Застосування клітинних і тканинних трансплантатів у комплексному лікуванні хворих із панкреонекрозом (клініко-експериментальне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ЗАСТОСУВАННЯ КЛІТИННИХ І ТКАНИННИХ ТРАНСПЛАНТАТІВ У КОМПЛЕКСНОМУ ЛІКУВАННІ ХВОРИХ ІЗ ПАНКРЕОНЕКРОЗОМ (клініко-експериментальне дослідження)

14.01.03 - хірургія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

КЕБКАЛО АНДРІЙ БОРИСОВИЧ

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Мамчич Володимир Іванович, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, професор кафедри хірургії та проктології.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Тамм Тамара Іванівна, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, завідувач кафедри хірургії та проктології;

доктор медичних наук, професор Копчак Володимир Михайлович, ДУ «Національний інститут хірургії і трансплантології імені О.О. Шалімова АМН України», завідувач відділу хірургії підшлункової залози і реконструктивної хірургії жовчних протоків.

Лауреат Державної премії України, Заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Бойко Валерій Володимирович, Харківський національний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри хірургії № 1, ДУ «Інститут загальної та невідкладної хірургії АМН України», директор.

Захист відбудеться “17“ _ червня_ 2011 року о 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.600.02 при Харківському національному медичному університеті МОЗ України (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4; тел. 707-73-27).

Із дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського національного медичного університету МОЗ України (м. Харків, пр. Леніна, 4).

Автореферат розіслано “13” травня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат медичних наук, доцент А.І. Ягнюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед хірургічних захворювань органів черевної порожнини гострий панкреатит посідає третє місце, причому, якщо загальна летальність при даному захворюванні становить 4,28_5,50%, то при його деструктивних формах смертність у післяопераційному періоді досягає 20_40% (Шалимов А.А. и соавт., 2002; Демин Д.Б. и соавт., 2003; Кукош М.В., Петров М.С., 2006). Розвиток панкреонекрозу пов'язаний з надмірною активацією протеолізу та процесів ліпопероксидації, внутрішньосудинною гемокоагуляцією, тяжким ендотоксикозом, поліорганною недостатністю та гнійно-некротичними ускладненнями як у самому органі, так і в оточуючих тканинах (Бойко В.В. и соавт., 2003; Савельев В.С. и соавт., 2006; Pandol S.J. et al., 2007), що й зумовлює високу летальність (Бурневич С.З. и соавт., 2004; Кошель Ю.Н., Малиновский А.В., 2009). Сучасні методи хірургічного лікування та консервативної післяопераційної терапії панкреонекрозу дещо поліпшили результати лікування, однак і нині їх не можна вважати задовільними (Иванов Ю.В., Алехнович А.В., 2004; Багненко С.Ф. и соавт., 2009; Werner J. et al., 2005). У розвитку ускладнень панкреонекрозу особливого значення набувають системні порушення регуляції агрегатного стану крові, які здатні призвести до поліорганної недостатності (Земсков В.С. та співавт., 2001). Водночас особливості порушень гемостазу при гострому некротичному ураженні підшлункової залози вивчені недостатньо навіть в експерименті, що стримує процес оптимізації лікування панкреонекрозу в клініці.

Активація протеолізу за каскадним механізмом провокує процеси інтраваскулярного мікротромбоутворення, що призводить до порушення мікроциркуляції в життєвоважливих органах із розвитком поліорганної недостатності (Ковальська І.О., 2006). У даному випадку особливого значення набувають системні та локальні процеси фібринолізу, зміни яких при панкреонекрозі не з'ясовано.

Гострий панкреатит є динамічним процесом із різноманітними патофізіологічними механізмами розвитку осередкових та системних ускладнень (Дронов О.І. та співавт., 2006). Адекватне оцінення стану захисних сил організму та розуміння взаємодії поміж різними компонентами імунної системи дають змогу швидко ідентифікувати розвинуті порушення та визначити стратегію цілеспрямованої терапії (Переяслав А.А., 2003; Андрющенко В.П. та співавт., 2007; Бойко В.В. и соавт., 2009). Тому основним резервом поліпшення результатів лікування хворих є розробка нових способів діагностики гострого некротичного панкреатиту та його ускладнень. Зокрема, дослідження маркерів гострофазного запалення (інтерлейкін-6 та С-реактивний білок) дало змогу визначити прогностичні критерії. Доведено, що при високому рівні цих маркерів запалення протягом перших 10_14 діб виявляється інтенсивний запальний процес і летальність досягає 30_40 %. (Бондаренко М.М. та співавт., 2009). Це свідчить про суттєву роль цитокінів у патогенезі панкреонекрозу, проте їхня роль остаточно не з'ясована.

Останнім часом альтернативним джерелом гемопоетичних стовбурових клітин-попередників (CD34+) усе частіше виступає кордова кров, котра містить набагато більшу частину некомітованих гемопоетичних клітин, ніж дорослий кістковий мозок (Бабийчук Л.А. и соавт., 2007). Більше того, гемопоетичні стовбурові клітини-попередники з кордової крові мають більший потенціал проліферації, ніж їхні аналоги з дорослого кісткового мозку.

Використання кордової крові для трансплантації в якості джерела гемопоетичних стовбурових клітин набуло значного поширення в останні 10 років, особливо в педіатрії. На сьогодні у світі проведено близько 5000 трансплантацій кордової крові (Румянцев А.Л., Масчан А.А., 2003; Кухарчук А.Л. и соавт., 2004). Пуповинна кров є безпечним, технічно легко отримуваним джерелом стовбурових клітин, які ефективно використовуються для лікування ряду захворювань (Ломакін І.І. та співавт., 2004; Bertolini F., Battaglia M., 1995; Cao Fu-jiang, Feng Shi-qing, 2009). Крім того, стовбурові клітини кордової крові можна використовувати в якості підтримуючої терапії для лікування широкого спектра захворювань без підбору HLA-ідентичного донора. Проте в лікуванні панкреонекрозу стовбурові клітини кордової крові, які здатні значно підвищити потенціал репаративної регенерації, досі не використовувалися.

Перераховані вище проблеми обумовлюють актуальність теми та свідчать про необхідність розробки та впровадження нових методів лікування некротичного панкреатиту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом прикладної науково-дослідної роботи “В експерименті та клініці визначити ефективність трансплантації стовбурових клітин, тканин ембріофетального і позафетального походження та тканинної терапії за Філатовим при імуно- і онкопатологічних процесах, панкрео- і колоногенних перитонітах, старінні та порушенні функції репродуктивної системи” (№ державної реєстрації 0107U01175). На підставі позитивних результатів доклінічних досліджень “Експериментальна оцінка ефективності клітинних і тканинних трансплантатів у комплексному лікуванні хворих на панкреонекроз” (код 13.2008), результатів первинної експертизи та позитивної спеціалізованої експертизи матеріалів клінічного випробування (протокол № 06 від 27 червня 2008 року) Координаційний центр трансплантації органів, тканин і клітин МОЗ України дав дозвіл Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика на проведення клінічних випробувань “Оцінка клінічної ефективності клітинних і тканинних трансплантатів у комплексному лікуванні хворих на панкреонекроз” відповідно до затвердженого протоколу клінічних випробувань (версія № НМАПО КК-1: 13.2008; протокол № Р-007/08, код Р-001.08), де автор був призначений відповідальним виконавцем.

Мета і задачі дослідження. Підвищити ефективність комплексного лікування хворих на панкреонекроз шляхом системної та локальної стимуляції процесів репаративної регенерації з використанням внутрішньовенного введення стовбурових клітин кордової крові та місцевої трансплантації кріоконсервованої кордової тканини.

Для досягнення мети дослідження були поставлені такі задачі:

1. Розробити експериментальну модель некротичного панкреатиту для вивчення впливу клітинних технологій.

2. Експериментально з'ясувати характер змін у системі регуляції агрегатного стану крові, системного (плазмового) і локального (тканинного) фібринолізу та протеолізу на різних стадіях розвитку панкреонекрозу.

3. В експерименті дослідити вплив використання нативних та озонованих стовбурових клітин кордової крові на перебіг панкреонекрозу.

4. Провести ретроспективний аналіз клінічної ефективності комплексного лікування некротичного панкреатиту та його ускладнень для обгрунтування використання клітинних та тканинних технології.

5. Розробити методику комплексного лікування хворих на некротичний панкреатит із застосуванням стовбурових клітин кордової крові та тканини.

6. З'ясувати детоксикаційні можливості використання в комплексному лікуванні хворих із некротичним панкреатитом фракційного перитонеального діалізу та введення стовбурових клітин кордової крові.

7. Визначити ефективність комбінованого місцевого використання тимчасової трансплантації кордової тканини та вуглецевої сорбуючої пов'язки у хворих із панкреонекрозом та перипанкреатичним некрозом.

8. Вивчити ефективність використання клітинної та тканинної терапії для профілактики та лікування ускладнень у хворих на некротичний панкреатит.

9. Порівняти ефективність використання озонованих та нативних стовбурових клітин кордової крові при лікуванні хворих на панкреонекроз.

10. Визначити клінічну ефективність комплексного лікування некротичного панкреатиту з використанням трансплантації стовбурових клітин кордової крові та кріоконсервованої кордової тканини.

Об'єкт дослідження: гострий некротичний панкреатит.

Предмет дослідження: трансплантація нативних і озонованих стовбурових клітин кордової крові та кріоконсервованої кордової тканини в комплексному лікуванні некрозу підшлункової залози.

Методи дослідження: клінічний, інструментальний, лабораторний, біохімічний, коагулометричний, цитологічний, імуноферментний, патофізіологічний, статистично-аналітичний.

Наукова новизна. Уперше з'ясовано експериментально та підтверджено клінічними випробуваннями, що трансплантація нативних і озонованих стовбурових клітин кордової крові хворим на панкреонекроз значно підвищує репаративно-пластичні процеси, сприяє поліпшенню перебігу захворювання, суттєво скорочує термін перебування хворого в стаціонарі та значно знижує летальність при тяжких формах некрозу підшлункової залози.

Уперше вивчено вплив трансплантації в зону некрозу підшлункової залози кріоконсервованої кордової тканини для запобігання кистоутворення у хворих на панкреонекроз.

Уперше доведено, що трансплантація нативних і озонованих стовбурових клітин кордової крові хворим на панкреонекроз значно зменшує кількість важких післяопераційних ускладнень, пов'язаних із розвитком синдромів системного запалення, дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові та поліорганної недостатності.

Уперше доведено, що трансплантація стовбурових клітин кордової крові різко зменшує активність у плазмі крові та тканині підшлункової залози металопротеаз, які при розвитку панкреонекрозу руйнують клітини та порушують репаративні процеси через надмірну інтенсифікацію лізису низько - та високомолекулярних білків і колагену.

Уперше показано, що дисбаланс у системі про - і протизапальних цитокінів спричиняє у хворих на панкреонекроз порушення метаболізму сполучної тканини, що гальмує проліферативні процеси та сприяє розповсюдженню запалення в черевній порожнині, та доведено високу ефективність трансплантації нативних і озонованих стовбурових клітин кордової крові щодо корекції порушень обміну сполучної тканини.

Уперше розроблено та клінічно апробовано методику лікування панкреатичної нориці після операції на підшлунковій залозі у хворих на некротичний панкреатит, яка заснована на трансплантації в зону норицевого ходу кріоконсервованої кордової тканини.

Розроблено методику комбінованої екзо- і ендогенної детоксикації, яка складається з проведення фракційного перитонеального діалізу та трансплантації стовбурових клітин кордової крові.

Вивчено вплив тимчасової трансплантації кордової тканини та використання вуглецевої сорбуючої пов'язки у хворих із панкреонекрозом та перипанкреатичним некрозом на локальні репаративні процеси.

Запропоновано концепцію відновлення репаративно-пластичних можливостей організму людини з тяжким панкреатитом за допомогою трансплантації стовбурових клітин кордової крові.

Практичне значення отриманих результатів. Застосування розробленого способу комплексного лікування хворих на панкреонекроз, спрямованого на системну та локальну стимуляцію процесів репарації через внутрішньовенне введення нативних і активованих озоном стовбурових клітин кордової крові та місцеву трансплантацію кріоконсервованої кордової тканини, має соціальне й економічне значення, сприяє суттєвому поліпшенню результатів лікування, зменшує термін перебування хворого в стаціонарі, частоту ускладнень і рівень летальності.

Розроблено показання до застосування трансплантації нативних і озонованих стовбурових клітин кордової крові та трансплантації кріоконсервованої кордової тканини, визначені критерії прогнозування щодо їх застосування, які істотно доповнюють можливості діагностичної та лікувальної тактики при некрозі підшлункової залози. Розроблено спосіб лікування панкреатичної нориці після операції з приводу некротичного панкреатиту, який заснований на трансплантації в зону норицевого ходу кордової тканини. Розроблено спосіб комбінованої детоксикації, який складається з фракційного перитонеального діалізу та трансплантації стовбурових клітин кордової крові.

Теоретичні положення дисертації та практичні рекомендації за результатами досліджень впроваджені і використовуються в навчальному процесі та в лікувальній практиці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика, Львівського національного медичного університету, Івано-Франківського державного медичного університету, Харківської медичної академії післядипломної освіти, Буковинського державного медичного університету, Кримського державного медичного університету імені С.І. Георгієвського, Донецького національного медичного університету імені М. Горького, Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, Одеського державного медичного університету, Української медичної стоматологічної академії, Запорізької медичної академії післядипломної освіти.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено розробку основних теоретичних і практичних положень роботи, проведено аналіз літературних джерел. Здобувач самостійно виконав набір і обробку фактичного матеріалу, написав усі розділи дисертації, сформулював висновки і практичні рекомендації. У наукових працях, опублікованих зі співавторами, здобувачем самостійно зібрано матеріал, здійснено огляд літератури за темою, зроблено узагальнення та сформульовано висновки. При підготовці праць, опублікованих у співавторстві, використано експериментальний і клінічний матеріал, огляд літератури та статистичні дані автора.

Дисертант особисто виконав експериментальну частину роботи. Безпосередньо брав участь у проведенні обстеження хворих та більшості оперативних втручань на підшлунковій залозі. Планування, організація досліджень дисертаційної роботи та впровадження в практику отриманих результатів здійснювалися за участю наукового консультанта _ професора кафедри хірургії та проктології Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика (м. Київ), доктора медичних наук Мамчича В.І.

Експериментальні та клінічні дослідження виконувалися за участю професора, доктора медичних наук Кухарчука О.Л. (ТОВ “EmProCell Clinical Research”, Мумбай, Індія) .

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на вченій раді Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика та обговорені на науково-практичних конференціях: Четверта українська школа-семінар «Мініінвазивні технології в сучасній хірургії», Славсько, 13_15 лютого 2003 р.; Міжнародна конференція хірургів «Окремі питання невідкладної хірургії», Ужгород, 9_10 жовтня 2003 р.; Міжнародна науково-практична конференція «Ехінококкоз, малоінвазивна хірургія і ангіологія», присвячена 100-річчю від дня народження професора І.Я. Дейнеки, Одеса, 3_4 вересня 2004 р.; Науково-практична конференція «Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини», Харків, 22 листопада 2005 р.; Науково-практична конференція з приводу 145-річчя Київської обласної клінічної лікарні, 29_30 листопада 2007 р.; Науково-практична конференція за участю міжнародних спеціалістів «Трансплантація органів, тканин та клітин», Київ, 20_21 листопада 2008 р.; Науково-практична конференція «VIII читання імені В.В. Підвисоцького», 28_29 травня 2009 р.; Науково-практична конференція з міжнародною участю «Актуальні питання невідкладної хірургії», присвячена 75-річчю від дня народження та 50-річчю науково-педагогічної діяльності професора Б.М. Даценка, Харків, 1_3 квітня 2009 р.; Науково-практична конференція з міжнародною участю «Актуальні питання невідкладної хірургії», Харків, 7_8 квітня 2011 р.; на міжкафедральному засіданні кафедр: хірургії та проктології, загальної та невідкладної хірургії, хірургії та судинної хірургії, анестезіології та інтенсивної терапії, дитячої хірургії, медицини невідкладних станів, судової медицини, неврології та рефлексотерапії Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України; відділу хірургії підшлункової залози та реконструктивної хірургії жовчних шляхів ДУ «Національний інститут хірургії і трансплантології імені О.О.Шалімова АМН України»; лабораторії виробничої трансфузіології та біотехнології ДУ «Інститут гематології та трансфузіології АМН України»; кафедри хірургії стоматологічного факультету Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (м. Київ, 28 грудня 2010 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 26 наукових праць у спеціалізованих виданнях, рекомендованих ВАК України, з яких 9 одноосібних. Отримано деклараційний патент України на винахід.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 319 сторінках. Складається зі вступу, дев'яти розділів (огляд літератури, матеріали та методи дослідження, 6 розділів власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів дослідження), висновку, практичних рекомендацій і списку використаних джерел, який містить 396 найменувань, із яких 206 вітчизняних і 190 зарубіжних джерел. Додатки у вигляді окремої книжки надруковано на 98 сторінках. Дисертаційна робота містить 108 таблиць і 114 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТи

Матеріали та методи дослідження. В експериментальній частині роботи використано 314 самців і самиць морських свинок. Усі операційні втручання проводилися в асептичних умовах під уретано-ефірним наркозом відповідно до основних вимог Ванкуверських конференцій (1979, 1994) про біомедичні експерименти щодо гуманного ставлення до лабораторних тварин. Для відпрацювання експериментальної моделі некротичного панкреатиту використано 37 статевозрілих морських свинок (самці і самиці) масою тіла 0,45_0,55 кг. Після серединної лапаротомії некротичне ураження підшлункової залози досягалося шляхом накладання двох лігатур на ліву (селезінкову) її частку при відстані між лігатурами 8 мм із подальшим уведенням у тканину підшлункової залози, що розташована між лігатурами, розчину тромбіну (500 од NIH/мл - по 0,1 мл на відстані 1,5 мм, усього 10 ін'єкцій) (патент України на корисну модель № 14144 від 15.05.2006р.). Для вивчення впливу нативних і озонованих стовбурових клітин кордової крові (СККК) на стан функціональних систем здорового організму використано 35 морських свинок: 10 інтактних тварин склали групу контролю, 10 морських свинок отримували трансплантацію стовбурових клітин кордової крові (внутрішньовенно), 15 тварин - внутрішньовенне введення озонованих стовбурових клітин кордової крові. З метою вивчення впливу стовбурових клітин кордової крові на виживаність тварин із панкреонекрозом та зміни у системі регуляції агрегатного стану крові, системного та локального фібринолізу і протеолізу ми виокремили 4 дослідні групи. При несправжній операції (контроль) у 27 морських свинок підшлункова залоза не лігувалася, а в тканину селезінкової частки підшлункової залози введено 1,0 мл 0,9% розчину натрію хлориду шляхом 10 серійних ін'єкцій (0,1 мл кожна) із проміжком відстані в 1,0 - 1,5 мм. У групі порівняння 50 тваринам моделювали панкреонекроз та вводили 10 мл 0,9% розчину натрію хлориду внутрішньовенно (секція яремної вени під ефірним наркозом). Основна група А морських свинок із панкреонекрозом та внутрішньовенним уведенням стовбурових клітин кордової крові (50 тварин). Основна група В морських свинок із панкреонекрозом та внутрішньовенним уведенням озонованих стовбурових клітин кордової крові (50 тварин). Тварини виводилися з експерименту через 24, 48 і 72 години після операції: під ефірним наркозом виконувалася релапаротомія та після забору крові шприцом із черевної аорти вилучали зразки підшлункової залози, які відразу поміщалися або в 10% розчин нейтрального формаліну для гістологічного аналізу, або заморожувалися у рідкому азоті для подальших біохімічних досліджень. Визначали протеолітичну активність у крові та тканині за рівнем лізису низькомолекулярних білків, високомолекулярних білків та колагену. Фібриноліз у крові та тканині визначали за сумарною, неферментативною та ферментативною фібринолітичною активністю. Стан гемостазу оцінювали за загальноприйнятими методиками.

Кордову кров отримували зі 140 плодів морських свинок від 65 вагітних самок, яким на 23 добу вагітності виконували кесарів розтин. У стерильних умовах збирали кров із пуповини та плаценти. Проводили дефібринацію на скляних кульках. Фракцію мононуклеарних клітин кордової крові відокремлювали на градієнті щільності фікол/верографіну. Середня кількість мононуклеарних клітин, отриманих у такій спосіб, становила 0,25?109/мл, відсоток життєздатних клітин за трипановим синім - 76%. Кордову кров розводили (1:2) з 0,9% розчином натрію хлориду та вводили морським свинкам внутрішньовенно (секція яремної вени під ефірним наркозом) із розрахунку 0,4 мл (500 000 клітин) на 0,1 кг маси тіла (загальна кількість трансплантованих клітин - 2,0-2,7?106/мл) через 12 год. після моделювання панкреонекрозу. Озонацію суспензії стовбурових клітин кордової крові проводили шляхом змішування 1,0 мл озонованого (апарат “Озон УМ-80”) стерильного 0,9% розчину натрію хлориду з 1,0 мл клітинної суспензії при концентрації озону в ізотонічному розчині натрію хлориду 20 мкг/1мл. Через 10 хв. після змішування отриману суспензію озонованих клітин кордової крові вводили морським свинкам внутрішньовенно. Термін уведення - через 12 год. після моделювання панкреонекрозу.

Для вирішення задач і досягнення мети клінічної роботи обстежено 642 хворих. Для обґрунтування використання клітинної та тканинної терапії проведено ретроспективний аналіз результатів лікування за історіями хвороб 463 хворих на гострий панкреатит та його ускладнення, які лікувалися у Київській обласній клінічний лікарні у 1996-2005 роках. З 2006 р. по 2010 р. під наглядом перебували 179 хворих на некротичний панкреатит, які проходили лікування в хірургічному відділенні цієї лікарні. Контрольну групу хворих із панкреонекрозом складали 106 пацієнтів, які отримували стандартне лікування, а основну групу _ 83 пацієнти, яким застосовували клітинні та тканинні технології. Групи хворих були репрезентативними за віком, статтю, видами некрозу підшлункової залози та парапанкреатичної клітковини (асептичний, інфікований) та типом оперативного втручання.

Ми розподілили хворих на групи, враховуючи запропоновану міжнародною робочою групою класифікацію некротичного (некротизуючого) панкреатиту (Польща, Угорщина 2007_2009 рр.). Відповідно до запропонованої нами робочої класифікації виокремлено такі групи хворих в залежності від типу ураження підшлункової залози та парапанкреатичної клітковини та їх інфікованості:

Група А _ хворі з панкреонекрозом та перипанкреатичним некрозом, які отримували клітинну та тканинну терапію. Кількість хворих групи А було 32. Асептичне ураження виявлено у 5 (15,6%) хворих, інфіковане - у 27 (84,4%) пацієнтів. Нативні СККК трансплантували 18 хворим, озоновані СККК - 14.

Група В _ хворі з ізольованим панкреонекрозом, які отримували клітинну та тканинну терапію. Кількість хворих групи В _ 22 пацієнти. Асептичне ураження виявлено у 8 (36,4%) хворих, інфіковане - у 14 (63,6%) пацієнтів. Нативні СККК трансплантували 11 хворим, озоновані СККК - 11.

Група С _ хворі з ізольованим перипанкреатичним некрозом, які отримували клітинну та тканинну терапію. Кількість хворих групи С _ 19 пацієнтів. Асептичне ураження виявлено у 2 (10,5%) хворих, інфіковане - у 17 (89,5%) пацієнтів. Нативні СККК трансплантували 10 хворим, озоновані СККК - 9.

Група D - хворі з наявністю панкреатичної нориці, які отримували тканинну терапію, їх кількість становила 10 пацієнтів.

У кожній основній групі хворих була своя відповідна репрезентативна контрольна група 1, 2, 3 та група зі стандартним лікуванням панкреатичних нориць.

На першому етапі за показаннями виконували мініінвазивні втручання (МІВ) у вигляді тонкоголкової пункції під контролем ультразвуку (УЗ). МІВ виконували на апараті «Pro focus 2202» (BK medical). Використовували пункційну голку Chibo №18-20. Ексудат брали на дослідження. За необхідності дренування виконували дренажем типу «pig tail» 10_14F.

Кордову кров отримували при нормальних пологах у здорових жінок, які до цього були обстежені на наявність вірусних та гемічних інфекцій і надали інформовану згоду щодо передачі крові до банку стовбурових клітин. Кріоконсервування мононуклеарних клітин виконували за допомогою програмного заморожувача, який дає змогу варіювати швидкість зниження температури на різних етапах кріоконсервування та виконувати ініціювання процесу кристалізації за певної температури для усунення явища переохолодження в кріоампулах (контейнерах). Кріоконсервовані стовбурові клітини кордової крові зберігали в кріобанку в рідкому азоті при температурі -196°С.

Для лікування хворих застосовували клітинну суспензію з такими параметрами: вміст клітин з ядрами становив від 0,11х109 до 3,7х109 клітин, кількість мононуклеарів 15_60% у суспензії, кількість колонієутворюючих одиниць (КУО) гранулоцитарно-макрофагального ряду _ 50±10х103/мл, вміст гемопоетичних клітин, що несуть на своїй поверхні маркери CD34+CD45+ і CD117+CD45+ були відповідно 0,85±0,20% та 1,52±0,39%. Вміст живих клітин після кріоконсервування не менше 80±10% від початкової.

Кордову кров у дозі 10_15 мл уводили хворим після розморожування внутрішньовенно повільно, розводячи фізіологічним розчином у співвідношенні 1:1, починаючи з 2_3 доби після малоінвазивного втручання або оперативного втручання впродовж 3-5 діб. Після озонування 200 мл фізіологічного розчину (концентрація озону - 20 мг/л) клітини додавали до нього і витримували впродовж 30 хв. Озоновані стовбурові клітини кордової крові вводили внутрішньовенно крапельно один раз на добу впродовж 3_5 днів, починаючи з другої доби після пункційного дренування або оперативного втручання.

Кордову тканину отримували з пуповини здорових новонароджених та перевіряли на біологічну безпеку за такими ж вимогами, що й стовбурові клітини кордової крові. У роботі місцево використовувалася жива кріоконсервована кордова тканина (ККТ) із пуповинного канатика, який складається з вени, двох артерій та амніона (розмір ділянок кордової тканини становив 4_5 см на 10_12 см, площею 40_60 см2). Для використання пуповинного канатика його розморожували при температурі 34_36?С. Визначення функціональної повноцінності зразків пуповинного канатика проводять за методом культивування тканини в двошаровому агаровому середовищі або в суспензійній культурі “in vitro” протягом 9_10 діб. Наявність міграції та росту клітин у зразках і формування моношару спеціалізованих клітин свідчить про збереження властивостей клітин і, таким чином, забезпечення їх трансплантаційного потенціалу.

Клітинну та тканинну терапію у 83 хворих на некротичний панкреатит виконували в різні періоди захворювання.

У ранній фазі токсемії при гострому панкреатиті 15 хворим виконували клітинну трансплантацію та фракційний перитонеальний діаліз для видалення токсичних речовин із організму, зменшення надходження їх до внутрішнього середовища та посилення функції основних органів детоксикації. Для дезінтоксикації ми використовували фракційний перитонеальний діаліз (ФПД). Показаннями для проведення ФПД були: кількість балів за шкалою АРАСНЕ ІІ більше 16, наявність ексудату в черевній порожнині понад 300 мл, показник амілолітичної активності ексудату черевної порожнини > 2000 од. Після постановки перитонеальної фістули для стимуляції репаративної регенерації в органах, що виконують ендогенну детоксикацію, внутрішньовенно вводили СККК протягом 3_5 діб. Внутрішньочеревний тиск вимірювали в сечовому міхурі за допомогою тонометра низького тиску за непрямою методикою. Контрольна репрезентативна група складалася з 30 хворих, які з метою детоксикації отримували форсований діурез. Також для уточнення впливу перитонеального діалізу на детоксикацію організму ми виокремили групу порівняння - 25 хворих, у яких використовували ФПД.

У 30 прооперованих хворих використовували введення СККК та місцево трансплантацію ККТ. Видалення некротичних тканин із підшлункової залози та парапанкреатичного простору та вільно лежачих секвестрів із підшлункової залози проводили за стандартною методикою. Видаляли тільки вільно розташовані секвестри методом дигітоклазії. Розморожували зразки ККТ. За допомогою ниток вивертали пуповинний канатик внутрішнім боком назовні. Внутрішній бік пуповинного канатика біологічно активний. Нитки не зрізували. Трансплантацію ККТ проводили на залишкову тканину підшлункової залози з усіх боків. Нитки виводили назовні. Фіксували кордову тканину марлевими тампонами в сальниковій сумці. За допомогою ниток, якими прошивали канатик, через 2_3 дні видаляли трансплантат кордової тканини. Після видалення ККТ з підшлункової залози брали мазки-відбитки. Для збільшення ефекту від лікування ми використовували місцево разом із кордовою тканиною вуглецеву сорбуючу пов'язку (ВСП). Вона являє собою активований волокнистий вуглецевий матеріал із розвинутою (1500 см2/г) сорбційною поверхнею та сорбційно-кінетичними характеристиками, які забезпечують швидке поглинання з вмісту рани великої кількості (до 1,5 г на 1г власної ваги) різноманітних біологічно активних компонентів. При використанні ВСП для лікування поверхні рани після некрсеквестректомії попередньо на 10_15 хвилин тканину замочували у розчині протеолітичних ферментів (0,1 г трипсину на 50 мл фізіологічного розчину). 30 хворим для місцевого лікування використано ККТ та ВСП. Контрольну репрезентативну групу становили 29 хворих із стандартним лікуванням, яке включало обробку поверхні рани антисептиком та використання мазевих пов'язок на водорозчинній основі. Також для уточнення впливу вуглецевої пов'язки на процеси в рані ми виокремили групу порівняння - 25 хворих, у яких використано ВСП на ділянку підшлункової залози та в парапанкреатичний простір.

Для з'ясування ефективності лікування панкреатичних нориць використовували кріоконсервовану тканину пуповинного канатика. 10 пацієнтів із наявністю зовнішньої неповної панкреатичної нориці після лікування некротичного панкреатиту отримували в комплексному лікуванні тканинну терапію, 10 хворих _ стандартне лікування. За допомогою кетгутових ниток (№ 3) вивертали пуповинний канатик внутрішнім боком назовні на поліхлорвініловій трубці. Кетгут зрізували. Прошивали з одного кінця, який буде назовні, пуповинний канатик лавсановою ниткою. Якщо панкреатична нориця мала широкий канал, то використовували 2 або 3 зразки ККТ. Після установки кордової тканини в панкреатичній нориці виводили нитки назовні. Трансплантат кордової тканини видаляли через 2_3 доби. Якщо кількість панкреатичного соку була більшою ніж 50 мл на добу, то процедуру трансплантації кордової тканини повторювали, але з меншим діаметром трубки. Якщо дебіт панкреатичного соку дорівнював 50 мл та менше, то трансплантували пуповинний канатик відповідного розміру в норицевий хід без поліхлорвінілової трубки з прошиванням назовні шкіри та кордової тканини. Через 3 дні кордову тканину замінювали. Процедуру виконували доти, поки не облітерувалися панкреатичні протоки.

Стан тромбоцитарно-судинного гемостазу оцінювали за відсотком адгезивних тромбоцитів, а також за індексом спонтанної агрегації тромбоцитів. Хронометричні параметри згортання крові (час рекальцифікації плазми, протромбіновий і тромбіновий час, активований парціальний тромбопластиновий час), Хагеманзалежний фібриноліз, потенційну активність плазміногену, активність антиплазмінів, рівень фібриногену в плазмі крові, активність антитромбіну III і ХІІІ фактора, концентрацію розчинних комплексів фібрин-мономера в крові визначали за допомогою наборів реактивів фірми (“Simko Ltd”, Україна). Дослідження протеолітичної активності проводили за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу (“Simko Ltd”, Україна). Біохімічні дослідження крові виконано на аналізаторі “Ultra” з використанням калібраторів і наборів реактивів фірми “Kоne” (Фінляндія). Білкові фракції крові визначали методом електрофорезу на апараті “Paragon” із використанням денситометра “Appraise” фірми “Beckman” (США). Загальний аналіз крові проводили на гематологічному аналізаторі “Еltrac-11” фірми “АER” (Австрія). Вміст у крові та в ексудаті вільного оксипроліну вимірювали за методикою Тетянець С.С., білковозвя'заного оксипроліну - за Осадчук М.А., гексозамінів, глюкуронових кислот, фукози, що не звя'зана з білками, - за Шараєвим П.Н. та співавт., сіалових кислот - за Муравйовою Л.А., Волковим Е.Ю., колагенолітичну активність плазми - за Шараєвим П.Н. та співавт. Вміст у плазмі крові молекул середньої маси вивчали за методом Габріеляна Н.І. та співавт. Визначення сумарної, неферментативної та ферментативної фібринолітичної активності плазми крові і тканин проводили за методикою Боднаря Б.М., Кухарчука О.Л. та співавт. Визначали в плазмі крові та перитонеальній рідині фагоцитарний індекс та фагоцитарну активність, НСТ-тест - за Карауловим А.В. Аналіз вмісту цитокінів у плазмі крові проводили на імуноферментному аналізаторі “Униплан-М” (Росія) наборами реагентів “ProCon IL-1” (ТОВ “Протеиновый контур”, Росія), “ProCon TNF” (ТОВ “Протеиновый контур”, Росія). Рівень у плазмі крові трансформуючого фактора росту 1 (ТФР?1) визначали методом імуноферментного аналізу реактивами фірми “R&D Systems. Quantikine TM - TGF?1” (США). Екстракцію цитокінів проводили на мікроколонках C2 AmprepTM (Велика Британія). Аналіз відповіді резидентних макрофагів на стимуляцію інтерлейкіном-1 та ендотоксином S.thyphimurium оцінювали за продукцією інтерлейкіну-1 та фактора некрозу пухлин (ФНП). Інтерлейкін-1 та ендотоксин активують перитонеальні макрофаги, які, в свою чергу, продукують інтерлейкін-1 та ФНП. Аналіз вмісту цитокінів в перитонеальній рідині проводили на імуноферментному аналізаторі “Униплан-М” (Росія) наборами реагентів “ProCon IL-1” (ТОВ “Протеиновый контур”, Росія), “ProCon TNF” (ООО “Протеиновый контур”, Росія). Матеріалом місцевого дослідження була грануляційна тканина відкритих ран. Після її обробки ізотонічним розчином натрію хлориду тканину січуть на шматочки розміром 0,15_0,25 см3 і готують екстракти з розрахунку 100 мг тканини на 1 мл забуференого ізотонічного розчину натрію хлориду (рН 7,4), гомогенізуючи біоптати у фарфоровій ступці. Отриманий гомогенізат центрифугують зі швидкістю 1500 об/хв. протягом 5 хв. Утворена при цьому надосадова рідина використовується для біохімічного дослідження. Вивчення репаративного процесу в рані проводили шляхом мікроскопічного дослідження мазків-відбитків ран за методом Д.М. Штейнберга. Гістологічні зрізи фарбували гематоксиліном і еозином.

Для опрацювання отриманих даних використовувався пакет прикладних програм “BioStat”. У дисертації використовувалися основні параметри вибіркового методу, при пошуку достовірності відмінності між групами використовувалися різні статистичні методи. У разі нормального розподілу ознак використовувався параметричний метод - t-критерій Стьюдента. У випадку, якщо характер розподілу відмінний від нормального, використовувалися непараметричні методи. Для бінарних ознак - критерій ?2. Для порівняння двох незалежних (незв'язаних) груп - метод Манна-Уїтні, залежних груп - критерій знаків.

Результати досліджень.

Пуповинна, або кордова кров містить стовбурові та комітовані гемопоетичні клітини, мезенхимальні стромальні мультипотентні клітини, unrestricted somatic stem cells та ендотеліальні прогеніторні клітини, зібрані з плацентарних і пуповинних кров'яних судин після фіксації пуповини.

Для відповіді на запитання - за якими механізмами реалізується позитивна клінічна дія трансплантації стовбурових клітин кордової крові - нами було проведено експериментальне дослідження їх впливу на гемостаз, фібриноліз і протеоліз, адже відомо, що патогенез панкреонекрозу пов'язаний з надмірною активацією протеолізу, внутрішньосудинною гемокоагуляцією та розвитком локальних та системних структурних і функціональних порушень.

За результатами нашого дослідження, у морських свинок із некрозом підшлункової залози впродовж трьох діб після операції відбувається прогресивне підвищення альбумінолітичної, казеїнолітичної та колагенолітичної активності плазми крові, що супроводжується інтенсифікацією плазмового фібринолізу. Переважно зростала частка низькоефективного неферментативного лізису фібрину. Упродовж експерименту відбувалося поступове збільшення летальності, яка становить 13,3% - через 24 год., 33,3% - через 48 год. та 55,0% - через 72 год. після моделювання панкреонекрозу (табл. 1). Нами виявлено, що трансплантація нативних СККК зменшує, але не нормалізує інтенсивність плазмового протеолізу: через 72 год. після операції лізис азоальбуміну, азоказеїну і азоколу перевищував контрольні величини відповідно в 2,5 (р<0,001), 3,0 (р<0,001) і 3,3 (р<0,001) раза. Водночас поступово знижувалася інтенсивність неензиматичного лізису фібрину, проте не нормалізувалася і через 72 год. перевищувала контроль у 3,6 (р<0,001) раза. Пригнічення протео- і фібринолітичної активності плазми крові відбувалося на тлі зменшення відсотка тварин, що загинули, який через 24 год. становить 6,7%, через 48 год. - 13,3%, через 72 год. - 35,0%.

трансплантація кордовий тканина панкреонекроз

Таблиця 1. Летальність в досліджуваних експериментальних групах

При порівнянні результатів впливу нативних і озонованих стовбурових клітин на параметри плазмового протеолізу виявилося, що в разі застосування останніх лише лізис азоальбуміну в усі періоди спостереження є меншим: через 24 год. - на 24,0% (р<0,02), через 48 год. - на 25,0% (р<0,01), через 72 год. - на 29,0% (р<0,01), тоді як інтенсивність розпаду високомолекулярних білків і колагену є практично однаковою. У разі застосування активованих озоном СККК, порівняно з нативними стовбуровими клітинами, інтенсивність плазмового неферментативного фібринолізу була нижчою в усі періоди спостереження: через 24 год. - у 1,7 (р<0,01) раза, через 48 год. - у 1,8 (р<0,02) раза, через 72 год. - на 37,0% (р<0,01), тоді як сумарний і ферментативний лізис фібрину практично не відрізнявся. Трансплантація озонованих СККК суттєво зменшує летальність експериментальних тварин: 0 - через 24 і 48 год. та 15,0% _ через 72 год. після моделювання некрозу підшлункової залози.

Нами досліджено також локальні зміни тканинного протеолізу та фібринолізу. Встановлено, що в морських свинок із панкреонекрозом у тканині підшлункової залози відбувалася прогресивна активація нейтральних протеаз, що характеризується перманентним збільшенням альбумінолітичної, казеїнолітичної та колагенолітичної активності. Максимальні зміни спостерігалися з боку тканинного колагенолізу, який через 72 год. після моделювання некрозу підшлункової залози перевищує контроль у 3,6 (р<0,001) раза. Через 72 год. сумарна фібринолітична активність значно перевищує контрольні величини, що пов'язано з переважною інтенсифікацією низькоефективного неферментативного лізису фібрину, який зростає в 5,6 (р<0,001) раза. Під впливом озонованих СККК тканинний нейтральний протеоліз у тварин із панкреонекрозом пригнічується більшою мірою, ніж при застосуванні нативних. Через 24 год. показники тканинної сумарної та ферментативної фібринолітичної активності в зазначених групах тварин не відрізняються. Водночас неензиматичний лізис фібрину був на 32,3% (р<0,05) меншим у разі застосування озонованих стовбурових клітин. Через 72 год. інтенсивність сумарного і неферментативного фібринолізу також є меншою у тварин, яким уводили активовані озоном стовбурові клітини (відповідно на 24,6 (р<0,05) і 36,4% (р<0,02)), проте ензиматичний лізис фібрину не відрізняється.

Стосовно гемостазу, ми встановили, що у морських свинок із некрозом підшлункової залози через 72 год. гіперкоагуляційні зсуви змінюються значним подовженням внутрішніх і зовнішніх процесів утворення протромбіназного комплексу на тлі пригнічення фібриногенезу. Уже через 24 год. після операції спостерігалися початкові процеси виснаження структурних резервів згортаючої системи крові, про що свідчить прогресуюче зниження вмісту в крові фібриногену. При цьому зворотні зміни з боку концентрації в крові розчинних комплексів фібрин-мономера та перманентне зменшення активності антитромбіну ІІІ є ознаками активації внутрішньосудинного згортання крові. Водночас активується Хагеманзалежний фібриноліз і підвищується потенційна активність плазміногену. Через 72 год. резерви плазмового фібринолізу, асоційованого з внутрішнім механізмом гемокоагуляції, виснажувалися, про що свідчить зниження Хагеманзалежного фібринолізу в 1,5 (р<0,01) раза та зменшення потенційної активності плазміногену на 76% (р<0,05), тоді як активність антиплазмінів продовжує збільшуватися і перевищує контроль у 1,4 (р<0,001) раза.

При застосуванні нативних і озонованих СККК через 24 год. після моделювання некрозу підшлункової залози тромбіновий час у зазначених групах тварин не відрізнявся. Через 72 год. усі часові параметри згортання крові були меншими у тварин, які отримували активовані озоном СККК: час рекальцифікації - на 24% (р<0,001), активований парціальний тромбопластиновий час - на 37% (р<0,001), протромбіновий час - на 38% (р<0,001), тромбіновий час - на 40% (р<0,001). Через 72 год. показники концентрації в крові фібриногену та активності антитромбіну ІІІ у морських свинок, яким трансплантували активовані озоном стовбурові клітини, виявлялися відповідно в 2,1 (р<0,001) і 1,9 (р<0,001) раза більшими, тоді як плазмовий вміст розчинних комплексів фібрин-мономера, навпаки, вдвічі меншим, ніж у тварин, які отримували нативні СККК. У тварин із панкреонекрозом, яким уводили озоновані СККК, активність ХІІІ фактора через 72 год. була на 48% (р<0,001) більшою ніж у разі застосування нативних клітин. Показники відсотка адгезивних тромбоцитів та індексу спонтанної агрегації тромбоцитів у всі періоди спостереження були нижчими у тварин, які отримували нативні стовбурові клітини: через 24 год. відповідно в 1,8 (р<0,001) раза і на 38% (р<0,001), через 48 год. - у 2,2 (р<0,001) і 2,0 (р<0,001) рази, через 72 год. - у 3,5 (р<0,001) раза і на 28% (р<0,001). Через 72 год. показники Хагеманзалежного фібринолізу, потенційної активності плазміногену й активності антиплазмінів у тварин, що отримували нативні та озоновані стовбурові клітини були практично однаковими.

Отже, застосування стовбурових клітин кордової крові у тварин приводить до зменшення протеолітичних процесів як в плазмі крові, так і в тканинах, причому найбільш виражені зміни відбуваються при трансплантації активованих озоном клітин. Нормалізація показників гемостазу та фібринолітичної активності відбувається швидше у морських свинок із використанням озонованих СККК, за винятком функціональної активності тромбоцитів, яка залишається значно підвищеною. Перераховані зміни відображені в показниках летальності.

Ураховуючи дані експериментальних досліджень, ми вивчили вплив озонування на трансплантаційний потенціал стовбурових клітин кордової крові. За результатами досліджень, загальна кількість ядромістких клітин крові та загальна кількість мононуклеарів у ексфузаті достовірно не відрізнялася (p>0,9) в клітинних суспензіях без озонування та з активацією клітин озоном. Вміст живих клітин також суттєво не відрізнявся. Кількість колонієутворюючих одиниць у 1,66 раза (р<0,05) більше у зразках кордової крові, де використовувався озонований фізіологічний розчин. Активація стовбурових клітин кордової крові озоном приводить до підвищення трансплантаційного потенціалу за рахунок збільшення КУО при збереженні загальної кількості ядромістких клітин крові та мононуклеарів в ексфузаті та збереження їхньої життєздатності.

Для вивчення необхідності застосування клітинних та тканинних технологій у клініці нами проведено ретроспективний аналіз 463 історій хворих на гострий панкреатит, які лікувалися в Київський обласній клінічний лікарні з 1996 року по 2005 рік. Летальність при гострому панкреатиті становила 11,7%. Частота некротичного панкреатиту серед усіх хворих становила 38,4% (178 хворих) і була стабільною, за винятком 1997 року, коли кількість пацієнтів із некрозом підшлункової залози досягала 66,7%. Серед пацієнтів із некротичним панкреатитом летальність становила 27,5% (49 хворих). Частота ускладнень некротичного панкреатиту становила 49,8%. У структурі ускладнень переважали поліорганна недостатність (19,2%), товстокишкові нориці (12,6%), уповільнений перитоніт (10,8%), арозивні кровотечі з сальникової сумки (8,4%), панкреатичні нориці (6,0%), шлункові нориці (5,4%) і шлунково-кишкові кровотечі з гострих виразок шлунка та дванадцятипалої кишки (4,2%). Синдром дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові діагностовано в 4,8% випадків. За даними ретроспективного аналізу, у 46,6% випадків некротичний панкреатит ускладнився утворенням кісти підшлункової залози. Отже, ускладнення панкреонекрозу були переважно пов'язані з трьома основними причинами: порушенням імунітету та розвитком інфекційних процесів, порушенням мікроциркуляції внаслідок дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові, що призводить до поліорганної недостатності, та прямою дією ферментів підшлункової залози, які потрапляють до черевної порожнини, перипанкреатичного простору та призводять до порушення репаративних процесів.

Для вивчення впливу клітинних і тканинних технологій на ускладнення некротичного панкреатиту нами безпосередньо обстежено 83 пацієнти. Із них 39 хворих _ із використанням нативних стовбурових клітин кордової крові, 34 із активованих озоном СККК. У 10 хворих використовували кордову тканину для лікування панкреатичної нориці. Контрольну репрезентативну групу становили 106 хворих на некротичний панкреатит, які отримували стандартне лікування.

За результатами нашого клінічного дослідження, у хворих на панкреонекроз поступово розвивалася прогресуюча хронометрична гіпокоагуляція, яка обумовлена пригніченням тромбіногенезу як за внутрішнім, так і за зовнішнім механізмами згортання крові, та поєднується з різким гальмуванням процесів фібриногенезу на тлі структурної гіперкоагуляції, про що свідчить прогресивне підвищення вмісту в крові фібриногену. Через 4_7 діб після початку захворювання у хворих на панкреонекроз розпочиналося прогресивне зниження протизгортаючої здатності крові, що супроводжувалося початковим короткочасним підвищенням активності фактора Лакі-Лорана, яке на 8_14-у добу змінювалося пригніченням фібринстабілізувальної здатності крові. У хворих на некротичний панкреатит короткочасна гіпертромбоцитемія змінювалася зниженням вмісту в крові тромбоцитів, що відбувається на тлі значного збільшення їх функціональної активності. У хворих із некрозом підшлункової залози надмірна активація плазмового фібринолізу переважно обумовлена збільшенням низькоефективного неферментативного лізису фібрину. Протягом лікування спостерігається поступове пригнічення Хагеманзалежного фібринолізу на тлі сталого виснаження структурних ресурсів фібринолітичної системи - у всі періоди потенційна активність плазміногену є значно меншою за контрольний рівень. Підвищення загальної активності антиплазмінів при панкреонекрозі є адекватною реакцією на підвищення сумарної фібринолітичної активності плазми крові. Підвищення вмісту в крові розчинних комплексів фібрин-мономера, зниження активності антитромбіну ІІІ та пригнічення фібринстабілізувальної здатності крові свідчать про те, що поступово у хворих на панкреонекроз розвивається синдром дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові. Як до так і після початку лікування у хворих на панкреонекроз у плазмі крові суттєво збільшується інтенсивність нейтрального протеолітичного розпаду низько- та високомолекулярних білків і колагену, що відбувається на тлі високої активності кислих протеїназ і призводить до сталого підвищення вмісту в крові молекул середньої маси.

Нами встановлено, що введення нативних та озонованих СККК хворим на панкреонекроз сприяє нормалізації тромбіногенезу за внутрішнім механізмом гемокоагуляції, викликає гальмування процесів згортання крові за зовнішнім шляхом утворення протромбінази та знижує ступінь пригнічення процесів фібриногенезу. За дії стовбурових клітин структурна нормокоагуляція супроводжується відновленням протизгортаючої здатності крові, кількості в крові тромбоцитів і активності ХІІІ фактора. Функціональна активність тромбоцитів поступово зменшувалася. Проте, якщо адгезивні властивості тромбоцитів упродовж лікування прогресивно знижувалися і через 2_3 тижні досягали контрольних показників, то агрегаційна здатність тромбоцитів наприкінці лікування залишалася підвищеною. Водночас трансплантація озонованих СККК викликала підвищення адгезивних і агрегаційних властивостей тромбоцитів, причому збільшення їх функціональної активності тривало аж до кінця третього тижня періоду спостереження. Після трансплантації хворим на панкреонекроз нативних та озонованих СККК сумарна фібринолітична активність плазми крові зменшується, однак залишається більшою за контроль за рахунок високої інтенсивності ферментативного фібринолізу, тоді як неферментативний лізис фібрину нормалізується на 15_21-у добу після початку лікування. Показники Хагеманзалежного фібринолізу та потенційної активності плазміногену досягають контрольних величин практично відразу після уведення СККК. Загальна активність антиплазмінів нормалізуються наприкінці спостереження. Суттєвого зменшення зазнає вміст у крові розчинних комплексів фібрин-мономера, який на 15_21-у добу виявляється майже у 4,0 (р<0,001) рази меншим, ніж до початку лікування. Крім того, трансплантація нативних СККК хворим на панкреонекроз упродовж трьох тижнів нормалізує плазмовий лізис низькомолекулярних білків і колагену, а також активність протеїназ за Кунітцом. Водночас відбувається перманентне зниження лізису високомолекулярних білків, який на 15_21-у добу після початку лікування виявляється на 30% (р<0,001) меншим за контрольні показники. Вміст у крові молекул середньої маси також прогресивно зменшується і наприкінці комплексного лікування перевищує контрольний рівень лише на 45% (р<0,001). Через 2 тижні після внутрішньовенного введення озонованих СККК у хворих на панкреонекроз відбувається нормалізація плазмової колагенолітичної активності та вмісту в крові молекул середньої маси, а такі параметри протеолізу як інтенсивність лізису низькомолекулярних, високомолекулярних білків та активність кислих протеїназ наприкінці спостереження виявляються меншими за контрольні величини.