Пренатальная цитогенетика

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

федеральное государственное образовательное

учреждение Высшего профессионального образования

«Южный федеральный университет»

Пренатальная цитогенетика

(учебное пособие)

А.А. Александрова

Ростов-на-Дону 2008

Рецензенты:

Главный генетик Ростовской области, заведующая МГК ГУЗ РО КБ, доктор медицинских наук

Амелина С.С.

Директор Научно-исследовательского института биологии Южного федерального университета, доктор биологических наук

Шкурат Т.П.

Александрова А.А.

Пренатальная цитогенетика: Учебное пособие. Ростов-на-Дону, 2008. 92 с.

Учебное пособие посвящено пренатальной цитогенетике. Изложены современные представления об этиологии и патогенезе хромосомных болезней. Рассмотрены основные стадии гаметогенеза и эмбриогенеза человека, вклад хромосомных нарушений в патологию человека на разных стадиях внутриутробного развития и постнатальном периоде, механизмы возникновения хромосомных аномалий, современные методы их диагностики.

Для студентов биологических, биолого-почвенных факультетов, для студентов медицинских вузов.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Модуль 1. Основы проэмбрионального и эмбрионального развития человека

Глава 1. Проэмбриональный период

Глава 2. Преэмбриональный период

Глава 3. Эмбриональный и плодный периоды

Модуль 2. Кариотип человека в норме и при патологии

Глава 4. Нормальный кариотип человека

Глава 5. Механизмы возникновения геномных и хромосомных мутаций на разных стадиях онтогенеза

Глава 6. Хромосомный мозаицизм

Модуль 3. Хромосомные болезни

Глава 7. Этиология и классификация хромосомных болезней

Глава 8. Клинико-цитогенетическая характеристика наиболее распространенных хромосомных болезней

Глава 9. Факторы, влияющие на частоту геномных и хромосомных мутаций

Модуль 4. Пренатальная диагностика хромосомных болезней

Глава 10. Предмет и задачи пренатальной диагностики

Глава 11. Современные методы пренатальной диагностики

Глава 12. Медико-генетическое консультирование

Глава 13. Принципы и методы диагностики хромосомных болезней

Введение

В медицинской генетике цитогенетика человека - сравнительно молодой раздел. Почти 50 лет тому назад впервые удалось выделить и описать хромосомы человека, затем установить этиологическую связь некоторых нарушений хромосомного набора с конкретными формами патологии, что привело к развитию клинической цитогенетики и всестороннему изучению хромосомных болезней. На начальном этапе (1956-1968 г.г.) изучение хромосом человека и их нарушений ограничивалось т.н. рутинным анализом, впоследствии дополненным методами, позволявшими оценивать тонкую структурную организацию хромосом - G-, Q-, R-, C-, T-, NOR-сегментацию (1968-1981 г.г.). На основе их применения в различных исследованиях были получены данные о частоте и разнообразии хромосомных аномалий, об их значении при различных формах врожденной патологии. На сегодняшний день к указанным методам добавились методы молекулярно-цитогенетической диагностики и все они успешно применяются при проведении инвазивных методов пренатальной диагностики наследственных болезней.

Данное учебное пособие состоит их четырех модулей, которые освящают проблемы пренатальной цитогенетики. Система оценки:

№№ пп	Критерии оценки	Баллы	Итого
Модуль 1	Ответы на проектные задания должны быть представлены в реферативной форме. Каждое задание по 5 баллов.	15	25
	Тесты (10 тестов по 1 баллу =10 баллов)	10
Модуль 2	Ответы на проектные задания должны быть представлены в реферативной форме. Каждое задание по 5 баллов.	15	25
	Тесты (10 тестов по 1 баллу =10 баллов)	10
Модуль 3	Ответы на проектные задания должны быть представлены в реферативной форме. Каждое задание по 5 баллов.	15	25
	Тесты (10 тестов по 1 баллу =10 баллов)	10
Модуль 4	Ответы на проектные задания должны быть представлены в реферативной форме. Каждое задание по 5 баллов.	15	25
	Тесты (10 тестов по 1 баллу =10 баллов)	10
Итого:		100	100

Шкала оценок: 100% -80% - оценка «отлично»

79% - 59 % - оценка «хорошо»

58% - 41% - оценка «удовлетворительно»

40% - 0 % - оценка «неудовлетворительно».

Модуль 1. Основы проэмбрионального и эмбрионального развития человека

Комплексная цель: Изучить процессы проэмбрионального и эмбрионального развития человека и их вклад в этиологию и патогенез хромосомной патологии.

Онтогенез, или индивидуальное развитие, человека включает пренатальный (внутриутробный) период, который длится примерно 280 суток, или 10 лунных месяцев, и постнатальный (внеутробный) период, продолжительность которого у разных людей варьирует и во многом определяется как внутренними, так и внешними по отношению к человеку факторами. Изучение пренатального развития человека (эмбриогенеза) встречается с рядом трудностей, связанных не только с получением необходимого для исследований материала, но этическими и религиозными нормами, существующими в общественном сознании. Ранние зародыши человека - “редкая находка”. Только в 1944 г. впервые был исследован 7.5-суточный зародыш человека, а в 1946 г. - 2 - 5-суточные зародыши. Наиболее полная коллекция человеческих эмбрионов находится в институте Карнеги (Балтимор, США). Описания ранних эмбрионов человека даны учеными Гертигом, Рокком и Стритером. Отечественной эмбриологии ранние стадии зародышей человека изучены и описаны А.Г. Кнорре (зародыш “ВМА-1”) и Б.П. Хватовым (зародыш “Крым”). Согласно ставшей классической классификации Института Карнеги, эмбриогенез человека подразделяют на стадии, которые обозначают по имени автора коллекции, как «горизонты Стритера». Эти горизонты, основанные на гистологическом описании уникальных находок, до имплантации обозначают арабскими, а после имплантации - римскими цифрами. Всего выделяют 23 горизонта. Первые 8 (с 1-го по 20 д.р.) соответствуют периоду бластогенеза (преэмбриональный период развития), остальные 15 горизонтов (IX-XXII - с 20-го по 60-й д.р.) - периоду раннего органогенеза (эмбриональный период). Горизонты Стритера не распространяются на фетальный (60-180 д.р. - стадия XXII) и перинатальный периоды (180-280 д.р.). Соответственно, преэмбриональный период согласно классификации Карнеги должен примерно соответствовать первым четырем неделям беременности, эмбриональный - с 5 по 9 недели беременности, плодный - с 9 по 40 недели беременности. Также в медицине существует и более упрощенная классификация по триместрам беременности, согласно которой I триместр беременности (до 13-й недели) соответствует эмбриональному периоду развития, II и III - фетальному (плодному) периоду. В последнем нередко принято выделять еще и перинатальный период - с 28-недели беременности до 7-го дня периода новорожденности. Развитие технологии искусственного оплодотворения позволило в деталях исследовать механизмы оплодотворения и дробления зиготы у человека.

Глава 1. Проэмбриональный период

Учитывая важность процессов проэмбрионального периода и начальных этапов эмбриогенеза в этиологии и патогенезе хромосомной патологии, рассмотри: гаметогенез (сперматогенез и оогенез) и оплодотворение.



Рис. 1. Внешний вид зародышей человека на XII-XXIII стадиях развития по классификации Карнеги.

Гаметогенез

Все половые клетки млекопитающих и человека берут начало от первичных половых клеток (ППК) -- гоноцитов. Происхождение ППК до настоящего времени окончательно не выяснено. Не вызывает, однако, сомнения, что эти клетки возникают значительно раньше, чем появляются зачатки гонад, то есть они имеют экстрагонадное происхождение. Согласно существующим представлениям ППК могут быть обнаружены в первичной полоске уже на 16-18-й день развития, затем они перемещаются в желточную (внезародышевую) энтодерму у основания аллантоиса, мигрируют в энтодерму средней кишки, откуда и попадают в половые валики -- зачатки гонад. В последнее время получены данные о том, что ППК выделяются в самостоятельный эмбриональный зачаток значительно раньше, еще во время дробления и формирования бластоцисты.

Рис 2. Принципиальная схема сперматогенеза и оогенеза.

Попав в зачатки гонад, гоноциты впервые обнаруживают признаки полового диморфизма. При формировании мужских гонад (семенников) они окружаются клетками целомического эпителия, образуя так называемые «половые тяжи», в составе которых пребывают в латентном, недифференцированном состоянии (сперматогоний) вплоть до начала полового созревания.

При формировании женских гонад (яичников) гоноциты задерживаются в наружном, корковом слое мезенхимной ткани половых валиков, активно пролиферируют, вступают в мейоз, после чего каждый из них окружается фолликулярными клетками и, в виде ооцитов 1-го порядка, сохраняется до полового созревания. Принципиальная схема гаметогенеза у млекопитающих и человека приведена на рисунке 2.

Сперматогенез

Общая продолжительность сперматогенеза у человека составляет 72 дня. За это время стволовые клетки сперматогенного ряда (сперматогоний), находящиеся в глубине извитых семенных канальцев, проходят длительный путь дифференцировки до зрелых, практически лишенных цитоплазмы, сперматозоидов, содержащих гаплоидный набор хромосом.

Рис. 4. Схема сперматогенеза.

В процессе сперматогенеза различают две фазы -- тестикулярную и эпидидемальную. Во время первой происходят основные этапы дифференцировки сперматогоний в сперматозоиды; во время второй завершается созревание спермиев. В результате накопления мукополисахаридов, холестерина, других защитных белков, меняются свойства наружных мембран, спермин приобретают подвижность.

Сперматогенез (тестикулярная фаза) включает два последовательных этапа: собственно сперматогенез и спермиогенез. Тестикулярная фаза контролируется гормонами гипофиза (фолликулостимулирующим и лютеотропным) и собственными гормонами семенников -- тестикулярными андрогенами (тестостероном, андростендионом и другими), которые продуцируются клетками Лейдига, находящимися в строме извитых семенных канальцев.

На 1-м этапе вступающие в мейоз клетки (сперматоциты 1-го порядка) претерпевают два последовательных мейотических деления. При этом из одного сперматоцита 1 -го порядка возникают 4 клетки (сперматиды) с гаплоидным числом хромосом. Все процессы дифференцировки проходят в стенке извитых семенных канальцев. При этом клетки сперматогенного ряда находятся непосредственно в цитоплазме клеток Сертоли, которые обеспечивают питание сперматоцитов и сперматид.

Во время спермиогенеза гаплоидные клетки -- сперматиды -- проходят ряд последовательных стадий дифференцировки (фаза Гольджи, фаза колпачка, акросомная фаза, фаза созревания). Они утрачивают цитоплазму, формируют специальные органоиды (хвост, шейку, акросому). Акросома возникает непосредственно из мембран аппарата Гольджи, покрывает в виде колпачка переднюю часть головки спермия (примерно до ее середины) и содержит набор литических лизосомных ферментов, важных для оплодотворения.

Особенно существенные изменения происходят непосредственно в ядре клеток. ДНК в составе хромосом утрачивает типичную для соматических клеток нуклеосомную организацию. Гистоновые белки, характерные для функционально активной ДНК, заменяются на кислые белки, богатые аргинином и протаминами. Спирализация ДНК достигает максимальной величины. Ежедневно у человека активного репродуктивного возраста продуцируется свыше 10 млн зрелых сперматозоидов.

Оогенез

В отличие от мужских половых клеток родоначальники женских половых клеток -- оогонии -- претерпевают важнейшие стадии дифференцировки, включая все этапы профазы мейоза, еще во внутриутробном периоде развития. Достигнув зачатков будущих яичников (половых валиков) примерно к концу 1-го -- середине 2-го месяца беременности, гоноциты теряют амебоидную подвижность, вступают в контакт с клетками фолликулярного эпителия и преобразуются в оогонии. В течение последующих 3-4 месяцев оогонии активно делятся митозом. В результате их число возрастает от исходных 1500-2000 клеток до нескольких миллионов. Максимальное число оогоний (до 7 млн) находится в яичниках плодов женского пола на 7-м месяце беременности. Сразу же за периодом размножения следует апоптоз -- запрограммированная гибель большей части оогониев. Причины апоптоза остаются невыясненными. Неясна и селективная роль такой массовой клеточной гибели. Возможно, погибают те оогонии, которые по тем или иным причинам не могут трансформироваться в ооциты и вступить в мейоз, либо, что кажется более правдоподобным, гибнущие клетки -- это ооциты, находящиеся в профазе мейоза.

Количество женских половых клеток к концу беременности и у новорожденных уменьшается в среднем до 2 млн, к 7 годам --до 300 000, а к началу полового созревания -- до 40 000. Реально в течение всей жизни овулирует не более 400-500 ооцитов. Значительная часть естественной убыли женских половых клеток происходит в результате апоптоза оогониев, другие погибают уже внутри атретических фолликулов, которые не доходят до овуляции. Уместно также отметить, что в отличие от млекопитающих, процессы оогенеза у человека протекают асинхронно, а потому значительно растянуты во времени.

Рис. 5. Схема оогенеза.

Уже с 3-го месяца беременности часть оогониев завершает циклы митотических делений, трансформируется в ооциты и вступает в период роста. Они увеличиваются в размерах, окружаются фолликулярными клетками, вступают в профазу мейоза. Однако в отличие от мужского мейоза, в оогенезе вслед за профазой не наступает метафаза, а мейоз блокируется, и ооциты надолго, вплоть до начала полового созревания, переходят в состояние покоя --диктиотену. Предполагается, что блокада мейоза связана с действием особых факторов, секретируемых соматическими (фолликулярными) клетками гонады. Окруженные одним слоем фолликулярных клеток ооциты образуют так называемые первичные (примордиальные) фолликулы. До полового созревания длится период медленного роста, во время которого прогрессивно увеличивается число слоев фолликулярных клеток, окружающих ооцит на стадии покоя (диктиотены). Ядро ооцита на этой стадии очень крупное, светлое, называется иногда «зародышевым пузырьком». Характерной структурой такого ядра у человека являются «ламповые щетки» -- петли ДНК, на которых происходит активный синтез РНК-комплексов, откладывающихся в ооплазме до момента оплодотворения. Размеры ооцита по мере увеличения числа фолликулярных клеток также увеличиваются. Рост самого ооцита прекращается только с началом периода быстрого роста его фолликула, что совпадает с периодом полового созревания. В это время внутри фолликула образуется полость (антрум), которая заполняется жидкостью. Ее размеры быстро увеличиваются. Фолликул превращается в Граафов пузырек.

Созревание ооцитов начинается с возобновления мейоза и заканчивается только после оплодотворения, когда завершается 2-е мейотическое деление. С наступлением активного репродуктивного возраста ооциты группами (5-10 шт.) вступают в мейоз, однако в большинстве случаев в каждом цикле овулирует только один, наиболее продвинутый в развитии доминантный фолликул, тогда как ооциты в остальных фолликулах, вступившие в период созревания, прекращают развитие и подвергаются атрезии.

Рост и созревание фолликулов с находящимися в них ооцитами находится под гормональным контролем как со стороны гипофиза (фолликулостимулирующий гормон -- ФСГ, лютетропный гормон -- ЛГ) и гипоталамуса (пролактин -- гонадотропин-релизинг гормон), так и самого яичника (эстрогены, гормоны фолликулярных клеток, прогестерон -- гормон желтого тела). При этом период роста ооцитов, особенно период быстрого роста, контролируется преимущественно ФСГ, а период созревания -- ЛГ. Примерно за сутки до овуляции, то есть до разрыва Граафова пузырька и выхода ооцита, отмечается пик подъема ЛГ.

Оплодотворение

Кульминационным моментом зарождения новой жизни является встреча мужских и женских гамет.

Рис. 6. Строение зрелого сперматозоида (а), акросомная реакция (б), последовательные этапы оплодотворения (в).

Примерно через сутки после подъема в крови женщины уровня ЛГ отмечается набухание и разрыв «зародышевого пузырька» (ядра ооцита), возобновляется мейоз, отделяется 1-е полярное тельце. Во время овуляции происходит разрыв Граафова пузырька, и ооцит на стадии метафазы II, окруженный «лучистым венцом» (corona radiata) из гранулезных клеток яйценосного бугорка (cumulus), попадает в ампулярную часть яйцевода, где обычно и происходит оплодотворение. Собственные оболочки овулировавшей яйцеклетки представлены блестящей оболочкой (zona pellucida) и плазматической (вителлиновой) мембраной, непосредственно прилежащей кооплазме. Блестящая оболочка имеет преимущественно мукополисахаридную природу и является продуктом как самого ооцита, так и питающих его фолликулярных клеток. Ее важной особенностью является наличие особых белков -- гликопротеи-нов ZP1, ZP2 и ZP3, ответственных за видовую специфичность оплодотворения

Овулировавший ооцит, безусловно, является самой крупной клеткой организма. Его диаметр без блестящей оболочки составляет 110-120 микрон, с блестящей оболочкой -- 140--150 микрон.

Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению только после нескольких часов пребывания в половых путях женщины. Во время их продвижения по яйцеводам, происходит удаление с наружной плазматической мембраны защитных белков, мукополисахаридов (в том числе фактора декапацитации) и холестерина. В результате этих процессов, получивших название реакции капацитации, изменяется электрический заряд наружной мембраны, усиливается потребление кислорода, возрастает подвижность сперматозоидов. Капацитация in vitro может быть получена путем инкубации в течение нескольких часов отмытых от слизи сперматозоидов в солевом растворе при +37^?С.

Считается, что in vivo места оплодотворения в яйцеводе достигают только несколько сперматозоидов из общего числа 30--40 млн клеток в одном эякуляте. Сперматозоиды могут сохранять способность к оплодотворению в течение нескольких дней, а по некоторым наблюдениям -- до 1 недели.

Основные биологические барьеры на пути проникновения спермия в овулировавшую яйцеклетку представлены клетками лучистого венца, блестящей (zona pellucida) и плазматической (вителлиновой) оболочками яйцеклетки.

Преодоление лучистого венца (corona radiata) достигается активным движением самого сперматозоида, а также за счет растворения и разжижения межклеточного мукополисахаридного матрикса гиалуронидазой, выделяемой акросомами погибших спермиев.

Пройдя через corona radiata, сперматозоид вначале неспецифически, а затем специфически связывается с поверхностью блестящей оболочки. Происходит так называемая «акросомная реакция»: в результате разрушения наружной акросомной мембраны спермия высвобождается набор литических ферментов (гиалуронидаза, акрозин, нейраминидаза), которые и обеспечивают пенетрацию блестящей оболочки. Общая продолжительность акросомной реакции составляет 10-15 минут. Естественно, что преодоление блестящей оболочки, являющейся наиболее серьезным естественным барьером, требует изначально наличия интактной нормальной акросомы. Сперматозоиды с неправильной формой головки или с нарушенной акросомой не способны к естественному оплодотворению.

Пройдя через блестящую оболочку, сперматозоид связывается своей постакросомальной областью (экваториальным сегментом) с микрофиламентами вителлиновой оболочки и погружается внутрь ооплазмы путем пиноцитоза, то есть без разрушения целостности наружной мембраны яйцеклетки.

Присоединение сперматозоида к плазматической мембране сопровождается сложной ответной реакцией яйцеклетки, получившей название «кортикальной реакции», или «реакции активации». Подобно волне, она распространяется по поверхностному слою яйцеклетки от места проникновения первого сперматозоида. Ее начало знаменуется локальным повышением концентрации ионов Са²⁺, которое стимулирует распад находящихся в кортикальном слое ооплазмы лизосомоподобных структур -- кортикальных гранул, содержимое которых (протеиназы, пероксидазы, нейраминидаза) быстро достигает сначала плазматической, а затем и блестящей оболочек. При этом происходит сокращение кортикального слоя ооплазмы, в результате между блестящей и плазматической оболочками появляется перивителлиновое пространство. В самой блестящей оболочке наблюдается быстрое разрушение рецепторных гликопротеинов ZP3, что делает невозможным прикрепление и проникновение в яйцеклетку других сперматозоидов (блок полиспермии). Реакция активации приводит к снятию мейотического блока, быстрому завершению яйцеклеткой 2-го деления созревания и отделению в перивителлиновое пространство 2-го полярного тельца. Головка спермия, попавшая в ооплазму в результате оплодотворения, и оставшийся после 2-го мейотического деления гаплоидный набор хромосом яйцеклетки трансформируются соответственно в мужской и женский пронуклеусы. Оплодотворение, продолжительность которого не превышает 24 часа, завершено. Начинается индивидуальное развитие нового организма.

Глава 2. Преэмбриональный период

Преэмбриональный период (первые 20 дней после оплодотворения) включает доимплантационные стадии, имплантацию и начало постимплантационного этапа развития.

Доимплантационный период (дробление, компактизация, бластуляция)

Доимплантационное развитие у человека занимает около 6-7 дней (1-6 д. р. /1 н. б.) и включает такие основные морфогенетические процессы как формирование пронуклеусов, дробление, компактизация и бластуляция.

Собственно развитие зародыша начинается с формирования мужского и женского пронуклеусов, которое завершается через 12 часов после оплодотворения. При этом мужской пронуклеус формируется несколько раньше женского (8 часов после оплодотворения). Деконденсация его хромосом выражена в большей степени, чем женского. В результате размеры мужского пронуклеуса несколько превосходят размеры женского. Через 9 часов происходит репликация хромосом. Через 30 часов хромосомы конденсируются, хромосомный материал обоих пронуклеусов объединяется в одной метафазной пластинке, наступает первое деление дробления.



Рис. 7. Прижизненные фотографии зародышей человека доимплантационного периода развития. Фазовый контраст. а- зигота, б - 2 бластомера, в - 4 бластомера, г - 6 бластомеров, д,е - морула, ж - бластоциста, з - вылупление бластоцтсты (Баранов, Кузнецова, 2007).

На стадии морулы (3-5 дни развития) зародыш состоит из 8-16 бластомеров, начинается процесс компактизации, сопровождающийся поляризацией бластомеров. Через 4,5-5 дней после оплодотворения зародыш превращается в бластоцисту - небольшой пузырек, заполненный жидкостью. В ходе дробления зародыш продвигается по маточной трубе в направлении матки как за счет тока жидкости, так и вследствие перистальтических сокращений мускулатуры и движения эпителиальный ресничек. На 5-6 день зародыш на стадии бластоцисты попадает в матку.

Следует отметить, что первые деления дробления осуществляются за счет генетической информации, накопленной ооцитом еще в период оогенеза. Зародыш обладает достаточным запасом готовых белков, рибонуклеопротеиновых комплексов, необходимых для синтеза новых белков, а также питательных веществ и энергетических ресурсов, чтобы полностью обеспечить начальные этапы эмбриогенеза. Синтез белков, необходимых на этой стадии, происходит на матрицах РНК, синтезированных еще в оогенезе, то есть на хромосомах ооцита. Отсюда название материнская РНК, переключение индивидуальной генетической программы с материнской РНК на геном самого зародыша происходит постепенно, только со стадии 4-8 бластомеров.

Имплантация и раннее постимплантационное развитие

Достигнув матки зародыш выходит из блестящей оболочки (хэтчинг). Клетки трофобласта вступают в непосредственный контакт с клетками слизистой оболочки матки и с помощью литических ферментов разрушают вначале эпителий, а затем и несколько подлежащих слоев децидуальных клеток. Постепенно зародыш оказывается полностью погруженным в эндометрий стенки матки. Продолжительность имплантации у человека составляет около 40 часов. Во время имплантации возникает внезародышевая мезодерма, выстилающая полость бластоцисты и участвующая в образовании хориона. Многочисленные ворсинки покрывают поверхность плодного яйца и глубоко проникают в толщу стенки, разрушая сосуды эндометрия. Это ведет к появлению лакун с материнской кровью, в которых плавают трофобластические тяжи, образующие первичные ворсинки. С их появлением зародыш называют плодным пузырем. Врастание в трофобластические тяжи внезародышевой мезодермы приводит к образованию вторичных ворсин (13-14 д.р.). Клетки наружного слоя трофобласта образуют синцитий. Внутренний слой представлен камбиальными клетками цитотрофобласта (клетки Лангханса). Эти клетки длительное время сохраняют митотическую активность, в связи с чем именно их используют для цитогенетического анализа при необходимости кариотипирования зародыша. У человека развитие хориона существенно опережает развитие производных эмбриобласта.

Этапы развития и дифференцировки зародыша человека на ранних стадиях развития представлены на рис.

Путем деляминации (расслоения) внутренней клеточной массы на эктодерму и энтодерму вначале образуется двухслойный, а затем, после формирования первичной полоски и Гензеновского узелка, и трехслойный (появляется зародышевая мезодерма) зародыш, возникают желточный мешок и амнион, соответственно, появляются амниотическая полость и полость желточного мешка. Из заднего конца крыши желточного мешка врастает в амниотическую ножку продолговатый, слепо оканчивающийся вырост -- аллантоис. Вместе с окружающей его мезенхимой и врастающими на более поздних стадиях эмбриогенеза сосудами, он принимает участие в формировании пуповины.

Рис. 8. Схема развития и дифференцировки эмбриона человека на ранних стадиях развития.

На 9-14-е сутки зародыш человека представлен мощно развитыми внезародышевыми частями (трофобласт, внезародышевая мезенхима, амнион, желточный мешок, амниотическая ножка), и лишь его ничтожная часть (дно амниотического пузыря и крыша желточного пузырька) представляет собой материал, из которого позднее формируется тело зародыша.

Основные морфологические характеристики зародыша человека в течение преэмбрионального периода развития представлены в таблице

Таблица 1

Основные морфологические характеристики зародыша человека - с 1-й по 23-ю стадии развития по классификации Карнеги (преэмбриональный период -стадии 1-8; эмбриональный период - стадии 9-12; ранний фетальный период - стадия 23)

Стадия по Карнеги	Возраст зародыша, дни	Менструальный возраст + 2 недели	КТР, мм	Морфологические особенности
Преэмбриональный период
1	0-2	20	0,2	Оплодотворение, зигота
2	2-4	2+2-2+3	0,2	От 2 до 16 бластомеров
3	4-5	3-3-3-2	0,2	Стадия компактизации, ранняя бластоциста, образование трофобласта и внутренней клеточной массы (ВКМ)
4	5-6	3-2-3-1	0,2	Освобождение от блестящей оболочки(«Хэтчинг»), начало имплантации
5	6-7	30-4-2	0,2	Деламинация внутренней клеточной массы бластоцисты с образованием эктодермы и энтодермы (1-я фаза гаструляции); первичный желточный мешок (ЖМ); разрастание трофобласта, начало образования ворсин
6	7-15	4-1-4+1	0,2-0,4	Вторичный ЖМ, эмбриональный диск грушевидной формы, 2-я фаза гаструляции, первичная полоска, кровяные островки в стенке ЖМ
7	16-18	4+1-4+3	0,4	Формирование трех зародышевых мешков, появление хорды
8	18-20	4+3-5-2	1,0-1,5	Формирование нервной пластинки, нервного желобка, образование первичных сосудов
Эмбриональный период
IX	20-21	5-2-50	1,5-2,5	Первые сомиты, вторичные ворсинки, начало формирование сердца, появление предпочки
X	21-22	5+1-5+2	2,0-3,5	4-12 сомитов, нервные валики начинают смыкаться в средней части, появляются две пары жаберных дуг, зачатки глаз, слуховые плакоды
XI	22-26	5+2-6-2	2,5-4,5	13-20 сомитов, нейропоры открыты, 3-4 пар жаберных дуг, эмбрион приобретаетС-образную форму, сердечная трубка S-образная, ритмично сокращается
XII	26-30	6-2-6+2	3-5	21-29 сомитов, определяются почки верхних конечностей, закрывается задний нейропор; закладываются печень, поджелудочная железа, пищевод, трахея, легкие, клапаны и перегородка сердца, начинается развитие мышц, костей
XIII	28-32	60-7-3	4-6	30-40 сомитов, появляются почки нижних конечностей, удлиняются и дифференцируются почки верхних конечностей, формируются слуховые пузырьки, передний, средний и задний мозг, аортальные дуги
XIV	31-35	6+3-70	5-7	Верхняя конечность разделяется на плечо и предплечье, определяется зачаток кисти, видны мандибулярные и гиоидные дуги, ротовая ямка, сердце 4-х камерное, формируются зачатки легких, закладки третичной (постоянной почки), мочевого пузыря
XV	35-38	70-7+3	7-10	Размеры мозга увеличиваются на 1/3, передний нейропор закрыт, видны 4 пары жаберных дуг, определяются мандибулярные и максилярные дуги, носовые ямки, формируются стопы, гонады заселяются первичными половыми клетками (ППК)
XVI	37-42	7+2-80	8-12	Пигментация глаз, начало оссификации костей, закладываются зубная пластинка и зачатки зубов, дифференцированы основные части конечностей
XVII	42-44	80-8+2	11-14	Определяются закладки пальцев верхних конечностей, формируется диафрагма, появляется половой бугорок, почки начинают вырабатывать мочу
XVIII	44-47	8+2-9-1	13-17	Определяются бедро, голень, пальцы нижних конечностей, срастаются веки, появляются соски
XIX	47-51	9-1-9+2	16-18	Туловище удлиняется и несколько выпрямляется; определяются полушария мозга, ушные раковины расположены низко, глаза в боковых частях головы, развивается задний мозг
XX	51-53	9+2-10-3	18-22	Верхние конечности удлинены, согнуты в локтях, определяются коленные и голеностопные суставы, различаются пальцы стоп
XXI	52-56	10-3-10-2	22-24	Поздняя эмбриональная стадия, конечности хорошо дифференцированы, пальцы рук сжимаются, завершается формирование межпредсердной перегородки
XX	56-60	10-2-100	23-28	Глаза открыты, появляются первые извилины мозга, возникают непроизвольные движения, возможно распознавание пола по гонадам, кишка из пупочного канатика втягивается в брюшную полость
Ранний фетальный период
XXIII	60-70	100-12+3	27-45	Масса тела (МТ) около 10г. Глаза закрыты веками, сформирована верхняя губа, формируется твердое небо, исчезает естественная пупочная грыжа, появляются очаги окостенения в длинных трубчатых костях, конечности хорошо сформированы, пальцы разделены
	70-77		50-70	МТ около 20-40г. Увеличивается масса мозга, голова наклонена вперед, гениталии дифференцированы по половому признаку, объем амниотической жидкости около 50 мл.
	77-90		70-90	МТ 45-60г. Плод начинает двигаться, хорошо прослушивается сердцебиение, развиваются зубы, растут волосы, дифференцируются бронхи

Глава 3. Эмбриональный и плодный периоды

Эмбриональный этап развития включает периоды раннего и позднего органогенеза (20-60 д.р., 5-12 н.б.), его начало соответствует стадии нейруляции, т.е. появлению нервной пластинки и закладке осевого комплекса органов. В это время происходит обособление зародыша от его внезародышевых частей, образование нервных валиков и их смыкание в нервную трубку, появляются первые сомиты, начинается сегментация и дифференцировка осевой мезодермы.

Копчико-теменные размеры зародыша в течение этого периода увеличиваются от 1,5-2 до 30-40 мм. Из центральных частей сомитов - миотомов- развивается вся скелетная мускулатура тела, из боковых пластинок - зачатки канальцев первичной почки (нефротомы), а также вторичной почки; эпителиальные выстилки брюшной, плевральной и перикардиальной полостей, вся гладкая мускулатура и зачаток сердца. Из других частей сомитов - склеротом (медиовентральная часть) и дерматом (дорсо-латеральная часть) развиваются соответственно осевой скелет и кожа). Развитие всех систем и органов представлено в таблице 1.

Плодный период

События органогенеза, происходящие преимущественно в эмбриональный период, переходят в плодный (фетальный) период, когда основными в морфогенезе становятся процессы гистогенеза. Дифференцировка клеточного и тканевого материала эмбриональных зачатков протекает параллельно с процессами органогенеза. Этапы дифференцировки клеточного материала:

1. Неспецифическая дифференцировка, когда клетки различных зачатков отличаются друг от друга какими-то общими морфологическими признаками (форма, количество и тип органоидов, взаиморасположение).

2. Специфическая (тканевая, или терминальная) дифференцировка - морфологическая, биохимическая и функциональная специализация клеток.

Каждый эмбриональный зачаток в норме дает начало определенной совокупности тканевых производных, имеет свое проспективное значение. Каждое производное проходит свойственные только ему этапы детерминации, дифференцировки и роста.

Неблагоприятные внешние воздействия в плодном периоде могут быть причиной нарушений развития нервной или репродуктивной систем, стойких эндокринных расстройств, т.е. дефектов именно тех органов, процессы терминальной дифференцировки которых растянуты во времени и не завершаются на момент рождения ребенка.

Следовательно, развивающийся зародыш человека чувствителен к повреждающему действию экзогенных и эндогенных факторов в течение всего антенатального периода развития, хотя конечный результат таких воздействий на разных стадиях эмбриогенеза может быть совершенно различным.

Проектное задание

1. Сравните процессы сперматогенеза и оогенеза. Какова роль полярных телец?

2. Что блокирует модификация рецепторного белка прозрачной оболочки после оплодотворения? Сравните процессы оплодотворения у человека и млекопитающих.

3. В чем отличия оплодотворения in vitro и in vivo?

Тесты рубежного контроля

1. Общая продолжительность сперматогенеза у человека составляет:

А) 36 дней

Б) 24 дня

В) 72 дня

Г) один месяц

2. Сперматозоид человека состоит из всего перечисленного, кроме:

А) головка

Б) шейка

В) акросома

Г) желточный мешок

3. Клетками сперматогенеза являются все, кроме:

А) сперматиды

Б) сперматоциты

В) сперматогонии

Г) акросома

4. Схема сперматогенеза включает следующие этапы:

А) эмбриональный митоз, постнатальный митоз, дифференцировка, мейоз

Б) митоз, первое деление мейоза, второе деление мейоза

В) первое деление мейоза, второе деление мейоза

Г) эмбриональный митоз

5. Рост и созревание фолликулов происходит под гормональным контролем всего перечисленного, кроме:

А) гипофиза

Б) гипоталамуса

В) мозжечка

Г) яичника

6. Основными биологическими барьерами на пути проникновения спермия в яйцеклетку являются все, кроме:

А) клетки лучистого венца

Б) блестящая оболочка

В) ядерная оболочка

Г) плазматическая оболочка

7. Доимплантационный период включает все перечисленное, кроме:

А) дробление

В) компактизация

В) развитие хориона

Г) бластуляция

8. Ворсины хориона образуются:

А) на 2-3 день развития

Б) на 13-14 день развития

В) на 8 неделе беременности

Г) на 5-6 неделе беременности

9. По время раннего постимплантационного развития образуется все перечисленное, кроме:

А) хорион

Б) амнион

В) желточный мешок

Г) бластоциста

10. Эмбриональный период развития длится с

А) 1 по 5 недели беременности

Б) с 5 по 12 недели беременности

В) с 13 по 18 недели беременности

Г) с 1 недели до 3 месяцев

Модуль 2

Комплексная цель: Ознакомиться с нормальным кариотипом человека. Изучить механизмы возникновения геномных и хромосомных мутаций на разных стадиях онтогенеза. Изучить явление хромосомного мозаицизма.

Глава 4. Нормальный кариотип человека

Рис. 9. Схематическое изображение хромосом человека при G-окрашивании в соответствии с международной классификацией

Унифицированная система описания и символики хромосом человека в норме и при хромосомных аномалиях и синдромах первоначально была основана на данных о размерах хромосом и центромерном индексе (отношении размеров короткого плеча к длинному), в дальнейшем на получаемых различными методами дифференциального окрашивания их специфической исчерченности, строго индивидуальной для каждой пары гомологичных хромосом. С тех пор, как в 1956 году Тио и Леван, в своей знаменитой статье сообщили, что число хромосом у человека в клетках эмбриона - 46, а не 48 как считали раньше, а Форд и Хамертон подтвердили эти выводы, многие лаборатории мира занимались созданием унифицированной системы классификации хромосом человека. Это привело в конечном итоге к установлению общей хромосомной номенклатуры, которая облегчает описание хромосомных аномалий, а также научные и клинические контакты между исследователями всего мира. Первая номенклатура хромосом, известная как “Денверская классификация” (1960), заложила основу для всех последующих номенклатур и многие ее положения остались неизмененными до настоящего времени. Затем были уточнения данной классификации хромосом в 1963 г. на специальной Лондонской конференции и в 1966 г. в Чикаго на 3-м Международном конгрессе по генетике человека. Эти дополнения выдержали испытания временем и использовались во всем мире для описания хромосомных заболеваний. В начале 70-х годов был опубликован первый кариотип больного с поперечной исчерченностью хромосом. Вскоре был разработан ряд методов для изучения природы дифференциального окрашивания. Исходя из полученных данных, каждую хромосому можно было идентифицировать более точно, а существующая система номенклатуры хромосом нуждалась в пересмотре. В 1971 г. в Париже во время работы 4-го Международного конгресса по генетике была принята новая система классификации хромосом человека и их аномалий. Впоследствии был создан постоянный комитет по номенклатуре хромосом, который периодически собирался и, по мере развития цитогенетических исследований, вносил поправки в существующую классификацию. Комитет собирался в Мехико, Лэйк-Плэсиде, Эдинбурге и Стокгольме, где было решено разработать и опубликовать унифицированный вариант номенклатуры хромосом человека, включающий основные положения совещаний в Денвере, Лондоне, Чикаго и Париже. Этот важный документ получил название “Международная система номенклатуры хромосом человека (1978)” или ISCN (1978) - “An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (1978)”. Таким образом, в одном документе давалась полная номенклатура хромосом в норме и при хромосомных аномалиях. Следующая важная проблема, рассмотренная постоянным комитетом, была расширенная номенклатура хромосом при использовании методов высокоразрешающего окрашивания хромосом (“high resolution banding”), в результате которого исследователи смогли получать до 2000 хромосомных сегментов на кариотип по сравнению с прежними 200-400 сегментами (Ворсанова, Юров, 1987). Новый документ был опубликован в Париже как “Международная система номенклатуры цитогенетики человека - исчерченность высокого разрешения (1981)” или “ISCN (1981)”. Необходимые поправки в классификацию были внесены в Иерусалиме (1985г) и в Берлине (1991г) во время работ Всемирных конгрессов по генетике человека. Наконец, этот же конгресс в Вашингтоне (1991г.) принял решение, в свете новых достижений по использованию молекулярно-цитогенетической диагностики хромосомных аномалий, подготовить новый окончательный документ по номенклатуре хромосом и их аномалий - ISCN (1995). Комитет учел все рекомендации, сообщенные исследователями мира, уточнил их, модифицировал и соединил в единый документ, который был опубликован в 1995 году как “Международная система для цитогенетической номенклатуры человека (1995)” /”An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (1995)” или “ISCN (1995)”/. В 2004 в Ванкувере на международной конференции были приняты новые поправки к цитогенетической номенклатуре человека и в 2005 году опубликована новая “Международная система для цитогенетической номенклатуры человека (2005)», которой в настоящее время пользуются исследователи всего мира - клинические генетики и цитогенетики, онкоцитогенетики, невропатологи и психиатры используют данную номенклатуру для описания хромосомных аномалий и синдромов, введения их в различные компьютерные программы и регистры.

В хромосоме выделяют короткое и длинное плечо, которые обозначаются буквами “р” и “q”, соответственно, а в каждом плече выделяют районы, которые пронумерованы последовательно от центромеры к теломере. В каждом районе хромосом полосы и сегменты нумерованы также последовательно в таком же направлении - от центромеры к теломере. Когда исследователям необходимо обозначить какой-либо участок при описании аномалии хромосом, то вначале пишут номер хромосомы, затем символ плеча (р или q), номер района и номер полосы (или сегмента) хромосомы. Например, запись - 6q 23 указывает на то, что это хромосома 6, длинное плечо, район 2, полоса (или сегмент) 3. В ряде случаев при особом способе окрашивания хромосом (высокоразрешающем методе) исследователи могут наблюдать и разделение сегмента на подсегменты, которые также необходимо указывать при описании кариотипа больного. Например, запись - 16q11.2 говорит о том, что аномалия затрагивает хромосому 16, длинное плечо, район 1, сегмент 1, подсегмент 2.

В кариотипе аутосомы пронумерованы с 1-й по 22-у по мере уменьшения их длины. Половые хромосомы (или гоносомы) обозначаются как Х (женский пол) и Y (мужской пол). Когда хромосомы окрашиваются гомогенно (без поперечной исчерченности), они могут быть легко представлены как хромосомы 7-ми различных групп, обозначаемых от А до G. Деление на группы основано на порядке уменьшения величины хромосом (длины) и по расположению центромеры. Группа А (1-3) - большие метацентрические хромосомы легко отличимые друг от друга по размерам и расположению центромер. Группа В (4-5) - большие субметацентрические хромосомы. Группа С (6-12 и Х) - мета- и субметацентрические хромосомы среднего размера, хромосома Х похожа на самые большие хромосомы из этой группы. Группа D (13-15) - среднего размера акроцентрические хромосомы со спутниками на коротких плечах. Группа Е (16-18) - относительно небольшие метацентрические и субметацентрические хромосомы. Группа F (19-20) - небольшие метацентрические хромосомы. Группа G - (21-22 и У) - маленькие акроцентрические хромосомы со спутниками на коротких плечах; хромосома Y в нормальном кариотипе никогда не имеет спутников. Районы и сегменты на хромосомах проявляются после дифференциального окрашивания хромосом различными методами, которые также следует указывать при описании хромосомных аномалий.

Глава 5. Механизмы возникновения геномных и хромосомных мутаций на разных стадиях онтогенеза

Хромосомные аномалии могут возникать на разных стадиях онтогенеза. Для пренатальной цитогенетики особенно важны те нарушения кариотипа, которые возникают в гаметогенезе, при оплодотворении и на ранних стадиях развития.

Хромосомные аномалии подразделяют на геномные и структурные. Первые связаны с изменением числа хромосом, вторые - их структуры.

Основными механизмами возникновения триплоидии являются нарушения оплодотворения, связанные с диандрией (присутствие в яйцеклетке двух отцовских геномов) или с дигинией (наличие в яйцеклетке лишнего гаплоидного генома матери).



Тетраплоидия может быть результатом одного из двух событий - блокирования веретена деления или эндомитоза.

Анеуплоидия возникает в результате нарушения сегрегации хромосом в митозе или в мейозе.

Основные механизмы возникновения анеуплоидии:

ь собственно нерасхождение хромосом (приводит к образованию дочерних анеуплоидных клеток - гипер- и гипоплоидных - вследствие сегрегации обеих гомологичных хромосом (хроматид) к одному полюсу в анафазе клеточного деления (истинное нерасхождение);

ь предделение (преждевременное разделение центромер, вследствие чего происходит сегрегация унивалентов к одному полюсу. Н-р, преждевременное разделение сестринских хроматид в первом делении мейоза оогенеза. Хромосомный набор во втором полярном тельце и ооците в этом случае будет определяться случайной комбинацией одиночных сестринских хроматид. Данный механизм наблюдается при синдроме Робертса и в отдельных 47,ХХХ лимфоцитах периферической крови у женщин с привычным невынашиванием.);

ь запаздывание хромосом (это полное отсутствие или замедленное относительно остальных хромосом движение хромосомы (или хроматиды) в анафазе, обусловленное, как правило, нарушением ее ориентации. Ведущую роль в этом механизме играют нарушения микротрубочек вретена деления, формирования и функций кинетохора);

ь первичное и вторичное нерасхождение хромосом

Первичное нерасхождение хромосом - аномальная сегрегация хромосом в случае вступления в мейоз нормальной диплоидной клетки. Подразделяется на три типа:

- простое, результатом которого являются гаметы с нуллисомией или дисомией;

- двойное, к которому относят сочетание двух простых нерасхождений, одно из которых произошло в оогенезе, другое - в сперматогенезе;

- последовательное нерасхождение, приводящее к возникновению полисомий, является результатом двух событий нерасхождения одной и той же пары хромосом - сначала в первом, а затем и во втором делениях мейоза.

При изучении роли рекомбинации в нерасхождении хромосом, было установлено, что нерасхождение хромосом в первом делении мейоза характеризуется подавлением рекомбинации и преимущественной локализаций хиазм в дистальных участках. При нерасхождении во втором делении мейоза большая часть рекомбинаций регистрируется в проксимальных районах. Увеличение числа теломерных хиазм с большей вероятностью приведет к нерасхождению в первом делении, а прицентромерных - во втором делении мейоза.

Глава 6. Хромосомный мозаицизм

Генетическими мозаиками называют особей - продуктов одной зиготы, в организме которых сосуществуют две или более популяции клеток с различным генотипом.

Рис. 10. Проспективная судьба клеток в течение пяти делений дробления.

Рис. 11. Модель возникновения ограниченного плацентарного мозаицизма при нерасхождении хромосом во втором делении дробления.



Рис. 12. Модель возникновения ограниченного плацентарного мозаицизма при нерасхождении хромосом в третьем делении дробления

Рис. 13. Возникновение ограниченного плацентарного мозаицизма при дроблении нормальной эуплоидной зиготы.

Хромосомный мозаицизм возникает на доимплантационных стадиях развития вследствие нерасхождения хромосом при дроблении бластомеров. Подразделяют на:

митотический мозаицизм - возникает вследствие нерасхождения хромосом при дроблении нормальной диплоидной зиготы и сопровождается образованием клона трисомных клеток (все моносомные клетки, за исключением 45,Х нежизнеспособный быстро элиминируются) с удвоенной материнской или отцовской хромосомой;

мейотический мозаицизм - возникает вследствие утраты лишней хромосомы из трисомной зиготы, возникшей вследствие ошибочной сегрегации хромосом в мейозе. При этом формируется диплоидный клон клеток и сохраняется клон клеток с трисомией.

Рис. 14. Возникновение ограниченного плацентарного мозаицизма и однородительской дисомии при дроблении анэуплоидной зиготы в случае нерасхождения хромосом в первом (а) или во втором (б) делениях мейоза.

Нерасхождение хромосом чаще происходит в хорионе и плаценте. В этих органах формируются и длительное время сохраняются клоны с трисомией, при этом клетки самого эмбриона имеют нормальный диплоидный кариотип. Данное явление называется ограниченный плацентой мозаицизм и относительно часто встречается при кариотипировании зародышей с целью пренатальной диагностики. Локализация анеуплоидного клона в эмбрионе и его размеры зависят от того, на какой стадии развития произошло нерасхождение хромосом, какова жизнеспособность и пролиферативные потенции клона клеток с аномальным кариотипом.

Проектное задание

1. Нарисуйте схему происхождения следующих мозаичных организмов:

А) 46,ХХ/45,ХО

Б) 46,ХХ/48,ХХYY

В) 45,ХО/47,ХХХ

Г) 46,ХХ/46,ХY

2. А) В процессе гаметогенеза у женщины происходит элиминация одной фигуры деления. Определите количество хромосом, возможное в яйцеклетке, если элиминация происходит в метафазу - I и метафазу - II мейоза.

Б) Во время митоза (в анафазе) у человека не разошлась: одна пар хромосом, две пары хромосом. Сколько хромосом будет в дочерних клетках?

В) В культуре ткани человека произошла элиминация одной хромосомы. Сколько хромосом будет в дочерних клетках, если элиминация происходит в разные фазы митоза?

3. Проведите сравнительный анализ кариотипа человека и обезьяны.

Тесты рубежного контроля

1. Диплоидный набор хромосом человека содержит:

А) 23 хромосомы

Б) 46 хромосом

В) 69 хромосом

Г) 96 хромосом

2. К аутосомам относятся:

А) хромосомы группы А

Б) хромосомы группы С

В) хромосомы Х и Y

Г) хромосомы с 1 по 22

3. Какие мутации относятся к геномным?

А) инверсии

В) транслокации

В) триплоидии, анеуплоидии

Г) внутрихромосомные перестройки

4. Структурные хромосомные перестройки связаны с:

А) изменением числа хромосом

Б) потерей фрагмента хромосомы

В) изменением структуры хромосомы

Г) увеличением количества генетического материала

5. Анеуплоидия - это:

А) увеличение хромосомного набора на целый гаплоидный набор

Б) изменение числа хромосом в результате добавления одной или нескольких хромосом

В) изменение числа хромосом в результате утери одной или нескольких хромосом

Г) изменение числа хромосом в результате утери или добавления одной или нескольких хромосом

6. Одним из основных механизмов анеуплоидии является:

А) блокирование веретена деления

Б) эндомитоз

В) диандрия, дигиния

Г) запаздывание хромосом, предделение

7. Хромосомный мозаицизм возникает:

А) вследствие нерасхождения хромосом в сперматогенезе

Б) вследствие нерасхождения хромосом в оогенезе

В) вследствие нерасхождения хромосом в митозе

...