Експериментальне і теоретичне обґрунтування та розробка засобів епізоотологічного моніторингу, діагностики вірусних хвороб тварин та молекулярно-генетичного типування їх збудників (ортоміксо-, параміксо-, герпес-, цирко- та пестивірусна інфекції)

Експериментально оптимізовані протоколи ПЛР на основі цих праймерних систем показали, що для ефективної ампліфікації ДНК-матриці різних герпесвірусів необхідним є додавання різної кількості іонів магнію до складу реакційної суміші (до фінальної концентрації від 2,5 до 4 мМ/см3), а також виправданим є застосування різних комерційно доступних базових наборів для ПЛР. Так, при виявленні ДНК герпесвірусів ІРТ та ІЛТ доцільним виявилось використовувати реактиви Амплісенс К 6_2, що дозволяло виявляти віруси в зразках з інфекційністю 1,5 lg ТЦД50/см3 та 0,8 lg EIД50/см3, а при детекції генетичного матеріалу вірусу хвороби Ауєскі -- базові суміші Core, що забезпечували індикацію ВХА при активності 1,0 lg ТЦД50/см3.

Методика виявлення ДНК вірусу ІРТ була впроваджена у систему контролю якості сперми з метою детекції збудника, а також стала основою для розробки діагностичної тест-системи «Bovi-DNA-test-IRT». Специфічність та висока чутливість діагностикуму була доведена у міжвідомчому досліді, на підставі чого його було рекомендовано до практичного застосування.

Протокол індикації ДНК вірусу хвороби Ауєскі став основою для розробки діагностичної тест-системи «Sui-DNA-test-ADV», яка продемонструвала високу чутливість, специфічність та була рекомендована до практичного застосування та використовується у моніторингових дослідженнях, які проводить ННЦ «ІЕКВМ».

На основі створених праймерів на ділянку гена тимідинкінази вірусу ІЛТ була розроблена методика індикації збудника за допомогою ПЛР, яка впроваджена у моніторингові та діагностичні дослідження й увійшла до «Методичних рекомендацій щодо індикації вірусу інфекційного ларинготрахеїту птиці методом полімеразної ланцюгової реакції».

З метою апробації запропонованої методики виявлення ДНК вірусу ІРТ були проведені дослідження різних зразків клінічного матеріалу від ВРХ та ДРХ з ознаками хвороби з 18 господарств, у тому числі 4 племоб'єднань 7 регіонів України (Харківської, Луганської, Донецької, Кіровоградської, Херсонської та Одеської областей та АР Крим). Крім того, щодо наявності контамінації цим збудником були досліджені зразки шести імпортованих в Україну партій сперми.

Проведені тестування дозволили виявити ДНК вірусу ІРТ у 2 імпортованих зразках, 6 зразках сперми баранів-плідників, 28 зразках сперми ВРХ, 42 зразках вагінальних зскрібків та 46 зразках паренхіматозних органів від аборт-плодів та іншого патологічного матеріалу.

Крім того, встановлено циркуляцію вірусу інфекційного ринотрахеїту серед великої рогатої худоби у 12 господарствах 6 областей України (Харківської, Луганської, Донецької, Кіровоградської, Херсонської та Одеської та АР Крим). Вірусоносійство при цьому спостерігали на фоні як застосування живих вакцин вітчизняного виробництва, так і серед не щеплених тварин. Метод ПЛР виявився більш чутливим за РІФ, оскільки дозволяв виявляти на 1-2 % більше позитивних зразків при дослідженні різних матеріалів.

Отже, ефективність розробленої системи розрахунку й оцінки якості праймерних систем була показана на моделі ДНК-вміщуючих вірусів родини Herpesviridae, завдяки чому для практики ветеринарної медицини запропоновано три методики на основі ПЛР і дві молекулярно-генетичні тест-системи. Базова методика виявлення ДНК вірусу ІРТ продемонструвала високу аналітичну чутливість, що визначає її як корисний тест у системі контролю вірусоносійства серед племінного та товарного поголів'я ВРХ й обґрунтовує доцільність залучення її до процесів оцінки якості генетичних ресурсів, зокрема сперми жуйних тварин.

З огляду на світовий досвід ця система має бути комплексною по відношенню до збудників інших інфекційних хвороб ВРХ з вертикальним шляхом передачі. Це зумовило необхідність продовження досліджень у напряму конструювання засобів детекції вірусу діареї, як другого за значимістю патогена після вірусу ІРТ.

Аспекти молекулярної епізоотології, розробка та апробація засобів діагностики цирковірусної інфекції свиней. Метою цієї частини виконаних досліджень було вивчення геномів ЦВС І та ІІ типів для створення системи індикації і диференціації збудника за допомогою ПЛР, оцінка широти циркуляції вірусу в господарствах України, визначення молекулярно-епізоотологічних характеристик ЦВІС на основі аналізу філогенетичних взаємозв'язків епізоотичних штамів.

Необхідність обраного напряму була обумовлена генетичними властивостями збудника. Існувала потреба у перевірці сформульованого алгоритму розрахунку праймерів на моделі одноланцюгових ДНК-матриць. З прикладної точки зору вона також пояснюється відсутністю в Україні комерційних засобів індикації, а на всьому просторі СНД -- типування цього збудника на фоні численної циркуляції вірусів серед свинопоголів'я.

Секвенування ДНК ЦВС_ІІ, що циркулює в Україні, мало на меті встановити вектори поширення захворювання та генотиповий склад популяції збудника, що сприяло створенню та застосуванню засобів специфічної профілактики.

Результатами проведеного порівняльного аналізу геномів ЦВС І та ІІ серотипів доведено високий ступінь їх гомології (понад 90 %). Проте, особливий інтерес з точки зору розробки системи праймерів для диференціації викликали саме невеликі за розміром відмінні ділянки ДНК.

За допомогою подальших біоінформатичних досліджень з пошуку олігонуклеотидів для ПЛР у консервативних ділянках геномів ЦВС І та ІІ типів були відповідно підібрані серотипоспецифічні праймерні системи PCV_2 F/R та PCV_1 F/R, які обмежували фрагменти гена rep довжиною 388 та 416 п. н. Окрім серотипоспецифічних були створені універсальні праймери, придатні як для індикації ЦВС, що теоретично можна було досягти за умов зниження специфічності гібридизації праймеру в одній або двох позиціях за зменшення температури відпалу, так і для ідентифікації ЦВС_ІІ за більш високої температурі відпалу (гібридизація за 100 %_ї комплементарності), що є технологічно та економічно виправданим кроком у системі діагностики. Цей принцип, який полягав у поетапності тесту із застосуванням тієї ж самої пари праймерів, що дозволяв за різних температурних умов відпалу проводити широко- та вузькоспецифічну детекцію ділянок ДНК, отримав назву методу T_step_point ПЛР. У нашому випадку були сконструйовані праймери, PCV 1_2, 5'- та 3'_кінці яких мали 100 %_ву комплементарність з ДНК обох серотипів ЦВС, що на 100 % комплементарно ЦВС_ІІ та на 85 % -- ЦВС_І (праймер містив три заміни по відношенню до послідовності штаму РК_15 ЦВС_І).

Теоретично пара PCV 1_2, розрахована за описаним вище принципом та згідно розробленого нами алгоритму, дозволяла проводити ампліфікацію 421 п. н._фрагменту гена rep ЦВС_ІІ за температури відпалу 59-62 °С та 421-428 п. н._фрагменту обох серотипів ЦВС за температури 52-55 °С, що було доведено експериментально (табл. 1).

На основі олігонуклеотидної пари PCV_1_2 запропонована тест-система для виявлення ДНК ЦВС_ІІ методом ПЛР «Sui-DNA-test-PCV2», яка за результатами міжлабораторного та міжвідомчого комісійних випробувань рекомендована в практику ветеринарної медицини.

З метою вивчення широти циркуляції ЦВС і вивчення генотипової варіабельності збудника інфекції проведені дослідження клінічного матеріалу (крові та зразків внутрішніх органів) від свиней різних статевовікових груп, підозрюваних у носійстві або захворюванні, з 16 господарств різних регіонів України та одного господарства Російської Федерації.

Таблиця 1 Ефективність специфічного відпалу праймерів PCV 1_2 на матрицях ДНК ЦВС_І та ЦВС_ІІ за різної температури (40 циклів ампліфікації)

Матриця ЦВС-І	Температура відпалу, °С
	52	54	55	57	59	60	61	62	65
40	+ (несп)	+	+	±	-	-	-	-	-
4	+ (несп)	+	+	-	-	-	-	-	-
2	+ (несп)	+	+	-	-	-	-	-	-
0,4	+	+	+	-	-	-	-	-	-
0,2	+	+	+	-	-	-	-	-	-
0,04	+	+	±	-	-	-	-	-	-
Матриця ЦВС-ІІ	Температура відпалу, °С
	52	54	55	57	59	60	61	62	65
40	+ (несп)	+	+	+	+	+	+	±	-
4	+ (несп)	+	+	+	+	+	+	±	-
2	+ (несп)	+	+	+	+	+	+	-	-
0,4	+ (несп)	+	+	+	+	+	+	-	-
0,2	+ (несп)	+	+	+	+	+	±	-	-
0,04	+ (несп)	+	+	+	+	+	±	-	-

ДНК цирковірусів виявлено в зразках від свиней, що належали 12 господарствам Луганської, Харківської, Сумської, Полтавської, Дніпропетровської та Донецької областей, а також Бєлгородської області Російської Федерації.

Вірусоносійство виявляли серед 17-100 % дослідженого поголів'я у різних господарствах. Клінічні ознаки захворювання були надзвичайно різноманітними, оскільки ЦВІС жодного разу не реєструвалась як моноінфекція.

Умовно всі зареєстровані форми вірус-вірусних, вірус-мікоплазмених та вірус-хламідійних захворювань свиней, до етіологічної структури яких входив ЦВС_ІІ, можна було розподілити на три групи:

-- захворювання, що супроводжувалось розвитком респіраторних клінічних проявів у молодняка чи тварин усіх вікових груп;

-- розлади системи репродукції;

-- змішана форма перебігу.

Характер патологічного процесу, що спостерігали, можна пояснити природою та тропністю первинних етіологічних агентів (мікоплазм, хламідій, вірусу РРСС та парвовірусу свиней).

У результаті ДНК-аналізу секвенованих ділянок гена rep довжиною 421 п.н. встановлено наявність трьох груп українських ізолятів цирковірусу свиней типу ІІ. Перший кластер, до якого увійшли ізоляти PCV2 Poltava та PCV2 Dnipro, у порівнянні з ізолятом k43C, характеризувався наявністю трьох замін: С>G в локусі 308 п. н., А>G -- 363 та Т>G -- 365 п. н. Другий був представлений ізолятами PorBelgorog та PCV2 Lugansk. Ці ізоляти містили по 11 замін у досліджуваній ділянці гена rep та делецію розміром 2 п. н. Третя група складалася з ізолятів PCV2 Lugansk2 та PCV2 Kharkov. Вони несли 14 нуклеотидних замін у ділянці гена rep довжиною 421 п. н., проте не мали відповідної делеції у позиціях 198-199 п. н. за матрицею вирівнювання. Характер замін другого та третього варіантів вірусу відзначався за локусами, що відповідали 248, 256 п. н. (відсутні у групи 2), 155, 289, 291, 367, 382 п. н. (відсутні у групи 3).

Після трансляції нуклеотидних послідовностей встановлено, що другий кластер різниться від першого на 13 амінокислот з майже 140 (ізолейцин (I) > серин (S) у позиції 52, фенілаланін (F) > S -- 53, 55, XX (зсув рамки зчитування за рахунок делеції) -- валін (V), аспарагін (N) -- 67, 66, аргінін (R) > лізин (K) -- 85, R > пролін (P) -- 103, гліцин (Q) > лейцин (L) -- 107, триптофан (T) > I -- 113, V > L -- 121, 122, S > N -- 123, R > K -- 130), які кодувала секвенована послідовність, що стало свідченням антигенних перебудов у різних субпопуляціях вірусу.

Другий кластер відрізнявся від третього лише у п'яти амінокислотних позиціях, тому лише п'ять нуклеотидних замін, виявлених при секвенування, були значущими (S > F -- 55, R > K -- 83, L > метіонін (M) -- 86, V > L -- 94, N > S -- 123).

Таким чином, було встановлено циркуляцію трьох підгруп вірусів, що мають дещо іншу нуклеотидну структуру відносно один одного. Це, у свою чергу, відбивалось і на амінокислотних послідовностях гена rep досліджуваних вірусів.

На підставі аналізу генетичної варіабельності ділянок ДНК збудника ЦВІС зроблено висновок, що ізоляти другого кластеру спричиняли розвиток респіраторних уражень, у той час як дві інші групи вірусів виявляли як за репродуктивних, так і за респіраторних та змішаних форм перебігу ЦВІС. Означені закономірності свідчать про наявність у послідовностях ДНК ЦВС_ІІ маркерів патогенних особливостей вірусів кожної з підгруп та зумовлює необхідність поглиблення цього напряму досліджень.

Аналіз секвенованих генотип-репрезентуючих фрагментів ДНК ЦВС_ІІ, ампліфікованих зі зразків матеріалу від свиней та поросят з асоційованим перебігом ЦВІС з РРСС, ПВІС, хламідіозами та мікоплазмозами, продемонстрував наявність трьох філогенетично споріднених груп вірусу, що мали зв'язки з ізолятами різних генотипів: як патогенними європейського генотипу (PCV2 Lugansk (ТОВ «Гранум»), PCV2 Lugansk2 (ТОВ «Клич»), PCV2 Kharkov (ТОВ АФ «Діброво») та PorBelgorog (ФДУ «Красноярузький СК»)), так і контамінантами культуральних біопрепаратів американського походження (PCV2 Poltava (ТОВ АФ «Ім. Фісуна») та PCV2 Dnipro (СТОВ «ЮСОЛС»)) (рис. 5).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 5 Дендрограма спорідненості штамів та ізолятів ЦВС_ІІ (Neighbor Joining, ¦ -- ізоляти українського походження)

Отже, за дослідження генетичних особливостей цирковірусів свиней І та ІІ серотипів було розроблено диференційні системи праймерів та ПЛР_протоколи на їх основі. За секвенування ДНК цирковірусів у ділянці гена rep встановлено циркуляцію у свинарських господарствах України ЦВС_ІІ генотипів 1 і 2.

Розробка системи індикації вірусу діареї великої рогатої худоби та генотипування збудника. Нами експериментально обґрунтувано ефективність алгоритму розрахунку праймерів для виконання різних типів досліджень за допомогою ПЛР на прикладі систем детекції РНК- та ДНК-вміщуючих вірусів. Даний етап досліджень передбачав продовження робіт щодо вдосконалення системи оцінки вірусної контамінації об'єктів ветеринарного нагляду (сперми ВРХ та інших), перш за все за детекцією вірусу діареї, як об'єкту подальших досліджень. Іншим фактором, що сприяв цьому, була його найбільша мінливість у межах родини та нетиповість будови РНК пестивірусів у цілому.

Доцільність скринінгу вірусоносійства на основі ПЛР при ВД ВРХ, контамінації сперми та продуктів тваринництва, біопрепаратів та культур клітин, генотипової належності збудників, детектованих у різних матеріалах з метою визначення ризиків заносу та поширення високопатогенних неендемічних варіантів зумовлювала наші подальші дослідження.

Спочатку був проведений аналіз нуклеотидних послідовностей двох ділянок геному вірусу діареї ВРХ: гена polyP (кодує поліпротеїнову структуру вірусу, яка в процесі збірки віріонів трансформується в основні антигенні одиниці збудника) та гена нефункціонального протеїну, розташованого в зоні унікальних кінцевих повторень на 5'_кінці РНК ВД (5' UTR), що дозволив виявити перспективні для видоспецифічної детекції та генотипування вірусу діареї ВРХ праймери BVDV, які фланкували ділянку 5' UTR-фрагмента довжиною 287 п. н.

За результатами проведених експериментів з оптимізації методики виявлення РНК вірусу діареї було встановлено, що найбільш контрастні смуги ампліконів навіть у кДНК з найменш активних зразків вірусу утворювались за умов застосування 40_циклової ампліфікації реакційних сумішей АмпліСенс та ТОВ «Ізоген», які забезпечували однаково ефективне виявлення генетичного матеріалу ВД у кінцевих розведеннях, що відповідало активності 0,5 та 1 lg ТЦД50/см3. На основі розробленого протоколу ПЛР була сконструйована молекулярно-генетична тест-система «Bovi-RNA-test-BVDV», яка пройшла міжвідомчі випробування та була зареєстрована в Україні.

Ефективність розробленої тест-системи була випробувана в умовах скринінгу вірусоносійства серед тварин, контролю вірусної контамінації генетичних ресурсів, клітинних ліній і біопрепаратів на їх основі.

Моніторингові дослідження щодо вірусної діареї проводились сумісно з відділом вірусології ННЦ «ІЕКВМ» у господарствах Запорізької, Полтавської, Миколаївської, Одеської, Харківської, Житомирської, Донецької та Черкаської областей. У даних областях було відібрано та досліджено за допомогою ПЛР 68 проб сперми від бугаїв-плідників, 45 проб вагінальних зскрібків від корів та нетелів, а також 73 проби органів від аборт-плодів і вимушено забитих телят. Було встановлено, що 4,4-19,8 % аналізованих об'єктів містили генетичний матеріал збудника.

Порівняльний аналіз запропонованого тесту показав, що він на 10-16 % переважає РІФ за чутливістю, що збігається з даними іноземних науковців та дозволяє визнати його потенційно кращим для оцінки якості сперми та скринінгу тварин щодо вірусоносійства при дослідженні змивів та зскрібків.

У ході впровадження системи контролю генетичних ресурсів перевірено 256 зразків сперми ВРХ від 126 бугаїв-плідників. За результатами цих досліджень було виявлено РНК ВД у 55 зразках (17 %). При цьому в 42 зразках одночасно детектовано РНК ротавірусу ВРХ, а у 4 спермодозах -- асоціацію ІРТ та ВД. У 5 % сперми була детектована ДНК хламідій, причому, лише у 2 зразках вона виявлялась без додаткових агентів, у решті спостерігали також контамінацію вірусом ІРТ. Вірус ІРТ як моноконтамінант був детектований лише у 14 з 30 позитивних проб (рис. 6).

Рис. 6 Співвідношення контамінантів сперми ВРХ

Отримані під час досліджень у господарствах України результати були узагальнені у «Методичних рекомендаціях щодо контролю контамінації сперми ВРХ вірусами і хламідіями», а зібрані при цьому проби використовували для проведення секвенування кДНК вірусу, визначення його філогенетичних зв'язків і молекулярно-епізоотологічних особливостей.

Відомо, що контамінація культур клітин здебільшого обумовлена нецитопатогенними варіантами вірусу, що ускладнює їх індикацію вірусологічними методами. Штами цього біотипу вірусу містять також нестабільні ділянки РНК, що призводить до зменшення цільових фрагментів у пробі, та, як наслідок, до хибно-негативних реакцій, отже не можна достовірно встановити контамінацію чи її відсутність. З огляду на це, для контролювання біопрепаратів для ветеринарної медицини і сировини для їх виробництва нами був запропонований метод концентрування РНК ВД на мембрані розподільчої колонки для селективної ізоляції плазмід. Пропускна здатність цих колонок становить 20 тис. п. н., молекули високої маси (> 20 тис. п. н.). Отже, баластні молекули нуклеїнових кислот, що містяться у сумарних екстрактах та потенційно можуть пригнічувати активність полімерази та ревертаз, проходять крізь пори таких колонок та не сорбуються на шарі силікагелю розподільчої мембрани. Елюювання РНК вірусу діареї після вивільнення від додаткових речовин проводилося у половинній кількості перерозподілом до ТЕ_буферу, чим досягалося дворазове у порівнянні до початкового зразка концентрування аналіту.

Випробування цієї методики на практиці показало, що з 16 негативних зразків біопрепаратів та культур клітин, РНК з яких виділяли звичайним способом сорбентної екстракції, 2 були контаміновані за результатами ПЛР після колонкової очистки від баластних нуклеїнових кислот. Ця методика успішно впроваджена в систему контролю суспензій клітин культур та концентрованих антигенів.

За результатами проведеного скринінгу культур клітин і біотехнологічної продукції встановлено наявність пестивірусу діареї у культуральних розплідках (FLK (1994), СПЕВ (1993)) та п'яти імунобіологічних препаратах, у тому числі вірус-вакцині ЛК_М проти класичної чуми свиней і комплексному металоглобуліні (КМГ_3).

Зразки, що за даними ПЛР-дослідження містили вірус діареї ВРХ (культури СПЕВ (1993), FLK (1994), сироватка крові ВРХ для біотехнологічних потреб, КМГ_3, вакцина проти класичної чуми свиней і два зразки сперми ВРХ), були використані з метою визначення генотипу збудника.

Один з провідних вчених у сфері генотипування збудника діареї ВРХ (Vilcek S., 2001, 2004) у своїх роботах неодноразово підкреслював найбільшу інформативність аналізу нуклеотидних послідовностей генотип-репрезентуючих ділянок вірусної РНК, зокрема ділянки 5'-UTR та Npro-області.

Отримані в результаті проведеного секвенування нуклеотидні послідовності фрагмента 5'-UTR довжиною 287 п. н. показали наявність чотирьох варіантів серед досліджуваних зразків вірусу діареї. Аналіз даних щодо кількості замін у досліджуваній області дозволив віднести до першого варіанта контамінанти, виявлені в сироватці крові ВРХ та в клітинних культурах (попарні відстані в межах групи складали 0,030-0,046, а між групами -- 0,130-0,373), до другого -- вірус, виявлений у вакцині проти КЧС та комплексному металоглобуліні (відстань у групі -- 0,095, між групами -- 0,130-0,373), до третього та четвертого -- контамінанти сперми ВРХ (міжгрупові відстані 0,200-0,373).

За результатами біоінформатичних порівнянь цих послідовностей з референтними Soldan -- U94914, 34B -- AF244952, SW90 -- AB003622, CD87 -- L32887, CS9598B -- Z79763, SE1146 -- Z79768 та іншими штамами генотипів 1 і 2 сконструйовано множинне рівняння та оцінено показники гомології вказаних вірусних контамінантів. Установлено, що попарні відстані між послідовностями аналізованої вибірки складали 0,000-0,349 у цілому та по групах: з першою -- 0,023-0,328, з другою -- 0,008-0,349, третьою -- 0,000-0,344, четвертою -- 0,072-0,327.

Побудована на основі отриманого рівняння дендрограма за топографічними особливостями гілкування розщеплювалось на дві основні лінії, що містили штами генотипів 1 і 2. У межах першого генотипу виявлено два субклади, один з яких представлений нецитопатогенними штамами типу NADL (1a), а другий -- цитопатогенними штамами (типовий представник -- штам Osloss) (1b). Генотип ІІ мав також два підтипи, а саме 2a (представлений штамом Soldan) та 2b (штам SE1146).

Секвеновані зразки кДНК вірусу діареї ВРХ, детектовані в зразках культур СПЕВ (1993), FLK (1994), сироватці крові ВРХ для біотехнологічних потреб, віднесені до генотипу 1b. При цьому перші два контамінанти були найбільш близькі до штаму Manas вірусу діареї ВРХ вказаного генотипу. Вірус, виявлений у сироватці крові ВРХ, мав найбільшу спорідненість зі штамом 390. Контамінанти, детектовані у вакцині проти класичної чуми свиней закордонного виробництва та комплексному металоглобуліні, належали до першого генотипу субтипу 1а вірусу діареї та демонстрували найближчу генетичну спорідненність до штамів NADL та Letuyi відповідно (рис. 7).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 7 Філогенетичні зв'язки між штамами вірусу діареї ВРХ (Neighbor Joining, Bootstrap = 1000, ізоляти українського походження позначені Ў)

Ізоляти вірусу діареї Poltava та Cherv Veleten належать до другого генотипу, а саме субтипів 2а та 2b відповідно. Їх топографічне розташування на дендрограмі вказувало на спорідненість означених контамінантів зі штамами TR-2006 (Канада) та Kosice (Західна Європа) відповідно. Отримані дані показали, що в Україні вже циркулюють неендемічні варіанти вірусу, здатні спричиняти масове захворювання телят і дорослих тварин. На превеликий жаль, наша держава є не єдиною з_поміж країн Європи, на території яких циркуляцію вірусу генотипу 2 зареєстровано останнім часом (вірус цієї генетичної родини детектували в Словаччині (Vilcek S., 2004), Франції (Liu L., 2009), Голландії (Mars M. H., 2005) та інших країнах). Установлення неендемічних варіантів вірусу ВРХ у країнах Євразії є сигналом для посилення заходів щодо контролю його розповсюдження, включаючи розробку засобів діагностики та систем моніторингу, а також зумовлює необхідність ретельного скринінгу об'єктів ветеринарного нагляду, особливо генетичних ресурсів, які вміщували означений тип збудника.

За результатами проведених досліджень розроблено систему індикації РНК вірусу діареї ВРХ, що дозволяє ампліфікувати перспективні області для генотипової диференціації збудника. Установлено циркуляцію в Україні вірусу генотипів 1 та 2. Показано ефективність системи ПЛР-методик при скринінгу вірусної контамінації генетичних ресурсів та об'єктів біотехнологічного контролю.

Отже, ефективність теоретично сформульованої нами системи розробки олігонуклеотидів, що складалась з підбору таргетного гена, його біоінформатичного аналізу, обрання консервативних ділянок, програмного обчислення олігонуклеотидів і перевірки їх якості й оцінки ампліфікаційних параметрів, була експериментально доведена на РНК- та ДНК-матрицях ортоміксо_, параміксо_, пести_, герпес_ та цирковірусів тварин. Були створені методології клонування генів вірусів хвороби Марека та високопатогенного грипу птиці, методики виявлення ДНК та РНК збудників за ПЛР, які стали основою для п'яти молекулярно-генетичних тест-систем, а також методик генотипування патогенів тварин. Проведений масив досліджень на практиці показав слушність означеної методології, дозволивши за короткий термін вирішити проблему браку експрес-методів діагностики на ринку України та започаткувати розвиток молекулярно-епізоотологічних досліджень популяцій вірусів тварин, що циркулюють у птахівничих, свинарських та скотарських господарствах і дикій фауні.

Висновки

1. У дисертації теоретично обґрунтовано та розроблено систему розрахунку олігонуклеотидів, валідації діагностичних методів, створення діагностикумів на основі узагальнення результатів молекулярно-генетичних, молекулярно-епізоотологічних і біоінформатичних досліджень збудників ортоміксо_, параміксо_, герпес_, цирко_ та пестивірусних інфекцій тварин. Ефективність розроблених методик експериментально аргументована при конструюванні тест-систем і засобів для індикації та ідентифікації вірусів грипу А з типування високопатогенних варіантів підтипу H5N1, ньюкаслської хвороби, інфекційного ларинготрахеїту птиці, хвороби Ауєскі, цирковірусів свиней, герпесвірусу інфекційного ринотрахеїту та пестивірусу діареї ВРХ, що забезпечують гено_ та патотипування, визначають походження та еволюцію збудників вірозів тварин на основі засобів молекулярної епізоотології.

2. Використання комплексу біоінформатичного забезпечення BioEdit, AmplifX, Oligo Software, BLAST і FASTA on_line дало можливість обґрунтувати універсальну систему створення та оцінки якості праймерів, яка складається з обрання таргетних генів через скринінг видо- та типоспецифічних мотивів вірусних геномів, множинного вирівнювання їх послідовностей, пошуку консервативних ділянок з ентропією не вище 0,2 за позицією та довжиною більше 15 п. н., програмного розрахунку олігонуклеотидів з урахуванням розмірів амплікону (150-600 п. н.), GC_вмісту (50 ± 5 %), GC_вмісту 3'_кінця (50-75 %), комплементарності до матриці, локальної (off_line), глобальної (on_line) оцінки їх широти детекції і таксономічної специфічності.

3. Застосування розроблених праймерів і методик для long_ПЛР дозволяє отримувати синтетичні гени gB та pp38 вірусу хвороби Марека та гемаглютиніну підтипу H5 високопатогенного вірусу грипу птиці, які можуть бути застосовані для конструювання рекомбінантних векторів з ефективністю 20-60 % та специфічністю 80-100 % за ПЛР-скринінгом.

4. Розроблено систему індикації та ідентифікації вірусів грипу А підтипу Н5N1 за ампліфікацією ділянок генів матриксного протеїну, гемаглютиніну та нейрамінідази, що забезпечує виявлення в досліджуваному матеріалі збудника в кількості, тотожній активності від 0,5 log2/см3. За розробленими тестами ідентифіковано 14 ізолятів вірусу грипу А, у тому числі виділених під час епізоотій в АР Крим.

5. Послідовності генів HA та NA ізолятів вірусу грипу А підтипу H5N1, виділених під час епізоотії 2005-2006 рр., характеризують штами Influenza A virus/Ch/Syvash/02/2005 (H5N1) та Influenza A virus/Ch/Prymorsky/01/2006 (H5N1), які мають 98,4-98,6 % гомології з ізолятами з Російської Федерації, як такі, що походять з азіатської генетичної лінії вірусів. Штам Influenza A virus/ Krasnogvardeysky/58/2008 (H5N1) є спорідненим з європейськими вірусами, що свідчить про наявність двох незалежних субпопуляцій збудника грипу, які зумовлюють ризики реасортації і можуть призвести до нових спалахів захворювання.

6. Установлено, що ген F вірусу ньюкаслської хвороби є носієм гено- та патотипоспецифічних ознак, на основі чого сконструйовані олігонуклеотиди NDV fusion та LaSota fusion, які у 40-45_цикловій ПЛР забезпечують індикацію збудника та диференціацію штамів, подібних до LaSota, у біоматеріалах. Ефективність ПЛР_методик на основі цих праймерів доведено при дослідженні вірусоносійства у дикої птиці та ідентифікації 32 епізоотичних ізолятів вірусу.

7. Віруси ньюкаслської хвороби, що виділені в Україні у період з 1967 по 2008 рр., віднесено до чотирьох генотипів за класифікацією E. Aldous (2003), а саме, першого, другого, четвертого (4b і 4d) та п'ятого (5а, 5d і 5c). Показано ідентичність результатів секвенування з використанням праймерів E. Aldous та NDV fusion щодо визначення генотипу та патотипу вірусу, що обґрунтовує доцільність застосування розробленої вітчизняної тест-системи «Poul_RNA_test_NDV» не тільки з метою діагностики або моніторингу хвороби, але й для вирішення задач з філогенетичних і молекулярно-епізоотологічних досліджень.

8. Експериментально встановлено тотожність даних патотипування вірусу ньюкаслської хвороби за оцінкою послідовностей гена F довжиною 375 п. н. та NP -- 580 п. н. методом секвенування та РЕА. Чотири з 13 проаналізованих за цими протоколами ізолятів належать до ленто_, один -- до мезо_ і вісім -- до велогенного варіантів збудника згідно топографії дендрограм філогенетичного аналізу та характеру патернів утворюваних рестриктів.

9. Біоінформатичний аналіз генів і геномів герпесвірусів тварин свідчить, що нуклеотидні послідовності генів глікопротеїнів і тимідинкінази можуть бути застосовані як таргетні для діагностичної детекції герпесвірусів ссавців і птиці. Розроблені зразки праймерів на основі фрагментів вірусного геному IRTV_gE, AuDV_gE та ILTV забезпечують ідентифікацію збудників інфекційного ринотрахеїту в спермі та іншому клінічному матеріалі, хвороби Ауєскі та інфекційного ларинготрахеїту птиці в зразках з інфекційністю 1,5 і 1 lg ТЦД50/см3 та 0,8 EIД50/см3 відповідно, що задовольняє діагностичні та моніторингові потреби.

10. Наявність типо- та видоспецифічних мотивів у області гена rep цирковірусу свиней І та ІІ типів дозволяє проводити детекцію та серотипову диференціацію збудника з утворенням продуктів ампліфікації з праймерами PCV_1 та PCV_2 довжиною 416 та 388 п. н. відповідно, виявляючи 2-4 мкг/см3 ДНК цирковірусів у біоматеріалах за вірусоносійства.

11. За допомогою молекулярно-генетичного моніторингу доведено розповсюдження збудників вірусних хвороб свиней (ЦВС_ІІ, вірус РРСС, ПВС) серед свинопоголів'я господарств Сумської, Харківської, Луганської, Полтавської, Донецької областей України та Бєлгородської -- Російської Федерації, що призводить до виникнення та розвитку респіраторних, репродуктивних і змішаних поліетіологічних (РРСС_ЦВІС, РРСС_ПВІС_ЦВІС та ЦВІС_ензоотична пневмонія) симптомокомплексів, які супроводжуються ураженням респіраторної системи (до 74 %), абортами (до 15 %) та мертвонародженнями (до 50 %). Циркулюючі збудники належать до американського (у двох господарствах) та європейського (у чотирьох господарствах) генотипів ЦВС_ІІ.

12. Методика виявлення РНК вірусу діареї великої рогатої худоби за допомогою ампліфікації 287 п. н. ділянки кДНК (РНК) з використанням праймерів BVDV F/R та створена на її основі діагностична тест-система забезпечують специфічні, точні та відтворювані результати детекції вірусу в зразках діагностичного матеріалу та об'єктах біотехнологічного контролю з інфекційністю від 0,5 lg ТЦД50/см3.

13. Розроблена система детекції контамінантів сперми ВРХ на основі виявлення ДНК вірусу ІРТ та хламідій, а також РНК вірусу діареї, за допомогою якої при дослідженні спермопродукції вітчизняного та зарубіжного походження встановлено наявність вірусної моно_ і поліконтамінації на рівні 44 %, у тому числі на долю вірусу ІРТ припадає 9 %, ВД -- 17 %, ІРТ+ВД -- 1 %, ВД+ротаврус -- 13 %.

14. Результати генотипування семи зразків вірусів діареї ВРХ, які були виявлені у спермі та ветеринарних імунобіологічних препаратах, вказують на циркуляцію всіх чотирьох субтипів збудника, що належать до двох генотипів -- 1 (5 ізолятів) та 2 (2 ізоляти). Вірус першого (європейського) генотипу виявляється у культурах клітин та ВІП (1a -- 2, 1b -- 3), а другого (американського) -- у спермі ВРХ (2a -- 1, 2b -- 1), що свідчить про тенденцію поширення високопатогенного неендемічного варіанта чинника серед ВРХ в Україні.

Пропозиції для практики

Для практики ветеринарної медицини запропоновані:

1. НД на «Тест-систему для виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н5N1 методом полімеразної ланцюгової реакції» (ТУ У 24.4-00497087-060:2007, РП № 3271-14-2871-07/08-1/0).

2. НД на «Тест-систему для виявлення РНК вірусу ньюкаслської хвороби методом ПЛР «Poul-RNA-test-NDV» (ТУ У 24.4-00497087-066:2008).

3. НД на «Тест-систему для виявлення ДНК вірусу інфекційного ринотрахеїту ВРХ «Bovi-DNA-test-IRT» (ТУ У 24.4-00497087-080:2009).

4. НД на «Тест-систему для виявлення ДНК вірусу хвороби Ауєскі «Sui_DNA-test - ADV» (ТУ У 24.4-00497087-082:2009).

5. НД на «Тест-систему для виявлення ДНК цирковірусу свиней «Sui_DNA-test-PCV2» (ТУ У 24.4_00497087_081:2009).

6. НД на «Тест-систему для виявлення РНК вірусу діареї ВРХ «Bovi_RNA-test-BVDV» (ТУ У 24.4_00497087_070:2009).

7. Методичні рекомендації щодо розрахунку праймерних систем для виявлення патогенів тварин (затверджені НМР ДКВМ України, протокол № 1 від 23-24 грудня 2009 р.).

8. Методичні рекомендації щодо виявлення вірусу грипу А та його диференціації від вірусу ньюкаслської хвороби за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (затверджені НМР ДКВМ України, протокол № 1 від 20 грудня 2007 р.).

9. Методичні рекомендацій щодо виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу H5N1 за геном гемаглютиніну (затверджені НМР ДДВМ МАП України, протокол № 3 від 20 грудня 2006 р.).

10. Методичні рекомендації щодо виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу H5N1 за геном нейрамінідази (затверджені НМР ДДВМ України, протокол № 3 від 20 грудня 2006 р.).

11. Методичні рекомендації щодо контролю контамінації сперми вірусами та хламідіями методом ПЛР (затверджені НМР ДКВМ України, протокол № 4 від 20 грудня 2007 р.).

12. Методичні рекомендації щодо виявлення вірусів свиней за допомогою ПЛР (затверджені НМР ДКВМ України, протокол № 1 від 23-24 грудня 2009 р.).

13. Методичні рекомендації щодо індикації вірусу інфекційного ларинготрахеїту птиці методом полімеразної ланцюгової реакції (затверджені НМР ДКВМ України, протокол № 4 від 20 грудня 2007 р.).

14. Спосіб виявлення ДНК вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби (патент на корисну модель № 25808, 2007 р.).

15. Спосіб виявлення РНК вірусу ньюкаслської хвороби (патент на корисну модель № 25810, 2007 р.).

16. Спосіб виявлення ДНК вірусу хвороби Ауєскі (патент на корисну модель № 29317, 2008 р.).

17. Спосіб отримання клонів E. coli -- носіїв генів вірусу хвороби Марека gB та pp38, як компонентів ДНК-вакцини (патент на корисну модель № 29318, 2008 р.).

18. Спосіб виявлення диференціації цирковірусів свиней І та ІІ серотипів за T-step-point-ПЛР (патент на корисну модель № 25809, 2007 р.).

19. Спосіб ідентифікації кДНК штамів вірусу високопатогенного пташиного грипу типу Н5 за ампліфікацією специфічної ділянки НА-гену (патент на корисну модель № 18727, 2006 р.).

20. Спосіб виявлення РНК вірусу діареї великої рогатої худоби (патент на корисну модель № 31039, 2008 р.).

21. Спосіб виявлення вірусу інфекційного ларинготрахеїту за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (патент на корисну модель № 31041, 2008 р.).

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Високопатогенний грип птиці [Текст] / Б. Т. Стегнiй, А. П. Герілович, Л. В. Коваленко, А. І. Бузун, А. М. Головко, Л. В. Олійник, І. Ю. Бісюк, С. С. Драгуть, Д. В. Музика, М. Ю. Стегній, В. І. Стеценко, І. І. Білоконов, Т. М. Приходько, О. М. Рула, Ю. П. Балим ; під ред. Б. Т. Стегнiя. -- Х. : ННЦ «IЕКВМ», 2006. -- 144 с. (Дисертантом написані у співавторстві окремі розділи монографії).

2. Полiмеразна ланцюгова реакція у практиці ветеринарної медицини [Текст] : наук.-метод. посібник / Б. Т. Стегнiй, А. П. Герілович, О. Ю. Лиманська, В. І. Болотін, А. В. Скрипник, С. А. Сапко, Р. Ю. Анічин. -- Х. : ННЦ «IЕКВМ», 2006. -- 110 с. (Дисертантом написані окремі розділи посібника, узагальнені викладені в ньому відомості та створено ряд методик, що наводяться у спеціальній частині видання).

3. Герилович, А. П. Обоснование практических подходов к разработке методик индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний животных вирусной этиологии на основе ПЦР-анализа [Текст] / А. П. Герилович // Вет. патология. -- 2007. -- № 4 (23). -- С. 107-111.

4. Герiлович, А. П. Вивчення можливості синтезу гену gB вірусу хвороби Марека in vitro та розробка регламенту його ампліфікації методом Long-ПЛР [Текст] / А. П. Герiлович // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. -- Х., 2007. -- Вип. 88. -- С. 51-56.

5. Герілович, А. П. Методологія розрахунку та теоретичної перевірки якості олігонуклеотидів для виявлення нуклеїнових кислот патогенів тварин на основі полімеразної ланцюгової реакції [Текст] / А. П. Герілович // Вет. біотехнологія : бюл. -- К., 2009. -- № 14. -- С. 56-69.

6. Герилович, А. П. Індикація РНК вірусу ньюкаслської хвороби та ідентифікація штамів, подібних до LaSota, за допомогою ПЛР [Текст] / А. П. Герилович // Проблеми зооінженерії та вет. медицини : зб. наук. праць. -- Х., 2009. -- Вип. 19, ч. 2, т. 1. -- С. 86-89.

7. Герiлович, А. П. Дослідження будови гену F вірусу ньюкаслської хвороби та створення системи праймерiв для iндикацiї збудника [Текст] / А. П. Герiлович // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. -- Х., 2007. -- Вип. 88. -- С. 56-61.

8. Герілович, А. П. Молекулярні методи гено- та патотипування вірусу ньюкаслської хвороби [Текст] / А. П. Герiлович // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. -- Х., 2009. -- Вип. 92. -- С. 108-113.

9. Герілович, А. П. Вивчення філогенетичних особливостей ізолятів цирковірусу свиней, циркулюючих в різних регіонах світу та розрахунок праймерів для диференціації серотипів збудника [Текст] / А. П. Герілович // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. -- Х., 2008. -- Вип. 89. -- С. 89-96.

10. Герілович, А. П. Застосування методу полімеразної ланцюгової реакції в системі контролювання контамінації сторонніми вірусами і мікоплазмами ветеринарних імунобіологічних препаратів [Текст] / А. П. Герілович // Вет. біотехнологія : бюл. -- К., 2008. -- № 13 (2). -- С. 333-340.

11. Герілович, А. П. Контроль вірусної та хламідійної контамінації сперми великої рогатої худоби [Текст] / А. П. Герілович // Вет. медицина України. -- 2009. -- № 6. -- С. 44-46.

12. Герілович, А. П. Генотипуваня вірусу діареї, виявленого в спермі бугаїв і біологічних препаратах [Текст] / А. П. Герілович // Вісн. аграр. науки. -- 2009. -- № 7. -- С. 43-46.

13. Стегнiй, Б. Т. Молекулярна епізоотологія: визначення завдань та основних понять [Текст] / Б. Т. Стегнiй, А. П. Герiлович, В. В. Дригiн // Вет. медицина України. -- 2008. -- № 1. -- С. 19-21. (Дисертант провів більшість аналітичних досліджень та брав участь у підготовці матеріалу до опублікування).

14. Дослідження варiабельностi генів гемаглютинiну та нейрамiнiдази високопатогенного вірусу грипу птиці штаму Influenza virus/CH/Sivash/02/2006/H5N1 [Текст] / А. П. Герiлович, Б. Т. Стегній, І. Ю. Бісюк, В. В. Дригін, І. П. Пчелкіна, Л. О. Щербакова // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. -- Х., 2006. -- Вип. 87. -- С. 54-60. (Дисертантом проведені експериментальні дослідження, результати яких підготовані до друку).

15. Стегнiй, Б. Т. Система монiторингу пташиного гриппу [Текст] / Б. Т. Стегнiй, А. П. Герiлович, А. I. Бузун // Вiсн. аграр. науки. -- 2006. -- № 8. -- С. 45-48. (Дисертантом проведені експериментальні дослідження щодо створення засобів молекулярно-генетичного моніторингу та матеріали підготовані до друку).

16. Стегнiй, Б. Оцінка варiабельностi гена гемаглютинiну вірусу високопатогенного грипу птиці субтипу H5N1 та розрахунок праймерiв для його детекцiї [Текст] // Б. Стегнiй, А. Герiлович // Вет. медицина України. -- 2007. -- № 2. -- С. 31-32. (Дисертантом розроблено методологію, проведені експериментальні дослідження, описані та інтерпретовані результати).

17. Comparative Study of Highly Pathogenic Avian Influenza Strains Isolated in Ukraine in 2006 and 2008 [Text] / A. P. Gerilovych, K. Smietanka, B. T. Stegniy, Z. Minta // Vet. Med. : Interdep. Subj. Sci. Coll. -- Kharkiv, 2008. -- Vol. 91. -- P. 18-22. (Дисертантом розроблено методологію, проведені експериментальні дослідження та матеріали підготовані до друку).

18. Stegniy, B. T. Molecular Characterization of Seed Strains for Bivalent Vaccine Against Newcastle Disease and Highly Pathogenic Avian Influenza [Text] / B. T. Stegniy, A. P. Gerilovych, A. B. Stegniy // Contemporary Agriculture : The Serbian Journal of Agricultural Sciences. -- 2008. -- Vol. 57, № 3-4. -- Р. 9-14. (Дисертантом розроблено методологію, проведена частина експериментальних досліджень, прийнято участь у написанні статті).

19. Gerilovych, A. P. Molecular Evolution of Newcastle Disease Virus in Ukraine [Text] / A. P. Gerilovych, A. Potkonyak // Contemporary Agriculture : The Serbian Journal of Agricultural Sciences. -- 2009. -- Vol. 58, № 1-2. -- P. 32-37. (Дисертанту належить ідея, розроблено методологію, проведені експериментальні дослідження та матеріали підготовані до друку).

20. Герiлович, А. П. Аспекти молекулярної епiзоотологiї ньюкаслської хвороби: генетична характеристика iзолятiв [Текст] / А. П. Герiлович, Б. Т. Стегнiй, В. В. Дригiн // Вiсн. аграр. науки. -- 2007. -- № 9. -- С. 25-29. (Дисертантом проведені експериментальні дослідження та матеріали підготовані до друку).

21. Genotyping of Newcastle Disease Virus Strains, Allocated in Ukraine in 1967-2007 (genotypes 1, 2 and 4) [Text] / A. Gerilovych, B. Stegniy, A. Potkonjak, V. Bolotin, O. Solodyankin // Contemporary Agriculture : The Serbian Journal of Agricultural Sciences. -- 2009. -- Vol. 59, № 3-4. -- P. 58-67. (Дисертанту належить ідея, розроблено методологію, проведено частину експериментальних досліджень та їх узагальнення).

22. Герілович, А. П. Нуклеотидний поліморфізм гена нуклеопротеїну вірусу ньюкаслської хвороби [Текст] / А. П. Герілович, О. О. Напненко // Біологія тварин : наук.-техн. бюл. Ін-ту біології тварин і Держ. наук.-досл. контрольного ін-ту вет. препаратів та кормових добавок. -- 2008. -- Вип. 9, № 4. -- С. 296-299. (Дисертантом розроблено методологію, проведені експериментальні дослідження та їх інтерпретація).

23. Розробка засобів моніторингу високопатогенного грипу птиці та ньюкаслської хвороби на основі методів ПЛР_аналізу [Текст] / Б. Т. Стегнiй, А. П. Герiлович, А. М. Головко, Л. В. Олiйник, А. В. Абрамов, О. Ю. Лиманська, А. I. Бузун, А. Б. Стегнiй // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. -- Х., 2007. -- Вип. 88. -- С. 222-229. (Дисертантом розроблено методологію та проведено узагальнення отриманих експериментальних даних).

24. Герілович, А. П. Оцінка профілю варіабельності гена тимідинкінази вірусу інфекційного ларинготрахеїту та створення методики індикації збудника на основі полімеразної ланцюгової реакції [Текст] / А. П. Герілович, І. І. Білоконов // Проблеми зооінженерії та вет. медицини : зб. наук. пр. -- Х., 2007. -- Вип. 15 (40), ч. 2, т. 1. -- С. 111-116. (Дисертанту належить ідея, розроблено методологію, проведені експериментальні дослідження та матеріали підготовані до публікації).

25. Стегній, Б. Т. Розробка протоколу виявлення цирковірусів свиней методом полімеразної ланцюгової реакції [Текст] / Б. Т. Стегній, А. П. Герілович, І. І. Білоконов // Проблеми зооінженерії та вет. медицини : зб. наук. праць. -- Х., 2008. -- Вип. 16 (41), ч. 2, т. 3. -- С. 89-96. (Дисертанту належить ідея, розроблено методологію, проведені експериментальні дослідження та узагальнені їх результати).

26. Генотипова варіабельність чинника цирковірусної інфекції в Україні [Текст] / А. П. Герілович, Б. Т. Стегній, С. А. Ничик, І. І. Білоконов // Проблеми зооінженерії та вет. медицини: зб. наук. праць. -- Х., 2009. -- Вип. 20, ч. 2, т. 2. -- С. 231-237. (Дисертанту належить ідея, розроблено методологію, проведено біоінформатичні та експериментальні дослідження та матеріали підготовані до друку).

27. Молекулярная диагностика вирус_хламидийных инфекций крупного рогатого скота [Текст] / В. И. Стеценко, Р. А. Кучерявенко, А. П. Герилович, А. В. Стеценко, Л. П. Тризна // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. -- Х., 2007. -- Вип. 88. -- С. 245-248. (Дисертантом виконана частина експериментальних досліджень та прийнято участь у підготовці публікації).

28. Дослідження контамінації сторонніми вірусами лікувально-профілактичних та діагностичних сироваток крові тварин [Текст] / О. О. Напненко, І. В. Компанієць, А. П. Герілович, Р. О. Кучерявенко // Біологія тварин : наук.-техн. бюлетень Ін-ту біології тварин і Держ. наук.-дослід. контрольного ін-ту вет. препаратів та кормових добавок. -- 2007. -- Вип. 8, № 3-4. -- С. 286-290. (Дисертантом проведена частина експериментальних досліджень та прийнято участь у підготовці публікації).

29. Патент на корисну модель № 25808 Україна, МПК 2006 С12N7/00. Спосіб виявлення ДНК вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби [Текст] / А. П. Герілович, Б. Т. Стегній, Р. О. Кучерявенко (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Ін_т експерим. і клініч. вет. медицини». -- № u 200703312; заявл. 27.03.07; опубл. 27.08.07, Бюл. № 13. -- 6 с.

30. Патент на корисну модель № 25810 Україна, МПК 2006 С12N7/00. Спосіб виявлення РНК вірусу ньюкаслської хвороби [Текст] / Б. Т. Стегній, А. П. Герілович (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Ін_т експерим. і клініч. вет. медицини». -- № u 200703315; заявл. 27.03.07; опубл. 27.08.07, Бюл. № 13. -- 6 с.

31. Патент на корисну модель № 29317 Україна, МПК 2006 С12N7/00. Спосіб виявлення ДНК вірусу хвороби Ауєскі [Текст] / А. П. Герілович, Б. Т. Стегній, І. В. Коровін (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Ін_т експерим. і клініч. вет. медицини». -- № u 200710068; заявл. 10.09.07; опубл. 10.01.08, Бюл. № 1. -- 6 с.

32. Патент на корисну модель № 29318 Україна, МПК 2006 С12N7/00. Спосіб отримання клонів E. coli -- носіїв генів вірусу хвороби Марека gB та pp38, як компонентів ДНК-вакцини [Текст] / А. П. Герілович (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Ін_т експерим. і клініч. вет. медицини». -- u 200710072; заявл. 10.09.07; опубл. 10.01.08, Бюл. № 1. -- 4 с.

33. Патент на корисну модель № 25809 Україна, МПК 2006 С12N7/00. Спосіб виявлення диференціації цирковірусів свиней І та ІІ серотипів за T-step-point-ПЛР [Текст] / Б. Т. Стегній, А. П. Герілович, М. В. Бабкін (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Ін_т експерим. і клініч. вет. медицини». -- № u 200703314; заявл. 27.03.07; опубл. 27.08.07, Бюл. № 13. -- 6 с.

34. Патент на корисну модель № 18727 Україна, МПК 2006 С12N7/00. Спосіб ідентифікації кДНК штамів вірусу високопатогенного пташиного грипу типу Н5 за ампліфікацією специфічної ділянки НА-гену [Текст] / А. П. Герілович, Б. Т. Стегній (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Ін_т експерим. і клініч. вет. медицини». -- № u 200605945; заявл. 29.05.06; опубл. 15.11.06, Бюл. № 11. -- 6 с.

35. Патент на корисну модель № 31039 Україна, МПК 2006 С12N7/00. Спосіб виявлення РНК вірусу діареї великої рогатої худоби [Текст] / А. П. Герілович, Б. Т. Стегній, О. Ю. Лиманська, М. Ю. Стегній (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Ін_т експерим. і клініч. вет. медицини». -- № u 200712241; заявл. 15.11.07; опубл. 25.03.08, Бюл. № 6. -- 6 с.

36. Патент на корисну модель № 31041 Україна, МПК 2006 С12N7/00. Спосіб виявлення вірусу інфекційного ларинготрахеїту за допомогою полімеразної ланцюгової реакції [Текст] / А. П. Герілович, Б. Т. Стегній (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Ін_т експерим. і клініч. вет. медицини». -- № u 200712267; заявл. 05.11.07; опубл. 25.03.08, Бюл. № 6. -- 6 с.

37. Gerilovich, A. P. Development of Technology for Marek's Disease Virus Recombinant Genes Obtaining in E. coli Model [Text] / A. P. Gerilovich // Mechnikov Institution Int. Biotechnology and Virology Young Scientists Conf. (Odessa, 28-31 May, 2007). -- Odessa, 2007. -- P. 172.

38. Development of Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Recombinant HA-gene Fusion Vector [Text] / A. P. Gerilovych, O. S. Solodyankin, V. I. Bolotin, B. T. Stegniy // 16th World Vet. Poultry Congr. (Marrakesh, Morocco, 8-12 Nov., 2009) : Proc. -- Marrakesh, 2009. -- P. 327. (Дисертанту належить ідея, розроблено методологію та частково проведені дослідження).

39. Герiлович, А. П. Розробка та лабораторне випробування праймерiв для iдентифiкацiї вірусу високопатогенного грипу птиці субтипу H5N1 за геном нейрамiнiдази [Текст] / А. П. Герiлович, Б. Т. Стегнiй // Птахівництво : мiжвiд. темат. наук. зб.. -- Х., 2006. -- Вип. 58 : VII Укр. конф. по птахівництву з мiжнар. участю (Алушта, 18-22 верес. 2006 р.). -- С. 516-520. (Дисертантом розроблено методологію, проведені експериментальні дослідження та підготований рукопис статті).

40. Герилович, А. П. Разработка средств мониторинга ньюкаслской болезни и гриппа птиц на основе метода ПЦР [Текст] / А. П. Герилович // Актуальные вопросы молекулярной диагностики : материалы 2_й междунар. конф. ГМА Респ. Беларусь (Минск, 16-19 мая 2007 г.). -- Минск, 2007. -- C. 11.

41. Gerilovych, A. P. Development of A Complex System for Highly Pathogenic Avian Influenza and Newcastle Disease Monitoring [Text] / A. P. Gerilovych, B. T. Stegniy // 15th World Vet. Poultry Congr. (Beijing, China, 10-15 Sept., 2007) : Proc. -- Beijing, 2007. -- P. 354.

42. Герилович, А. П. Изучение нуклеотидной последовательности вариабельной области гена F и филогенетический анализ вируса ньюкаслской болезни [Текст] / А. П. Герилович, Б. Т. Стегний, Д. В. Музыка // Материалы 5_го междунар. вет. конгр. по птицеводству (Москва, 21-24 апр. 2009 г.). -- М., 2009. -- С. 100-102. (Дисертантом розроблено методологію, проведені експериментальні дослідження та матеріали підготовані до друку).

43. PCR-screening of Chlamydiae and Viral Contamination of Bull Semen in Farms of Southern and Eastern Ukraine [Text] / A. P. Gerilovych, A. V. Skrypnyk, V. I. Bolotin, O. S. Solodyankin, A. B. Stegniy, B. T. Stegniy // Infektionen durch intrazellulдre Erreger-Diagnostik, Epidemiologie und Pathgenese der Chlamydien- und Coxielleninfektionen : Zusammenarbeit mit dem NRL Q-Fieber und dem AVID (Jena, 25-26 Sept., 2008). -- Jena, 2008. -- P. 39-41. (Дисертанту належить ідея, розроблено методологію, проведено частину експериментальних досліджень та матеріали підготовані до друку).

44. Герилович, А. П. Оценка вариабельности генов гликопротеидов вируса болезни Ауески и создание специфических праймеров для его выявления [Текст] / А. П. Герилович // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных : материалы конф. (Покров, 13-14 нояб. 2008 г.). -- Покров, 2008. -- С. 108-111.

45. Герилович, А. П. Секвенирование участка гена rep длиной 421 п. н. украинских изолятов Porcine circovirus type 2 и изучение филогенетических связей возбудителей [Текст] / А. П. Герилович // Молекулярная диагностика-2007 : материалы 6_й междунар. конф. (Москва, 28-30 нояб. 2007 г.). -- М., 2007. -- Т. 2. -- С. 16-17.

46. Герилович, А. П. Разработка системы индикации и дифференциации цирковирусов свиней методом полимеразной цепной реакции [Текст] / А. П. Герилович, Б. Т. Стегній // Молекулярная диагностика-2007 : материалы 6_й междунар. конф. (Москва, 28-30 нояб. 2007 г.). -- М., 2007. -- Т. 2. -- С. 14-15. (Дисертанту належить ідея, розроблено методологію, проведені експериментальні дослідження та тези підготовані до друку).

...