Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса

Количественное определение белка проводили по методу OWarburg и W.Christian (1941) сравниванием показаний поглощения белка при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).

Гельфильтрацию проводили на хроматографической установке «Minicoldlab» (LKB, Швеция).

Золь серебра готовили в соответствии с рекомендациями А.Г.Полтавченко (1998).

Комплексирование частиц серебра с иммунным реагентом (антигеном) проводили по методикам I.Raska (1988), А.Г.Полтавченко (1998).

2.9 Сублимация МИБП

Лиофилизацию антигенов, диагностических препаратов проводили в камере TG-5 (Германия). Жидкие препараты разливали в ампулы ШПВ-6 по 0,5-1 мл, замораживали в низкотемпературном столе типа NZ-280/75 при температуре минус (45±5) ⁰С в течение 24 часов и и лиофилизировали.

2.10 Статистическая обработка материала

Экспериментальные данные были обработаны методами вариационной статистики, изложенными в работах И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (1962), В.Ю. Урбах (1975), П.И. Сызранцева (1938).

Глава 3. СИФИЛИС В РЕСПУБЛИКЕ СЕВЕРНАЯ ОСЕТИЯ-АЛАНИЯ

Республика Северная Осетия-Алания (РСО-А) является регионом, где наряду с общероссийскими проблемами (увеличение числа социально неадаптированных лиц, более раннее начало половой жизни, рост проституции и др.) имеются и свои особенности, главными из которых являются высокая плотность населения, приближенность к "горячим точкам", наличие большого количества беженцев и вынужденных переселенцев, выраженность миграционных процессов. Численность населения РСО-А 2003 г. составляла 676,319 ч. Из административных районов наибольшая плотность населения в г. Владикавказе и Пригородном районе (1116ч./кв.км.), Правобережном (121 ч./кв.км.), Моздокском (762ч./кв.км.), Ардонском(69 ч./кв./км.). Ниже этот показатель в горных Ирафском (11 ч./кв.км.) и Алагирском (21 ч./кв.км.) районах.

Социально-экономические и военно-политические проблемы 90-х годов на северном Кавказе и в Закавказье обусловили особую демографическую обстановку в РСО-А, имеющую большое значение в эпидемиологии венерических заболеваний. С 1991 года в Республику хлынул поток беженцев из Южной Осетии, Грузии, Таджикистана, Армении, Азербайджана, Чечни и Ингушетии (всего до 50000 человек), которые в недостаточной степени подвергались медицинским осмотрам. Ослабление паспортного режима привело к притоку большого числа лиц без определённого места жительства, ведущих беспорядочную половую жизнь, злоупотребляющих алкоголем и наркотиками. Безработица заставляла постоянных жителей искать временную работу в других регионах страны или же заниматься коммерцией, что также сопряжено с частыми выездами за пределы республики. В миграцию, прежде всего, включаются лица сексуально активные, в основном мужского пола, зачастую не состоящие в браке или же длительное время находящиеся в разлуке с семьёй. Таким образом, бытовые и психологические проблемы, частое среди мигрантов употребление спиртного порождают лёгкость в выборе половых партнёров. При этом возрастание миграционных процессов идет параллельно увеличению динамики заболеваемости сифилисом.

Показатель заболеваемости сифилисом в Республике в 1979 г. составлял 43,8 на 100 тыс. жителей. В последующие годы вплоть до 1991 г. отмечалась тенденция к снижению (7,5 на 100 тыс. жителей), после чего кривая заболеваемости вновь устремилась вверх, достигнув максимального уровня в 1996 г. (43,5 на 100 тыс. жителей). Некоторое снижение к 1999 году (до отметки 43,5 на 100 тыс. жителей (средне-российский уровень - 165,2 на 100 тыс.) не отражает истинной заболеваемости сифилисом в республике, так как открытые в эти годы негосударственные дерматовенерологические учреждения не ведут статистической отчетности. Соотношение больных сифилисом и гонореей составило в 1999 году 1:1,7, что свидетельствует об издержках регистрации больных сифилисом. (Базаев В.Т., Фидаров А.А., Тургиев М.С. и др., 2001).

Для сравнения можно привести показатели заболеваемости сифилисом по Южному Федеральному округу, которые составили в 2001 году 121,6 на 100 т.н. На прилегающих к РСО-Алания территориях показатель заболеваемости следующий:

Ингушская Республика-15,6;

Кабардино-Балкарская Республика-83,8;

Республика Дагестан-43,3;

Карачаево-Черкесская Республика-117,2;

Ставропольский край-137,0;

Чеченская Республика отчётности не подаёт.

В 1999 г. зарегистрировано 289 случаев (43,5 на 100 тыс.). Высокая заболеваемость наблюдалась в Ирафском, Моздокском, Дигорском и Алагир-ском районах (рисунок 1).

г. отмечен ростом количества больных в Кировском, Ардонском, Правобережном, Пригородном районах и в г. Владикавказе. Во всех остальных районах заметно снижение случаев заболевших (рисунок 2).

год «знаменателен» взлётом заболеваемости(303 случая - 44,7 на 100 тыс.). «Отличились» Алагирский, Ардонский, Ирафский районы и г. Владикавказ. Не изменилась ситуация в Дигорском районе. Снизилась заболеваемость в Кировском, Моздокском, Правобережном и Пригородном районах ( рисунок 3).

В 2002 г. общая заболеваемость населения снизилась до 39,9 на 100 тыс., но продолжала расти в г. Владикавказе, Правобережном, Ирафском, Дигорском районах (в Дигорском почти в 2 раза) ( рисунок 4).

Подъём заболеваемости в 2003 г. (43,0 на 100 тыс.) произошёл за счёт увеличения случаев сифилиса в Пригородном (в 2 раза), Ардонском (в 2,5 раза), Кировском (более чем в 3 раза) и Алагирском (почти в 5 раз) районах. В других районах республики и в г. Владикавказе наблюдалось некоторое снижение заболеваемости (рисунок 5).

Анализируя заболеваемость сифилисом в РСО - А по районам за пять лет (таблица 3, рисунок 6), можно отметить, что она носит циклический характер, во всех районах и в г. Владикавказе наблюдается её нестабильность, со «взлётами» и «падениями». И только в Моздокском районе, несмотря на высокие цифры, идет постоянное, из года в год снижение случаев сифилиса. С 1999 г. по 2003 г. стало заметно изменение удельного веса различных форм сифилиса в сторону увеличения раннего (с 43,5% до 56,0%), появление позднего скрытого сифилиса (5,8%) и врожденного сифилиса (1,7%). С 2001 г. отмечены случаи нейросифилиса (таблица 4, рисунок 7). В структуре заболеваемости превалируют скрытые формы сифилиса, которые характеризуются полным отсутствием симптоматики и выявляются только по положительным серологическим реакциям при обследовании крови в поликлиниках, стационарах, при устройстве на работу и различных профилактических осмотрах.

Основную массу больных сифилисом составляют лица обоих полов (таблица 5) в возрасте от 20 до 39 лет (таблица 6, рисунок 8). Однако в последнее время отмечается тенденция к увеличению удельного веса лиц в возрасте свыше 40 лет. По семейному положению основную массу больных составляют холостые - 65 % (из них - разведенные 5 %), состоящие в браке повторно (13,0%) , т.е. семья является одним из сдерживающих факторов в предупреждении случайных половых связей. Анализ социального состава больных сифилисом показал, что основная масса больных (78,9%) представлена нигде не работающими лицами, что в значительной мере затрудняет проведение противоэпидемических мероприятий. Среди причин, влияющих на заболеваемость, необходимо отметить возросшую сексуальную активность подростков, увеличение числа вне- и добрачных половых связей вследствие возросшей сексуальной раскрепощённости населения, коммерциализацию интимных отношений, широкое распространение порнографии, наркомании и т. д.

Анализируя случаи вспышек заболеваемости сифилисом в различных районах РСО-А, можно отметить формирование очагов в большинстве случаев вокруг женщин, чаще приезжих, являющихся первоисточником, так называемое «ядро заболеваемости». Это обычно социально негативные лица, неработающие, ведущие беспорядочную половую жизнь, неженатые или разведённые, неоднократно болеющие ИППП, злоупотребляющие алкоголем и наркотиками, ранее судимые, без определённого места жительства.

Вокруг «ядра» формируется наиболее многочисленная группа лиц, в целом социально адаптированных, семейных, работающих, но, в силу своего низкого культурного и образовательного уровня, неумения организовать свой досуг, они характеризуются бытовым пьянством, ранним началом половой жизни, алкогольным опьянением в момент заражения, промискуитетом, многочисленными внебрачными половыми связями, отсутствием целостных сведений о клинике и профилактике венерических болезней. По профессиональному признаку это чаще работники сельского хозяйства, работники общественного питания и торговли. И, наконец, третью группу составляют лица с социально позитивным поведением. Они могут состоять в браке с лицами из первых двух групп. Внебрачные половые связи у них, как правило, не отмечаются. В профессиональном плане эту группу составляют инженерно-технические работники, студенты и служащие. С учётом особой эпидемической значимости лиц первой и второй групп, страдающих алкоголизмом и бытовым пьянством, наличия повторных заражений венерическими заболеваниями, наличия в анамнезе более 4 половых контактов в течение последних 6 месяцев, считаем, что данные группы больных должны находиться на специальном учёте с выделением их в особую диспансерную группу. После окончания лечения при клинико-серологическом контроле этой группе рекомендуем увеличить кратность осмотров (без увеличения срока диспансерного наблюдения), даже после негативации КСР.

В СССР кожно-венерологическая служба, поддерживаемая законодательными актами, достаточно эффективно проводила работу по выявлению и лечению больных ИППП и, в частности, сифилиса, но воспринималась эта деятельность как карательная. В современных условиях изменения, происходящие в стране, коснулись и кожно- венерологической службы, которой необходимо восстановить атмосферу доверия населения.

Есть причины умышленного сокрытия половых контактов: опасение разглашения тайны заболевания, опасение мести, желание оградить партнёра от неприятностей, чувство стыда, большая разность в возрасте между партнёрами, физическая или психическая неполноценность полового партнёра, гомосексуальная связь, инцест, уверенность в невиновности партнёра в силу его семейного положения или принадлежности к декретированным контингентам. Нежелание встречаться с половыми партнёрами в стационаре приводит к тому, что больные дают заведомо ложную информацию о них, а зачастую сообщают о них только по выписке из стационара или находясь на кли-нико-серологическом контроле в диспансере. Врачам дерматовенерологам необходимо умение вести неоднократные диалоги с любым пациентом, сохраняя уважение к его личности, вызывая его на откровенность. С целью повышения эффективности диспансерной работы по выявлению половых контактов к беседам с пациентами привлекаются заведующий отделением, зав. оргметодотделом, юрист, главный врач. Большое значение имеет создание фототек больных сифилисом, взаимосвязь с администрациями КВД соседних республик и областей.

Для активизации выявления больных сифилисом, наряду с троекратным серологическим обследованием беременных женщин, целесообразным является и двукратное обследование их мужей, в частности, при получении декретного отпуска.

В данное время все мигранты и вынужденные переселенцы, прибывающие в республику или получающие права на прописку, проходят обследование в СОРКВД.

Необходимо обследование на сифилис всех больных с лекарственной непереносимостью, особенно если она сопровождается подъёмом температуры, с эрозивно-язвенными процессами в полости рта и прямой кишки, с паховым лимфаденитом, воспалительными процессами гениталий, эрозиями шейки матки и уретритами.

С работниками МВД проводятся совместные рейды по притонам с выявлением социально-негативных лиц, основных носителей и распространителей сифилитической инфекции.

Поголовная вассерманизация пациентов лечебных учреждений, совместные консультации и консилиумы врачей всех специальностей с дерматовенерологами, профилактические осмотры организованных слоёв населения, чтение лекции, активное использование средств массовой информации являются теми факторами, с помощью которых и выявляется большинство больных сифилисом. Так, процент активно выявленных больных сифилисом в РСО-А с 1999 года по 2003 год колебался от 84,1% до 89,4%. По Российской Федерации эта цифра за тот же период находилась в пределах от 60% до 70%.

Во всех районных ЦРБ и лечебных учреждениях г. Владикавказа налажено взятие крови на реакцию микропреципитации у всех пациентов. У находящихся в гинекологических, неврологических, офтальмологических, кардиологических стационарах, пациентов женских консультаций, абортариев и рожениц родильных домов кровь исследуется на МРП, реакцию Вассер-мана (КСР). Но при проверке исполнения действующих приказов обнаруживается, что:

нет 100% вассерманизации в стационарах и поликлиниках республики;

не полностью (ИФА, ПЦР, культуральная диагностика) обследуются лица, страдающие воспалительными заболеваниями мочеполовых органов, бесплодием;

не во всех случаях беременные становятся на учёт в первой половине беременности (случаи врождённого сифилиса) и не всегда соблюдается кратность серологических обследований;

имеет место лечение ИППП специалистами других профилей (гинекологами, урологами и т.д.), без привлечения к обследованию половых партнёров;

не часто проводятся совместные семинары представителей кафедры дерматовенерологии, врачей дерматовенерологов со специалистами терапевтами, акушер-гинекологами, педиатрами и неонатологами, офтальмологами, кардиологами, рентгенологами, невропатологами и т.д.;

6) не все частнопрактикующие врачи заключают договор с СОРКВД для проведения лабораторной диагностики, подача сведений о количестве пролеченных больных ИППП продолжает вызывать сомнение;

остаётся очень низкой цифра выявленных больных сифилисом в смотровых кабинетах, урологами республики и при проф. осмотрах (таблица 7, рисунок 9);

недостаточна санитарно-просветительская работа среди разных сло-ёв населения по профилактике ИППП, половому воспитанию молодёжи и т. д. с привлечением средств массовой информации.

В централизованной лаборатории Северо-Осетинского кожновенероло-гического диспансера во исполнение приказа МЗ № 87 с 2001 г. для исследования на сифилис широко применяются: тест быстрых плазменных реагинов (RPR), метод иммуноферментного анализа (ИФА), как скрининговый, трепо-немные подтверждающие тесты - реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ), позволившие выявить большее количество поздних форм сифилиса: в 2000 г. поздний скрытый сифилис был в 2-х, в 2002 г. - уже в 4-х случаях; в 2000 г. нейросифилис не обнаруживался, а в 2002 г. - уже диагностировали 7 случаев этой тяжёлой формы болезни.

Необходимо отметить, что в 12,4% случаях при установлении диагноза раннего скрытого сифилиса и 50,0% - при нейросифилисе при отрицательной реакции Вассермана ИФА была резко положительной.

Сложившаяся эпидемиологическая ситуация, отдельные политические, демографические особенности нашей республики диктуют органам здравоохранения необходимость активизации мероприятий и совершенствование форм и методов по борьбе с сифилисом и другими ИППП. В любой момент нестабильность в соседних республиках может вылиться в новый поток мигрантов с новым всплеском заболеваемости.

При этом лабораторные методы играют существенную роль в системе этих мероприятий. Расширение арсенала лабораторных методов и особенно за счет экспрессных, с помощью которых возможно исследовать большое количество людей за короткий промежуток времени и получить достоверную информацию о сложившейся ситуации по этой инфекции, даст возможность принимать оперативные меры в борьбе с заболеваемостью сифилисом.

Глава 4. РАЗРАБОТКА ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО СУСПЕНЗИОННОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА

Усиливающаяся в последние годы тенденция использовать в качестве носителей антигенов и антител инертные синтетические материалы привела к оживлению интереса к реакции агглютинации латекса (РАЛ) и широкому изучению возможностей её применения в диагностике. В качестве матриц для приготовления иммунореагентов применяли различные носители: полистироловые, поливинилтолуеновые, полиметакрилатные, полиакролеиновые. На различных моделях бактериальных, грибковых, паразитарных антигенов детально отработаны условия сенсибилизации латекса иммунобиологически активными субстратами, стабилизации суспензий сенсибилизированного латекса и стандартизации латексовых ди-агностикумов (Лукин Ю.В., Бахарев В.Н., Заиченко А.С. и др., 1985; Лукин Ю.В., Трифонов В.Д., Туркин С.И. и др., 1985; Ерохин Е.П., 1991; Юдицкая Н.М., 1991; Воробьева З.Г., Фокина Е.Н., 1992; Ковалева Л.Н., 1992; Базиков И.А., 2000; Касторная М.Н., 2003; Parks D., Braun W., Oi V., 1979; Kaplan M., Galef T, Bercovici T., 1983; Farchy C.T., Hunter T.F., Larsen S.A. et al., 1984; Margel S., Wiesel T., 1984; Cox D.L., Chang P., Mc Dovall A.M et al., 1992; Matsumoto M., Ishikawa F., Matsubayashi T. et al., 1993; Young H., Moyes A. et al., 1998 и др.).

По мнению Ю. В. Лукина (1986), метод латексной агглютинации с использованием окрашенных полиакролеиновых микросфер не уступает по чувствительности и наглядности методу гемагглютинации и иммунофер-ментному анализу. Химические свойства латексных микроносителей относительно постоянны и поддаются более легкой и точной характеристике по сравнению с поверхностными свойствами наружной мембраны эритроцитов, которые широко варьируют в зависимости от источника выделения. Поэтому латексные микроносители обеспечивают более воспроизводимые результаты по сравнению с эритроцитарными и могут с успехом их заменять в этом виде иммуноанализа.

К латексам, используемым для приготовления диагностических препаратов, предъявляют достаточно высокие требования. У них должно отсутствовать неспецифическое связывание с клетками, они должны иметь активные функциональные группы для связывания биологических лиган-дов, быть монодисперсными и стабильными в физиологическом растворе. Кроме того, для расширения областей их биохимического применения в такие латексные системы можно вводить специальные добавки (Rembaum A., Dreuer W., 1980). Преимущество полиакролеиновых систем перед другими микросферами обеспечивается наличием альдегидных групп на поверхности латексных частиц, легкообразующих ковалентную связь с аминогруппами белков, а также низкий уровень неспецифических взаимодействий с клеточными мембранами. В состав полиакролеинового латекса нет необходимости добавлять детергенты, так как однородность суспензии обеспечивается его природой (Воробьева З.Г., Фокина Е.Н., 1992).

В данном разделе работы изложена биотехнология приготовления трепонемного суспензионного латексного антигенного диагностикума для реакции агглютинации и дана оценка его диагностической ценности. Изготовление препарата осуществляли в соответствии с методикой, разработанной И.А.Базиковым (2000), в нашей модификации, используя в качестве полимерной матрицы акролар К, полученный из института биоорганической химии им. Шемякина. Гомогенные частицы латекса правильной сферической формы, окрашенные в розовый цвет, имели средний диаметр (1,2±0,1) мкм.

Лигандом служил комплексный антиген, полученный по разработанной нами биотехнологической схеме, состоящий из коммерческого ультраозвученного трепонемного антигена (УЗТА) для РСК производства ФГУП «Аллерген» (г.Ставрополь), подверженного специальной очистке, и цетавлонового супернатанта, представляющего собой поверхностные антигены трепонем, извлеченные нами по методике M.C.Blake, E.C.Gotschlich (1982), в соотношении 2:1. При производстве УЗТА используют штаммы культуральных бледных трепонем, которые относятся к трем иммунологическим группам по классификации Р.Р.Гельтцера и Л. В. Зебницкой (1950). Для извлечения антигена применяют водно-солевую экстракцию и ультразвуковую дезинтеграцию. Водно-солевые экстракты обладают наиболее сложным макромолекулярным составом, и в них обнаруживаются в тех или иных количествах все выявляемые у того или иного микроба антигены (Бельская Н.А., Митина В.С., Вейнблат В.И., 1970, 1972; Вейнблат В.И., Бельская Н.А., Митина В.С., 1971; Вейнблат В.И., Каминский В.В., Орлова Л.С., 1972; Вейнблат В.И., 1974; Афанасьев Е.Н., 1984, 2000; Тюменцева И.С., 1996 и др.). Механизм разрушения микробной клетки ультразвуковым дезинтегратором заключается в процессе образования и захлопывания кавитационных полостей, сопровождающихся чередованием высоких давлений и разрежений (Эльпинер И.Э., 1955, 1975; Гуревич Г.А. Кудрявцев Н.А., Фихте Б.А. и др., 1972). Под воздействием ультразвуковых волн прежде всего наступает разрушение клеток микробов, а действие ультразвука на химические вещества, находящиеся в клетках, проявляется гораздо медленнее, и это обеспечивает возможность получения различных активных комплексов микробной клетки в наименее измененном виде (Благовещенский В.А., Степанчук-Рудник Г.И., Жулина Л. В. и др., 1961). УЗТА, являясь поливалентным антигеном, состоит из протеинового, полисахаридного и липоидного антигенов (Овчинников, Н.М. Беднова В.М., Делекторский В.В., 1987).

В связи с тем, что УЗТА содержит в своем составе групповые антигены (его используют для удаления из исследуемых сывороток групповых антител, например, при постановке РИФ-абс), для повышения его специфичности мы подвергали этот антиген очистке по схеме, представленной на рисунке 10.

Этап иммуносорбции перекрестно-реагирующих антигенов T.pallidum из УЗТА проводили с помощью твердофазного полиакрила-мидного сорбента, полученного на основе иммуноглобулинов сыворотки донорской крови человека и специфических иммуноглобулинов, выделенных из гипериммунной кроличьей сыворотки против корпускулярного антигена, полученного из биомассы T.phagedenis (штамм Рейтера) (рисунок 11). Указанную сыворотку получали гипериммунизацией кроликов-продуцентов по схеме, представленной в таблице 8. Способ иммунизации заключался в следующем: животным трехкратно с интервалом в 7 дней в увеличивающихся дозах (5х10⁹ м.к., 5х10¹⁰м.к., 5х10¹² м.к' в 1 мл физиологического раствора) вводили 0,5 мл антигена внутривенно и одновременно в подколенные лимфоузлы, подушечки задних лап, подушечки передних лап (по 0,5 антигена с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ). В эти же сроки кроликам внутримышечно инъецировали по 0,5 мг иммунокоррек-тор - тималин. Через 7 дней после последнего введения антигена проводили тотальное кровопускание

Иммуноглобулины из полученных сывороток крови выделяли с помощью ПЭГ-6000 по A.Polson, G.M.Potgieter, J.T.Largier et а1 (1964).

Приготовление твердофазного иммуносорбента и процесс сорбции проводили следующим образом. Иммуноглобулины инсолюбилизировали путем механического включения их в решетку полиакриламидного геля: в (9±0,1) мл Ig ( на каждый вид иммуноглобулинов иммуносорбент готовили отдельно) растворяли ( 600±1) мг акриламида, (200±1) мг N, N¹ - метилен-бисакриламида и 0,2 ТЕМЕД. К полученной смеси добавляли (5±0, 1) мг персульфата аммония, растворенного в (1±0, 05) мл Ig. Указанную операцию проводили при температуре (4±1) ⁰С, тщательно перемешивая.

Таблица 8. Схема иммунизации кроликов

Обозначения: м.к. - микробные клетки; в/в - внутривенно; в/м - внутримышечно ПАФ - полный адъювант Фрейнда полиакриламидного геля, соответствующие каждому Ig, измельчали, продавливая через фильеры, получая мелкие гранулы сорбента одинаковой величины. После этого сорбент промывали 10-кратным объемом раствора калия роданистого в концентрации 0, 3 моль/л путем центрифугирования при 3000-4000 g в течение 5 мин. Для удаления несвязавшегося белка и роданистого калия иммуносорбенты отмывали 10-кратным объемом забуфе-ренного 0, 9 % раствора хлорида натрия путем центрифугирования при указанном режиме. Исчезновение ионов CNS определяли качественной реакцией 1 % раствором треххлорного железа. Иммуносорбенты, смешанные в равных количествах, добавляли в УЗТА из расчета 10 мл сорбента на 20-40 мл антигена и инкубировали при температуре (37±1) ⁰С в течение 20 ч и при температуре 22 ⁰С 4 ч. Антиген отделяли центрифугированием. Для повторного использования иммуносорбента проводили его регенерацию 3 М раствором роданистого калия или натрия, обеспечивающую диссоциацию комплекса «иммобилизованный антиген - антитело», с последующим отмыванием физиологическим раствором. Сорбент хранили при температуре плюс 4 ⁰С с добавлением тимеросаля в концентрации 1:10000. Такой сорбент, регенерируя, можно использовать до 20 раз.

Белковый компонент переосаждали (NH₄)₂SO₄ до 80 % насыщения и очищали на колонке с сефадексом G-100 с последующим элюированием 0, 1 М фосфатным буферным раствором. Белковый компонент очищенного антигена выходил одним пиком (рисунок 12). Фракции 8-21 собирали, концентрировали до 5 мг/мл белка с помощью ПЭГ- 6000 в диализной трубке «Visking».

Для извлечения поверхностных антигенов из культуральных бледных трепонем штаммов V, VI, VII, VIII IX и Рейтера применяли цетил-триметиламмонийбромид (цетавлон)- катионное поверхностно-активное вещество, обладающее не только экстрактивными, но и антисептическими свойствами, используя методику M.C.Blake, E.C.Gotschich (1982). Для комплексного трепонемного антигена (см.рисунок 10) использовали супернатант, который в отличие от осадка является наиболее специфическим антигенным полимерным комплексом, включающим липид, полисахарид в сочетании с протеинами и нуклеиновыми кислотами (Rossettim O.L., Arese N.L., Boschiroli M.L. et al., 1996).

Рисунок 12 . Хроматограмма очищенного УЗТА

Примечание: колонка h - 650 мм, r - 12, 5 мм, V пробы - 5 мл, элюэнт 0, 1 М ФСБ, рН 7, 2.

Для получения качественного латексного диагностикума по биотехнологической схеме, представленной на рисунке 13, необходимо было подобрать эмпирическим путем оптимальные условия сенсибилизации матрицы.

При отработке концентрации лиганда в работу брали следующие дозы комплексного трепонемного антигена: 0,05 мг; 0,1 мг; 0,15 мг; 0,20 мг;

0,30 мг.

В процессе работы изучена зависимость взаимодействия лиганда с частицами латекса от экспозиции (1 ч, 1,5 ч, 3 ч, 5 ч). Для эффективной сенсибилизации латекса с антигеном необходима экспозиция, равная 3 ч, при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. При изучении

Размещено на http://www.allbest.ru

Рисунок 13. Принципиальная технологическая схема изготовления суспензионного трепонемного диагностикума для РАЛ

роли температурного фактора, влияющего на связывание лиганда, мы использовали следующие параметры: 22 ⁰, 37 ⁰, 45 ⁰ . Установлено, что температура 22 ⁰С является оптимальной для взаимодействия латекса с антигеном.

В процессе выполнения работы апробированы различные диапазоны рН среды: 4,0; 5,0; 6,0; 7,2, 7,4. Прочное связывание лиганда с матрицей происходит при рН 7,2.

Таким образом, нами отработаны оптимальные условия сенсибилизации латексных микросфер комплексным трепонемным антигеном: 0,20 мг лиганда соединяли с 2 мл 2 % полимерного носителя. К смеси добавляли 2 мл 0,9% раствора натрия хлорида, рН 7,2. Сенсибилизацию проводили в течение 3 ч при температуре 22 ⁰С на магнитной мешалке. Далее суспензию осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 3-4 мин и дважды отмывали от несвязавшегося антигена.

Для стабилизации трепонемного полимерного латексного диагно-стикума мы использовали метод лиофилизации, который широко применяется для практических целей как наиболее надежный ( Бланков Б.И., Клебанов Д.Л., 1961; Тинкер А.И., 1971; Голубев Л.Г., Сажин Б.Е., Валашек Е.Р., 1978; Мирошниченко А.И., Лопаткин О.Н., Жарникова И.В. 1987; Жарникова И.В. 2003,2004).

Процесс лиофилизации заключается в следующем: готовый препарат со стабилизирующей жидкостью (защитная среда) замораживается при температуре минус 40-70⁰ С. После чего препарат помещают в сушильную камеру, где создается вакуум при помощи вакуумного насоса, при этом влага испаряется, минуя переход в жидкую фазу, непосредственно изо льда, в результате чего структура препарата не нарушается. При высушивании методом сублимации создаются условия, при которых вещество претерпевает минимальные биохимические изменения. Возможность денатурирования биологически активных веществ этим методом сводится к минимуму, благодаря тому, что замораживание блокирует растворение веществ. При высушивании под вакуумом скорость окислительных процессов значительно снижается в высушиваемом материале, а интенсивность процесса высушивания определяется разностью давлений пара над препаратом.

Примененяют различные среды высушивания, защищающие диагно-стикумы при замораживании и лиофилизации, обеспечивающие их мелкопористую плотную структуру и сохраняющие активность препаратов: са-харозо-декстрановые, сахарозо-поливинилпирролидоновые, лактозные, желатиновые и др. Защитные среды подразделяются на две группы: к первой группе относятся среды, в которых снижается интенсивность обезвоживания в период лиофилизации в связи с увеличением концентрации веществ. В эту группу входят: глутамат натрия, лактоза, сахароза. Ко второй группе относят среды, которые не изменяют скорость отдачи воды при высушивании. Этими свойствами обладает крахмал, декстран, желатин, поливинилпирролидон и другие. Но наилучшими средами считают среды, полученные при комбинировании веществ 1 и 2 групп.

Подготовку препарата к лиофилизации осуществляли следующим образом. Отмытый диагностикум суспендировали в половине первоначального объема стерильной защитной среды, в состав которой входили по 5 г желатины и сахарозы, растворённые в 100 мл дистиллированной воды. Препарат разливали в ампулы ШПВ-6 по 1 мл. Для замораживания использовали лиофильное устройство НС 700/50 «Frigera», ЧССР. Ампулы с ди-агностикумом выдерживали в морозильной камере при температуре минус (40±1)⁰С (19±1) ч. Лиофилизацию проводили на установке для сублимационной сушки ТГ-5 (ГДР).

Время режима сублимационного высушивания составляло (24 ± 2) часа, при котором температура конденсатора была доведена до минус 40⁰ С. При рабочем давлении в сублимационной камере 35- 40 Па, когда температура препарата достигала 5-10⁰ С, через 14- 16 часов включали подогрев и досушивали препарат до температуры 25⁰ С, выдерживали при этой температуре 4-5 часов для достижения величины остаточной влажности 2- 4 % (рисунок 14).

Ампулы запаивали на газокислородной горелке. Контроль качества препарата (растворимость, цветность, потеря в массе при высушивании, герметизация) осуществляли в соответствии с методиками, изложенными в ГФ СССР, XI изд., том 1 и МУК 4.1/4.2.588-96.

При изучении чувствительности и специфичности диагностикума использовали два варианта постановки РАЛ: на стекле, как скрининг на сифилис (качественный тест), и титрование сывороток в микропланшетах (количественный тест). Для этого использовали 96-луночные микропланшеты для иммунологических реакций из полистирола отечественного и импортного производства.

Исследуемые сыворотки инактивировали на водяной бане (30±2) мин при температуре (56±1)⁰С. На обезжиренное стекло наносили сыворотки в следующих дозах - 0,04 мл; 0,02 мл; 0,01 мл и 0,03 мл - контроль сыворотки. К первым трем дозам сыворотки добавляли по одной капле диагностикума. К последней дозе сыворотки добавляли 0,03 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Сыворотки осторожно смешивали с диагностикумом стеклянной палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Через 5 мин учитывали результаты реакций. При наличии в пробе специфических антител к трепоне-мам антиген взаимодействовал с ними, что приводило к агглютинации, которая становилась видимой, благодаря присутствию окрашенных латексных частиц (положительный результат). Реакция учитывалась невооружённым глазом или с помощью микроскопа (рисунок 15).

Результат выражался числом плюсов от 1 до 4 в зависимости от интенсивности микроагглютинации. Появление крупных агрегатов расценивали как положительный результат (4+; 3+), средней величины и мелких -как слабоположительный результат (2+; В сомнительных случаях ориентировались на контроль - суспензия оставалась гомогенной - равномерное распределение латексных частиц.

Размещено на http://www.allbest.ru

Методика постановки РАЛ в планшетах заключалась в следующем: в каждую лунку вносили по 50 мкл раствора белкового стабилизатора, который специально готовили для постановки РАЛ. Технология его изготовления состояла в следующем: 25 мл белка куриного яйца смешивали на магнитной мешалке с 75 мл 1,6 % раствора карбоната натрия до получения гомогенного раствора. Смесь фильтровали через 8 слоев марли, смоченной дистиллированной водой, помещали на водяную баню и выдерживали при периодическом помешивании 10-12 мин с момента закипания воды. Смесь охлаждали и нейтрализовали 1Н соляной кислотой до рН 7,07,2, фильтровали через 8 слоев марли, повторно выдерживали на кипящей водяной бане в течение 10-12 минут, разливали по 1 мл в ампулы и лио-фильно высушивали. Перед употреблением белковый стабилизатор разводили 1:100 забуференным физиологическим раствором, рН 7,2.

Анализируемый образец сыворотки вносили в первую лунку планшета и раститровывали шагом 1:2.В две последние лунки каждого ряда не вносили исследуемый материал. Они служили контролем оседания суспензии в растворе. Далее в каждую лунку планшета вносили по 1 капле диагностикума. Микропланшеты встряхивали до равномерного распределения суспензии и оставляли на столе при температуре 22 ⁰С. Учет проводили через 3-6 часов. В случае положительной реакции суспензия ди-агностикума равномерно устилала дно лунки в виде «зонтика». При отрицательном результате реакции и в опыте, и в контроле - суспензия диаг-ностикума выпадала в виде «пуговки» или узкого кольца с ровным краем (рисунок 16).

По вышеописанной технологии нами изготовлено 10 серий диагно-стикума. Оценка их диагностической ценности проводилась на базе централизованной лаборатории Северо-Осетинского РКВД (акт о внедрении от 23.09.2004 г.). Для исследования были взяты сыворотки крови 416 стационарных больных до лечения и после лечения с различными диагнозами: сифилис первичный серопозитивный (Lues premaria seropositiva), сифилис вторичный свежий (Lues secundaria recens), сифилис вторичный рецидивный (Lues secundaria recidive), сифилис скрытый ранний (Lues latens prae-cox), сифилис скрытый поздний (Lues latens tarda), нейросифилис ранний (Neurosyphilis preacox) в сравнении с КСР (микрореакция преципитации, реакции Вассермана , ИФА, РНГА, РИФ). Контрольной группой служили сыворотки крови 167 лиц, свободных от сифилитической инфекции.

На основании проведенных испытаний установлено, что изготовленный по разработанной нами технологии трепонемный суспензионный антигенный диагностикум позволяет проводить реакцию агглютинации латекса по чувствительности, сопоставимую с такими трепонемными тестами, как РПГА,ИФА, РИФ, в то же время РАЛ превосходит реакции Вассермана и МР по этому показателю (таблицы 9,10). При сравнительном изучении специфичности РАЛ и МР (таблица 11) достоверно установлена его высокая специфичность.

Таким образом, простота постановки, демонстративность реакции, низкая стоимость анализа свидетельствуют о целесообразности его применения в практическом здравоохранении, особенно при проведении массовых обследований больных на сифилис.

Примечание: числитель - положительные результаты; знаменатель - процентное соотношение; * знаменатель - отрицательные результаты в РВ

Примечание: числитель - положительные результаты; знаменатель -процентное соотношение

Глава 5. РАЗРАБОТКА ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГ-НОСТИКУМА С КОЛЛОИДНЫМ СЕРЕБРОМ ДЛЯ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗА

В последние годы в иммунодиагностике четко просматриваются подходы, направленные на расширение круга маркеров, повышающих специфичность и чувствительность определения, сокращающих время анализа, обеспечивающих продолжительность сохранения свойств иммунодиагности-кумов и снижение себестоимости тест-систем (Коллинз У.П., 1991). Во многом эти задачи могут решаться подбором более эффективных меток, поскольку наиболее часто используемый ферментный маркер - пероксидаза хрена - имеет ряд недостатков, среди которых: относительно сложная процедура выделения и очистки функционально активного фермента и обусловленная этим значительная стоимость полученного маркера и, соответственно, - диагностикума на его основе; значительная (30-50 %) потеря активности фермента и лиганда в процессе получения конъюгата путем ковалентного связывания этих реагентов (Кривеня В.Я., Елигулашвили Р.К., 1983); необходимость обеспечения в процессе анализа строгих физиологических условий для нормального функционирования фермента (Кривеня В.Я., Елигулашвили Р.К., 1983; Березин И.В., Угарова Н.Н. Киршенгольц Б.М., 1975). Отмеченные недостатки послужили основанием для развертывания работ по изысканию хромогенных маркеров для иммунохимических реакциий.

Поиски доступных, дешевых каталитически активных металлов, способных с высокой чувствительностью выявляться «физическим проявлением» обратили внимание на серебро. Имеющиеся единичные работы в доступной литературе свидительствуют, что золь каллоидного серебра обладает рядом положительных характеристик, позволяющих использовать его в качестве маркеров специфических иммунных реагентов в иммунохимическом анализе (Патент RU №2092853, 1997; Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Кали-новский А.И., 2001; Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Меринов С.П. и др.,

2002; Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.П., 2002; Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.П., Загоскина Т.Ю., 2002; Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Меринов С.П., 2004).

Нами впервые разработана биотехнология изготовления серебросо-держащего антигенного трепонемного диагностикума для дотиммуноанализа (ДИА), которая включает следующие этапы: получение водной взвеси частиц маркера с заданной дисперсностью; конъюгирование маркера со специфическим к определяемому лиганду иммунореагентом; стабилизация конъюгатов и блокирование свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера высокомолекулярными биополимерами; коррекция водородного показателя водной взвеси иммунодиагностикума до параметров, необходимых для осуществления иммунохимической реакции (рисунок 17).

Получение высокодисперсной водной взвеси маркера может быть осуществлено восстановлением нитрата серебра цитратом или боргидридом (предпочтительнее) натрия. В процессе получения золей серебра мы учли рекомендацию М.И. Шалкаускаса, А.Ю. Вашкялиса (1977) и А.Г.Полтавченко с соавт. (1998) о том, что для восстановления азотнокислого серебра боргидридом натрия необходимо брать избыток последнего, поскольку только 20-30 % боргидрида участвуют в восстановлении металла, остальной за время реакции подвергается гидролизу. Кроме того, избыток бор-гидрида гарантирует полное восстановление ионов серебра из раствора, что предотвращает на последующих этапах приготовления иммунозоля связывание с иммунореагентами и негативное влияние на их специфическую активность (Розовский Г.И., 1971). Как показал А.Г.Полтавченко с соавт. (1998, 2002), наиболее перспективным для использования в качестве маркера яв-ляя*ется золь, полученный из 0,02% водного раствора нитрата серебра (средний размер частиц около 9 нм). Он стабилен, содержит сферические частицы с поверхностью около 300 нм , способен обеспечивать высокую чувствительность выявления «физическими проявителями» со значительным диапазоном линейной зависимости оптической плотности от концентрации золя и сразу после приготовления имеет рН около 9,0, оптимальный для сорбции белкового лиганда.

Конъюгирование маркера со специфическим к определяемому лиган-ду иммунореагентом может быть осуществлено физической сорбцией или с использованием промежуточных связующих реагентов. Вследствие значительной площади поверхности частиц маркера (с поверхностью частиц золя серебра размером 1-2 мкм могут связываться сотни тысяч молекул типа IgG) могут быть использованы иммунореагенты с относительно невысокой специфической активностью, поскольку достаточный уровень активности иммунодиагностикума может быть достигнут адсорбцией на частице маркера от нескольких сотен до нескольких тысяч активных молекул специфического иммунореагента. Больший уровень специфической нагрузки не дает выигрыша в чувствительности анализа и, более того, в ряде случаев повышает неспецифический фон определения. При отработке процедуры конъю-гирования хорошие результаты получаются в процессе связывания маркера с иммунореагентом путем его дробного введения в смесь.

Важной характеристикой серебряных иммунозолей (золей, частицы которых сорбционно связаны с иммунореагентами) является их агрегативная устойчивость в процессе хранения и при проведении анализа . Агрегацию (коагуляцию) вызывают любые электролиты, но с заметной скоростью. Она начинается лишь при достижении определенной пороговой концентрации -так называемого «порога быстрой коагуляции».

В качестве стабилизаторов, предотвращающих агрегацию частиц и защищающих их от коагулирующего действия электролитов, используют высокомолекулярные природные или синтетические соединения и поверхностно активные вещества. Они связываются с поверхностью частиц посредством нековалентных связей, в основном, электростатической и гидрофобной природы, и образуют стабильные комплексы (Batteiger В., Newhall W.J., Jones R.B., 1982; Raska I., 1988).

Стабилизацию полученного конъюгата и блокирование свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера производят одним из известных высокомолекулярных соединений или их комбинацией.

Известно, что ионы серебра обладают бактериостатическим действием, основанным на образовании нерастворимых комплексов. Это приводит к изменению вторичной структуры белковой молекулы, что вызывает необратимую денатурацию белка. В реакцию вступают карбоксильные группы кислых - кислотных остатков: чем больше ионизированных карбоксильных групп на молекуле белка, тем активнее она денатурируется ионами серебра. С учетом вышеизложенного при работе с серебряными иммунозо-лями вытекают два практически важных следствия. Во-первых, поскольку в коллоидном растворе всегда присутствуют свободные ионы серебра, они могут денатурировать молекулы иммунореагента. Чтобы избежать этого, стабилизирующий раствор должен содержать более кислый белок. Во-вторых, надежды на бактериостатические свойства серебряного золя при хранении им-мунодиагностикума не всегда бывают оправданы, поскольку следовые количества ионов серебра, достаточные для инактивирования микроорганизмов в чистой воде, в иммунозоле расходуются на взаимодействие с кислыми белками стабилизирующего раствора. В связи с этим для длительного хранения необходимо вводить в состав диагностикума консервант, например, азид натрия.

Связывание белков с частицами золя тяжелых металлов в значительной степени является необратимым, однако следует учитывать, что разные участки поверхности коллоидных частиц металла обладают неодинаковой связующей способностью, а некоторые участки поверхности золей серебра вообще не связываются с белками (Джеймс Х., 1980; Raska I., 1988). Отсюда часто при выборе дозы иммунореагента исследователи ориентируются не на теоретические расчеты, а на эмпирически найденные значения.

Золи серебра мало контрастны и с увеличением размеров частиц от 5 до 100 нм изменяют окраску от светло-желтой до темно-бурой. Окраску, обусловленную непосредственно накоплением частиц золя, удается визуально обнаружить только при значительных скоплениях крупных частиц, дающих более интенсивный цвет на белых подложках. Высокодисперсные золи даже при их значительном накоплении на нитроцеллюлозной мембране (НЦМ) трудно визуально зарегистрировать, поэтому для учета результатов имму-ноанализа необходимо усиление сигнала.

Учитывая упомянутые выше методические приемы, мы провели ряд исследований по отработке биотехнологии изготовления трепонемного им-мунодиагностикума с частицами золя серебра.

Золь серебра получали восстановлением азотнокислого серебра бор-гидридом натрия. Для этого к 5 мл 0,05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливали равный объем 0,02% водного раствора азотнокислого серебра. Перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин.

При конструировании диагностикума использовали комплексный тре-понемный антиген ( глава 4).

Прежде чем комплексировать золь с лигандом, необходимо было определить количество последнего, способного стабилизировать золь, используя флокуляционный тест. Для расчета минимального количества антигена в 10 лунок планшета для РПГА вносят по 50 мкл дистиллированной воды и титруют в них (с шагом 2) белковую суспензию. Затем в каждую лунку добавляют по 250 мкл золя, перемешивают и через 5 мин вносят по 250 мкл 10 % раствора натрия хлорида. Спустя 2-3 минуты визуально, по цвету золя, учитывают результат. Даже слабое отклонение цвета от соломенно-желтого свидетельствует о нестабильности комплекса. Для расчета оптимального количества препарата мы следовали рекомендациям I.Raska (1988). Например, в случае изменения цвета в 6-й лунке микропланшета при добавлении раствора хлорида натрия считаем, что это разбавление образца 1:32. При этом объем белковой суспензии 50 мкл/32 будет стабилизировать 250 мкл золя. Таким образом, для приготовления 10 мл диагностикума необходимо 50/32 х (10000 мкл/250 мкл) = 62,5 мкл. Для большей надежности увеличиваем объем белка на 20 %, добавляя таким образом в 10 мл золя 62,5 + 20 % = 75 мкл белка. Для длительного хранения комплекса необходима его консервация азидом натрия.

Наиболее эффективно стабилизировал золь серебра антиген в количестве 375 мкг на 10 мл золя. Исходя из этого, для приготовления диагности-кума к 1 мл антигена (375 мкг белка) при постоянном интенсивном перемешивании добавляли 5 мл золя серебра. После 10-минутного перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре в раствор добавляли следующую порцию золя - 3 мл, а спустя 10 мин - еще 2 мл золя и 2 мл 10 % водного раствора БСА (для блокирования свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера). Через 30 мин перемешивания диагностикум стабилизировали внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 1 % БСА, 10% НЛС и 0,04% азида натрия. Приготовляемый препарат дополнительно интенсивно встряхивали в течение 30 минут, разливали в ампулы ШПВ-6 по 2 мл. Срок хранения диагностикума - 6 месяцев.

Подбор условий постановки и учет реакции

Постановку реакции осуществляли традиционным для дот-иммуноанализа способом. Сыворотки крови перед исследованием инактиви-ровали при 56 ⁰С в течение 30 мин, разводили забуференным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,2 с 0,5% БСА в 200 раз и титровали путем двухкратного разведения до необходимой концентрации в планшете для иммунологических реакций. Каждое разведение сывороток наносили на твердофазный носитель в объеме 1 мкл в виде линейно расположенных точек. В качестве такового мы апробировали НЦМ для электрофореза «Bio-Rad», «Mil-lipor», «Serva» и мембранные фильтры «Amicon», «Millipor», «Sinpor» и «Владипор» с различным размером пор, исходя из того, что прочность связывания ими антител и их сорбционная емкость может быть неоднозначна.

Проведенные испытания показали, что наименее пригодными оказались мембранные фильтры «Amicon», «Millipor» и «Владипор».Хорошими характеристиками обладали НЦМ и мембранные фильтры «Sinpor» (достаточная сорбционная емкость и прочность связывания наносимого материала).

После нанесения исследуемого материала (1 мкл) на мембрану мы испытали несколько режимов иммобилизации: 20,30,40 мин при (20±1) ⁰С, 10,15,20 мин при 37 ⁰С. Для ускорения высыхания капли можно использовать вентилятор. Все режимы сорбции были приемлемы, для дальнейшей работы нами избран режим: 10 мин при 37 ⁰С.

Мембрану после фиксации материала помещали в чашку Петри и однократно промывали ЗФР. Затем подложку заливали ЗФР, содержащим 1 % БСА, блокируя таким образом на ней свободные участки связывания в течение 10-15 мин при комнатной температуре. После двукратного промывания ЗФР мембрану помещали на 5-10 мин в раствор диагностикума, затем тщательно (трехкратно по 2-3 мин) промывали ЗФР и однократно - дистиллированной водой. Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембраны в раствор проявителя на 5-8 мин.

При выполнении настоящей работы мы опробовали 14 составов проявителей для каталитического усиления сигнала серебряного золя.

Проявитель выбирали по проявляющему веществу: амидол, гидрохинон, глицин, метол, фенидон в разных сочетаниях (таблица 12).

Химические ингредиенты проявителей растворяли при температуре воды от 0 до 5 ⁰С (для проявителя №6 воду брали с более низкой температурой -18-22 ⁰С, так как при растворении щелочи выделяется большое количество тепла).

При приготовлении раствора по рецепту нужно добавлять следующее по порядку вещество только после растворения предыдущего. При приготовлении проявителей сначала следует растворить сохраняющее вещество, затем проявляющее. Метол - исключение из этого правила, так как он труднее растворяется в растворе сульфита. В этом случае сначала растворяют в воде небольшое количество сульфита, затем метол, далее - основное количество сульфита, гидрохинон и дальнейшие составные части после того, как каждое предыдущее вещество растворилось.

Результаты испытаний показали, что проявители, содержащие метол, развивали высокую оптическую плотность: исследуемые сыворотки крови, содержащие специфические антитела, проявлялись в виде серо-коричневых пятен различной интенсивности в зависимости от количественного содержания антител. В то же время остальные проявители давали светлые малоконтрастные отложения (рисунок 18).

Картина проявления сохраняется и после небольшой передержки (более 7 мин) проявителя - диффузное серебро, восстановленное в растворе, легко отмывалось, тогда как восстановленное на сорбированных частицах золя на твердой матрице удерживалось прочно. В связи с этим в экспериментах мы использовали проявитель, содержащий метол.