Пренатальная цитогенетика

На результаты анализов оказывают влияние различные факторы -- многоплодная беременность, особенности женского организма, акушерские проблемы и пр. Следствием этого нередко могут быть ложноотрицательные либо ложноположительные результаты исследования. Во всех подозрительных случаях назначается уточняющее обследование УЗ-сканирование, амниоцентез, плацентоцентез или кордоцентез.

Ультразвуковой (УЗ) скрининг плода, оболочек и плаценты

Стандартный акушерский УЗ-скрининг пороков развития у плода проводят в два этапа: на сроках 11-13 недель беременности и 22-25 недель беременности.

Показан всем беременным женщинам.

Плод и плацента

1 способ. На поверхность живота женщины устанавливается датчик (трансдюсер), испускающий звуковые волны высокой частоты. Отражаясь от тканей плода, эти волны снова улавливаются датчиком. Компьютерная обработка волн формирует сонограмму -- изображение на экране монитора, которое и оценивается специалистом.

2 способ (чаще используется на ранних сроках). Трансдюсер особой конструкции, защищенный латексным презервативом, вводится во влагалище женщины.

Диагностика десятков разновидностей врожденных пороков развития у плода (пороки головного и спинного мозга, сердца, почек, печени, кишечника, конечностей, лицевых структур и др.). Раннее (до 12 недели беременности) выявление специфических признаков синдрома Дауна у плода. Кроме того -- уточнение: характера беременности (маточная/ внематочная); количества плодов в матке; возраста плода (срока беременности); наличия отставания в развитии плода; положения плода в матке (головное или тазовое предлежание); характера сердцебиения плода; пола плода; расположения и состояния плаценты; состояния околоплодных вод; нарушений кровотока в сосудах плаценты; тонуса маточной мускулатуры (диагностика угрозы прерывания беременности).

Потенциальное вредное воздействие УЗ-сканирования на организм плода гораздо меньше вредного воздействия рентгеновского излучения (группа экспертов ВОЗ официально признала безопасным четырехкратное УЗИ плода во время беременности).

Технические ограничения и относительная субъективность интерпретации результатов сканирования. Диагностическая ценность УЗ-скрининга может существенно снижаться при слабых технических возможностях аппарата и низкой квалификации специалиста.

Сортинг фетальных клеток

Между 8-й и 20-й неделями беременности.

Аналогичны таковым для биопсии хориона, плацентоцентеза и кордоцентеза.

Эритробласты или лимфоциты плода, содержащиеся в венозной крови беременной женщины.

Для сортинга (отделения плодных клеток, содержащихся в крови женщины, от ее собственных клеток) используют высокоспецифичные моноклональные антитела и проточный лазерный сортинг. Полученные клетки плода подвергают молекулярногенетическим исследованиям.

Практически аналогичны возможностям биопсии хориона, плацентоцентеза и кордоцентеза

Пренебрежимо низкий риск осложнений для плода, обусловленный малой инвазивностью процедуры в сочетании с диагностическими возможностями, идентичными таковым при высоко инвазивных манипуляциях (биопсия хориона и др.)

Большая трудо-и техноемкость метода, приводящая к высокой себестоимости исследования. Недостаточная проверенность в плане надежности -- данная методика в настоящее время преимущественно носит статус экспериментальной и в рутинной практике используется крайне редко.

Глава 12. Медико-генетическое консультирование

Медико-генетическое консультирование (МГК) - это специализированная помощь населению по предупреждению появления в семье больных с наследственной патологией. Согласно современным представлениям МГК - это коммуникативный процесс, в результате которого активно заинтересованные пациенты (либо их родственники) с наследственными заболеваниями получают сведения о характере данного заболевания, а также способах его предупреждения и лечения.

Этот вид медицинской помощи населению -- наиболее успешный путь профилактики наследственной патологии, предотвращения рождения потомства с наследственными болезнями или дефектами.

Основные задачи МГК:

- Установление точного диагноза наследственного заболевания.

- Определение типа наследования заболевания в данной семье.

- Составление прогноза рождения ребенка с наследственной болезнью.

- Расчет риска повторения болезни в семье.

- Определение наиболее эффективного способа профилактики.

- Помощь семье в принятии правильного решения.

- Пропаганда медико-генетических знаний среди врачей, населения.

Условно процесс МГК можно разделить на несколько этапов:

1. Верификация клинического диагноза наследственного (или предположительно наследственного) заболевания: на данном этапе крайне важна роль клинициста, в том числе, врача-педиатра, и особенно в случаях, когда, в силу обстоятельств, недоступен осмотр генетика.

2. Установление характера наследования заболевания в консультируемой семье: проводится в рамках клинико-генеалогического метода. О типе наследования нельзя однозначно судить при малочисленности семьи, что актуально в наше время.

3. Оценка генетического риска повторения заболевания (генетический прогноз): принципиально выделяют два способа оценки генетического риска - теоретический (для моногенных заболеваний) и эмпирический (мультифакториальные и хромосомные болезни).

4. Определение наиболее эффективных способов профилактики: зависит от конкретной ситуации. Необходимо учитывать возраст консультируемых, состав семьи (наличие либо отсутствие здоровых детей), тяжесть заболевания, возможность пренатальной диагностики, религиозные установки семьи и т.д.

5. Объяснение обратившимся смысла собранной и проанализированной медико-генетической информации: проводится в максимально доступной и не директивной форме; критерием эффективности МГК на данном этапе является понимаемость со стороны консультируемого той информации, которую дает врач-генетик.

Медико-генетическое консультирование в пренатальной диагностике имеет свои характерные особенности, отличающие его от традиционной работы врача-генетика. Прежде всего, основная цель врача-генетика - разработать алгоритм профилактики наследственной и врожденной патологии. В случае необходимости аргументировано принять решение о целесообразности направления беременной на инвазивную диагностику для исключения хромосомной или генной патологии у плода, и после проведения процедуры дать грамотные рекомендации, основанные на глубоких знаниях медицинской генетики, репродукции человека, эмбриологии, тератологии, педиатрии и акушерства.

Медико-генетическое консультирование должны пройти все семьи, планирующие иметь ребенка, и все женщины, направляемые на пренатальную диагностику.

Показания для медико-генетического консультирования:

ь установленная или подозреваемая наследственная болезнь в семье - рождение ребенка с врожденным пороком развития; задержка физического развития или умственная отсталость у ребенка; аномалии полового развития;

ь повторные спонтанные аборты, выкидыши, мертворождения; выявление патологии в ходе просеивающих программ;

ь кровнородственные браки;

ь воздействие известных или возможных тератогенов (мутагенов) до или в первые 3 месяца беременности;

ь значимые отклонения результатов биохимического скрининга маркерных сывороточных белков;

ь выявление у плода УЗ-маркеров хромосомных болезней и ВПР;

ь неблагополучное протекание беременности.

Основная задача врача-генетика в пренатальной диагностике - оценить степень риска врожденной (наследственной) патологии и определить целесообразность инвазивного вмешательства для проведения соответствующих лабораторных исследований в каждом конкретном случае. Для решения данной задачи используют следующие методы медицинской генетики: клинико-генеалогический, цитогенетические, молекулярные, иммунологические и др. Учитывая то обстоятельство, что инвазивная пренатальная диагностика проводится только в определенные сроки беременности, необходимо по возможности проведение проспективного медико-генетического консультирования (до беременности или на самых ранних ее сроках), с целью своевременного принятия решения о проведении процедуры.

Желательно до беременности провести исследование кариотипов супругов на предмет наличия сбалансированных хромосомных перестроек, уточнить молекулярную природу мутаций в семьях высокого риска моногенных болезней, провести ДНК-анализ на наличие основных мутаций, сопряженных с наиболее частыми генными болезнями (муковисцидоз, фенилкетонурия, спинальная амиотрофия Верднига-Гоффама и др.).

Необходимо информировать супругов о мерах преконцепционной (до зачатия) профилактики врожденной и наследственной патологии. А также предоставить информацию о лекарственных препаратах и потенциально опасных для плода промышленных вредностях, действующих до и во время беременности. На схеме представлен список известных тератогенов:

Показаниями для направления на инвазивную пренатальную диагностику являются:

v Возраст женщины 35 лет и старше;

v Наличие в семье ребенка или выявление при предыдущей беременности плода с болезнью Дауна, с другими хромосомными болезнями, с множественными врожденными пороками развития;

v Семейное носительство хромосомных перестроек или генных мутаций;

v Наличие в семье моногенных заболеваний: муковисцидоза, фенилкетонурии, миопатии Дюшенна, миотонической дистрофии, хореи Гентингтона, болезни Вильсона-Коновалова, Виллебранда, Кеннели, адреногенитального синдрома, спинальной амиотрофии Верднига-Гоффмана, атаксии Фридрейха, телеангиоэктазии Луи-Барр, агаммаглобулинемии швейцарского типа, миопатии Шарко-Мари-Тус и др.;

v Ультразвуковые маркеры хромосомных болезней у плода;

v Высокий риск болезни Дауна по результатам биохимического скрининга маркерных сывороточных белков во II триместре беременности.

Глава 13. Принципы и методы диагностики хромосомных болезней

В настоящее время разработаны надежные и эффективные методы хромосомного анализа клеток плода и зародышевых оболочек.

В зависимости от срока беременности и задач исследования материалом для хромосомного анализа могут служить клетки амниотической жидкости, хориона, плаценты и лимфоциты пуповинной крови плода, полученные тем или иным инвазивным методом.

Инвазивный (оперативный) методы - это внутриматочные вмешательства под ультразвуковым контролем, выполняемые с целью получения плодного материала, для последующих гистологических, биохимических, цитогенетических или молекулярных анализов (рис. 20).

Доимплантационный период (стадия дробления)

Методы ЭКО:

§ Преконцепционная диагностика (полярные тельца)

§ Доимплантационная диагностика (бластомеры или трофобласт)

I триместр беременности

(период органогенеза)

Хорионбиопсия:

§ Трансцервикальный способ (7-12-я недели)

§ Трансабдоминальный способ (с 9/10-й недели)

II триместр беременности

(плодный период)

Плацентобиопсия:

§ Цитогенетическая диагностика - до 22-й недели

§ Молекулярная диагностика - до 26-й недели

Амниоцентез (с 13/14-й недели)

Кордоцентез (с 19/20-й недели)

Характеристика методов получения препаратов хромосом для стандартного кариотипирования плода, их преимущества и недостатки представлены в таблице 5.

Таблица 5

Методы получения препаратов хромосом для стандартного кариотипирования плода

Метод	Преимущества	Недостатки	Результативность
Культивирование клеток амниотической жидкости клеток хориона или плаценты	Высокое качество хромосомных препаратов: - достаточное количество метафазных пластинок - возможность дифференциального окрашивания хромосом различными методами	Контаминация культур материнскими клетками Длительность культивирования (1,5-3 недели) Опасность инфицирования культуры Дорогостоящие реактивы, оборудование и расходные материалы Вес образца хориона не менее 15мг	99%
Варианты «прямого» метода анализа клеток хориона или плаценты	Скорость (1-2дня) Возможность анализа образца небольшого объема Возможность анализа с 9,5 до 20 недель беременности Отсутствие контаминации материнскими клетками Экономичность	Низкий митотический индекс Недоступность некоторых методов дифференциальной окраски хромосом	96-99%
Культивирование лимфоцитов пуповинной крови	Относительная скорость (2-4дня) Высокое качество хромосомных препаратов: -достаточное количество метафазных пластинок -возможность дифференциального окрашивания хромосом различными методами	Контаминация культур материнскими клетками Исследования начиная с 18-й недели беременности	>99%

Цитогенетический анализ клеток плодного происхождения

Клетки амниотической жидкости (КАЖ) представлены несколькими типами различного происхождения:

ь Клетки амниотической оболочки (собственно амниоциты);

ь Эпителиальные клетки плода (эпидермиса, пищеварительного тракта, мочеполовых и дыхательных путей, слизистой ротовой полости).

Количественный и качественный состав КАЖ, а также концентрация жизнеспособных клеток имеют индивидуальную вариабельность и зависят от стадии развития. Оптимальными для пренатальной диагностики являются амниоциты, которые обычно пролиферируют и являются специфическими для данной культуры.

Стандартное культивирование амниоцитов с момента получения образца АЖ до кариотипирования занимает 14-21 день.

Клетки ворсин хориона имеют различное происхождение:

ь Клетки цитотрофобласта (дифференцируются на стадии морулы)

ь Клетки мезенхины (дифференцируются на стадии бластоцисты).

Для хромосомного анализа по клеткам хориона или плаценты используют два основных метода

1. Длительное культивирование

2. «Прямые» препараты.

Лимфоциты пуповинной крови плода . Для хромосомного анализа крови плода используют стандартную методику стимулирования лимфоцитов фитогемагглютинином. Этот метод дает наиболее адекватное представление о хромосомном статусе плода и рекомендуется для кариотипирования плода в случае хромосомного мозаицизма в плаценте, а также при наличии пороков развития не только во втором, но и в третьем триместре беременности.

В настоящее время известно несколько способов окрашивания хромосом, основными среди которых являются G-, Q-, R-, C- методы. При G - методе окрашивания (G-banding) каждая хромосома имеет специфическую последовательность темных и светлых полос. Данный тип окрашивания получается при воздействии на хромосомные препараты таких агентов как щелочи, протеолитические ферменты, солевые растворы и т.д. Окрашенные G-методом препараты можно анализировать под световым микроскопом. Этот метод сравнительно прост, не требует специальной оптики и широко используется в клинической практике. Получить Q - окрашивание (Q-banding) можно при использовании специальных флюоресцентных красителей, таких как акрихин, акрихин иприт и т.д. При этом, для каждой хромосомы получают специфическую последовательность ярко- и тускло-флюоресцирующих полос. Исчерченность при Q- и G- окрасках почти всегда совпадает. При Q-методе требуется специальная флюоресцентная оптика для анализа хромосомных препаратов. При R-дифференциальном окрашивании получается обратная G-banding картина, т.е. полосы, окрашенные при G-способе, не окрашиваются и наоборот. R-метод, единственное преимущество которого состоит в четко прокрашенных теломерных участках, трудно воспроизводим. C - метод (C-banding) - специфическое окрашивание околоцентромерного гетерохроматина. С помощью этого метода окрашиваются прицентромерные районы хромосом (в основном, крупные блоки гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16, часто также хромосом 13, 14, 15 и 21, 22) и дистальная часть хромосомы Y. В дополнение к основным методам существует метод высокоразрешающего окрашивания, при котором большую исчерченность обеспечивали исследования хромосом на различных стадиях клеточного цикла, т.е. в профазе или прометафазе (вышеописанные методы предполагают исследование клеток в метафазе митоза) с использованием приемов, влияющих на конденсацию хромосом. При этом, как было отмечено выше, наблюдают большее число полос на каждой хромосоме отдельно и в кариотипе в целом. Разработка генно-инженерных технологий и их применение в исследованиях генома человека вывело изучение тонкой организации хромосом на новый этап. Появление в начале 90-х годов прошлого века молекулярно-цитогенетических методов и методов ДНК-анализа открыло в изучении хромосом человека и их нарушений новое измерение - субмикроскопический уровень. Именно с их помощью проблема объективной диагностики широкого спектра хромосомной патологии была подведена к разрешению.

Проектное задание

1. На приеме у врача-генетика беременная женщина 31 года, обеспокоенная тем, что ее сестра недавно родила дочь с синдромом Дауна. Опишите рекомендации врача-генетика. Ответ аргументируйте.

2. При генетическом консультировании у женщины обнаружена одна перестройка, захватывающая хромосомы 2 и 3.

А) Как называется эта перестройка?

Б) Нарисуйте схему синапсиса этих хромосом в мейозе, отметив все выделенные фрагменты хромосом.

В) Фенотип этой женщины в норме, почему?

Г) У женщины в анамнезе два невынашивания беременности. Объяснимо ли это с точки зрения генетики?

Можно ли ей рекомендовать попытаться забеременеть еще раз?

Какова вероятность рождения у нее нормального ребенка?

3. Супружеская пара нуждается в генетическом консультировании, поскольку со стороны мужа в трех поколениях имелись мертворожденные и несколько детей умерли вскоре после рождения из-за врожденных дефектов. Оказалось, что в кариотипе мужа 46 хромосом, однако при дифференциальной окраске хромосом выяснилось, что хромосома 1 содержит протяженную инверсию(70% всей длины). Гомолог хромосомы 1 и все другие хромосомы в норме.

А) Объясните причину высокой эмбриональной смертности в родословной мужа.

Б) Какова вероятность рождения нормальных детей и детей с аномалиями у этих супругов?

В) Можно ли советовать жене вынашивать каждую беременность, чтобы определить нормальный них ребенок или нет, или же есть другие способы диагностики?

Тесты рубежного контроля

1. Пренатальная диагностика:

А) комплекс мероприятий, направленных на предупреждение развития заболевания у ребенка

Б) мероприятия по предотвращению беременности при высоком риске рождения больного ребенка

В) диагностика болезни у эмбриона или плода

Г) оценка риска развития заболевания у будущего ребенка

2. Показаниями для пренатального цитогенетического исследования являются:

А) возраст матери 39 лет

Б) в анамнезе рождение ребенка с синдромом Дауна

В) наличие у троюродного брата расщелины губы и неба

Г) робертсоновская транслокация у отца

3. Укажите неинвазивные методы пренатальной диагностики:

А) фетоскопия

Б) УЗИ

В) хорионбиопсия

Г) анализ ХГЧ в сыворотке беременной

4. Укажите инвазивные методы пренатальной диагностики:

А) кордоцентез

Б) УЗИ

В) анализ АФП и ХГЧ в сыворотке беременной

Г) биопсия ворсин хориона

5. Укажите оптимальные сроки проведения биопсии хориона:

А) 10-12 недель

Б) 4-6 недели

В) 7-9 недель

Г) 22-25 недели

6. Укажите оптимальные сроки проведения кордоцентеза:

А) 10-12 недель

Б) 5-8 недели

В) 7-9 недель

Г) 20-22 недели

7. Кордоцентез проводят при повышенном риске по:

А) хромосомным синдромам, обусловленным структурными мутациями

Б) наследственным болезням крови

В) порокам развития

Г) хромосомным синдромам, обусловленным числовыми мутациями

8. По результатам УЗИ (множественные аномалии) женщине 27 лет был проведен амниоцентез на 16 неделе беременности. При цитогенетическом исследовании у плода выявили трисомию 21. Какова должна быть тактика врача-генетика?

А) рекомендовать прерывание беременности

Б) предоставить семье полную информацию о вероятном состоянии здоровья ребенка, возможностях его лечения и социальной адаптации

В) рекомендовать повторную беременность

Г) предоставить право окончательного решения о пролонгировании или прерывании беременности родителям

9. Объектом исследования при проведении кордоцентеза являются:

А) ворсины хориона

Б) пуповинная кровь плода

В) клетки плаценты

Г) венозная кровь матери

10. Ошибки при определении кариотипа плода могут быть связаны:

А) с клональным характером роста клеток амниотической жидкости

Б) с мозаицизмом клеток плода

В) с физиологической полиплоидией культивируемых клеток

Г) с загрязнением образцов вод клетками материнского происхождения

Д) со всеми перечисленными причинами

Список литературы

1. Бочков Н.П. Клиническая генетика. Учебник. М. :ГЭОТАР-МЕД. 2001.- 448с.

2. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Чернышов В.Н. Хромосомные синдромы и аномалии. Классификация и номенклатура. Ростов-на-Дону: Изд. РГМУ, 1999. -192 с.

3. Захарова А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека (Атлас) АМН СССР. -М.: Медицина, 1982. -264с.

4. Клаг У., Каммингс М. Основы генетики. М.: Техносфера, 2007. -896с.

5. Козлова С.И., Демикова Н.С. Наследственные сидромы и медико-генетическое консультирование. - М.: Товарищество научных изданий КМК: Авторская акдемияю-2007.-448с.

6. Лазюк Г.И. Тератология человека. М. Медицина.-1991 - 448с.

7. Приходченко Н.Н., Шкурат Т.П. Основы генетики человека. Ростов-на-Дону: Феникс, 1997. - 368с.

8. Фогель Ф. Мотульски А. Генетика человека. М.: Мир. 1989. Т.1, 2, 3.

www.geneticlinics.org - обзоры по наследственным заболеваниям

www. rusmedserv.com переведенные обзоры из Geneticlinics.org

www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM -каталог наследственных болезней

Размещено на Allbest.ru

...