Експериментальне і теоретичне обґрунтування та розробка засобів епізоотологічного моніторингу, діагностики вірусних хвороб тварин та молекулярно-генетичного типування їх збудників (ортоміксо-, параміксо-, герпес-, цирко- та пестивірусна інфекції)

47. Герилович, А. П. Разработка и апробация методики выявления РНК вируса диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции [Текст] / А. П. Герилович // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологи животных, рыб, пчёл : материалы конф. (Mосква, 9-10 окт. 2008 г.). -- С. 102-106.

Анотація

Герілович А. П. Експериментальне і теоретичне обґрунтування та розробка засобів епізоотологічного моніторингу, діагностики вірусних хвороб тварин та молекулярно-генетичного типування їх збудників (ортоміксо-, параміксо-, герпес-, цирко- та пестивірусна інфекції). -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 -- ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія. Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини». Харків, 2011.

Створено уніфіковану систему розрахунку праймерних послідовностей на основі пошуку таргетних генів, їх аналізу щодо консервативних ділянок, біоінформатичного виявлення праймерів та оцінки їх якості за теоретичним мікро- і макроаналізом. Ефективність вказаної системи доведена на моделі РНК- та ДНК-матриць вірусів тварин з п'яти родин, завдяки чому розроблено дві векторні системи, дев'ять методик з індикації, ідентифікації та генотипування вірусів грипу птиці (тип А, підтипи H5, N1), ньюкаслської хвороби, інфекційного ринотрахеїту ВРХ, хвороби Ауєскі, інфекційного ларинготрахеїту птиці, цирковірусної інфекції свиней та діареї ВРХ. Методики та векторна система посвідчені патентами України на корисні моделі.

Уперше проведено молекулярно-епізоотологічні та філогенетичні дослідження українських ізолятів вірусів грипу птиці (2005-2008 рр.), цирковірусів свиней (2006-2008 рр.), вірусів ньюкаслської хвороби (1967-2008 рр.) та діареї ВРХ (2006-2008 рр.), на підставі чого визначено генотипи збудників, їх зв'язки з іншими генетично подібними популяціями та висунуто ряд гіпотез щодо ймовірних джерел їх потрапляння та видозмінення у популяції сільськогосподарських тварин і птиці в Україні.

Обґрунтовано застосування методів ПЛР, секвенування та ПДРФ у системі молекулярної діагностики хвороб тварин, контролю біотехнологічної сировини, продукції та генетичних ресурсів тварин.

За результатами досліджень розроблено, випробувано та зареєстровано в Україні шість молекулярно-генетичних тест-систем для виявлення ДНК і РНК вірусів тварин. Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України затверджені «Методичні рекомендації щодо розрахунку праймерних систем для індикації та ідентифікації патогенів тварин» та 6 рекомендацій на діагностичні протоколи.

Ключові слова: методологія розрахунку праймерів, методики виявлення РНК та ДНК патогенів тварин, секвенування, молекулярна епізоотологія, філогенетичний аналіз ортоміксо-, параміксо-, цирко- та пестивірусів тварин.

Аннотация

Герилович А. П. Экспериментальное и теоретическое обоснование и разработка средств эпизоотологического мониторинга, диагностики вирусных болезней животных и молекулярно-генетического типирования их возбудителей (ортомиксо-, парамиксо-, герпес-, цирко-и пестивирусная инфекции). -- Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени доктора ветеринарных наук по специальности 16.00.03 -- ветеринарная микробиология, эпизоотология, инфекционные болезни и иммунология. Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины». Харьков, 2011.

Создано унифицированную систему расчёта праймерных последовательностей на основе поиска таргетных генов, анализа их консервативных участков, биоинформатического расчёта праймеров и оценки их качества по теоретическим показателям методами микро- и макроанализа. Эффективность указанной системы доказана на модели РНК-и ДНК-матриц вирусов животных из пяти семейств, благодаря чему разработано две векторные системы, девять методик индикации, идентификации и генотипирования вирусов гриппа птиц (тип А, подтипа H5, N1), ньюкаслской болезни, инфекционного ринотрахеита КРС, болезни Ауески, инфекционного ларинготрахеита птиц, цирковирусной инфекции свиней и диареи КРС. Методики и векторная система защищены патентами Украины на полезные модели.

Впервые проведены молекулярно-эпизоотологические и филогенетические исследования украинских изолятов вирусов гриппа птицы (2005-2008 гг.), цирковирусов свиней (2006-2008 гг.), вирусов ньюкаслской болезни (1967-2008 гг.) и диареи КРС (2006-2008 гг.). Полученные данные указывают на циркуляцию в Украине двух независимых групп вируса гриппа птиц подтипа H5N1, первая из которых по первичной нуклеотидной последовательности напоминает ряд вирусов из Российской Федерации, наиболее близких в генетическом отношении к штаммам китайского происхождения, а вторая -- боле современные западноевропейские варианты.

Установлена генетическая разнородность популяций вирусов ньюкаслской болезни, которые в разные годы представлены штаммами 1, 2, 4 и 5 генотипов азиатского и европейского происхождения. Показан их межвидовой трафик и предложен альтернативный метод генотипирования возбудителя, который заключался в секвенировании смежного участка гена F, включая последовательность сайта нарезания.

Доказано генетическое разнообразие выявляемых среди свинопоголовья цирковирусов и их принадлежность к двум известным генотипам патогенного 2_го серотипа.

Оценка генетической вариабельности вирусов диареи КРС, обнаруженных в сперме и биопрепаратах для ветеринарного использования, показала наличие вируса обоих генотипов, включая неэндемичные штаммы генотипа 2.

Обосновано использование методов ПЦР, секвенирования и ПДРФ в системе молекулярной диагностики заболеваний, при контроле биотехнологичного сырья и продукции, генетических ресурсов животных.

По результатам исследований разработаны, испытаны и зарегистрированы в Украине шесть молекулярно-генетических тест-систем для выявления ДНК герпесвирусов ИРТ и болезни Ауєски, цирковирусов свиней и РНК ортомиксовируса высокопатогенного гриппа птиц, парамиксовируса ньюкаслской болезни и пестивируса -- возбудителя диареи КРС. Научно-методическим советом Государственного комитета ветеринарной медицины Украины утверждены «Методические рекомендации по расчёту праймерных систем для индикации и идентификации патогенов животных» и 6 рекомендаций на диагностические протоколы на основе классического варианта ПЦР.

Предложенные для практики разработки применяются в мониторинговой и диагностической работе, а также используются для биотехнологического контроля.

Ключевые слова: методология расчёта праймеров, методики выявления РНК и ДНК патогенов животных, секвенирование, молекулярная эпизоотология, филогенетический анализ ортомиксо-, парамиксо-, цирко- и пестивирусов животных.

Summary

Gerilovych A. P. Experimental and theoretical study and development of epizootological monitoring, diagnostics of animal viral diseases and their agents molecular-genetic typing means (orthomyxo-, paramyxo-, herpes-, circo- and pestyviral infections). -- Manuscript.

Thesis for the doctor's degree in veterinary science, specialty 16.00.03 -- veterinary microbiology, epizootology, infectious diseases and immunology. National Scientific Center `Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine'. Kharkiv, 2011.

The unified system of primer sequence calculating was elaborated based on search of target genes, analysis of their conservative sites, primer bioinformatics detection and assessment of its quality in theoretical micro- and mаcroanalysis. The effectiveness of the system proved to model RNA and DNA viruses of animals matrices of five viral families, so developed two vector systems, nine methods of detection, identification and genotyping avian influenza virus (type A, subtype H5, N1), Newcastle disease virus, infectious bovine rhinotracheitis virus, Aujeszky disease virus, infectious laryngotracheitis virus, porcine circovirus and bovine viral diarrhea virus. Methods for vector system construction and pathogen detection based on PCR were patented in Ukraine for utility models.

The first time the molecular and phylogenetic studies epizootological Ukrainian avian influenza virus isolates (2005-2008), porcine circovirus (2006-2008), Newcastle disease virus (1967-2008) and bovine diarrhea virus (2006-2008) was done. Based on this study the genotypes of pathogens and their relationship with other genetically similar populations were defined. Several hypotheses regarding possible sources of ingress and modifying them in populations of farm animals and poultry in Ukraine were formulated.

By the results of researches, six molecular genetic test systems for detection of DNA and RNA viruses of animals were tested in interlaboratory trials and registered in Ukraine. Scientific-Methodical Council of State Committee of Veterinary Medicine of Ukraine adopted `Guidelines on the calculation praymernyh systems for detection and identification of pathogens of animals' and six recommendations for diagnostic protocols.

Keywords: methodology of primer calculation, identifying methods of DNA and RNA animal pathogens, sequencing, molecular epizootology, phylogenetic analysis of orthomyxo-, paramyxo-, circo- and pestyviruses of animals

Размещено на Allbest.ru