Експериментальне і теоретичне обґрунтування та розробка засобів епізоотологічного моніторингу, діагностики вірусних хвороб тварин та молекулярно-генетичного типування їх збудників (ортоміксо-, параміксо-, герпес-, цирко- та пестивірусна інфекції)

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР «ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ»

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

16.00.03 -- Ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія

Експериментальне і теоретичне обґрунтування та розробка засобів епізоотологічного моніторингу, діагностики вірусних хвороб тварин та молекулярно-генетичного типування їх збудників (ортоміксо-, параміксо-, герпес-, цирко- та пестивірусна інфекції)

Герілович Антон Павлович

Харків 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини».

Науковий консультант: доктор ветеринарних наук, професор, академік НААН Стегній Борис Тимофійович, Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», директор

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, академік НААН Бусол Володимир Олександрович, Національний університет біоресурсів і природокористування України, професор кафедри епізоотології та організації ветеринарної справи;

доктор ветеринарних наук, професор Галатюк Олександр Євстафійович, Житомирський національний агроекологічний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології

доктор біологічних наук, професор Рибаков Сергій Сергійович, Федеральна державна установа «Федеральний центр охорони здоров'я тварин», начальник відділу ящуру, особливо небезпечних та маловивчених хвороб (Російська Федерація)

Захист відбудеться «20» квітня 2011 р. о 9-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий «19» березня 2011 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат ветеринарних наук П. О. Шутченко

1. Загальна характеристика роботи

епізоотологічний вірусний тварина збудник

Актуальність теми. На сьогодні більшість напрямів фундаментальних і прикладних досліджень у сфері природничих і медичних наук не можна вважати повними та достатньо обґрунтованими без залучення методів молекулярної біології. Їх застосування поширюється на розробку, дослідження та впровадження ряду біотехнологічних процесів, фундаментальну вірусологію, мікробіологію та мікологію, медичні та ветеринарні дисципліни. З метою створення ефективних систем профілактики хвороб людини та тварин методи молекулярної біології і генетики застосовують для діагностики інфекцій і генетичних аномалій, дослідження системи імунітету, вивчення епізоотичного (епідемічного) процесу при особливо небезпечних захворюваннях, а також для контролювання біотехнологічних процесів (Глик Б., 1998; Hungnes O., 2000; Acheson N. H., 2007; Amstutz B., 2008; Niessen L., 2008; Milos P., 2009).

Діагностика інфекційних хвороб тварин зазвичай ґрунтується на принципах комплексності, при цьому провідна роль у встановленні діагнозу належить лабораторним методам. У зв'язку з цим, щорічно збільшується арсенал діагностичних тестів, які впроваджуються у повсякденну практику (Belбk S., 1991; Bevan L. S., 1992; Kelling C. L., 1996; Vilcek S., 2001; Alexander D. J., 2001, 2008; Capua I., 2007, 2008).

За зростання ризиків виникнення ряду нових інфекцій і спалахів емерджентних зоонозних захворювань усе більш гострою стає проблема пошуку засобів експрес-діагностики. Їх розробку також спонукає і необхідність контролювання об'єктів міжнародної торгівлі тваринного походження та ветеринарних імунобіологічних препаратів (WHO, 2005, 2008; O. I. E., 2008, 2009; LeBlanc N., 2010).

Першооснову цих методів складає полімеразна ланцюгова реакція, яка вже впродовж 20 років є провідним інструментом молекулярної біології, діагностики, біотехнології та епізоотології (епідеміології). Об'єми її застосування у світі щорічно зростають. Еквівалент витрат на проведення дослідів лише за період з 2004 до 2007 рр. зріс з 1,5 до 4,2 млрд. доларів США. Це пояснюється розробкою, валідацією та впровадженням нових тест-систем, усе більш інтенсивним залученням ПЛР до створення рекомбінантних конструкцій, системи контролю біотехнологічних процесів, фундаментальних проектів з повногеномного секвенування тощо (Acheson N. H., 2007; Amstutz B., 2008; Milos P., 2009).

З метою виявлення та типування збудників, а також діагностики таких небезпечних захворювань, як грип, ньюкаслська хвороба, блутанг, лейкоз і туберкульоз, герпесвірози тварин і птиці, та ряду інших інфекцій запропоновано чимало тестів на основі різних модифікацій полімеразної ланцюгової реакції (Hungnes O., 2000; Spackman E., 2002, 2005; Sachse K., 2003; Monti G., 2005; Capua I., 2007, 2008; Hemmatzadeh F., 2007). Нажаль, не всі вони доступні практичній ветеринарній медицині у формі комерційних тест-систем. До того ж, віруси швидко мутують, утворюючи нові генетичні варіанти, унаслідок чого деякі методики з детекції можуть стати неспроможними виявляти нові генотипи. У цьому аспекті МЕБ і ряд авторів з далекого зарубіжжя рекомендують проводити систематичну перевірку й удосконалення національних і референтних методик на основі ПЛР у напряму конструювання праймерів та оптимізації режиму детекції з урахуванням особливостей циркулюючих або потенційних загрозливих щодо занесення гено_, серо_ та патотипів вірусів (Vilcek S., 2001; Aldous E., 2003; Sachse K., 2003; Spackman E., 2005; Андриясов A. B., 2006; Capua I., 2008).

У контексті дослідження особливостей епізоотичного процесу значну увагу сьогодні приділяють молекулярно-епізоотологічному аналізу. Детальна порівняльна оцінка генетичних характеристик виділених збудників з урахуванням особливостей перебігу інфекцій дає можливість оцінити шляхи видозмінення патогену, його хазяїноспецифічні мутації, ступінь патогенності, маркери стійкості до антибактерійних і противірусних препаратів, визначити час і шляхи заносу інфекції на територію окремого господарства чи країни в цілому. Ці дослідження започатковані та інтенсивно розвиваються при вивченні таких інфекцій, як ортоміксовірози, параміксовірози, пестивірози, цирковірози тварин, туберкульоз, лейкоз та інші. Отриманні дані дозволили суттєво поглибити знання про біологію збудників, внести уточнення до систематики, розробити та скоригувати системи моніторингу, профілактики та боротьби (Belak S., 1991; Hierhozer J. C., 1996; Глик Б., 1998; Сid_Arregui A., 2000; Vilcek S., 2001, Kim J., 2001; Sachse K., 2003; Werner O., 2006; Capua I., 2008).

Аналіз ситуації щодо впровадження загальнобіологічних методологій, спрямованих на глибоке дослідження первинних ознак патогенності мікроорганізмів, детермінованих їх генетичним потенціалом, в Україні та країнах СНД вказує на помітний брак протоколів і технологій, здатних забезпечити вивчення молекулярних механізмів патогенності вірусів і бактерій тварин, тенденцій і характеру їх поширення, еволюцію джерел і резервуарів інфекції.

Вирішення цієї проблеми можливе лише за теоретичних досліджень з розробки універсальної системи пошуку олігонуклеотидів для молекулярної діагностики інфекційних хвороб та експериментального доведення її ефективності при створенні систем детекції і генотипування РНК_ та ДНК_вміщуючих вірусів родин Orthomixoviridae (Avian influenza virus), Paramyxoviridae (Newcastle disease virus), Flaviviridae (Bovine pestivirus_1, 2), Circoviridae (Porcine circovirus 1, 2), Herpesviridae (Pseudorabies virus, Bovine herpesvirus_1 (IRT_PVV virus), Gallid herpesvirus_1), що мають значне поширення у господарствах України та прилеглих держав.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно тематичного плану наукових досліджень ННЦ «ІЕКВМ», затвердженого Національною академією аграрних наук України, у рамках завдань 37.04-001.05 «Вивчити генетичну мінливість високопатогенних ізолятів вірусу грипу птиці» (2006-2010 рр., № держреєстрації 0107U003192), 03.01.02 «Створити рекомбінантний штам вірусу хвороби Марека, вивчити біологічні властивості та на його основі розробити ДНК-вакцину» (2006-2010 рр., № держреєстрації 0106U000346), 37.01-006.01 «Розробити і випробувати у виробничих умовах ПЛР тест-системи для виявлення і диференціації хламідій» (2006-2008 рр., № держреєстрації 0106U000333), 37.03-001.06 «Провести дослідження господарств України щодо інфекційних пневмоній свиней мікоплазменної етіології та розробити систему контролю мікоплазмозу свиней» (2006-2010 рр., № держреєстрації 0106U000334), за контрактами з Міністерством аграрної політики України (2006-2009 рр.), проектом ІРР Р168 Українського науково-технологічного центру «Development of Aujeszky disease virus antigen and MAb for ELISA» (2007-2008 рр.).

Мета і задачі дослідження. Мета досліджень полягала у теоретичному вивченні та експериментальному обґрунтуванні створення, валідації і впровадження молекулярно-генетичних методик з індикації і генотипування збудників вірусних інфекцій тварин у біотехнологію діагностичних ПЛР_тест_систем, а також методологій молекулярно-епізоотологічних досліджень для удосконалення лабораторної діагностики в Україні.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

- розробити алгоритм розрахунку праймерних систем для створення рекомбінантних біотехнологічних конструкцій, діагностичних тест-систем і методик та експериментально довести його компетентність;

- створити систему індикації вірусів грипу А та ідентифікації високопатогенних штамів (H5N1) методом зворотно-транскриптазної ПЛР;

- провести ідентифікацію епізоотичних ізолятів вірусу високопатогенного грипу птиці та дослідити їх молекулярно-епізоотологічні особливості;

- розробити молекулярно-генетичну тест-систему для виявлення РНК вірусу ньюкаслської хвороби методом ПЛР та визначити її придатність для молекулярно-епізоотологічного скринінгу;

- провести патотипову та генотипову ідентифікацію ізолятів вірусу ньюкаслської хвороби на основі методів секвенування генів F та NP і філогенетичного аналізу їх послідовностей;

- розробити систему розрахунку праймерів і створення ампліфікаційних протоколів для виявлення ДНК-вміщуючих вірусів на моделі збудників ІРТ, хвороби Ауєскі та ІЛТ;

- дослідити генетичні особливості цирковірусів свиней, розробити засоби моніторингу та генотипування збудників ЦВІС;

- розробити методику індикації РНК пестивірусу діареї ВРХ за допомогою ПЛР, визначити її придатність для скринінгу біотехнологічно значимих матриць (сперма ВРХ, культури клітин, сировина та кінцеві продукти біофабричного виробництва) і вивчити генотипові особливості виявлених контамінантів.

Об'єкт дослідження: ортоміксо_, параміксо_, герпес_, цирко_ та пестивірусні інфекції тварин, молекулярна діагностика, молекулярна епізоотологія та молекулярна біотехнологія.

Предмет дослідження: гени та геноми референтних штамів і польових ізолятів вірусів високопатогенного грипу птиці, ньюкаслської хвороби, інфекційного ринотрахеїту ВРХ, хвороби Ауєскі, інфекційного ларинготрахеїту птиці, цирковірусів свиней, діареї ВРХ, праймери та ПЛР-протоколи, їх валідація, рестрикційний аналіз, секвенування генів, філогенетичний аналіз послідовностей нуклеїнових кислот збудників, молекулярні маркери патогенності та генотипової належності.

Методи дослідження. Робота виконана з використанням епізоотологічних, клінічних, патолого-анатомічних, молекулярно-генетичних, філогенетичних, біоінформатичних та статистичних методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні теоретично обґрунтовано та експериментально реалізовано алгоритм універсального розрахунку та перевірки праймерних систем на основі застосування комплексу біоінформатичних програм, визначено параметри пошуку й оцінки олігонуклеотидних систем. Розроблено методологію створення протоколів для ПЛР_ та ЗТ_ПЛР_детекції ДНК_ та РНК_вміщуючих збудників родин Orthomixoviridae, Paramixoviridae, Herpesviridae, Circoviridae та Flaviviridae (рід Pestivirus). Гармонізовано системи валідації методик індикації і типування вірусів тварин методом полімеразної ланцюгової реакції.

На основі розробленого алгоритму біоінформатично проаналізовано мінливі та консервативні гени, окремі ділянки нуклеїнових кислот вірусів високопатогенного грипу птиці, ньюкаслської хвороби, хвороби Ауєскі, інфекційного ринотрахеїту ВРХ, інфекційного ларинготрахеїту птиці, діареї ВРХ і цирковірусів свиней. Розроблено нові специфічні праймерні системи, які стали базисом для розробки специфічних праймерів і створення вітчизняних протоколів детекції згаданих патогенів у біологічних і патологічних матеріалах, зразках сировини для виготовлення ветеринарних імунобіологічних препаратів і готової біофабричної продукції, що адаптовані до умов вітчизняних діагностичних установ та є ефективними по відношенню до субпопуляцій збудника, які циркулюють у господарствах України. За проведеними біоінформатичними розрахунками запропоновано метод одночасної індикації та диференціації цирковірусів свиней за T_step_point ПЛР, що, на відміну від описаних модифікацій, є принципово новим підходом у системі молекулярної діагностики цирковірозів свиней.

Уперше проведено молекулярно-епізоотологічні та філогенетичні дослідження українських ізолятів вірусу грипу птиці (2005-2008 рр.), цирковірусу свиней (2006-2008 рр.), вірусів ньюкаслської хвороби (1967-2008 рр.) та діареї ВРХ (2006-2008 рр.), на підставі чого визначено генотипи збудників, їх зв'язки з іншими генетично подібними популяціями та висунуто ряд гіпотез щодо ймовірних джерел їх потрапляння та видозмінення у популяції сільськогосподарських тварин в Україні.

За результатами біоінформатичних досліджень створено специфічні праймерні системи та запропоновано алгоритми відпрацювання протоколів long_ПЛР для накопичення химерних генів вірусів тварин на моделі gB та pp38 збудника хвороби Марека та гемаглютиніну вірусу грипу підтипу H5N1 для розробки біотехнологічних конструкцій.

Новизна розробок посвідчена 8 патентами України на корисні моделі.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Основу представлених у дисертаційній роботі наукових і практичних результатів складає теоретично сформульована та експериментально доведена система біоінформатичного аналізу нуклеотидних послідовностей вірусів тварин, що є продуктом аналітичних досліджень потенційних можливостей різних програм біоінформатичного призначення. Вона дозволяє на основі поетапного аналізу генів і геномів обирати перспективні олігонуклеотидні системи для виявлення патогенів тварин і напрацювання їх штучних генів у лабораторних умовах. За допомогою цієї системи розкриваються можливості для розробки праймерів як для рутинної детекції збудників вірозів тварин, так і для вирішення наукових задач з вивчення їх генотипової варіабельності в процесі мікроеволюції, філогенетичних зв'язків, а також для накопичення синтетичних вірусних генів, що є основою сучасних технологій рекомбінантних ДНК. Ефективність системи була розкрита на моделі захворювань, спричинених як ДНК-, так і РНК-вміщуючими вірусами.

Результати досліджень використано для розробки нормативної документації щодо виготовлення, контролювання та застосування зареєстрованих в Україні молекулярно-генетичних тест-систем та методик виявлення вірусів високопатогенного грипу птиці, ньюкаслської хвороби, хвороби Ауєскі, інфекційного ринотрахеїту ВРХ, діареї ВРХ, цирковірусів свиней. Розроблено способи виявлення РНК ортоміксо_, параміксо_ та пестивірусів та ДНК герпес_ і цирковірусів. Розроблено та затверджено Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України «Методичні рекомендації щодо виявлення РНК вірусів високопатогенного грипу птиці субтипу H5N1 за геном гемаглютиніну», «Методичні рекомендації щодо виявлення РНК вірусів високопатогенного грипу птиці субтипу H5N1 за геном нейрамінідази» (протокол № 3 від 21 грудня 2006 р.), «Методичні рекомендації щодо індикації вірусів грипу А і диференціації їх від вірусів ньюкаслської хвороби», «Методичні рекомендації щодо виявлення ДНК вірусу інфекційного ларинготрахеїту за допомогою ПЛР» та «Методичні рекомендації щодо контролю контамінації сперми ВРХ вірусами та хламідіями за допомогою ПЛР» (протокол № 1 від 27 грудня 2007 р.), «Методичні рекомендації щодо виявлення збудників основних вірусних захворювань свиней за допомогою полімеразної ланцюгової реакції» та «Методичні рекомендації щодо розрахунку праймерних систем для індикації та ідентифікації патогенів тварин» (протокол № 1 від 23-24 грудня 2009 р.).

Особистий внесок здобувача полягає в самостійному виконанні методичних, аналітичних та експериментальних робіт. Дослідження зі секвенування ДНК та кДНК вірусів тварин здійснені за участі Dr. T. Stadejek і Dr. K. Smietanka (Національний ветеринарний дослідницький інститут, Польща), І. П. Пчьолкіної (ФДУ «Федеральний центр здоров'я тварин», м. Владимир, Росія), Prof. S. Vilcek (Центр ДНК-аналізу Департаменту ветеринарної медицини Сільськогосподарського Університету, м. Кошице, Словаччина) та Dr. G. Wewalka (Bundesstadtliche Bakteriologische Serologische Untersuchungsanstalt, м. Відень, Австрія). Опрацювання результатів секвенування, їх аналіз і трактування проведені здобувачем особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались, обговорювались і були схвалені на звітних сесіях вченої ради та засіданнях методичної комісії ННЦ «ІЕКВМ» (2006-2010 рр.), міжнародній науково-практичній конференції «Високопатогенний грип птиці» (с. Новий Світ, АР Крим, 2006 р.), науково-практичній конференції «Актуальні проблеми молекулярної діагностики у ветеринарній медицині та біології» (м. Феодосія, АР Крим, 2007 р.), ІІ_й міжнародній науковій конференції «Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування» (м. Львів, 2007 р.), 6_й всеросійській науково-практичній конференції «Молекулярна діагностика-2007» (м. Москва, 2007 р.), міжнародній конференції «Інфекційна патологія тварин» та міжнародній конференції молодих вчених до 50_річчя ФДУ ВНДІЗТ (м. Владимир, 2008 р.), ІІІ_му та V_му міжнародних ветеринарних конгресах з птахівництва (м. Москва, 2007, 2009 рр.), симпозіумі «Veterinarstvo i stokarstvo u proizwodji zdrawstvevo bezbedne hrane» (Херцег Нові, Сербія і Чорногорія, 2008 р.), міжнародному ветеринарному конгресі, присвяченому 85_річчю з дня заснування ННЦ «ІЕКВМ» (м. Харків, 2008 р.), науково-практичній звітній конференції ХДЗВА (м. Харків, 2009 р.), міжнародній науково-практичній конференції «Моніторинг, прогнозування та профілактика інфекційних хвороб тварин із використанням сучасних методів епізоотології, молекулярної біології та біотехнології» (м. Феодосія, АР Крим, 2009 р.), міжнародній науково-практичній конференції на честь 205_річчя кафедри епізоотології ХДЗВА (м. Харків, 2009 р.), міжнародній науковій конференції «Biological Threat Science Review» (м. Атланта, США, 2009 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 47 наукових праць, з них 22 -- у фахових виданнях України та 4 -- за кордоном, у тому числі 10 одноосібних, одна монографія й один науково-методичний посібник. Здобувачем отримано 8 патентів України на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 370 сторінках комп'ютерного друку, ілюстрована 43 таблицями та 50 рисунками. Робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень (шість розділів), їх аналізу та узагальнення, висновків і пропозицій виробництву, списку джерел літератури, який містить 629 найменувань, у тому числі 507 -- авторів з далекого зарубіжжя, а також додатків, оформлених окремою книгою.

2. Вибір напрямів досліджень, матеріали та методи досліджень

Незважаючи на розмаїття представлених у світі варіацій полімеразної ланцюгової реакції та її похідних, існувало декілька напрямів досліджень, які можна було вважати перспективними. З одного боку, в Україні і, навіть, у світі, попри існуючі численні протоколи та засоби молекулярної діагностики, не існувало уніфікованої схеми створення олігонуклеотидних конструкцій для реалізації фундаментальних та прикладних завдань, а з іншого -- вірусні геноми демонструють значні розбіжності, що характеризує їх у еволюційному відношенні, зумовлює потребу в створенні нових засобів детекції унаслідок втрати актуальності існуючих. Дієвість розроблюваної нами системи розрахунку праймерів необхідно було показати на прикладі різних типів вірусних геномів, для чого нами було проаналізовано послідовності РНК та ДНК окремих представників як мінливих (ортоміксо-, параміксо-, цирко- та пестивіруси), так і генетично консервативних (герпесвіруси) груп збудників, а також створено засоби їх детекції.

Віруси. Дослідження проведені на моделі РНК-вміщуючих вірусів, що належать до родин Orthomyxoviridae (збудник грипу птиці), Paramyxoviridae (збудники ньюкаслської хвороби та парагрипу_3 ВРХ), Flaviviridae (збудники діареї ВРХ та класичної чуми свиней), Birnaviridae (збудник хвороби Гамборо), та ДНК-вміщуючих вірусів з родин Herpesviridae (збудники ІРТ, хвороб Ауєскі, Марека та інфекційного ларинготрахеїту птиці) та Circoviridae.

Експерименти щодо створення методик виявлення РНК вірусу грипу А та ідентифікації субтипу Н5N1, а також досліди з вивчення аспектів молекулярної епізоотології високопатогенного грипу проведені з використанням штамів вірусу грипу А/курка/Сиваш/02/05/H5N1 (Influenza A virus/chicken/Syvash/02/ 05/H5N1), А/курка/Приморський/01/06/Н5N1 (Influenza A virus/chicken/ Prymorsky/01/06/H5N1), А/курка/Красногвардійський/(58_60)/08/H5N1 (Influenza A virus/chicken/Krasnogvardiysky/(58-60)/08/H5N1) з активністю 1-10 log2/см3 за РГА. Для ідентифікації високопатогенних вірусів підтипу Н5 та визначення специфічності індикації збудників грипу А досліджували віруси низькопатогенного грипу птиці підтипів Н1-Н14, у тому числі H5N2 та H5N3.

Для конструювання молекулярно-генетичної тест-системи з виявлення вірусу ньюкаслської хвороби використано інактивовані епізоотичні та вакцинні (Ла-Сота (LaSota), клон Україна (LaSota, clone UA) та ЛГ_85 (LG_85)) штами.

Для вивчення молекулярно-епізоотологічних характеристик вірусу ньюкаслської хвороби готували РНК-екстракти з біомаси епізоотичних ізолятів вірусу від свійської і дикої птиці, що зберігаються у колекції відділу вивчення хвороб птиці ННЦ «ІЕКВМ», та позитивних за ПЛР зразків патматеріалу.

З метою розробки системи індикації герпесвірусу ІРТ ВРХ використано збудник штаму Молдавський. При розробці тест-системи для виявлення ДНК вірусу хвороби Ауєскі застосовано ДНК-екстракти з інактивованого формальдегідом вірусного матеріалу штаму УНДІЕВ_18В з колекції відділу вірусології ННЦ «ІЕКВМ». Штами ВНИИБП_У та Г (G) герпесвірусу ІЛТ отримані з колекції ННЦ «ІЕКВМ». Систему індикації пестивірусів створено на основі штаму Oregon вірусу діареї ВРХ з колекції ННЦ «ІЕКВМ».

Хімічні реагенти. Для екстракції ДНК та РНК, зворотної транскрипції, ампліфікації, секвенування, рестрикції, лігіювання та трансформації у роботі використані реагенти (ферментні системи та їх буфери, а також інші компоненти реакційних сумішей) виробництва ФДУН «Центральний науково-дослідний інститут епідеміології Росспоживнагляду» (м. Москва, Росія), ТОВ «Ізоген» (м. Москва, Росія), Fermentas (Латвія), Qiagen, Invitrogen, Applied Biosystems (США) та інші. Виготовлення буферних систем для електрофоретичного аналізу здійснювали із застосуванням реактивів фірм Sigma-Aldrich Ltd., Serva, Invitrogen (США).

Праймери. У роботі використано олігонуклеотидні системи для виявлення та типування ортоміксо_, параміксо_, герпес_, цирко_ та пестивірусів тварин, які були описані в доступній науковій літературі (Spackman E., 2003; Aldous E., 2003; Smietanka K., 2006; Андриясов А. В., 2007; Fuchs M., 1999; Schmitt J., 1998; Dangler C. A., 1992, O. I. E., 2008) та розроблені особисто дисертантом.

Устаткування. Дослідження виконано із залученням спецустаткування для класичної ПЛР виробництва фірм БіоКом, ДНК_Технологія (Росія), BioMetra (Німеччина), Eppendorf (США), для електрофорезу -- фірми BioRad (США), для оцінки результатів електрофорезу -- фірм BioRad (США), Hoffmann (Німеччина), БіоКом (Росія). ДНК-секвенування проводили за допомогою електрофоретичних вертикальних камер BioRad (США) та автоматичних ДНК-аналізаторів АВІ3100, Applied Biosystems (США).

Програмне забезпечення. Праймерні системи конструювали й оцінювали їх якість (специфічність, біофізичні параметри), створювали моделі векторних систем і проводили філогенетичний аналіз за допомогою програм BioEdit v. 5.1.1.7, MEGA v. 4.0, AmplifX v. 1.4, Vector NTI v. 9.0 (Invitrogen, США), Oligo Software v. 1.0 (OligoSoft), FASTA on_line, BLAST on_line, Clustal W on_line.

Матеріал для досліджень відбирали з дотриманням правил і вимог МЕБ (МЕБ, 2008) та з урахуванням місць потенційної локалізації збудників інфекційних хвороб в організмі тварин.

Екстракцію нуклеїнових кислот проводили за фенол-хлороформним методом (Маниатис Т. И., 1984; Иванов П. Л., 1999) та афінною сорбцією за допомогою комерційних наборів.

Ампліфікацію нуклеїнових кислот збудників здійснювали методами класичної ПЛР і ПЛР у режимі реального часу за протоколами МЕБ та за in house-методиками (O. I. E., 2008; Андриясов А. В., 2007; Spackman E., 2003; Aldous E., 2003; Smietanka K., 2006; Fuchs M., 1999; Schmitt J., 1998; Dangler C. A., 1992) з метою детекції і типування вірусів грипу за генами М, NP, NA, HA, ньюкаслської хвороби -- за генами F, NP, герпесвірусів ІРТ ВРХ, хвороби Ауєскі та ІЛТ птиці -- за gC, gE, TK, цирковірусів свиней -- за rep- і cap-генами та вірусу діареї ВРХ -- за 5' UTR-ділянкою.

Рестрикційний аналіз проводили з метою створення липких кінців при отриманні фрагментів для генетичних конструкцій, а також для визначення поліморфізму варіабельного фрагмента гена NP вірусу ньюкаслської хвороби за використання комерційних ендонуклеаз у відповідності з протоколами виробників.

Відповідність розміру продуктів ПЛР, розподілення фрагментів рестрикції після обробки рестриктазами та напрацювання очищеного матеріалу для секвенування встановлювали за допомогою електрофоретичного аналізу з використанням агарозних і поліакриламідних гелів.

Праймери конструювали за створеною нами схемою, що передбачала обрання таргетного гена, аналіз його варіабельності, пошук зон консервативності та їх програмний скринінг щодо виявлення відповідних олігонуклеотидних регіонів.

ПЛР-протоколи оптимізували шляхом визначення відповідних термічних (температури відпалу, денатурації та елонгації), часових параметрів ампліфікаційних циклів, а також композицій реакційних сумішей.

Секвенування ДНК (кДНК) збудників інфекцій тварин здійснювали з використанням методу термінаторів (Sanger F., 1980) та його сучасних модифікацій, за оцінкою поліакриламідних електрофореграм або за автоматичним обліком за допомогою ДНК-аналізатора. З метою секвенування використані фрагменти кДНК з РНК вірусів грипу субтипу Н5N1 (n = 6), ньюкаслської хвороби (n = 32), вірусу діареї ВРХ (n = 7) та ДНК ЦВС_ІІ (n = 6), напрацьовані за допомогою класичної ПЛР.

За філогенетичного аналізу послідовностей ДНК та РНК вірусів у молекулярно-епізоотологічних дослідженнях ізолятів складали дендрограми, які аналізували за допомогою програми MEGA 3.1 за алгоритмом Neighbor Joining. Аналіз філогенетичного дерева здійснювали шляхом візуальної оцінки його топографії та попарних відстаней між компонентами вибірки. Під час дослідження філогенетичних зв'язків вірусів грипу птиці до вибірок залучали послідовності ізолятів, виділених у той же час у різних країнах світу. Варіабельність вірусу НХ вивчали за трьома алгоритмами порівняння: дослідження генотипоспецифічних ділянок (Aldous E., 2003), патотипоспецифічних ділянок (Smietanka K., 2006) та молекулярно-епізоотологічне дослідження області, ампліфікованої з праймерами власного дизайну. Оцінку варіабельності та генотипування цирковірусу свиней та пестивірусу діареї ВРХ проводили шляхом аналізу секвенованих послідовностей з праймерами до генів rep та 5' UTR (Vilcek S., 2004) відповідно.

Під час створення генетичних конструкцій були проаналізовані специфічні фрагменти геномів вірусів хвороби Марека та високопатогенного грипу птиці, підібрано праймери, що фланкували гени gB і pp38 ВХМ, а також НА (Н5) та розроблено протоколи накопичення їх повних копій за long-ПЛР. Теоретично сконструйовані та зібрані векторні системи на основі плазмід pBR322, pUC18, для клонування фрагментів ДНК ВХМ та pUC19 гена гемаглютиніну для вірусу грипу, якими трансформували компетентні клітини E. coli.

3. Результати досліджень та їх аналіз

Теоретичне обґрунтування параметрів розрахунку праймерних систем для створення рекомбінантних та діагностичних біотехнологічних конструкцій. Запровадження інтенсивних схем господарювання в птахівництві, скотарстві та свинарстві зумовлює розвиток епізоотичного процесу цілого ряду інфекційних хвороб, що в свою чергу пояснює необхідність створення нових засобів захисту тварин, моніторингу та діагностики. Переважний попит серед останніх мають засоби експрес-індикації та ідентифікації патогенів. З_поміж них на особливу увагу заслуговують молекулярно-генетичні методики, протоколи та тест_системи. За виявлення вірусних геномів можна проводити експрес-діагностику інфекційних хвороб тварин, детекцію контамінантів об'єктів біотехнологічного та ветеринарно-санітарного контролю. Основу молекулярно-генетичних технологій складає полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), за якої можна здійснювати дослідження у трьох основних напрямах: виявляти та типувати збудника за допомогою власне реакції, проводити напрацювання мінливих фрагментів вірусних геномів для поглибленого їх вивчення з метою молекулярно-епізоотологічних досліджень і накопичувати in vitro синтетичні нуклеїнові кислоти, що можуть бути застосовані в якості експресуючих векторів для отримання рекомбінантних білків, або як контрольні зразки для ПЛР.

За результатами аналізу світового досвіду та власних напрацювань ми сформулювали схему, що складалась з комплексу заходів з підбору таргетних послідовностей за оцінкою параметрів широти вибірки та її репрезентативності, теоретичного програмного обрахунку консервативних зон цих послідовностей, підбору в них праймерних пар, теоретичної оцінки останніх за показниками якості, такими як близькість температур плавлення, ймовірність димеризації, комплементарність до матриці, GC-вміст та оцінки за показниками таксономічної специфічності (теоретичний макроаналіз) (рис. 1).

Рис. 1 Схема розробки праймерних систем для детекції патогенів тварин за допомогою ПЛР

Розроблена схема передбачала застосування комплексу локальних (AmplifX, BioEdit, ClustalW) та on_line (BLAST, FASTA) програмних продуктів, які в сукупності забезпечували її ефективність.

Підбір таргетних генів базується на принципах таксоноспецифічності, дозволяючи створити олігонуклеотиди для виявлення роду, виду, підвидів і підтипів збудників. Праймери мають бути консервативними в межах групи мікроорганізмів, що пояснює необхідність аналізу генетично стабільних ділянок для їх обрахунку, а також прогнозовано специфічними та стабільними. Результати вказаних етапів досліджень дозволяли ідентифікувати олігонуклеотиди, які у подальшому застосовували для розробки методик індикації та ідентифікації патогенів, їх наступної валідації і конструювання діагностикумів. Крім створення діагностичних праймерів, до схеми розрахунку було покладено принципи, які дозволяли її успішно застосовувати з метою створення олігонуклеотидів для секвенування (гіперваріабельність обмежуваної ділянки) та отримання синтетичних генів для біотехнологічних потреб.

З метою розкриття ефективності сформульованого алгоритму було створено праймерні системи для виявлення вірусів грипу, ньюкаслської хвороби, герпесвірусів тварин, цирковірусів свиней та збудника діареї ВРХ, а також олігонуклеотиди для синтезу in vitro повнокопійних генів вірусів хвороби Марека та грипу.

Так, конструювання праймерів здійснювали з урахуванням не лише принципів комплементарності, але й покрокової локалізації старт-кодону рамки зчитування для забезпечення відповідності утворюваного продукту. До тіл праймерів долучали ендонуклеазокомпетентні сайти, що дозволяло накопичувати синтетичні ДНК-послідовності генів gB та pp38 вірусу хвороби Марека та гемаглютиніну вірусу високопатогенного грипу птиці підтипу H5N1. Ці продукти були успішно клоновані в складі плазмідних векторів pBR_Ch_gB, pUC_Ch_pp38 та pUC_ChINF_AivH5 у клітинах E. coli. Позитивна реакція отриманих клонів у ПЛР свідчила про специфічність клонування та ефективність запропонованої схеми обрахунку праймерів для створення рекомбінантних конструкцій.

Отже, був розроблений алгоритм розрахунку праймерних систем для створення рекомбінантних біотехнологічних конструкцій та діагностичних тест-систем і методик. Закладені в його основу принципи теоретично були загальними для більшості типів нуклеїнових кислот вірусів тварин, що необхідно було довести експериментально при конструюванні олігонуклеотидів для індикації, ідентифікації і генотипування вірусів тварин за ПЛР та секвенування. З цією метою в якості об'єктів для подальших досліджень були обрані збудники п'яти родин, що характеризувались різними рівнями мінливості та типами нуклеїнових кислот, якими були представлені їх геноми.

Розробка засобів діагностики ортоміксовірусних інфекцій (індикації вірусів грипу А та ідентифікації підтипу Н5N1). У зв'язку з відсутністю в Україні вітчизняних засобів типування вірусу грипу птиці та з огляду на властиву збуднику грипу генетичну нестабільність (Saif Y., 2002; Сюрин В. Н., 1998; Capua I., 2008; Monne I., 2008; Werner O., 2006) існувала необхідність у створенні нових засобів молекулярної діагностики цієї хвороби. Були проведені дослідження щодо розробки ряду молекулярно-генетичних протоколів, а саме методики індикації вірусу грипу А методом ПЛР та ідентифікації високопатогенних варіантів підтипу Н5N1. Це надало можливості перевірити систему розробки праймерів в експериментальних умовах на моделі РНК-вміщуючих вірусів.

За даними вивчення послідовностей генів, що кодували внутрішні білки вірусу, були створені праймери AivM, які фланкували ділянку гена М довжиною 560 п. н., дозволяючи за 40-45_циклової ампліфікації виявляти РНК 14 підтипів збудника грипу типу А за активності 0,5 log2/см3 і вище за РГА.

Наступним етапом роботи щодо створення системи молекулярної діагностики грипу було конструювання підтипоспецифічних праймерів, придатних до виявлення збудників з антигенною формулою H5N1, які, за даними ряду дослідників (Monne I., 2008; Capua I., 2008; Андриясов А. В., 2006), складають основу популяції патогенних вірусів у Євразії та Африці.

За результатами біоінформатичного аналізу послідовностей генів гемаглютиніну та нейрамінідази збудника грипу підтипу H5N1 були виявлені консервативні ділянки, у межах яких розраховані праймери систем AivH5 та AivN1, що фланкували ділянки відповідних генів довжиною 487 і 425 п. н.. Шляхом підбору компонентів реакційної суміші, кількості та тривалості циклів за застосування РНК-матриці штаму Influenza A virus/chicken/Syvash/02/05/H5N1 було розроблено методики ампліфікації цих фрагментів вірусного геному. У процесі їх оптимізації показано критичне значення вмісту як активних, так і сольових компонентів реакційної суміші. Експериментально було встановлено, що обидва протоколи демонстрували високу специфічність, завдяки чому при виявленні кожного з генів досягалась детекція збудника підтипу H5N1 на фоні відсутності реакцій з гетерологічними матрицями за одним із генів. Чутливість методик дозволяла виявляти збудника у нативних (за обома генами) та інактивованих (за гемаглютиніном) матеріалах за активності вірусу від 0,5 log2/см3 і вище за РГА, що задовольняло моніторингові потреби.

Іншим важливим напрямом, де активно має бути задіяна система створення олігонуклеотидів для ПЛР, є секвенування генетичного матеріалу патогенів з метою з'ясування походження, характеру мутацій і мікроеволюції у популяціях вірусу та поповнення даних баз нуклеотидних послідовностей. З цією метою нами були вивчені особливості генів гемалютиніну та нейрамінідази збудників, ізольованих під час першої епізоотії грипу в 2005-2006 рр. (Influenza A virus/ch/Syvash/02/05/H5N1, Influenza A virus/ch/Prymorsky/ 01/06/H5N1) та 2008 р. (Influenza A virus/ch/Krasnogvardeysky/58/08/H5N1).

Порівняння послідовностей, отриманих при секвенуванні, дозволило виявити дві заміни, зумовлені крапковими мутаціями, у центральній ділянці гена штамів Influenza A virus/ch/Syvash/02/05/H5N1 та Influenza A virus/ch/ Prymorsky/01/06/H5N1 стосовно до родоначальника генетичної лінії -- штаму A/duck/Khabarovsk. Обидві вони ідентифіковані як незначущі.

У штаму Influenza A virus/ch/Krasnogvardeysky/58/08/H5N1 встановлено сім замін, включаючи чотири значимі, у порівнянні до попередника, та шість замін відносно штаму Influenza A virus/ch/Syvash/02/05/H5N1.

Нуклеотидна структура сайту нарізання та дані її трансляції вказували на високопатогенну природу всіх аналізованих вірусів (PQGERRRKKR*GLF).

Термінальні регіони містили чотири та дев'ять замін відповідно. Таким чином, сумарна дивергенція між штамами сягала 2 %.

На основі отриманих даних щодо мінливості фрагмента була побудована невкорінена дендрограма, яка показала належність досліджуваних вірусів до різних груп. Штам Influenza A virus/ch/Syvash/02/05/H5N1 топографічно відповідав гілці ізолятів з Росії та Центральної Азії. Цей штам мав значну (до 3 %) відмінність від європейських штамів. Штам Influenza A virus/ch/ Krasnogvardeysky/58/08/H5N1 характеризувався близькою спорідненістю до центральноєвропейських ізолятів з Польщі, Чехії тощо (рис. 2).

Рис. 2 Філогенетичні зв'язки ізолятів вірусу грипу, виділених в Україні у 2005, 2006 та 2008 рр., за геном гемаглютиніну

Отримані результати свідчать про європейське походження нової генерації вірусів, у той час як російське походження збудників перших спалахів інфекції в Криму та інших регіонах України є доведеним фактом.

Для остаточного з'ясування ситуації щодо молекулярно-епізоотологічних характеристик вірусу нової генерації проведено більш глибоке вивчення інших генів збудника, зокрема секвенування сегменту, відповідального за амінокислотну послідовність нейрамінідази, показало наявність трьох замін, у тому числі двох смислових, у структурі гена нейрамінідази штаму Influenza A virus/ch/ Syvash/02/05/H5N1 ймовірного родоначальника генетичної лінії -- штаму A/duck/ Khabarovsk.

Штам Influenza A virus/ ch/Krasnogvardeysky/58/08/H5N1 характеризувався вже дев'ятьма замінами, включаючи шість значимих, у порівнянні до попередника та містив 11 замін відносно штаму Influenza A virus/ch/Syvash/02/ 05/H5N1. Дивергенція між штамами становила 3,5 %.

На основі отриманих даних щодо мінливості фрагмента гена нейрамінідази була побудована невкорінена дендрограма, яка також показала відповідність досліджуваних вірусів незалежним кладам. Проведений її аналіз вказував на те, що штам Influenza A virus/ch/Syvash/02/05/H5N1 відповідно до топографії походив з гілки ізолятів з Росії та Центральної Азії. Цей штам мав значні (до 4 %) відмінності від вірусів, виділених у Західній Європі. Штам же Influenza A virus/ch/Krasnogvardeysky/58/08/H5N1, як і у випадку аналізу гена гемаглютиніну, характеризувався близькою спорідненістю з центральноєвропейськими ізолятами (рис. 3).

Отримані результати підтвердили європейське походження нової генерації вірусів. Дані шведських вчених (Belak S., Zohari S., 2009, pers. comm.) про потенційну можливість циркуляції обох геногруп на одній території може бути розцінено як наслідок феномену популяційної реасортації, обумовленої контактом на Кримському півострові вірусоносіїв російських та європейських штамів. Викладені обставини розширюють це поняття, дозволяючи говорити про визначальну роль дикої птиці у системі реасортаційних перебудов вірусних геномів, що є базисом для прискорення еволюційних процесів у його популяціях.

Секвеновані послідовності генів гемаглютиніну та нейрамінідази ізолятів вірусу грипу, виділених в Україні, були застосовані з метою перевірки правильності розробки праймерів до підтипоспецифічних генів та опубліковані в базах даних нуклеотидних послідовностей (GenBank).

З метою впровадження результатів досліджень для практики розроблена та зареєстрована в Україні тест-система для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н5N1 методом ПЛР, яка успішно застосовується в системі засобів моніторингу хвороби серед дикої і домашньої птиці.

Отже, експериментально було доведено ефективність розробленої системи розрахунку праймерів на моделі вірусу грипу, створено засоби індикації та ідентифікації високопатогенних варіантів збудника. Філогенетичними дослідженнями послідовностей генів гемаглютиніну та нейрамінідази показано циркуляцію двох незалежних у генетичному відношенні субпопуляцій вірусу підтипу H5N1 в Україні.

Рис. 3 Філогенетичні зв'язки ізолятів вірусу грипу, виділених в Україні у 2005-2006 рр. (виділена область зверху) та 2008 р. (виділена область знизу) за геном нейрамінідази

З метою формування повноцінної системи молекулярної діагностики грипу окрім розроблених методик з індикації і типування вірусу згідно міжнародних вимог (WHO, 2006; O. I. E, 2008) необхідним було розробити інструментальне забезпечення диференційної діагностики грипу від ньюкаслської хвороби, що зумовило наступний напрям нашої роботи.

Розробка системи індикації РНК вірусу ньюкаслської хвороби. Дослідження варіабельності нуклеотидного складу основних генів та філогенетичних зв'язків у популяції збудника. Необхідність розробки системи індикації параміксовірусу ньюкаслської хвороби (НХ) була обумовлена відсутністю комерційних засобів молекулярної діагностики НХ на фоні необхідності диференціації збудника від вірусу грипу. Окрім того, його значна мінливість зумовлювала необхідність вивчення генотипових і молекулярно-епізоотологічних характеристик вірусної популяції.

На першому етапі досліджень був проведений біоінформатичний аналіз генів збудника. З урахуванням характеристик гена F, таких як наявність високоваріабельних ділянок і мотиву патогенності (сайту нарізання F1/F2), його було обрано як таргетний при створенні олігонуклеотидів для виявлення вірусу за ПЛР. При цьому ми поєднали підходи щодо створення праймерів для індикації і секвенування. Отримана при цьому висококонсервативна олігонуклеотидна пара NDV fusion відповідала вимогам специфічної детекції збудника за своєю 100 %_ю комплементарністю до матриці та обмежувала варіабельну ділянку, включаючи сайт нарізання, що є привабливим з точки зору молекулярно-епізоотологічних перспектив.

На основі праймерів NDV fusion був відпрацьований протокол індикації РНК ВНХ за ПЛР з виявленням ділянки F_гена довжиною 345 п. н. Крім цієї пари праймерів був створений додатковий антисмисловий олігонуклеотид LaSota fusion RR, що відрізнявся від NDV fusion RR тим, що містив дві заміни в тілі, суворо комплементарних до відомих послідовностей вакцинного штаму LaSota, з якого виготовляється більшість зареєстрованих в Україні вірус-вакцин. Протокол індикації вірусу НХ був покладений в основу створеної нами технології виготовлення зареєстрованої в Україні тест-системи для виявлення РНК вірусу НХ «Poul-RNA-test-NDV».

Для вирішення питання молекулярної діагностики НХ окрім тесту індикації необхідно було підібрати оптимальні схеми гено_ та патотипування вірусу. Дослідженнями з секвенування генотип-репрезентуючої ділянки гена F довжиною 375 п. н. за Aldous E. (2003) 32 українських ізолятів вірусу НХ було встановлено циркуляцію вірусів НХ генотипів 1, 2, 4 (b і d) та 5 (a, c і d) на фоні відсутності третього та ендемічного для американського континенту шостого генотипів. За амінокислотною послідовністю найбільш значущого мотиву патогенності (сайту нарізання F1/F2) проаналізовані штами демонстрували ознаки вело_, мезо_ та лентогенних патотипових груп.

До першого генотипу відносились штами, виділені від індичок і качок у 1967 та 2005-2006 рр. відповідно (BCh, Muskovy duck). Віруси цієї групи були уражені дикі птиці різних видів і кури.

Ізоляти генотипу 2 (Borky, Lubotyn) різнилися за патогенністю, хоча всі вони були виділені від курей у період з 1987 по 2003 рр. Дивергенція на рівні 5 % між послідовностями другого генотипу та різні рівні патогенності є типовими для цього кладу, оскільки він вміщує як традиційні атенуйовані та апатогенні вакцинні штами, так і віруси, які здатні викликати патології у свійської птиці.

Віруси четвертого генотипу, ізольовані в Україні, розподілялись на лінії 4b (Kiev та ін.) та 4d (Kharkiv та ін.), що є типовою ситуацією для всіх вірусів цієї групи, виділених у країнах СНД. Ці ізоляти також мали схожість з рядом збудників з Азії, що доказує їх філогенетичні зв'язки з цими ізолятами. Віруси п'ятого генотипу були представлені 15 ізолятами субліній 5a (Cirkuny), 5c (PI/Kharkiv) та 5d (група вірусів Wild bird та ін.), виділеними від курей у 1993-2008, 2003-2004, 2008 та 1993-2007 рр. Філогенетично ці віруси також мали азіатське та китайське походження.

На наступному етапі роботи були досліджені філогенетичні зв'язки та генотипова належність 13 з 32 ізолятів (представників різних груп) з метою порівняльного вивчення інформативності секвенування 375 п. н. ділянки за Aldous E. та 345 п. н. ділянки, обмеженої створеними нами праймерами системи NDV fusion (рис. 4).

У результаті аналізу дендрограми, побудованої за алгоритму NJ, установлено, що секвеновані послідовності гена F довжиною 375 п. н. 13 ізолятів, виділених в Україні, відносяться до генотипів 1, 2, 4d, 5a та 5d. Структура сайту нарізання цих вірусів охоплювала всі три основні патотипи збудника.

Усі ізоляти генотипів 4d, 5a та 5d мали амінокислотну послідовність, типову для велогенних вірусів, у той час як до генотипу 2 відносились як авірулентні, так і вірулентні ізоляти, а до генотипу 1 -- лише авірулентний штам. Дивергенція в групі штамів генотипу 2 досягала майже 20 % за секвенованим фрагментом. При цьому найбільшу гетерологічність послідовності демонстрував ізолят Lugansk. Решта ізолятів різнилась від інших представників кладу на 4-12 %.

Представник генотипу 4d відрізнявся від інших ізолятів на 5-12 % за аналогічної дивергенції по групі в цілому. Вірус генотипу 1 мав до 10 % нуклеотидних відмінностей у своїй групі. ВНХ генотипу 5а відрізнявся від представників своєї групи на 0-5 %.

Збудники генотипу 5d розподілились на два клади, перший з яких сформували лише ізоляти, виділених в Україні, з дивергенцією в кладі до 2 %, у той час як ізолят Ch/Kharkiv/07 відрізнявся від вірусу-прототипу на 5 %. Дивергенція по групі складала до 12 %.

Дослідженням ампліконів гена F довжиною 345 п. н. цих вірусів доведено належність вірусів до аналогічних кладів за топографією, а саме до генотипу 1 віднесено один штам, до типу 2 -- шість, до геногруп 4d і 5a -- по одному, а до

Рис. 4 Дендрограма генотипової належності ізолятів вірусу НХ

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аналіз отриманої дендрограми та попарних відстаней аналізованих послідовностей показав, що рівень дивергенції при порівнянні двох методик секвенування лишався майже незмінним за генотип-репрезентуючими групами, а топографічні характеристики у межах кладів також виявилися стабільними. Структура амінокислотних послідовностей у ділянці сайту нарізання була ідентичною при аналізі даних секвенування обох фрагментів.

Таким чином було доведено, що секвенування суміжних областей кладоспецифічної ділянки гена F репрезентує однакові результати при генотипуванні ВНХ. Отримані результати відкривали перспективи для застосування розробленого нами протоколу ПЛР з метою напрацювання мінливих фрагментів, інформативних у разі застосування з метою як визначення патогенності вірусу за амінокислотними мотивами сайту нарізання, так і визначення генотипу та ймовірного географічного походження збудника, що дає відповіді на ряд запитань при виконанні фундаментальних досліджень.

Показано, що секвенування, філогенетичний аналіз послідовностей NP_гена вірусу НХ та його рестрикційно-ензимне картування дозволяють визначити патотипові характеристики збудника, що відповідають профілеві патогенності за сайтом нарізання при ДНК-аналізі відповідних областей гена F.

Отже, була створена методика виявлення РНК вірусу НХ, на основі якої сконструйована молекулярно-генетична тест-система.

За результатами комплексу молекулярно-епізоотологічних досліджень показана її придатність для генотипування ВНХ. Доведено циркуляцію вірусу НХ вело_, мезо_ та лентогенного патотипів, що належать до генотипів 1, 2, 4 та 5 та мають європейське й азіатське походження.

Розробка засобів діагностики герпесвірусних інфекцій на основі полімеразної ланцюгової реакції. По завершенні досліджень ефективності системи розрахунку праймерів на моделі матриць РНК-вміщуючих вірусів тварин було визначено її компетентність по відношенню до ДНК-геномних збудників на моделі вірусів родини Herpesviridae. Це було обумовлено також відсутністю засобів молекулярної детекції вірусів ІРТ, ІЛТ та хвороби Ауєскі на фоні циркуляції цих збудників у ряді господарств України та суміжних країн, а також пріоритетним значенням ПЛР для діагностики ІРТ ВРХ та DIVA-діагностики при хворобі Ауєскі (O. I. E., 2008).

На основі аналізу баз даних нуклеотидних послідовностей герпесвірусів для детекції збудників інфекційного ринотрахеїту ВРХ та хвороби Ауєскі як таргетні були обрані гени gE, відсутні у делеційних мутантів, які застосовуються у виробництві маркованих вакцинних препаратів, а для детекції вірусу інфекційного ларинготрахеїту -- ген ТК. За проведеними біоінформатичними розрахунками в цих генах були ідентифіковані консервативні ділянки, у межах яких обрані специфічні праймери IRTV_gE, AuDV_gE та ILTV, що фланкують зазначені гени довжиною 245, 235 та 176 п. н.