністю 10 ОЗ/мл слабкими респондерами виявились 24,58% осіб, середніми - 41,52%, активними респондерами з вмістом антитіл в межах 10,0 - 16,0 МО/мл - 33,90%. Не виявлено осіб з надвисоким вмістом антистафілококових антитіл.