Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса

Используя сконструированный иммунодиагностикум, исследовано в ДИА с коллоидным серебром 215 проб сывороток крови больных различными формами сифилиса, 55 - обследуемых на сифилис. Контрольной группой служили сыворотки крови 70 лиц, свободных от сифилитической инфекции. Эти же сыворотки параллельно оценивались в МР. Результаты испытаний, представленные в таблице 13 и рисунках 19, 20, несомненно свидетельствуют о высокой чувствительности разработанного диагностикума. Так, у 157 (73%) больных обнаруживались антитрепонемные Ат в титрах 1:400, у 58 (27%) человек - 1:800, в то же время как из 215 больных, обследованных в МР, лишь у 165 (77,3 %) больных отмечен положительный результат. Из 55 обследуемых на сифилис у 40 (72%) титр сывороток в ДИА был равен 87

Таблица 13. Сравнительное исследование сывороток крови

82

Размещено на http://www.allbest.ru

1:400, у 5 (9 %) - 1:800, и лишь у 10 (18,2 %) - отрицательный результат. Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном у 45,7% обследуемых (25 человек) была отрицательной. Специфичность иммунодиагности-кума на основе коллоидного серебра подтверждена при исследовании 70 сывороток крови лиц, свободных от сифилитической инфекции (Акт испытаний от 26.09.2004).

Таким образом, золь серебра является достаточно стандартным и легко воспроизводимым препаратом, пригодным для применения в качестве маркера иммунных реагентов. Нами впервые сконструирован высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностикум для ДИА с использованием комплексного трепонемного антигена, меченного частицами коллоидного серебра. Этот тест, в сравнении с традиционными серологическими реакциями на сифилис, более чувствителен, экспрессен, экономичен и свидетельствует о перспективности ДИА со специфическим антигеном трепонем, меченным коллоидным серебром, в качестве экспрессного ультрамик-рометода лабораторной диагностики сифилиса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время насчитывается более 20 инфекций, передаваемых половым путем, среди которых сифилис занимает значительное место. Заболеваемость сифилисом в России остается крайне высокой и составляет более 143 случаев на 100 тыс. населения. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза, причем её подъем имеет многие признаки эпидемии: преобладают в структуре свежие формы; происходит рост числа детей с врожденным и приобретенным бытовым сифилисом; появились территории с показателями заболеваемости, значительно превышающими статистические показатели по стране (Аковбян В. А., Прохоренков В.И., Машкиляйсон А.Л. и др. 1995; Адаскевич В.П., 1999; Родионов А.Н., 2000).

Республика Северная Осетия-Алания является регионом, где наряду с общероссийскими проблемами (увеличение числа социально неадаптированных лиц, более раннее начало половой жизни, рост проституции и др.), имеются и свои особенности, главными из которых являются высокая плотность населения, приближенность к "горячим точкам", наличие большого количества беженцев и вынужденных переселенцев, выраженность миграционных процессов.

Анализируя заболеваемость сифилисом в РСО - А по районам за пять лет, можно отметить, что она носит циклический характер, во всех районах и в г. Владикавказе наблюдается её нестабильность, со «взлётами» и «падениями». Так, подъем заболеваемости в 2003 г. (43,0 на 100 тыс.) произошёл за счёт увеличения случаев сифилиса в Пригородном (в 2 раза), Ардонском (в 2,5 раза), Кировском (более чем в 3 раза) и Алагирском (почти в 5 раз) районах. В других районах Республики и в г. Владикавказе наблюдалось некоторое снижение заболеваемости.

С 1999 г. по 2003 г. стало заметно изменение удельного веса различных форм сифилиса в сторону увеличения раннего (с 43,5% до 56,0%), появления позднего скрытого сифилиса (5,8%) и врожденного сифилиса (1,7%). С 2001 г. отмечены случаи нейросифилиса. В структуре заболеваемости превалируют скрытые формы сифилиса, которые характеризуются полным отсутствием симптоматики и выявляются только по положительным серологическим реакциям при обследовании крови в поликлиниках, стационарах, при устройстве на работу и различных профилактических осмотрах.

Основную массу больных сифилисом составляют лица обоих полов в возрасте от 20 до 39 лет. Однако в последнее время отмечается тенденция к увеличению удельного веса лиц в возрасте свыше 40 лет. По семейному положению основную массу больных составляют лица разведённые (5%), состоящие в браке повторно (13,0%) и холостые (60%), т.е. семья является одним из сдерживающих факторов в предупреждении случайных половых связей. Анализ социального состава больных сифилисом показал, что основная масса больных (78,9%) представлена нигде не работающими лицами, что в значительной мере затрудняет проведение противоэпидемических мероприятий. Среди причин, влияющих на заболеваемость, необходимо отметить возросшую сексуальную активность подростков, увеличение числа вне- и добрачных половых связей вследствие возросшей сексуальной раскрепощённости населения, коммерциализацию интимных отношений, широкое распространение порнографии, наркомании и т. д.

Таким образом, анализ заболеваемости сифилисом в Республике Северная Осетия-Алания свидетельствует о высокой тенденции распространения этого заболевания. Это обусловливает необходимость разработки и интенсивного проведения противоэпидемических мероприятий как в неблагополучных районах, так и в целом по Республике. При этом лабораторные методы играют существенную роль в системе этих мероприятий.

В централизованной лаборатории Северо-Осетинского кожновенерологического диспансера во исполнение приказа МЗ № 87 с 2001 г. для исследования на сифилис широко применяются: тест быстрых плазменных реагинов (RPR), метод иммуноферментного анализа (ИФА), как скрининговый, трепо-немные подтверждающие тесты - реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ), позволившие выявить большее количество поздних форм сифилиса: в 2000 г. поздний скрытый сифилис был в 2-х, в 2002 г. - уже в 4-х случаях; в 2000 г. нейросифилис не обнаруживался, а в 2002 г. - уже диагностировали 7 случаев этой тяжёлой формы болезни. Необходимо отметить, что в 12,4% случаях при установлении диагноза раннего скрытого сифилиса и 50,0% - при нейросифилисе при отрицательной реакции Вассермана ИФА была резко положительной.

Дальнейшее расширение арсенала лабораторных методов, и особенно за счет экспрессных, с помощью которых возможно исследовать большое количество людей за короткий промежуток времени и получить достоверную информацию о сложившейся ситуации по этой инфекции , дает возможность принимать оперативные меры в борьбе с заболеваемостью сифилисом.

Нами разработана биотехнология приготовления трепонемного суспензионного антигенного диагностикума для реакции агглютинации и дана оценка его диагностической ценности. Изготовление препарата осуществляли в соответствии с методикой, разработанной И.А.Базиковым (2000), в нашей модификации, используя в качестве полимерной матрицы акролар К, полученный из института биоорганической химии им. Шемякина. Гомогенные частицы латекса правильной сферической формы, окрашенные в розовый цвет имели средний диаметр (1,2±0,1) мкм.

Лигандом служил комплексный антитиген, полученный по разработанной нами биотехнологической схеме, состоящий из коммерческого ульт-раозвученного трепонемного антигена (УЗТА) для РСК производства ФГУП «Аллерген» (г.Ставрополь), подверженного специальной очистке, и цетавло-нового супернатанта, представляющего собой поверхностные антигены трепонем, изолированные нами по методике M.C.Blake, E.C.Goschliech (1982), в соотношении 2:1. Коммерческий антиген и поверхностные антигены извлекали из культуральных бледных трепонем штаммов V, VI, VII, VIII, IX и Рейтера.

УЗТА предварительно подвергали очистке , которая заключалась в иммуносорбции неспецифических антигенов, переосаждении сульфатом аммония, гельфильтрации, стабилизации методом сублимации.

Для извлечения поверхностных антигенов использовали цетавлон, позволяющий изолировать полимерный комплекс, включающий липид, полисахарид в сочетании с протеинами и нуклеиновыми кислотами. Комплексный антиген явился в дальнейшем высококачественным сырьем при конструировании препаратов для иммунодиагностики сифилиса.

Нами получен трепонемный суспензионный диагностикум на основе полиакролеиновой матрицы, При этом отработаны оптимальные условия сенсибилизации латексных микросфер комплексным трепонемным антигеном: 0,20 мг лиганда соединяли с 2 мл с 2 % полимерного носителя. К смеси добавляли 2 мл 0,9% раствора натрия хлорида, рН 7,2. Сенсибилизацию проводили в течение 3 ч при температуре 22 ⁰С на магнитной мешалке. Далее суспензию осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 3-4 мин и дважды отмывали от несвязавшегося антигена. Для стабилизации трепо-немного полимерного латексного диагностикума отработан оптимальный режим его лиофильного высушивания.

По вышеописанной технологии изготовлено 10 серий диагностикума. Оценка их диагностической ценности проводилась на базе централизованной лаборатории Северо-Осетинского РКВД. Для исследования были взяты сыворотки крови 416 стационарных больных до лечения и после лечения с различными диагнозами: сифилис первичный серопозитивный; сифилис вторичный свежий, сифилис вторичный рецидивный, сифилис скрытый ранний, сифилис скрытый поздний, нейросифилис ранний в сравнении с

КСР (микрореакция преципитации, реакции Вассермана , ИФА, РНГА, РИФ). Контрольной группой служили сыворотки крови 167 лиц, свободных от сифилитической инфекции.

При изучении чувствительности и специфичности диагностикума использовали два варианта постановки РАЛ: на стекле, как скрининг на сифилис (качественный тест), и титрование сывороток в микропланшетах (количественный тест). Для этого использовали 96-луночные микропланшеты для иммунологических реакций из полистирола отечественного и импортного производства.

На основании проведенных испытаний установлено, что изготовленный по разработанной нами технологии трепонемный суспензионный антигенный диагностикум позволяет проводить реакцию агглютинации латекса, по чувствительности, сопоставимую с такими трепонемными тестами, как РПГА, ИФА, РИФ, в то же время РАЛ превосходит реакции Вассермана и МР по этому показателю. При сравнительном изучении специфичности РАЛ достоверно установлена его высокая специфичность.

В последние годы в иммунодиагностике широко развиваются направления, связанные с иммунохроматографическими, иммунофильтрационными и так называемыми «дот-блот» методиками, в которых в качестве твердой фазы используют пористые мембраны, а в качестве маркера - ферменты, красители или золи металлов. В поисках доступных и дешевых каталитически активных металлов, способных выявляться «физическим проявлением», мы обратили внимание на коллоидное серебро. Золи серебра достаточно стандартны и легко воспроизводимы, а сконструированные с их участием тест-системы по чувствительности практически не уступают другим твердофазным методам.

Нами отработаны методические подходы при конструировании диаг-ностикума с применением коллоидного серебра в качестве маркера трепо-немного антигена для детекции в ДИА специфических антител.

Золь серебра получали восстановлением азотнокислого серебра бор-гидридом натрия. Для этого к 5 мл 0,05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливали равный объем 0,02% водного раствора азотнокислого серебра. Перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин. При конструировании диагностикума использовали комплексный трепонемный антиген.

Наиболее эффективно стабилизировал золь серебра антиген в количестве 375 мкг на 10 мл золя. Исходя из этого, для приготовления диагности-кума к 1 мл антигена (375 мкг белка) при постоянном интенсивном перемешивании добавляли 5 мл золя серебра. После 10-минутного перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре в раствор добавляли следующую порцию золя - 3 мл, а спустя 10 мин - еще 2 мл золя и 2 мл 10 % водного раствора БСА (для блокирования свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера). Через 30 мин перемешивания диагностикум стабилизировали внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 1 % БСА, 10% НЛС и 0,04% азида натрия. Приготовляемый препарат дополнительно интенсивно встряхивали в течение 30 минут, разливали в ампулы ШПВ-6 по 2 мл. Срок хранения диагностикума - 6 месяцев.

Постановку реакции осуществляли традиционным для дот-иммуно-анализа способом. Сыворотки крови разводили забуференным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,2 с 0,5% БСА в 200 раз и титровали путем двухкратного разведения до необходимой концентрации в планшете для иммунологических реакций. Каждое разведение сывороток наносили на твердофазный носитель в объеме 1 мкл в виде линейно расположенных точек. В качестве такового мы апробировали НЦМ для электрофореза «Bio-Rad», «Mil-lipor», «Serva» и мембранные фильтры«Агшсоп», «Millipor», «Sinpor>m «Вла-дипор» с различным размером пор, исходя из того, что прочность связывания ими антител и их сорбционная емкость может быть неоднозначна.

Проведенные испытания показали, что наименее пригодными оказались мембранные фильтры «Amicon», «Millipor» и «Владипор». Хорошими характеристиками обладали НЦМ и мембранные фильтры «Sinpor» (достаточная сорбционная емкость и прочность связывания наносимого материала).

После нанесения исследуемого материала (1 мкл) на мембрану мы испытали несколько режимов иммобилизации: 20,30,40 мин при (20±1) ⁰С, 10,15,20 мин при 37 ⁰С. Все режимы сорбции были приемлемы, для дальнейшей работы нами избран режим: 10 мин при 37 ⁰С.

Мембрану после фиксации материала помещали в чашку Петри и однократно промывали ЗФР. Затем подложку заливали ЗФР, содержащим 1% БСА, блокируя таким образом на ней свободные участки связывания в течение 10-15 мин при комнатной температуре. После двукратного промывания ЗФР мембрану помещали на 5-10 мин в раствор диагностикума, затем тщательно (трехкратно по 2-3 мин) промывали ЗФР и однократно - дистиллированной водой. Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембраны в раствор проявителя на 5-8 мин.

Проявитель выбирали по проявляющему веществу: амидол, гидрохинон, глицин, метол, фенидон в разных сочетаниях. Всего нами было апробировано 14 составов проявителей для каталитического усиления сигнала серебряного золя. Результаты испытаний показали, что проявители, содержащие метол, развивали высокую оптическую плотность: исследуемые сыворотки крови, содержащие специфические антитела, проявлялись в виде серо-коричневых пятен различной интенсивности в зависимости от количественного содержания антител. В то же время остальные проявители давали светлые, малоконтрастные отложения. В связи с этим в экспериментах мы использовали проявитель, содержащий метол.

Используя сконструированный иммунодиагностикум, исследовано в ДИА с коллоидным серебром 215 проб сывороток крови больных различными формами сифилиса, 55 - обследуемых на сифилис. Контрольной группой служили сыворотки крови 70 лиц, свободных от сифилитической инфекции. Эти же сыворотки параллельно оценивались в МР. Результаты испытаний несомненно свидетельствуют о высокой чувствительности разработанного диагностикума. Так, у 157 (73%) больных обнаруживались антитрепонемные Ат в титрах 1:400, у 58 (27%) человек - 1:800, в то же время как из 215 больных, обследованных в МР, лишь у 165 (77,3 %) больных отмечен положительный результат. Из 55 больных обследуемых на сифилис у 40 (72%) титр сывороток в ДИА был равен 1:400, у 5 (9%) - 1:800, у 10 (18,2%) - отрицательный результат. Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном у 45,7% обследуемых (25 человек) была отрицательной. Специфичность иммунодиагностикума на основе коллоидного серебра подтверждена при исследовании 70 сывороток крови лиц, свободных от сифилитической инфекции.

Таким образом, нами сконструирован высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностикум для ДИА с использованием комплексного трепонемного антигена, меченного частицами коллоидного серебра. Этот тест, в сравнении с традиционными серологическими реакциями на сифилис, более чувствителен, экспрессен, экономичен и свидетельствует о перспективности использования ДИА со специфическим антигеном трепонем, меченным коллоидным серебром, в качестве экспрессного ультрамикроме-тода лабораторной диагностики сифилиса.

ВЫВОДЫ

Впервые представлен многолетний анализ заболеваемости сифилисом в Республике Северная Осетия-Алания, выявивший её высокий уровень и тенденцию к распространению в отдельных районах Республики, что диктует необходимость проведения массовых, скрининговых профилактических обследований населения с привлечением надежных экспрессных методов лабораторной диагностики.

Подобран эффективный комплекс последовательных манипуляций, позволивший получить высокоспецифичный комплексный трепонем-ный полноценный антиген, явившийся высококачественным сырьем при конструировании препаратов для иммунодиагностики сифилиса.

Получен трепонемный суспензионный диагностикум на основе полиакролеиновой матрицы и комплексного антигена, обеспечивающий высокую чувствительность, специфичность, демонстративность, воспроизводимость реакции агглютинации латекса.

Впервые отработаны методические подходы для конструирования диагностикума с применением коллоидного серебра в качестве маркера трепонемного антигена и детекции в ДИА специфических антител. ДИА пригоден для исследования на сифилис клинического материала, характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностью, простотой выполнения, демонстративностью.

Лабораторные и клинические испытания разработанных суспензионных антигенных диагностикумов для РАЛ и дот- иммуноанализа показали по ряду параметров свое превосходство над традиционными серологическими реакциями и перспективность их использования в качестве скринирующих тестов на сифилис.

Размещено на Allbest.ru