Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса

Размещено на http://www.allbest.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сифилис - болезнь оборотень, хамелеон, грозная с хроническим волнообразным течением, способная проявить себя множеством кожных симптомов, поражающая практически все органы и ткани, в глубоком смысле - нейроинфекция, протекающая без особых ощущений для больного, который, находя массу отговорок и объяснений проявлениям её, не обращается к специалисту. Сифилис способен сбить с толку многих врачей не венерологов и требует к себе отношения по принципу - всякая сыпь на коже считается сифилисом,пока не доказано обратное. Необходимо отметить, что заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), и в частности сифилис, способствуют распространению такого смертельно опасного заболевания как ВИЧ-инфекция.

По статистике Минздрава РФ, в России в 2002 г. зарегистрировано 1,047 млн. случаев ЗППП, в том числе 207 тыс. 157 случаев заболевания сифилисом. Заболеваемость сифилисом в России остается крайне высокой и составляет более 143 случаев на 100 тыс. населения. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза. За прошедший год зарегистрировано свыше 52 тыс. больных ЗППП в возрасте до 17 лет. У девочек до 14 лет показатель заболеваемости сифилисом по сравнению с 1990 г. возрос в 85 раз. Проведенный в 37 субъектах России анализ путей заражения сифилисом показал, что в 60 % случаев дети заразились половым путем. В таких условиях большое значение приобретает своевременная диагностика данного заболевания, основанная на высокочувствительных и высокоспецифичных реакциях. Особая роль при этом должна отводиться методам массового профилактического обследования населения (скрининга) с целью раннего выявления инфекции, что также диктует необходимость повышения требований к чувствительности и специфичности экспрессных тестов на сифилис (Овчинников Н.М., Беднова, В.Н., Делекторский В.В., 1987; Дмитриев Г.А., 1996; Ткачев В.К., 1997; Сухова Л.П., Машеро В.В., Войнова Н.Н., 1999, Онищенко Г.Г.,2°°2; Jo-honson P.C., Farnie M.A., 1994; Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolf A.N., 1995; Young H., 1998).

В лабораторной практике используют комплекс серологических реакций (КСР), включающий отборочную реакцию микропреципитации (МР) с кардиолипиновым антигеном и стандартные серологические реакции - реакцию связывания комплемента (РСК) с кардиолипиновым и трепонем-ным антигенами. Кроме того, ставят специфические реакции - иммуноф-луоресценции (РИФ) и её модификации (РИФ- абс, РИФ - 2°°), реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), иммуноферментный анализ (ИФА). При этом не все вышеуказанные тесты равнозначны по чувствительности и специфичности из-за разных причин: использование неспецифического кардиолипинового антигена, наличия в исследуемом материале антител к общим антигенам спирохет, перекрестные реакции при других заболеваниях и определенных физиологических состояниях организма. сифилис биотехнология имуннопрепарат трепонемный

Поэтому в зоне внимания исследователей постоянно находятся проблемы совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики сифилиса с целью расширения арсенала диагностикумов и повышения их качества.

Цель и основные задачи исследования

Цель диссертационной работы - разработка биотехнологии получения новых эффективных специфичных трепонемных иммунпрепаратов и оценка их пригодности для использования в диагностике сифилиса.

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:

провести анализ заболеваемости и лабораторной диагностики сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания;

получить высокоспецифичный полноценный комплексный трепо-немный антиген для использования его при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП);

разработать биотехнологию получения трепонемного антигенного диагностикума на основе полимерной матрицы - латекса для экспресс-диагностики сифилиса в реакции агглютинации (РАЛ);

разработать трепонемный суспензионный антигенный диагности-кум с коллоидным серебром для дот-иммуноанализа (ДИА);

провести лабораторные и клинические испытания разработанных трепонемных иммунодиагностикумов.

Научная новизна работы

Впервые представлены данные об особенностях эпидемиологии сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания за последние пять лет. Методом эпидемиологического районирования определены тенденции распространения этой инфекции и причины высокой заболеваемости в отдельных районах Республики, которые выше многих территориальных показателей по Российской Федерации.

Разработана высокоэффективная схема получения комплексного трепонемного антигена, который использован в качестве лиганда при конструировании иммунодиагностикумов.

Получен трепонемный суспензионный антигенный латексный диагностикум, характеризующийся высокой чувствительностью и специфичностью.

Впервые осуществлена разработка биотехнологии получения трепо-немного антигенного препарата на основе коллоидного серебра для ДИА.

Практическая значимость диссертации

Разработанные суспензионные антигенные трепонемные полиакролеиновый диагностикум для РА и иммунодиагностикум с частицами золя коллоидного серебра для ДИА, как показали лабораторные и клинические испытания, обеспечивают высокую специфичность, чувствительность, и демонстративность при проведении иммуноанализов. Сочетание этих двух тестов позволяет серологически верифицировать сифилис практически у 100 % пациентов и рекомендовать их применение в составе нового комплекса реакций на сифилис.

Результаты реакций учитывают визуально, вследствие чего отпадает нужда в дорогостоящем оборудовании. Простота и экономичность реакций, стабильность их компонентов позволяют осуществлять постановку тестов в лабораториях различного уровня. Это обусловливает их преимущества и особую ценность при проведении массовых скрининговых исследованиях на сифилис.

Материалы научных разработок легли в основу следующих методических документов:

Методические рекомендации «Получение и применение суспензионных трепонемных антигенных латексного диагностикума и имму-нодиагностикума с коллоидным серебром для экспресс-анализа на сифилис», одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол № 8 от 30.09.2004) и утверждены директором СтавНИПЧИ.

Информационно-методическое письмо «Характеристика заболеваемости сифилисом с 1999 г. по 2003 г. в Республике Северная Осетия-Алания с учетом региональных особенностей. Совершенствование методов и мер по её снижению», утверждено ЦКМС СОГМА 10.11.2004 г.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на 8-й научной сессии сотрудников СОГМА «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (Владикавказ, 2°°1 г.), межлабораторной научной конференции СтавНИПЧИ (Ставрополь, 2°°4 г.).

Публикации

Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных работах.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Она изложена на 125 страницах, содержит 13 таблиц и 2° рисунков. Список литературы включает 165 отечественных и 82 зарубежных источника.

Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

1.1 Эпидемиология сифилиса

Заболеваемость инфекциями, передаваемыми половым путем (ИППП), продолжает увеличиваться во всем мире и представляет одну из основных социальных и медицинских проблем, обусловленная значительным инфицированием молодых людей. По данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется более 250 млн. случаев заболевания ИППП, в том числе сифилисом - 3,5 млн. (Мавров Г.И., Гебенко Т.В., 1998; Чеботарев В.В., Земцов М.А. 1999; Еремин В.Ф., Барабанов Л.Г., Гасич Е.Л. и др., 2002; Quinn T.C., 1994; Chermesky M.A., 1999 и др.).

Уровень заболеваемости сифилисом в России достиг беспрецедентных по своим масштабам величин за всю послевоенную историю нашей страны: в 1996 году заболеваемость сифилисом составила 264,6 случая на 100000 населения (Горелова О.В., Аковбян Н.А., Фидаров А.А., 1999), а среди лиц в возрасте 20-29 лет - 900 случаев на 100000 (Young 2001), в 1999 г. она достигла 186,7 случаев на 100000 населения (Ломоносов К.М., 2002). Лишь в 1925 году в разгар НЭПа показатель заболеваемости сифилисом был выше - 683 случая на 100000 населения (Волкославская В.Н., 1998; Онищенко Г.Г., 2002). Эпидемия сифилиса наносит в настоящее время в России большой ущерб как здоровью граждан, так и экономике страны (Лосева О.К., 1991; Аравийская Е.Р., 1999; Лосева О.К., Бабкова И.Н., 1999).

Значительный рост заболеваемости сифилисом отмечается во всех республиках бывшего Советского Союза (с увеличением заболеваемости среди подростков, беременных и сельского населения) (Капкаев Р.А., 1998;

Еремин В.Ф., Баранов М.Г.. Гасич Л.Е. и соавт., 2002; Юлдашев К.А., Магрунов Б.А., Парпиев З.А. и соавт., 2003).

Как сообщает ряд исследователей, в Российской Федерации в последние годы регистрируется увеличение специфических поражений нервной системы среди всех форм сифилитической инфекции (Лосева О.К., 1999; Олисов А.О., Потекаев Н.С., Дударев А.Ф. и соавт., 1999; Бакулев А.Л., Колоколов О.В., Суворов А.П., 2002; Кулигин В.И., Селисский Г.Д. , Богуш П.Г. и соавт., 2003; Хамидов Ш.А., Валиханов У. А., Балтабаев М.К., 2004).

Одним из ведущих эпидемических факторов, определяющих значительный рост инфекций, передаваемых половым путём (ИППП), в России является активизация способов передачи инфекции (Навроцкий А.П., 1989; Яцуха М.В., Аковбян В.А., 1994; Лосева О.К., Нашхоев М.П., 1999). В реальной жизни это означает появление массивных контингентов лиц, занимающихся коммерческим сексом, гомосексуализмом, наркоманией. Однако это лишь одна из особенностей эпидемиологии сифилиса.

Общепринято, что распространение инфекционных заболеваний регулируется определёнными механизмами: свойствами возбудителя заболевания (вирулентность), иммунной структурой населения (восприимчивость к заболеванию), особенностями механизмов передачи возбудителя (активация, замедление, прекращение) (Лосева О.К., Нашхоев М.П., 1999). Вирулентность относится к фенотипическим характеристикам возбудителя инфекции и может изменяться в определённую сторону под влиянием различных факторов окружающей среды (например, условий культивирования). Патогенность микроба закреплена генетически. Попадая в восприимчивый организм человека, микроорганизм проявляет свою патогенность, которая реализуется в виде комплекса клинических симптомов, характерных для сифилитической инфекции (Лосева О.К., Доля О.В., Чиханатова А.Е., 1997; Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Урманов И.Х., 1998; Иванов В.М., Ломоносов К.М., Стенина М.А., 1998; D'Alessandro G., 1957; DAlessandro G., Dardanoni L., 1958; DAlessandro G., Del Carpio C.A., 1958).

В литературе высказываются предположения о том, что наблюдаемая периодизация колебаний заболеваемости сифилисом может быть связана с периодически изменяющейся солнечной активностью (11-14 лет), в результате чего происходят изменения или вирулентности микробов, или иммунного статуса популяции (Роуз Н.Р., 1989; Александров М.В., Пиря-тинская В.А., Соколовский В.В., 1997; Ометов В.К., Авилов Е.Н., Капус-тюк Л. П., 1998). В том числе изменения интенсивности магнитных и корпускулярных потоков, достигающих поверхности Земли, воздействуют на психоэмоциональный и соматический статус человека, нарушая его самочувствие и поведение, в том числе сексуальное (Чеботарев, 1999).

Другим важным фактором, способным оказать влияние на распространение сифилиса, является состояние восприимчивости организма, зависящее от иммунной структуры населения. Действительно, при распространении инфекций вначале происходит заражение наиболее восприимчивой части населения, и после периода «эпидемиологического насыщения» инфекционный процесс идёт на убыль (Бухарович А.М., 1989; Турги-ев Б.С., 1995; Лузан Н.В., 1999). Однако высказывается также мнение (Тихонова Л. И., 1999), что в силу особенностей сифилитической инфекции, а также особенностей инфекционного иммунитета такая часть населения на самом деле не создаёт «иммунной прослойки», столь характерной для других эпидемий. Так, Г. А. Оксман и соавт. (1996) (Оксман Г. А., Смоловский К., Ноэл Дж., 1996; Крутских Е.С., Яцуха М.В., Шевченко А.А., 1998), моделируя эпидемическое распространение сифилитической инфекции, ввели поправку на иммунность свежеинфицированных лиц, удалив эту группу из числа восприимчивой популяции.

Состояние иммунного статуса организма является одним из существенных факторов патогенеза инфекционного заболевания и, в частности, определяет основные клинические проявления болезни и объясняет полиморфизм клинических симптомов одного и того же заболевания у разных больных. Этот феномен достаточно изучен и установлен у больных хроническими дерматозами (Скрипкин Ю.К., Резайкина А.В., 1997).

Влияние механизмов передачи инфекций на их распространение может происходить путём активации, замедления или прекращения передачи возбудителя. Половой путь передачи инфекции является по своему уникальным, подверженным и зависящим от целого комплекса не только биологических, но и социальных факторов, а именно: в определённых социальных условиях активность механизма передачи и возможность его реализации могут резко возрастать.

С началом известных социально-экономических изменений в нашем обществе появился новый рынок - интимные услуги. Бесчисленные публикации в газетах предложений приятного досуга, эскорта, эротического массажа, открытая уличная и вокзальная проституция, легальное существование различных секс- и гей-клубов не оставляют сомнений в том, что интимные услуги представляют мощный организованный и криминальный бизнес (Калмыкова Т.Д., 1991; Шакиров М.Т., 1991; Чеботарев В.В., 1999). Количество проституток только в Москве насчитывает от 30 до 50 000. Таким образом, произошла резкая и качественно новая активация специфического механизма передачи возбудителя сифилиса и других инфекций, передающихся половым путём: появились и широко распространились социальные группы - проститутки, гомосексуалисты, наркоманы, для которых «нормой» интимной жизни являются частые половые связи с постоянной сменой половых партнёров. Произошло то, что в классической эпидемиологии определяется как «увеличение интенсивности взаимодействия популяций паразита и его хозяев, а также увеличение числа участвующих в системе элементов».

Реализация эпидемического распространения сифилиса в России происходит по следующей схеме. В эпицентре очага находятся так называемые ядерные группы - проститутки, геи, наркоманы. Именно здесь происходит «хранение» инфекции и «воспроизводство» больных. Следующий уровень - это пользователи (клиенты), которые включают бизнесменов, криминальные элементы, учащуюся молодёжь, лиц с бисексуальной ориентацией. И, наконец, третий уровень представлен их жёнами, мужьями, близкими, детьми, случайными знакомыми и т.д. (Аковбян В. А., Резайкина А.В., Тихонова Л.И., 1998).

Сеть государственных учреждений - кожно-венерологических диспансеров, женских консультаций, родильных домов, поликлиник и т. п. обслуживает контингенты третьего и частично второго уровней заболевших, тогда как эпицентр, т. е. наиболее опасные в эпидемическом плане «ядерные группы», остаются вне зоны досягаемости врачей-специалистов. Очевидно, что ни одна система здравоохранения не способна справиться с эпидемическим распространением сифилиса при отсутствии лечебно-профилактических мероприятий в группах высокого риска поведения. Организация лечебно-профилактической работы среди проституток, гомосексуалистов является весьма важной проблемой во всём мире. Об этом было заявлено на прошедшем в июле 1997г. в Риге под эгидой ВОЗ и программы UNAIDS межгосударственном совещании по проблемам ИППП в странах бывшего СССР.

Один из путей организации первичной и вторичной профилактики сифилиса среди проституток, гомосексуалистов и наркоманов является легализация проституции. В этом случае будет налажен учёт и регулярное медицинское освидетельствование проституток, в результате чего заболеваемость сифилисом среди них удастся взять под контроль. Решение о легализации проституции является весьма ответственным государственным актом, непосредственно затрагивающим основные этические, моральные, национальные и религиозные устои общества.

Опыт многих стран мира свидетельствует о том, что работа среди проституток и гомосексуалистов должна проводиться постоянно, вне зависимости от решения государственных органов об их легализации. Поскольку и те, и другие избегают контактов с государственными лечебными организациями, данная работа должна проводиться общественными неправительственными организациями типа «Врачи без границ», «Журналисты против СПИД», «Мы и Вы», Ассоциация САНАМ и др. Учитывая их немногочисленность, отсутствие подготовленных специалистов, можно считать, что «ядерные группы» в России остались вне лечебного и профилактического надзора специалистов. Сохранение подобного положения в дальнейшем чревато продолжающимся распространением сифилиса и ВИЧ-инфекции, что в условиях нынешней социально-экономической нестабильности может принять характер национальной катастрофы.

Единые методы и принципы противоэпидемических мероприятий, направленных на борьбу с распространением сифилиса, принятые в России, постоянно совершенствуются и обогащаются новыми организационными формами (Щепеткова Т.В., 1990; Ладейщиков В.Е., 1996; Аковбян В.А., Резайкина А.В., Тихонова Л.И., 1998; Калмыкова Г.Н., 1998).Так, изучена возможность контроля, прогнозирования и управления эпидемическим процессом. Разработана компьютерная модель и её программная реализация для определения эпидемиологической ситуации в стране, прогноза уровня регистрации больных сифилисом до 2005 года и эффективности противоэпидемических мероприятий, направленных на снижение заболеваемости сифилисом в России (Оксман Г.А., Смоловский К., Ноэл Дж, 1996). Изучение деятельности лечебно-профилактических учреждений по активному выявлению больных сифилисом при всех видах профилактических медицинских осмотров выявило снижение этой работы с 80,7% в 1987г. до 61,9% в 1995 г., что привело к накоплению среди населения не-санированных больных сифилисом, продолжавших заражать партнёров, увеличивая число зарегистрированных больных, особенно с наиболее заразными первичными и вторичными свежими формами (Аковбян В. А., Ре-зайкина А.В., Тихонова Л.И., 1998).

По материалам Ростовского кожно-венерологического диспансера, проведено изучение сезонности в распространении сифилиса (ОметовВ.К., Авилов Е.Н., Капустюк Л.П., 1998). Использованы динамические ряды интенсивных и экстенсивных показателей заболеваемости. Для измерения величин сезонного подъёма и его интенсивности использовали индекс и коэффициент сезонности, показатель сезонности подъёма. Установлено, что сезонность подъёма сифилиса отмечалась на протяжении 5 месяцев с августа по декабрь. Изучение сезонности представляет возможность более углублённого проведения мероприятий по эпидемиологическому контролю за сифилисом.

Среди молодёжи появилась значительная прослойка верующих. Среди больных сифилисом они составляют 17% (Бондаревский Я.И., 1999). Как правило, они знают и называют источник заражения и половые контакты. Формы работы с ними, организован, естественно, не через подписку-предупреждение, а через библейские каноны. Высказывается мнение (Прохоренков В.И., Шергин С.Н., Карачаева Ю.В., 1998), что следует привлечь духовенство, которое имеет сейчас широкие возможности для участия в духовном воспитании детей и формирования «здорового» стереотипа, т. к. воспитание в подростковом возрасте уже не даёт весомого эффекта за счёт сформировавшегося к этому периоду поведенческого менталитета.

Таким образом, современное состояние эпидемиологии сифилиса основано на главенствовании эпидемических факторов, определяющих распространение сифилиса, в первую очередь, активацию путей передачи инфекции, т.е. появление и широкое распространение проституции, гомосексуализма, наркомании, причины которых заключаются в невысоком культурном уровне значительной массы населения, отсутствии моральных принципов, духовности, на фоне социально-экономического состояния России. Эти обстоятельства привели к возникновению эпидемии, начавшейся в нашей стране в последнее десятилетие минувшего века и продолжающейся поныне. Основным её источником послужили больные скрытым сифилисом (Потекаев Н. С., , Потекаев С. Н., 2002). Эта эпидемия по своим масштабам превосходит подъем заболеваемости сифилисом в 1963 и 1978 гг. В 1996 г. заболеваемость сифилисом была почти в 20 раз выше по сравнению с 1991 г. В.В. Чеботаревым и соавт. (Чеботарев В.В, Павлик Л.В., 1996; Чеботарев В.В, Павлик Л.В., Гуджиева О.Д., 1996; Чеботарев В.В, Павлик Л.В., Земцов М.А., 1996) показаны особенности эпидемии на примере Ставропольского края. Авторы установили преобладание манифестных форм над латентными; большое разнообразие вторичных сифилидов с нарастанием среди них везикулезных, пустулезных, симптома Пинкуса и других редких вариантов; частое поражение органов зрения и слуха; рост приобретенного сифилиса (бытового и при половом заражении) у детей и подростков и раннего врожденного сифилиса с активным проявлением и летальным исходом, случаи вторичного рецидивного сифилиса с отрицательными серологическими реакциями. Более частыми стали биполярные и экстрагенитальные шанкры.

1.2 Методы лабораторной диагностики сифилиса

Открытие F. Schaudinn и Е. Hoffman в 1905 г. возбудителя заболевания сифилисом и выделение Я. Г. Шершевским в 1910 г. его чистой культуры положили начало лабораторной диагностики сифилиса. В 1909 году Coles описал методику микроскопирования Spirochaeta pallida в тёмном поле, обратив особое внимание на подвижность микрорганизма. Данный метод используется в диагностике сифилиса и сегодня.

В связи с тем, что трепонемы практически не поддаются культивированию и не окрашиваются обычными лабораторными красителями, были разработаны иные лабораторные методы идентификации возбудителя на различных стадиях заболевания (Беднова В.Н., Лосева О.К., 1985; Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е., 1996; Dische Z., 1930; Fromm G., 1954; Vais-man A., Hamelin A., 1958; Cristian C.L., De Simore A.R., Abrussof L., 1965; Deacon W.E., Hunter E.F., 1962; Fostrom L., 1967; Simon M., Milward F., Le-febvere R. et al., 1992). Эти исследования можно разделить на четыре категории: 1) Прямое микроскопическое исследование при наличие видимых повреждений; 2) Серологические нетрепонемные тесты, используемые в скрининговых целях; 3) Серологические трепонемные тесты, являющиеся подтверждающими исследованиями; 4) Тесты прямого обнаружения антигена, в настоящее время используемые в качестве Золотого Стандарта при испытаниях новых тестов в исследовательских целях.

В лабораторной диагностике сифилиса ведущее место занимает серодиагностика (Дмитриев Г.А., 1996; Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е., 1996; Пожарская В.О., 1996; Cannefax C.R., Garson W., 1957; Faure M., Pillot J., 1960; Doniach A., 1976; Pucilow K., Zajac W., 1980; Bernard Ph., Souyri N., Bonnetbanc G.M., 1984; Hardi P.H., 1985; Farshy C.E., Hunter E.F., Pope V. et al., 1986; Kell P.D., Barton S.T., Sammerbell C.D., 1991; Bolensen E., Abecht S., Benche W. et ak., 1993; Sevars A.H.., Schasfoart R.V., Salden M.H., 1993). В нашей стране согласно Приказу Минздрава № 87 от 26.03.2001 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса», используются микрореакция преципитации (МР) с кардиолипиновым антигеном, метод иммуноферментного анализа (ИФА) - как скрининговые, реакция связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами - диагностический тест; реакция иммобилизации бледных трепо-нем (РИТ) и реакция иммунофлуоресценции (РИФ) - специфические тесты.

История специфической диагностики сифилиса фактически уходит к началу 20-го века, когда независимо друг от друга отечественные и зарубежные исследователи отметили феномен снижения подвижности бледных трепонем под влиянием сыворотки крови больных сифилисом. Это привело к созданию в 1949 году серологического теста - реакции иммобилизации бледных трепонем (РИТ) для обнаружения специфических антител в организме больных сифилисом. Были предприняты многочисленные попытки стандартизации и упрощения этой реакции (Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е., 1996; Дмитриев Г.А., 1996; Goodhort G.L., 1983). Вместе с тем, трудности приготовления препарата, высокая стоимость исследования, необходимость привлечения квалифицированных специалистов значительно ограничили применение РИТ в широкой практике. Кроме того, РИТ, как показано многочисленными авторами (Назарова П.Г., Старченко Е.В., Касаткин Е.В. и др. 1996; Разнатовский А.М., Соколовский Е.В., Красносельских Т.В., 1996; Соколовский Е.В., 1996; Короткий Н.Г., Маркин И.Я., 1997; Цераиди Н.Ф., Мажников А.Г., Коротков Н.В., 1998), долгое время остаётся положительной после окончания адекватной терапии, недостаточно чувствительна при ликвородиагностике сифилиса и в настоящее время используется главным образом при сомнительных результатах других тестов в качестве дополнительного.

В последние годы в России разработана и внедрена в практику РПГА (Дмитриев Г.А., 1996; Дмитриев Г.А., АкоповаЗ.П., 1997; Иванов О.Л., Ломоносов К.М., Стенина М.А., 1998). По сравнению с РИТ и РИФ, она довольна проста в постановке, даёт возможность в течение нескольких часов получить результат, не требует дополнительного оборудования и высокой профессиональной подготовки. РПГА, по мнению исследователей (Ким Э.Г., 1992; Миракян М.Е., Бабаян К.Р., 1998), даёт высокий процент совпадений с РИФ-абс и РИТ, но обладает меньшей специфичностью (Тимченко Г.Ф., 1991; Сидорова Е.В., Ляхов В.Ф., 1995; Акопова З.П., 2000; Фриго Н.В., Комарова В.Д., Обрядина А.П. и соавт., 2000). Имеются сообщения (Тимченко Г.Ф., 1991) о высокой чувствительности РПГА, а также о том, что РПГА становится положительной также рано, как и РИФ. Отмечена важность использования РПГА при нейросифилисе (Миракян М.Е., Бабаян К.Ф., 1998). Однако следует учитывать, что РПГА недостаточно чувствительна при установлении излеченности: положительные результаты регистрируются в отсутствии клинических проявлений сифилиса и при отрицательных результатах КСР.

Неотъемлемой составной частью комплекса серологических исследований на сифилис является реакция микропреципитации или метод микроагглютинации с использованием кардиолипинового антигена (МР, МРП). История создания антигена началась в 40-х годах, когда удалось установить качественный состав действующей субстанции - фосфолипида, а также лецитина и холестерина, способствующих основному компоненту участвовать в реакции. Многолетние исследования отечественных и зарубежных учёных позволили удалить балластные липиды из антигена, снижающие чувствительность и специфичность теста, создать определённые молярные соотношения компонентов кардиолипина, т.е. стандартизировать антиген (Патрушева Н.Б., Рогачей Л.Н., Дегтярева Г.И. и др., 1997). Эта реакция в настоящее время в тех или иных модификациях широко используется во всём мире в качестве отборочной, неспецифической для диагностики сифилиса (Родионов А.Н., 1977; Милич М.В., Антоньев А.А., Блохин Б.А. и соавт., 1983; Дьяченко Л.А., Оловянишников Л.В., 1988; Скрипкин Ю.К., Курбанова А.А., Шарапова Г.Я. и соавт., 1999; Сивак В.В., Чеботарев В.В., Чеботарева Н.В., 2003 и др.).

Однако, как показал ряд исследований, при использовании МР могут быть как ложноотрицательные результаты, особенно у больных с ранним и латентными формами сифилиса (Милич М.В., Антоньев А.А., Бло-хин Б.А., 1983; Дмитриев Г.А., Галишников Ю.А., Зверева Н.С., 2000), так и ложноположительные, обусловленные образованием реагинов вследствие разных причин, так называемые «биологические ложноположительные реакции» (Шинский Т.Э., Протонолова Н.Е., Юминова В.В. и соавт.,1983). Ложноположительные результаты серологических реакций на сифилис можно объяснить присутствием в организме возбудителей, имеющих с бледной трепонемой общие антигены (в числе заболеваний - трепанемато-зы, лептоспироз, возвратный тиф, туберкулез, лепра) (Лямперт И.М., 1972; Милич М.В.,1984; Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Дилекторский В.В., 1987; Фриго Н.В., 2001).Ложноположительные результаты встречаются и при изменении липидного и глобулинового обмена, а также при коллаге-нозах, эндокардитах , инфарктах миокарда и мозга, онкологических заболеваниях, малярии, гепатитах (Ивашкин Т.В., Буеверов А.О., 2001; Фриго Н.В., 2001; Афонин А.В., Молочков В. А., Буеверов А. Л., 2003).

В настоящее время появилось много сообщений об использовании латексов в качестве матриц для приготовления иммунореагентов (Fitzgerald T.J., 1992; Farshy C.E, Hunter E.F., Pope V. et al., 1986). По мнению Ю. В. Лукина (1986), метод латексной агглютинации с использованием окрашенных полиакролеиновых латексов не уступает по чувствительности и наглядности методу гемагглютинации и иммуноферментному анализу. Химические свойства латексных носителей относительно постоянны и поддаются более легкой характеристике по сравнению с поверхностными свойствами наружной мембраны эритроцитов, которые широко варьируют в зависимости от источника выделения. Поэтому латексные микроносители обеспечивают более воспроизводимые результаты по сравнению с эритроцитарными носителями и могут с успехом заменять их в этом им-муноанализе.

Зарубежные тест-системы для экспресс диагностики сифилиса используют в ряде случаев покрытые антигеном латексные частицы (ВДРЛ-латекс - «Санофи» (Франция), RPR-"Human" (Германия), "Organon Technik" (Голландия) и др., причём иногда применяются цветные латексы, облегчающие учёт результатов реакции. Для получения таких диагностику-мов используют полистироловый латекс, несущий на своей поверхности карбоксильные группы. В составе носителя всегда имеется определённое количество ионных или неионных детергентов, гидрофильные группы которых вместе с карбоксильными группами латекса создают общий поверхностный заряд, благодаря чему гранулы латекса спонтанно не агглютинируются. Полиакролеиновый латекс содержит на своей поверхности альдегидные группы, способные вступать в реакцию с первичными аминогруппами, образуя основание Шиффа. В состав полиакролеинового латекса нет необходимости добавлять детергенты, так как однородность суспензии обеспечивается его природой (Воробьева З.Г., Фокина Е.Н., 1992). Реакции с кардиолипиновым антигеном при условии строгой стандартизации и контроля препаратов весьма чувствительны, просты в исполнении, занимают считанные минуты, не требуют дорогостоящего оборудования и квалифицированного персонала.

Обширные исследования по изучению диагностической ценности РИФ при сифилитической инфекции проводились неоднократно (Беднова В.Н., 1987; Овчинников Н.М, Беднова В.Н., Делекторский В.В., 1987; Бед-нова А.Н., Коляденко В.Г., Павлова Е.В., 1992; Дмитриев Г. А., Брагина Е.Е., 1996; Прокопов Н.И., 1996; Petersen C.S. , Pedersen N.S., Axelsen N.H., 1982; Oranne G., DHallwyn M.A., Larsen S.A., 1993). Были изучены -различные модификации РИФ и установлена высокая чувствительность и специфичность теста практически при всех формах сифилиса (Беднова В.Н., Коляденко В.Г., Павлова Е.В., 1992; Прокопов Н.И., 1996; Beebe G.L., Nouri N.G., 1984; Ito F., Hunter E.F., George R.W. et al., 1992). Вместе с тем, возможность РИФ как и любого серологического теста ограничена: она не может служить критерием излеченности, после полноценной терапии, при негативации стандартного комплекса серореакций (КСР) длительное время может оставаться положительной из-за наличия в крови специфических иммуноглобулинов класса G (Дмитриев Г. А., 1996). Наибольшую сложность представляет диагностика врождённого сифилиса, которая основывается на обнаружении в крови ребёнка, рождённого от матери, болевшей во время беременности сифилисом, специфических Ig М, так как именно этот глобулин в отличие от других проникает через плаценту и свидетельствует об инфицированности (Красносельских Т.В., 1998). За рубежом (Sanofi diagnostiks Paster, France) пошли по пути создания так называемой тест-системы для РИФ - «Сифилам», основанной на методе непрямой им-мунофлуоресценции: специфические антитела, присутствующие в сыворотке пациента, заражённого бледной трепонемой, связываются антигеном и визуализируются при флуоресцентном микроскопировании при добавлении меченного флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) античеловеческого глобулина (анти-Ig G, Ig A, Ig M) (Lefevre G.C., Prere M.F., Abbal M. et al., 1983; Paris-Hamelin A., Loupy G., Vaisman A. et al., 1985; Van der Sluis J.J., Van Reede E.C., Boer M., 1986). Во избежании перекрёстной реакции антителами, вырабатываемыми к непатогенным трепонемам, сыворотка истощается обработанным ультразвуком гомогенатом трепонем штамма Рейтер, неспецифические антитела элиминируются, что значительно повышает специфичность результата (Санофи, 1999). В работе О.В.Пожарской (1998) приводятся данные по применению сорбента, полученного из содержимого цитоплазматического цилиндра культуральных бледных трепо-нем, при постановке РИФ-абс на сифилис. Приготовленный антиген из клеточных структур культуральных бледных трепонем применялся также в РСК и ИФА.

В последние два десятилетия за рубежом и в России разработаны методики постановки иммуноферментного анализа, который является специфическим тестом на сифилис (Котровский А.В., 1986; Бабий А.В., 1990; Беднова В.Н., Дмитриев Г.А. , Бабий А.В. и др., 1994; Беднова В.Н., Дмитриев Г.А., Бабий А.В., 1995; Сидорова Е.В., Ляхов В.Ф., 1995; Сафронова А.В., Маликов В.Е., Бурова А. А. и соавт., 1999; Серегин С.В., Белавин П.Б., Бабкина И.И., 2000; Farchy C.E., Hunter E.F., Larsen D.A. et al., 1984; Byrne R.E., Laska S., Bell M. et al., 1992). Метод ИФА - высокочувствителен и специфичен, он рекомендуется для диагностики всех форм сифилиса и распознавания ложноположительных результатов, полученных в других серологических тестах (Дмитриев Г.А., Галишников Ю.А., Зверева Н.С., 2000; Фриго Н.В., Комарова В.Д., Обрядина А.П., 2000; Morrison-Plunner T., Alderte Y.F., Basemon J.B., 1983; Lee Y.B., Farshy C.E., Hunter E.F. et al., 1986; Gasponi A., Nedosant R.P., Fosti A. et al., 1988; Silletti R.P., 1995). Преимуществом ИФА является то, что будучи специфической реакцией, он с успехом может использоваться и как скрининг-тест при массовых обследованиях на сифилис благодаря возможности автоматизации постановки и учёта результатов реакции (Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В., 1987; Van der Sluis J.J., 1992; Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.N., 1995). Впервые сифилитические антитела в иммуноферментном анализе были определены в 1975 г. I. Veldcamp, A. Visser фиксировали обработанный ультразвуком антиген из патогенных бледных трепонем на поверхности полистирола и применяли антивидовой конъюгат, меченный щелочной фосфатазой (Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В., 1987). В России ИФА в диагностике сифилиса начали использовать в 1982 г. (Кот-ровский А.Ф., Беднова В.Н., 1982). Широкое применение ИФА стало возможным в 1986 году после разработки тест-системы ИФА с целью дифференцирования ложноположительных результатов, полученных в стандартных серологических реакциях на сифилис, при профилактическом освидетельствовании на сифилис больших групп населения. Оценка эффективности применения ИФА показала, что в 7,2% случаев он является более чувствительным методом по сравнении с РИТ.

При наличии в анамнезе диагноза сифилиса 2-5 летней давности в 1,54 % случаев были обнаружены положительные результаты в ИФА, в то время как результаты РИФ были отрицательные (Ометов В.К., Маргуль М.П., Уразовская Е.В. и др., 1997). Отрицательные результаты ИФА при положительной РИФ регистрировали в 1,04% случаев при туберкулёзе, онкологических заболеваниях, беременности, у больных травматологических и психоневрологических отделений (Paris-Hamellin A., Loupy G., Vaisman A. et al., 1985; Stienstra S. Peeters T., Von der Straaten A.M. et al., 1992; Young H., Moyes A., Millan A. et al., 1992; Nayar R., Campos J.M., 1993), что подтверждает большую чувствительность и специфичность ИФА по сравнению с РИФ и тем более с РИТ, указывая на возможность расширения использования этого теста в серодиагностике сифилиса. Ведущими специалистами в области серологической диагностики сифилиса в России высказывается мнение о возможности замены общепринятого комплекса серологических реакций (КСР) комплексом ИФА с РМП (Киселева Г.А., Беднова В.Н., Дмитриев Г. А., 1998). В этой связи совершенствование этих реакций приобретает особую значимость.

С развитием молекулярных методик, новые, потенциально более чувствительные тесты появились как дополнение к существующей диагностике сифилиса (Фриго Н.Ф., 1997; Фриго Н.Ф., Главинская Т.А., Комарова В.Д., 1998; Молочков В.А., Кириченко И.М., 2004). Так, ПЦР может иметь огромное значение при диагностике врождённого сифилиса (пассивно передающиеся антитела мешают диагностике), нейросифилиса (единственный на сегодняшний день серологический метод имеет чувствительность 50%), раннего первичного сифилиса (в настоящее время доступен только метод микроскопирования) и, наконец, при различении новой инфекции от старой (Суханов Е.С., Сметанина С.Е., Максимов А.А., 1998; Гребенников В.А., Жаров Л.В., Ометов В.К., 1999). Однако при ПЦР невозможно дифференцировать небольшое число жизнеспособных персистирующих трепонем от погибших микроорганизмов, ДНК которых может быть амплифицирована (Короткий Н.Г., Чиненова Е.Г., 1998; Рассказов, 1998).

Результаты исследований в области серодиагностики сифилиса на данный период проанализированы в целом ряде работ как отечественных (Беднова В.Н., Лосева О.К., 1985; Батыршин Р.Ф., 1993; Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е., 1996; Каральник Б.В., Денисова Т.Г., Кешилева З.Б., 1999; Сухова Л.П., Машеро В.В., Войнова Н.Н., 1999; Воробьёва З.Г., Блинова Т.В., Бурков А.Н., 2000; Ломоносов К.М., 2002; Сивак В.В, Чеботарев В.В., Чеботарева Н.В., 2003; Петришина С.В., 2004 и др.), так и зарубежных авторов (Balic-Winter A., Kansky A., 1985; Alderete G.T., Freeman-Shade L., Baseman G., 1985; Backhouse J.L., Hudson B.J., 1995; Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.H., 1995; Young H., 1998; Augenbraun M., Rolfs E., Johnson R., 1998; Egglestone S.I., Turner A.J.L., 2004). Полученные данные позволили, с одной стороны, определить комплекс диагностических тестов, предназначенных для массовых обследований на сифилис и диагностики различных клинических форм сифилитической инфекции, а, с другой стороны, обеспечить повышение чувствительности и специфичности за счёт их усовершенствования. В то же время, как указывают многие авторы (Овчинников В.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В., 1987), нельзя признать удовлетворительным решение целого ряда проблем серодиагностики сифилиса, в частности, проблемы значительного количества ложно-положительных реакций на сифилис с сыворотками крови людей, свободных от сифилитической инфекции, и недостаточной эффективности диагностики ранних и поздних форм заболевания сифилисом. Причины неспецифически положительных реакций с сыворотками крови лиц, свободных от сифилиса, при использовании как неспецифического кардиолипинового, так и специфических трепонемных антигенов проанализированы в работе К.К. Борисенко, В.Н. Бедновой (1990). Показано, что перспективным направлением для уменьшения числа ложноположительных реакций на сифилис является повышение специфичности диагностических тест-систем, используемых в серологических тестах, а для уменьшения числа ложноотрицательных результатов необходимо повысить чувствительность диагностикумов.

Актуальность дальнейшего проведения исследований в данном направлении подтверждается также результатами работ (Grob J.J., Bonerand Y.J., 1986; Horvath I., Puskas E. Et al., 1994; Vila P., Hernarder M.C., Lopez-Fernandes M.F. et al, 1994), где показано, что значительное число неспецифически положительных результатов реакций с кардиолипином связано с наличием у обследуемых лиц аутоиммунных заболеваний, число которых за последние годы имеет тенденцию к возрастанию. Анализ использования различных трепонемных антигенов в практике серодиагностики сифилиса показывает, что специфическим тестам, обладающим высокой диагностической ценностью, присущи высокие техническая сложность и стоимость их обеспечения (РИФ-абс, ИФА и др.). Более дешевые и менее сложные в техническом обеспечении серологические тесты на сифилис (РСК, РПГА) обладают и меньшей диагностической ценностью.

В качестве одного из направлений совершенствования серодиагностики сифилиса является выделение основных трепонемных антигенов и их характеристики (DAlessandro G., Oddo F.G., 1946; DAlessandro G, Oddo F.G., Dardanoni L., 1950; DAlessandro G., Zaffiro P., 1962; Bailey M.G., Penn C.N., Cockayne A., 1985; Berg R.W., Duncan W.P., Thornton C.G., 1972; Christiansen A.H., 1967; Antoni G., Dal Maso G., Berti B., 1996).

В данном направлении известны проведённые В.О. Пожарской (1986, 1995,) исследования функциональных свойств клеточных структур культуральных бледных трепонем и использование их при производственном выпуске новых диагностических препаратов на сифилис.

В ряде работ изучены биополимеры с различной молекулярной массой, выделенные из фибрилл (Hardi P.H., Fredediricks W.R., Nell E.E., 1975; Wachter M.S., Johnson R.S., 1976; Petersen C.S., Pedersen N.S., Axelsen N.H., 1981) и наружной оболочки (Cox D.L., 1994; Cox D.L., Akins D.P., Porcella S.F. et al, 1995; Radolf J.D., 1995; Radolf J.D., Robinson E.J., Burell K.W. et al., 1995; Antoni G., Dal Maso G., Berti B. et al., 1996) патогенных трепонем. Полученные данные подтвердили высокую антигенность выделенных фракций и перспективность их применения для серодиагностики сифилиса.

Высокая специфичность таких тест-систем, как ИФА, выпускаемых НПО «Рекомби-Бест», обеспечивается за счёт использования в качестве антигена рекомбинантных белков, представляющих мембранный протеин бледной трепонемы. Известно, что липопротеины обусловливают неспецифические реакции, поэтому использование очищенных белковых антигенов является перспективным методом молекулярной биологии, но достаточно трудоёмким и дорогостоящим (Серегин С.А., Белавин П.Б., Бабкина С.Г., 2000).

Успешное решение задачи совершенствования экспрессных методов лабораторной диагностики сифилиса, а также определение перспективных направлений их использования во многом зависит от выбранного научно-методического подхода к объекту исследования.

1.3 Использование коллоидного серебра в конструировании диагностических тест-систем

Коллоидное серебро является активным катализатором и способно инициировать большое число индикаторных каталитических реакций (Крейнгольд С.У., 1983; Мюллер М. и др., 1983), пригодных для выявления следовых количеств золя. Особо привлекают каталитические реакции восстановления металлов из их растворимых солей. Такие реакции используются в аналитической химии (Файгл Ф., Ангер В., 1976; Мюллер

М. и др. 1983), фотографии (Джеймс Х., 1980), при химической металлизации пластмасс (Шалкаускас М.И., Вашкялис А.Д., 1977) и производстве зеркал (Винокуров В.М., 1950). Сущность их заключается в образовании слоя металла в результате химической реакции, протекающей преимущественно на каталитически активной поверхности , в частности, на поверхности, сенсибилизированной серебром. Эти реакции отличаются очень высокой чувствительностью. Необходимым является автокаталитический характер реакции восстановления. Это обеспечивает как преимущественное осаждение металла на связанный с маркером участок поверхности, так и получение на нем покрытия необходимой толщины. В отсутствие катализа реакция либо не протекает, либо протекает во всем объеме раствора и приводит к выпадению на не связанного с поверхностью порошкообразного металла.

Наиболее доступным и надежным способом получения высокодисперсных золей серебра считается конденсационный, основанный на химическом восстановлении металла из его растворимых солей. Обычно при получении золей серебра, применяемых в медицинских и химических целях, металл восстанавливают в присутствии защитных коллоидов, белка, полисахаридов или синтетических полимеров (Джеймс Х., 1980; Родионов П.П., Третьяков В.В., 1992). При этом одновременно происходит зародышеобразование, конденсация частиц металлического серебра и блокирование их поверхности защитным полимером, препятствующим дальнейшему росту металлических ядер и стабилизирующим золь (Джеймс, 1980). Однако такой подход не может быть использован для получения золя маркера, поскольку в дальнейшем маркер необходимо сорбционно связать с иммунореагентом, а блокированная поверхность золей теряет адсорбирующие свойства.

Анализ структур частиц золей провел А. Г. Полтавченко и соавт. (1998) в соответствии с теорией малоуглового рентгеновского рассеяния (Свергун Д.И., Фейгин Л.А.,1988). Малоугловые рентгенограммы измеряли на дифрактометре фирмы «Siemens» (Германия) при длине волны используемого излучения 0,154 нм и температуре образцов 18 ⁰С. Известно, что агрегативная устойчивость золя обеспечивается прежде всего наличием на поверхности дисперсных частиц двойных электрических слоев (Лабораторные работы 1986). В основе мицеллы лежит нерастворимый в данной дисперсионной среде агрегат, состоящий из множества атомов серебра. Поверхность агрегата может заряжаться, благодаря избирательной адсорбции ионов из дисперсионной среды или диссоциации молекул в поверхностном слое агрегата. Частица металла с адсорбированными на ней потенциалопределяющими ионами составляет ядро мицеллы. Заряд ядра компенсируется эквивалентным зарядом противоположно заряженных ионов, расположенных в виде двух слоев - адсорбционного и диффузного в объеме среды.

Установлено, что высокодисперсные иммунозоли серебра могут быть использованы в качестве метки специфических реагентов при постановке иммунокаталитического анализа на микротитровальных планшетах (Полтавченко А.Г. с соавт., 1998, 2002).

Несмотря на известные достоинства указанных меток, примеры их систематического применения в микробиологической практике и конкретно - в твердофазных диагностических тест-системах пока, к сожалению, немногочисленны. Это обстоятельство обусловлено прежде всего недостаточной развитостью методологии иммуноанализа с применением коллоидных металлов, хотя потребность в создании новых биомаркеров на основе перспективных зондов, удовлетворяющих запросам исследовательской и клинической практики в области диагностики инфекционных заболеваний, в том числе и сифилиса, велика.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Штаммы микроорганизмов, взятые в работу

При выполнении работы были использованы штаммы культураль-ных бледных трепонем, представители трех иммунологических групп по классификации Р.Р.Гельтцера и Л.В. Зебницкой: I группа - IX штамм «Ставрополь»; II группа - VII и VIII штамм (штаммы выделены из крови больных вторичным активным сифилисом Л.И.Тутовой под руководством Р.Р.Гельтцера (1947, 1949, 1950); III группа - V штамм «Казань», выделенный 3.Х. Каримовой и Г.Г. Кондратьевым (1941); патогенные трепонемы - штамм Никольса и непатогенные трепонемы - T.phagedenis (тлтамм Рейтер). Характеристика штаммов микроорганизмов представлена в таблице 1.

2.2 Питательные среды

Для выращивания трепонем использовали печеночную питательную среду (ППС) (Гельтцер, 1936); пептонный бульон из бычьих сердец (ПББС) (Овчинников, Резникова, Сагдеева, 1970); тиогликолевую среду (Сержантова, 1979)

2.3 Основные химические реактивы и биологическое сырье

Биологическое сырье и основные химические реактивы, использованные при проведении исследований, представлены в таблице 2.

2.4 Аппаратное оснащение исследований

При выполнении экспериментальных работ использовано следующее оборудование и аппаратура:

иономер универсальный рН-150 (завод измерительных приборов, г. Гомель, Белоруссия);

мешалка магнитная ММ-5 (завод комплектных лабораторий, г. Мукачево, Украина);

- термостат электрический суховоздушный ТС-80м (Одесское ПО лабораторной медицинской техники «Медлаборатортехника», Украина);

микроскоп биологический «Биолам Р1» (ЛОМО, г. Санкт-Петербург);

морозильное устройство НС-280/75 («Фригера», национальное предприятие Колин, Чехословакия);

холодильник бытовой (Московское ПО ЗИЛ);

установка для сублимационной сушки ТГ-5 (г. Дрезден, Германия);

весы технические ВСМ-20 (г.Нижний Тагил);

весы электронные Sartorius (Германия);

центрифуга лабораторная К-24 (Германия);

спектрофотомер СФ-26 (ЛОМО, г.Санкт-Петербург);

- прибор для встряхивания и инкубирования планшет Thermoshaker ST (Литва);

регистрирующий спектрофотометр Multiskan (LKB, Швеция);

хроматографическая система «Minicoldlab» (LKB, Швеция)

2.5 Материалы, полученные из клиник

Клинико-лабораторные исследования проводили с 686 сыворотками больных различными формами сифилиса и 237 - людей контрольной группы (беременные, доноры, больные гонореей, кожные, терапевтические, онкологические и инфекционные больные). Сыворотки крови больных сифилисом разделены по формам заболевания, а контрольной группы - по объединяющим признакам.

При анализе сложных для диагностики случаев с целью уточнения окончательного диагноза заболевания было изучено 65 историй болезней и амбулаторных карт больных сифилисом.

2.6 МИБП и биологические препараты

Акролар К - НИИ Биоорганической химии им. Шемякина, г.Москва.

Антиген трепонемный ультраозвученный сухой (УЗТА) - ФГУП «Аллерген», г.Ставрополь.

Антиген кардиолипиновый - «Биолек», г.Харьков, Украина.

Люис- РПГА-тест - «Ниармедик плюс», г.Москва.

Иммуноглобулины диагностические трепонемные люминесцирую-щие - «Bio-Rad», Франция.

Полный адъювант Фрейнда (ПАФ) - «Calbiochem», США.

Тест-система диагностическая люис - антипаллидум для ИФА -«Бест», Новосибирск.

Тималин - завод медицинских препаратов, АО «Самсон», Санкт-Петербург.

2.7 Лабораторные животные, использованные в опытах

В работе использовали 10 здоровых кроликов породы "Шиншилла", весом 2,5-3 кг из питомника СтавНИПЧИ.

В процессе содержания животных поддерживали рекомендуемый режим питания согласно приказу № 1179 (М., 1983).

Все процедуры по экспериментальным животным, включая эвтаназию, проводили согласно рекомендациям В.В.Карпенко, В.И.Сачкова (1985), С.А. Куфлиной, Т.Н.Павловой (1985).

2.8 Физико-химические и иммунологические методы