Многоцветный анализ в проточной цитометрии для медико-биологических исследований
Разработка критериев применения многоцветных параметров для иммунофенотипирования клеток на основе стандартизации протоколов исследований в проточной цитометрии. Изучение фенотипа лимфоцитов для лабораторной диагностики нарушений иммунного статуса.
Рубрика | Медицина |
Вид | автореферат |
Язык | русский |
Дата добавления | 26.12.2017 |
Размер файла | 487,3 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Многоцветный анализ в проточной цитометрии для медико-биологических исследований
14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика,
14.00.36 - аллергология и иммунология
Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени
доктора биологических наук
ХАЙДУКОВ Сергей Валерьевич
Санкт-Петербург - 2008
Научные консультанты: академик РАН, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор ЧЕРЕШНЕВ Валерий Александрович
доктор медицинских наук, профессор ЗУРОЧКА Александр Владимирович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ТОТОЛЯН Арег Артемович
доктор биологических наук, профессор ПОЛЕВЩИКОВ Александр Витальевич
доктор биологических наук, профессор ЗЫБИНА Наталья Николаевна
Ведущая организация: ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Защита состоится «25» декабря 2008 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2).
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России
Диссертация в виде научного доклада разослана « » 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
д.м.н. профессор С.С. Алексанин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. За последние годы проточная цитометрия становится одним из наиболее востребованных методов, как для фундаментальных исследований, так и для диагностики в клинико-иммунологической практике. Расширилась приборная база, и значительно увеличились возможности анализа клеток иммунной системы, позволяющие охарактеризовать не только качественные и количественные параметры основных популяций клеток, но и их более широкий субпопуляционный состав. Используя различные методологические подходы и новую реагентную базу, при помощи проточной цитометрии стало возможным оценивать функциональные свойства популяций и субпопуляций клеток иммунной системы. Значительно расширились возможности для диагностики иммунодисфункций, аллергии, специфических Т-эффекторов и многое другое (Mandy F.F. et al, 2003; Boumiza R. et al., 2005; He X.H. et al., 2006).
Логика развития современной технической, методологической и идеологической базы проточной цитометрии формируется на основе очень широких возможностей современных приборов. Оснащенные гибким программным обеспечением, они способны одновременно анализировать колоссальное количество клеток, идентифицировать отдельные их группы, классы, популяции, субклассы, субпопуляции и т.д., измерять их поверхностные и внутриклеточные маркеры, оценивать их функциональное состояние (Shapiro H.M. 2003).
Развитие современных клеточных технологий и разнообразие новых методологических подходов к исследованиям, связанным с использованием проточной цитометрии в биологии и медицине, поставило целый ряд вопросов о стандартизации данного метода. Эти вопросы особенно важны как для врачей лабораторной диагностики, так и для ученых и специалистов (Луговская С.А. и др., 2005; Gallego A. et al., 2003; Luider J. et al., 2004).
Столь высоко информативный инструмент анализа создает предпосылки для появления множества новых методологических подходов для диагностики различных клеточных дисфункций. Например, уже сейчас 4-5 параметрический анализ позволяет выявить не только ту или иную субпопуляцию клеток, но и ее функциональную активацию или депрессию. В то же время, если увеличить анализ до 9-15 параметровой системы оценки рецепторов клеток, появляется возможность значительно более углубленного анализа, который оправдан для научных исследований, но с точки зрения практической медицины такой подход навряд ли применим, поскольку связан со значительными методологическими трудностями. Именно поэтому возникла необходимость остановиться на тех методологических подходах, которые позволяют по-новому взглянуть на динамическую систему взаимодействия клеток иммунной системы во всем ее разнообразии с четкой характеристикой субпопуляций клеток.
Цель работы. Обосновать методологию, критерии и направления применения многоцветного цитометрического анализа субпопуляций лимфоцитов в медико-биологических исследованиях и оценить их эффективность. цитометрия иммунный лимфоцит
Задачи исследований:
1. Разработать критерии применения многоцветных параметров для иммунофенотипирования клеток на основе стандартизации протоколов исследований в проточной цитометрии.
2. Экспериментально обосновать возможные пути применения и расширения спектра исследований с использованием многоцветного анализа в проточной цитометрии.
3. Обосновать и оценить эффективность применения многоцветного анализа при изучении фенотипа лимфоцитов для лабораторной диагностики нарушений иммунного статуса человека.
4. На основе применения цитометрического анализа разработать алгоритм использования панели для скрининговых исследований и расширенной панели для более углубленного анализа при выявлении отдельных субпопуляций лимфоцитов, параметры которых не попадают в референтные значения.
5. Обосновать методологию использования многоцветного анализа для проведения углубленных научных исследований активности субпопуляций лимфоцитов.
Научная новизна исследований.
Впервые предложен алгоритм оптимизации работы на проточных цитометрах от пре-аналитического, аналитического до пост-аналитического этапов исследований, позволивший разработать критерии стандартизации методов исследований. На их основе разработаны критерии включения тех или иных параметров исследований клеток для практического использования.
Экспериментально обоснованы современные подходы к расширению спектра исследований с учетом использования многоцветного анализа в клинической и научно-исследовательской практике.
Обоснована возможность оценки функциональной активности клеток иммунной системы в процессе их дифференцировки при воздействии различных химических соединений (например, к действию кальциевых ионофоров).
Предложена и внедрена многопараметрическая панель моноклональных антител к различным кластерам дифференцировки, которая охватывает большинство лимфоцитов периферической крови и включает степень активации различных субпопуляций Т-клеток, В-клеток и NK-клеток, что позволяет более точно диагностировать наиболее часто встречающиеся нарушения иммунной системы. Данная панель включает:
IgG/IgG/IgG/CD45 - изотипический контроль
CD19/CD5/CD27/CD45 - В1, В2, В-клетки памяти
CD16/CD56/CD3/CD45 - субпопуляции NK-клеток
CD8/CD4/CD3/CD45 - субпопуляции Т-клеток
CD8/CD38/CD3/CD45 - активированные Т-цитотоксические и NK-клетки
CD4/CD25/HLA-DR/CD45 - активированные Т хелперы
CD45RA/CD45R0/CD4/CD45 - активированные Т хелперы и Т-клетки памяти
TCR-бв/TCR-гд/CD3/CD45 - бв- и гд-Т-клетки
CD4/CD25/CD127/CD45 - регуляторные Т-клетки.
Предложенные подходы позволили повысить качество диагностики нарушений иммунного статуса и значительно расширили возможности исследования клеток иммунной системы в норме и патологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Разработанный алгоритм оптимизации настройки приборов и создания протоколов для многопараметрического анализа применим при работе на большинстве проточных цитометров ведущих фирм производителей, и может быть использован для стандартизации исследований и разработки критериев включения новых параметров исследования клеток иммунной системы.
2) Среднестатистические значения параметров иммунного статуса условно здоровых лиц в различных регионах России сопоставимы со среднестатистическими значениями параметров иммунного статуса человека, опубликованными в литературе.
3) Введение в первичную панель скринигового исследования иммунной системы антител для выявления аутореактивных клонов В-клеток (CD19,CD5) улучшает диагностику и мониторинг за пациентами с аутоиммунными заболеваниями.
4) При наличии отдельных субпопуляций лимфоцитов, параметры которых не попадают в референтные значения в ходе скрининговых исследований иммунной системы человека, необходимо проведение дополнительных исследований с оценкой некоторых минорных субпопуляций лимфоцитов и анализа функциональных характеристик клеток.
5) В клинико-диагностической практике наиболее предпочтителен четырехцветный цитометрический анализ по сравнению с двух- и трехцветным, что дает возможность получать достоверные данные, характеризующие как субпопуляционный состав, так и ряд функциональных параметров иммунокомпетентных клеток при уменьшении количества образцов и времени, затраченного на получение конечного результата.
6) Изменение репертуара поверхностных рецепторов CD4+ Т-лимфоцитов в процессе активации и дифференцировки сопровождается резистентностью их к действию кальциевых ионофоров.
Практическая значимость работы. Разработанные подходы к стандартизации исследований в проточной цитометрии, алгоритмы оптимизации исследований отдельных субпопуляций и комплексной оценки клеток иммунной системы, предложенные в работе, позволяют применять полученные данные в повседневной практике клинико-диагностических и научно-исследовательских лабораторий, оснащенных современными приборами.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс обучения врачей на курсе клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО Челябинской государственной медицинской академии Росздрава, Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. академика И.П.Павлова; в работу научно-исследовательских лабораторий Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва), ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова (г. Москва), Всероссийском Центре Экстренной и Радиационной Медицины им. А.Н.Никифорова, МЧС России (г. Санкт-Петербург), ММА им. И.М. Сеченова (г. Москва), Пятигорском ГНИИ курортологии, и ряде других.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы апробированы как на отечественных, так и на международных симпозиумах и конференциях: Первый Всесоюзный иммунологический съезд (Сочи, 1989); 11th Meeting of European Federation of Immunological societies. (Espoo, Finland. 1991); 8th International Congress of Immunology, (Budapest, Hungary, 1992); 5th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Tissue Antigens (Boston, USA, 1993); 6th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Tissue Antigens, (Kobe, Japan, 1996); Fourth International Symposium on Clinical Immunology (Amsterdam, Holland 1997); 10 International Congress of Immunology (New Delhi, India, 1998); John HUMPHRY Advanced Summer Program in Immunology (Pushchino, 1998, 2000, 2002, 2004); The 8th Annual Meeting of Tissue Engineering Society International, (Shanghai International Conventional, P.R. China, 2005); “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге” (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2007); 2-я конференция “Иммунология репродукции” (Сочи, 2007); Симпозиум “Иммунология слизистых оболочек и аллергология: теория и практика” (Анталия, Турция, 2007); XX Зимняя международная молодежная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2008).
Личный вклад автора в работу. Диссертационная работа является результатом многолетних (1986-2008 гг.) исследований по изучению механизма функционирования иммунной системы человека и животных при помощи метода проточной цитометрии и различных флуоресцентных зондов. Все результаты получены лично автором или при его непосредственном участии. Доля личного участия в совместных публикациях пропорциональна числу соавторов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 89 работ, в том числе 3 монографии, 82 работы опубликованы в рецензируемых журналах по перечню ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.
Материалы и методы исследования.
Пациенты. При скрининговом исследовании использовали для анализа периферическую кровь 356 условно здоровых лиц.
Для исследования гомеостаза ионов кальция у CD4+ Т-лимфоцитов в процессе их активации и дифференцировки in vivo использовали кровь лиц, показатели иммунного статуса которых соответствовали нормам для здоровых людей. Было обследовано 112 человек.
Для оценки активности и количества, различных субпопуляций клеток иммунной системы было обследовано 214 человек с заболеваниями, в основе которых лежат иммунные механизмы (аутоиммунный тиреоидит, ревматоидный артрит и др.).
Выделение клеточных популяций и реагенты для исследования. Фракцию мононуклеаров выделяли из венозной крови доноров центрифугированием на Ficoll-Paque. Клетки инкубировали с иономицином при 37° в течение 10 мин в среде Хенкса с 1% ФСК. После инкубации с иономицином клетки промывали ФСБ с 5% ФСК для удаления Са2+-ионофора. Чувствительные и резистентные к иономицину Т-клетки разделяли на Ficoll-Paque (d = 1,077 г/см3). Чувствительные к иономицину клетки не сохраняли жизнеспособность после обработки ионофором. Фракцию иономицин-резистентных (ИР-фракция) клеток собирали с поверхности Ficoll-Paque, окрашивали МА.
В работе использовали среду Хенкса, брефелдин А, ФСК, ФСБ, ДМСО, ФМА, ConA, ФГА и культуральный пластик фирмы ICN (США), иономицин и гепарин (Calbiochem, Швейцария), Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция). Все используемые в работе моноклональные антитела (МА) получены от фирмы Beckman Coulter (США).
Проточная цитофлуориметрия. Для разработки алгоритма настройки цитометров, создания протоколов и последующего анализа были использованы контрольный материал ImmunoTrol, ImmunoTrol Low (Beckman-Coulter, США) и цельная периферическая кровь, полученная от условно здоровых лиц. Для окрашивания клеток использовали следующую панель МА меченых FITC (изотиоцианат флуоресцеина), PE (фикоэритрин), PC5 (комплекс PE с цианином-5), ECD (комплекс PE с техасским красным) или PC5 (комплекс PE с цианином-7): CD4, CD5, CD8, CD14, CD19, CD25, CD26, CD27, CD29, CD38, CD45, CD45RA, CD45R0, CD62L, CD69, CD95 CD127, CD234, CD294, гд-TCR, бв-TCR, Vв1-TCR, Vв2-TCR, Vв14-TCR и HLA-DR (Beckman Coulter, США). Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили по безотмывочной технологии с использованием следующих лизирующих растворов: OptiLyse C, OptiLyse B, ImmunoPrep и Whole Blood Lysing Reagents (Beckman Coulter, США).
Для анализа окрашенных клеток и настройки были использованы следующие проточные цитометры: EPICS XL, EPICS XL-MCL, EPICS “Elite”, EPICS “Altra”, Cytomics FC500, Cytomics FC500 MPL (Beckman Coulter, США), FACSCalibur (Becton-Dickinson, США) и PAS-III (Partec GmbH, Германия).
Для корректного исключения из зоны анализа всех частиц, которые не соответствовали по размерам и гранулярности живым лимфоцитам, вводили необходимые логические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому, боковому светорассеянию и CD45. Математическую обработку цитометрических данных проводили при помощи программ EXPO-32 и CXP v. 2.2 (Beckman Coulter, США). В каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Абсолютные значения получены как в одноплатформенной (с помощью реагента Flow Count (Beckman Coulter, США)), так и в двухплатформенной (с использованием результатов гематологического анализа) системах.
Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием стандартного пакета прикладных программ «Statistic for Windows 6.0». Полученные данные обрабатывали дискриптивными методами и представляли в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (M±m).
Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине.
Проточная цитометрия как современная технология быстрого измерения характеристик клеток появилась в результате естественного развития традиционных гистохимических и цитохимических методов анализа. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.д.
Две существенные особенности проточной цитометрии делают этот метод особенно ценным для клинической практики:
- во-первых, этот метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу. Анализы такого рода служат для выявления отклонений, происходящих в процессе онкогенеза. Большинство современных применений цитометрии связано в первую очередь с анализами по фенотипу;
- во-вторых, это способность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е. встречающиеся с частотой 10-5-10-7, что возможно благодаря огромной производительности. Так, современные цитометры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 100000 клеток в секунду.
Информация, извлекаемая из сигналов светорассеяния и измерения времени пролета клеток через зону анализа, позволила исследователям судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток). В свою очередь, это привело к возможности типировать клетки без применения флуоресцентных красителей, что особенно ценно при работе с периферической кровью. Данный подход позволяет разделить и расположить в виде гистограммы лейкоциты периферической крови на три группы клеток - лимфоциты, моноциты и гранулоциты (Bossuyt X. et al., 1997).
Развитие гибридомной технологии привело к тому, что у исследователей появился в руках такой инструмент, как моноклональные антитела. МА предоставили возможность типировать клетки не только благодаря их морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для определенных клеток и их функционального состояния (Leucocyte typing VI., 1997). В настоящее время известно 339 кластеров дифференцировки (Cluster of Differentiation, CD) клеток человека (Zola H., et al., 2005).
Использование МА напрямую меченых различными флуорохромами позволило значительно повысить информативность цитометрического анализа за счет многоцветности. Поскольку современные цитометры, как правило, оборудованы более чем тремя фотоэлектронными умножителями (от 3 до 12 ФЭУ), это позволяет на одном образце периферической крови анализировать практически все основные субпопуляции клеток.
Высокий уровень автоматизации, простота в эксплуатации, небольшие размеры современных приборов, их высокая точность, специфичность и воспроизводимость результатов позволяют использовать их не только как исследовательские, но и как клинико-диагностические.
Перечисленные возможности метода проточной цитометрии определяют клинические и общебиологические области его применения. К первой относятся - иммунология, онкология, онкогематология (включая диагностику, оценку эффективности лечения и мониторинг пациентов, входящих в группу риска), трансплантология, общая гематология и др. Ко второй - клеточная кинетика, клеточная энзимология, клеточная физиология, генетика и др.
Процесс развития иммунного ответа организма на проникновение инфекции или какие-либо другие воздействия сопровождается значительными изменениями субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток. Это относится как к изменению абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, их субпопуляционного состава, так и к появлению на клеточной поверхности определенных функциональных молекул. Под воздействием различных агентов клетки приспосабливаются и отвечают на это изменением экспрессии тех или иных мембранных и внутриклеточных маркеров. Таким образом, одним из эффективных механизмов иммунорегуляции является модуляция экспрессии функционально значимых молекул. В свою очередь, не менее важным является и изменение абсолютных количеств иммунокомпетентных клеток в периферической крови.
Таблица 1. Среднестатистическое содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови взрослых условно здоровых лиц полученное в результате скринингового исследования (N = 362).
Субпопуляции лимфоцитов |
Относительные количества |
Абсолютные количества (кл./л) |
|
Лимфоциты (CD45bright) |
32 ± 4%* |
1,363-2,808 x 109 |
|
Т-клетки (CD3+,CD19-) |
73 ± 12% |
0,946-2,079 x 109 |
|
Т хелперы(CD3+,CD4+) |
45 ± 10% |
0,576-1,336 x 109 |
|
Т хелперы активированные/памяти (CD3+, CD4+, CD45R0+, CD29+) |
15 ± 10% |
0,068-0,702 x 109 |
|
Т хелперы наивные (CD3+,CD4+,CD45RА+) |
30 ± 10% |
0,272-1,123 x 109 |
|
Т цитотоксические (CD3+,CD8+) |
27 ± 8% |
0,372-0,974 x 109 |
|
Т-клетки активированные (CD3+, HLA-DR+, CD25+, CD38+) |
3 ± 3% |
0,007-0,165 x 109 |
|
Т-NK клетки (CD3+, CD16+, CD56+) |
3 ± 3% |
0,007-0,165 x 109 |
|
В-клетки (CD3-, CD19+, CD20+, HLA-DR+) |
12 ± 5% |
0,111-0,376 x 109 |
|
NK-клетки (LGL) (CD3-, CD16+, CD56+, CD38±, CD8±) |
13 ± 5% |
0,123-0,369 x 109 |
|
Индекс соотношения CD4+/CD8+ |
1,5-2,6 |
Относительные и абсолютные количества лимфоцитов определяли от общего количества лейкоцитов. Относительные и абсолютные количества субпопуляций Т-, В-, и NK-клеток определяли от общего количества лимфоцитов.
Определение субпопуляционного состава или фенотипа лимфоцитов в настоящее время является важным диагностическим признаком, позволяющим судить о течении процессов, происходящих в организме. Под фенотипом следует понимать совокупность функционально значимых маркеров, характерных для определенных стадий дифференцировки, пролиферации, активации или программируемой клеточной гибели (апоптоза). Относительное и абсолютное количество клеток, имеющих тот или иной фенотип, как раз и является конечным результатом иммунофенотипирования.
При подтвержденной ВИЧ инфекции на «абсолютном содержании CD4+ Т-клеток в единице объема» построена система стадирования течения заболевания, что является одним из основных критериев назначения антиретровирусной терапии.
Иммунофенотипирование позволяет судить о типе клеток и их функциональном состоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров. В отличие от флуоресцентной микроскопии, метод проточной цитометрии позволяет наиболее полно и наиболее корректно оценить иммунофенотип пациентов. Иммунофенотипирование с использованием многоцветного анализа особенно важно для характеристики высоко специализированных субпопуляций лимфоцитов, таких как клетки иммунологической памяти, антиген-специфические и регуляторные T клетки и субтипы NK-клеток.
Очень важным разделом для биологии и медицины при появлении новых методик исследования является формирование нормативных показателей. Не является исключением и проточная цитометрия. Проведенные исследования условно здоровых лиц в различных регионах России с использованием скрининговой панели позволили определить среднестатистические значения параметров иммунного статуса человека. Результаты, представленные в Таблице 1, свидетельствуют о близости среднестатистических параметров иммунного статуса условно здоровых лиц к данным в отечественной и зарубежной литературе (Zidovec Lepej S., et al., 2003, Pope V., et al., 1994, Comans-Bitter W.M., et al., 1997).
Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для иммунофенотипирования. Оптимизация настройки цитометров и подготовка протоколов для анализа.
Иммунофенотипирование позволяет охарактеризовать клетки при помощи МА и дает возможность судить об их типе и функциональном состоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров. Однако следует учитывать, что многие маркеры могут одновременно экспрессироваться на различных типах клеток и определять их наличие следует в режиме не менее чем двухцветного анализа, а типирование лейкозов желательно проводить в четырех- и более цветном анализе (Nagata H., et al., 2001; Claude L., et al., 2005).
В настоящее время все большее количество клинико-диагностических лабораторий используют метод проточной цитометрии для определения иммунного статуса пациентов, диагностики лимфопролиферативных заболеваний и многих других важных параметров иммунной системы. Однако, отсутствие стандартных подходов к настройке цитометров, созданию протоколов для исследования и подготовке образцов для анализа, по-прежнему делает метод проточной цитометрии достаточно субъективным и, в значительной степени, зависимым от опыта оператора.
В процессе цитометрического анализа могут быть допущены ошибки на разных этапах. Во-первых, цитометр должен находиться в рабочем состоянии и проходить все тесты проверки его работоспособности. Во-вторых, протоколы конкретного анализа должны быть правильно настроены. Данная процедура не зависит от типа прибора, поскольку процедуры подготовки инструментов для соответствующего анализа осуществляются практически по одному и тому же алгоритму. В-третьих, на конечный результат значительное влияние оказывает использование некачественных реагентов или реагентов с истекшим сроком годности. И, наконец, в-четвертых, на результат оказывают влияние ошибки, допущенные в ходе подготовки образца для анализа.
Одним из наиболее важных этапов при проведении стандартной процедуры анализа фенотипа клеток ПКЧ является правильность настройки протоколов для конкретных типов анализа.
Данный этап состоит в следующем: настройка дискриминатора, настройка параметров светорассеяния, настройка параметров чувствительности фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) для флюоресценции, введение коэффициентов компенсации.
Рис. 1. Пример использования дискриминатора для удаления из зоны анализа частиц, не соответствующих клеткам по параметрам светорассеяния. А - анализ образца в отсутствии дискриминатора; Б - анализ образца при включенном дискриминаторе.
Оптимизация настройки дискриминатора. Современные цитометры обладают высокой чувствительностью по малоугловому светорассеянию, т.е. по размерам исследуемых частиц (чувствительность достигает 0,1 мкм), поэтому они регистрируют множество объектов, которые не являются клетками. Особенно это проявляется на образцах, приготовленных по так называемой «безотмывочной» технологии. Наличие в образце множества объектов, которые не являются лейкоцитами, приводит к тому, что цитометр «захлебывается» от обилия данных и это приводит к получению недостоверных результатов. Чтобы избежать этого эффекта, необходимо ввести ограничения по отображаемым на гистограмме событиям, т.е. задать границы чувствительности цитометра. Для этих целей служит дискриминатор. Необходимо ввести такие его значения, чтобы были видны все основные популяции клеток анализируемого образца, а частицы, которые не являются клетками (дебрис), не попадали в зону анализа. Как правило, это ограничение ставится на канал малоуглового рассеяния света (Рис. 1). Следует отметить, что слишком завышенные значения дискриминатора могут убрать из анализа часть интересующей исследователя популяции клеток, поэтому к этому этапу настройки цитометра необходимо подходить со всей ответственностью.
Рис. 2. Распределение клеток периферической крови при оптимальной настройке каналов светорассеяния. FS - малоугловое светорассеяние; SS - светорассеяние под углом 90о.
Оптимизация настройки параметров светорассеяния. Как правило, современные цитометры используют два канала светорассеяния: регистрируется сигналы от малоуглового светорассеяния и рассеяния света под углом 90о. Малоугловое светорассеяние (Forward Scatter, FS) представляет собой рассеяние света от поверхности клеток под малыми углами (1-19о) и пропорционально диаметру исследуемого объекта. В свою очередь, канал бокового светорассеяния или рассеяния света под углом 90о (Side Scatter, SS) регистрирует весь свет, рассеянный как самой клеткой, так и ее органеллами, т.е. характеризует структуру и гранулярность объекта. Таким образом, два вида светорассеяния позволяют регистрировать два морфологических параметра клеток.
Использование двух этих параметров позволяет в гетерогенной популяции клеток локализовать все входящие в нее компоненты. Данная процедура производится за счет использования «гейтирования». GATE (ворота) - логически ограниченная область клеток с определенными характеристиками на гистограмме их распределения, позволяющая анализировать события, заключенные исключительно в данную область. Гейтирование (от gating) - введение данных логических ограничений из одной гистограммы в другие. Данная функция позволяет отображать и анализировать события, попадающие исключительно в интересующую нас область.
Примером могут служить лейкоциты периферической крови, состоящие из лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов (Рис. 2). При анализе периферической крови необходимо соблюдать правило: все основные популяции клеток должны быть отображены на гистограмме распределения клеток по двум светорассеяниям, что облегчит работу.
Использование морфологических параметров (FS и SS) для локализации лимфоцитов достаточно часто приводит к получению некорректных результатов. Это бывает связано, как правило, с неполным лизисом эритроцитов, попаданием базофилов в зону лимфоцитов и т.д. Для диагностики состояния иммунной системы и ее аномалий более корректным представляется локализация лимфоцитов, опираясь на экспрессию общего для лейкоцитов антигена (CD45) в многоцветном анализе (анализ больше трех цветов) и многостадийное гейтирование. В последнее время все чаще используется метод локализации лимфоцитов именно по наличию CD45.
Рис. 3. Оптимизация настройки каналов флуоресценции. Негативные клетки должны находиться в середине первой декады логарифмической шкалы интенсивности флуоресценции (А). Б и В - примеры неправильной настройки цитометра. Б - слишком высокое напряжение на ФЭУ. В - слишком низкое напряжение на ФЭУ.
Оптимизация настройки параметров фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) для флюоресценции. После настройки каналов светорассеяния приступают к настройке чувствительности каналов флюоресценции. Этот процесс начинают с анализа негативного контроля, который представляет собой клетки образца, окрашенные неспецифическими антителами мечеными теми же флуорохромами с которыми предстоит работать в дальнейшем (изотипический контроль). Негативные клетки должны попадать в первую декаду на логарифмической шкале интенсивности флюоресценции по всем задействованным каналам (Рис. 3А). Необходимо добиться того, чтобы клетки контроля легли, по возможности, в центре первой декады. Следует сразу отметить, что неспецифическое взаимодействие антител различных классов с поверхностью клеток мишеней не одинаково. Исходя из этого, антитела для контрольного образца должны быть того же изотипа и в той же концентрации, что и МА к CD маркерам, используемые для анализа.
На Рис. 3Б и Рис. 3В приведены гистограммы, полученные на цитометрах, настроенных некорректно. Если контрольные клетки попадают во вторую декаду, это, в конечном счете, может привести к ложно-позитивным результатам (Рис. 3Б), а низкая чувствительность приводит к занижению реальных значений (Рис. 3В). И то и другое при клинико-диагностических исследованиях недопустимо.
Оптимизация введения коэффициентов компенсации. После настройки чувствительности прибора в случае многоцветного анализа возникают проблемы. Даже в случаях использования для анализа линейных маркеров, таких как CD19 и CD3, можно увидеть дубль позитивные клетки, хотя они в природе не встречаются. Данный парадокс связан с тем, что спектры, испускаемые флуорохромами, не бывают точечными, а имеют свое распределение в определенном диапазоне. Практически невозможно избежать дополнительного вклада излучения во все ФЭУ, предназначенные для регистрации других флуорохромов, даже если использовать различные наборы барьерных светофильтров. Таким образом, необходимо провести вычитание из общей интенсивности флуоресценции на каждом ФЭУ дополнительного сигнала, генерируемого другими флуорохромами. Данное вычитание называется введением в программу анализа коэффициентов компенсации.
Рис. 4. Гистограмма распределения клеток периферической крови иллюстрирующая первое правило введения коэффициентов компенсации. Значениям MEAN X и MEAN Y соответствуют значения максимумов проекций гистограмм распределения клеток на оси X и Y.
В процессе анализа регистрируется ряд статистических параметров, среди которых есть такое значение как MEAN (рис 4). Этот параметр отражает среднестатистическое положение максимума пика распределения частиц на гистограммах в выбранном канале флюоресценции или светорассеяния. Для процедуры введения коэффициентов компенсации необходимо использовать клетки, окрашенные антителами, связанными с разными флуорохромами, (например, CD3-FITC и CD19-PE) и анализировать их в двухпараметрическом режиме. Антитела для этой процедуры подбирают таким образом, чтобы они относились к двум непересекающимся CD маркерам. Гистограмму разбивают на четыре квадранта, в которых определяют значение MEAN для каждого типа флуоресценции. Первое правило введения коэффициентов компенсации гласит: коэффициенты компенсации введены правильно, если MEAN квадранта 1 равен MEAN квадранта 3 по оси Х, а MEAN квадранта 4 равен MEAN квадранта 3 по оси У (рис 4).
Рис. 5. Гистограмма распределения клеток периферической крови иллюстрирующая второе правило введения коэффициентов компенсации.
Второе правило оптимизации введения коэффициентов компенсации гласит: если мысленно нарисовать линии из центров областей позитивных клеток, то они должны быть приблизительно параллельны осям X и Y или должен образоваться прямоугольник (рис 5).
Рис. 6. Примеры неправильного использования коэффициентов компенсации. При недокомпенсации (А): MEAN квадранта 4 больше, чем MEAN квадранта 3 по оси У, а MEAN квадранта 1 больше, чем MEAN квадранта 3 по оси Х. При перекомпенсации (Б): MEAN квадранта 3 больше, чем MEAN квадранта 4 по оси У, а MEAN квадранта 3 больше, чем MEAN квадранта 1 по оси Х.
Всегда существует вероятность пере- или недокомпенсации. На Рис. 6 представлены оба этих случая. При недокомпенсации исследователь может получить завышенный результат и ложно позитивные клетки (рис 6А). При перекомпенсации можно потерять часть позитивных клеток и, как следствие этого, получить заниженный результат (рис 6Б).
Рис. 7. Оптимизация двухпараметрического анализа FITC (FL1) против PE (FL2) при изменении чувствительности одного из каналов флуоресценции: А - низкая чувствительность по FL2; Б - повышение чувствительности по каналу флуоресценции FL2 за счет увеличения напряжения на ФЭУ; В - вычитание дополнительного вклада интенсивности флуоресценции FITC за счет увеличения коэффициента компенсации.
Между напряжением на ФЭУ и коэффициентами компенсации существует взаимосвязь. В некоторых случаях, когда используют МА от разных фирм производителей, возникает необходимость изменить чувствительность по одному из каналов флюоресценции. Эта процедура приводит к тому, что изменяется и отображение флюоресценции на двухпараметрических гистограммах. Повышая чувствительность по одному из каналов, необходимо изменить и соответствующий этому каналу коэффициент компенсации. Например, в двухпараметрическом анализе FITC против PE, задействованы два канала флюоресценции (FL1 и FL2). Для повышения чувствительности по каналу флюоресценции FL2 поднимают напряжение на ФЭУ. При этом наблюдается дополнительный вклад интенсивности флуоресценции FITC в канал FL2, который необходимо вычесть за счет увеличения коэффициента компенсации (Рис. 7).
Таким образом, алгоритм настройки рабочего протокола выглядит следующим образом: проверка работы цитометра; настройка дискриминатора; настройка каналов светорассеяния; настройка каналов флюоресценции; введение коэффициентов компенсации.
Предложенный подход для настройки проточных цитометров и последующего анализа окрашенных клеток применим к большинству производимых цитометров.
Стандартные настройки и создание протоколов позволяют более корректно проводить анализ как в клинико-диагностических, так и научно-исследовательских целях. В свою очередь, это позволяет использовать подготовленные протоколы для исследований и включать или исключать те или иные параметры в анализ, в зависимости от целей поставленных перед врачом-лаборантом или научным работником.
Идентификация субпопуляций В-клеток.
При оценке относительного количества и характеристик клеток, участвующих в иммунном ответе на антигены, очень важно иметь представление обо всех типах клеток, участвующих в формировании специфического (адаптивного) иммунного ответа организма на внедрение патогена. При формировании иммунной реакции одна из ведущих ролей принадлежит клеткам тимического происхождения, получивших название Т-лимфоциты. В то же время эффекторные механизмы специфической иммунореактивности обеспечиваются либо эффекторными Т-клетками (Т-эффекторами ГЗТ, цитотоксическими Т-клетками), либо специфическими гуморальными факторами, секретируемые определенной субпопуляцией лейкоцитов. Специфический гуморальный иммунный ответ обеспечивают хорошо всем известные антитела. Они обладают способностью взаимодействовать с внедрившимися микроорганизмами, активировать систему комплемента и стимулировать фагоцитарную активность клеток-фагоцитов, взаимодействуя с их мембранными рецепторами.
Рис. 8 Гистограмма распределения CD3 и CD19 на лимфоцитах периферической крови. CD3-CD19+ В-клетки (квадрант J1), CD3+CD19- Т-клетки (квадрант J4).
Популяцией лимфоцитов, отвечающей за продукцию антител, являются В-клетки. Каждый лимфоцит, относящийся к В-клеткам, запрограммирован на продукцию антител одной-единственной специфичности, и эти антитела присутствуют на его поверхности в качестве рецептора для соответствующего антигена. Один В-лимфоцит несет на своей поверхности примерно 105 идентичных молекул антител. Данные антитела называют поверхностным или мембранными иммуноглобулинами (Робсон А., и др., 2006).
Основной формой мембранных иммуноглобулинов являются иммуноглобулины класса М (IgM). Они экспрессируются на мембране всех зрелых В-клеток, которые не имели контакта с антигеном. Однако, на поверхности В-клеток, дифференцировка которых уже завершилась, присутствуют и иммуноглобулины класса D (IgD). В процессе формирования иммунного ответа происходит переключение изотипов мембранных иммуноглобулинов на IgG, IgA, IgE (Ярилин А.А., 1999).
Кроме мембранных иммуноглобулинов, В-клетки экспрессируют целый ряд мембранных маркеров, которые необходимы для формирования В-клеточного рецептора (BCR) и играют важную роль в передаче сигнала в процессе распознавания антигена, а также являются маркерами линейной принадлежности B-клеток, что особенно полезно при идентификации данной популяции лимфоцитов. К таким маркерам, прежде всего, относятся CD19 и CD21. Данные молекулы формируют ко-рецепторный комплекс, в который вовлечен также и CD81 (Hultin L.E., et al., 1993).
Рис. 9 Гистограмма распределения CD20 и CD5 на лимфоцитах периферической крови у пациента с ревматоидным артритом.
CD19 антиген (также известный как B4) - представляет собой мембранный гликопротеин, принимающий участие в регулирование развития B-лимфоцитов, их активации и дифференцировки. Эта молекула экспрессируется на всех нормальных B-клетках, включая про-B-лимфоциты, но исчезает у плазматических клеток в процессе их созревания. Молекула CD19 отсутствует на мембране нормальных T-клеток, NK-клетках, моноцитах и гранулоцитах (Рис. 8). В связи с этим данный антиген рекомендуется для количественной оценки общей популяции B-клеток (Hultin L.E., et al., 1993).
Кроме перечисленных выше структур, в состав В-клеточного рецепторного комплекса вовлечены и другие молекулы, например CD20 - интегральный не гликозилированный мембранный белок. Данная молекула является Ca2+-каналом и участвует в активации и пролиферации В-клеток за счет регуляции трансмембранной проводимости ионов Ca2+. Молекула CD20 присутствует на всех нормальных B лимфоцитах периферической крови, лимфатических узлов, селезенки, миндалин и костного мозга, но отсутствует на плазматических клетках (Hultin L.E., et al., 1993).
Иногда для локализации В-клеток используют CD20, но данная молекула может экспрессироваться в низкой плотности на других популяциях лимфоцитов. Хотя CD20 первоначально был описан как B-клеточный линейный маркер, оказалось, что небольшая субпопуляция Т-клеток человека экспрессирует CD20. Причем, B-клетки экспрессируют CD20 в высокой плотности (CD20bright), а T-клетки в низкой (CD20dim) и составляют 2.4 +/- 1.5 % от лимфоцитов периферической крови.
Хотя оценка экспрессии CD20 полезна при характеристике B-клеток, необходимо достаточно осторожно подходить к интерпретации получаемых результатов (Рис. 9). Особенно это относится к случаям фенотипирования костного мозга. Сходная проблема может возникнуть при фенотипирования периферической крови у пациентов с ревматоидным артритом.
Рис. 10. Гистограмма распределения CD5 и CD19 на лимфоцитах периферической крови. Субпопуляции В-клеток: CD19+CD5+ В-1 (квадрант G2); CD19+CD5- B-2 (квадрант G1).
В настоящее время среди В-клеток выделяют три основные субпопуляции, а именно: В-1, В-2 и В-клетки памяти. Достаточно важная роль при данном делении отводится молекуле CD5 (Рис. 10). CD5 обнаружен на всех зрелых T-лимфоцитах и на большинстве тимоцитов. CD5 также присутствует на субпопуляциях B-лимфоцитов, но отсутствует на гранулоцитах и моноцитах. Молекула CD5 является лигандом для CD72 антигена, который присутствует на B-лимфоцитах. Точная функциональная роль CD5 все еще до конца не изучена, однако для этих молекул была показана физическая ассоциация с антиген-специфическим рецепторным комплексом как на T-, так и на B-лимфоцитах и возможность модулировать передачу сигналов через этот комплекс. В последние годы было показано, что CD5 может быть посредником негативной регуляции при передачи сигналов для BCR.
Кроме роли, связанной с передачей сигналов при активации, молекула CD5 была расценена как возможный маркер B-клеток, позволяющий различать их субпопуляции: CD5+ B-клетки (также называемые B-1 клетки) и CD5- B-клетки (или B-2 клетки) (Рис. 10).
Рис. 11. Гистограммы распределения CD5 и CD19 на лимфоцитах периферической крови. Субпопуляции В-1 лимфоцитов у пациента К. с аутоиммунным тиреоидитом: А - до лечения; Б - в процессе лечения.
Анализ В-1 и В-2 клеток в ПКЧ условно здоровых лиц позволил определить среднестатистическое количество этих субпопуляций. Было проанализировано 60 условно здоровых лиц, и результаты представлены в Таблице 2.
Таблица 2. Среднестатистическое содержание субпопуляций В-1 и В-2 лимфоцитов в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (N = 60).
Субпопуляции |
Содержание |
|||
Относительно лимфоцитов (%) |
Относительно общих В-клеток (%) |
Абсолютное количество (кл/л) |
||
Общие В-клетки |
12 5,0 |
0,099-0,336 х 109 |
||
В-1 клетки |
1,3 0,8 |
10,8 6,7 |
0,022-0,115 х 109 |
|
В-2 клетки |
10,7 4,2 |
89,2 7,1 |
0,081-0,323 х 109 |
B-1 клетки вызывают значительный интерес за счет того, что их ассоциируют с продукцией аутоантител, в том числе и при аутоиммунной патологии. Значительная роль B-1 клеток была отмечена при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и синдроме Шегрена. Увеличение количества CD5+ B-клеток наблюдали у пациентов, страдающих миастенией, инсулин-зависимым диабетом и тиреоидитом Хашимото. Доля CD5+ В-клеток может составлять треть и более от всех В-клеток (Рис. 11).
Следующей субпопуляцией В-клеток, вызывающей значительный интерес у исследователей, являются В-клетки памяти. Идентификация CD27 как маркера памяти B-клеток позволила надежно и эффективно идентифицировать в периферической крови наивные В-клетки (IgM+/CD27-) и B-клетки памяти (CD27+) (Рис. 12).
CD27 антиген представляет собой трансмембранный гликопротеин. Он обнаружен на медуллярных тимоцитах, периферических T лимфоцитах, активированных B лимфоцитах и NK клетках. Его лигандом является молекула CD70.Взаимодействие CD27 с его лигандом (CD70) на T клетках является одним из условий дифференцировки B-клеток в плазматические клетки. В свою очередь, существующие данные указывают на то, что отсутствие IgD-CD27+ B-клеток памяти в значительной степени объясняет нарушение продукции иммуноглобулинов, несмотря на функциональную передачу сигналов молекулой CD40 у пациентов с синдромом X-связанного гипер-IgM.
Таблица 3. Среднестатистическое содержание субпопуляций В-клеток памяти в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (N = 60).
Субпопуляции |
Содержание |
|||
Относительно лимфоцитов (%) |
Относительно общих В-клеток (%) |
Абсолютное количество (кл/л) |
||
Общие В-клетки |
12 5,0 |
0,099-0,336 х 109 |
||
В-клетки памяти |
4,3 2,5 |
31,25 8,45 |
0,012-0,040 х 109 |
Анализ В-клеток памяти в ПКЧ условно здоровых лиц позволил определить среднестатистическое количество этой субпопуляции. Было проанализировано 60 условно здоровых лиц, и результаты представлены в Таблице 3.
Гуморальный иммунный ответ играет значимую роль в устранении как внутриклеточных, так и внеклеточных патогенов. Этот процесс проистекает за счет дифференцировки зрелых B-клеток в плазматические клетки, которые секретируют большие количества антител. Однако большинство антигенов вызывают иммунную реакцию лишь при наличии и участии Т-лимфоцитов. Это относится к белковым и клеточным антигенам, а также к вирусам, которые объединяют в понятие "Т-зависимые" антигены. Лишь небольшое количество антигенов способно вызывать иммунный ответ без участия Т-клеток. Некоторые бактериальные липополисахариды при достаточно высокой концентрации способны к поликлональной активации значительной части популяции В-лимфоцитов, т.е. для такой стимуляции антигенная специфичность роли не играет. Линейные антигены, медленно распадающиеся в организме и имеющие организованную определенным образом и часто повторяющуюся детерминанту (полисахарид пневмококков, полимеры D-аминокислот, поливинилпироллидон) также способны непосредственно стимулировать В-лимфоциты. Индуцируемый Т-независимыми антигенами иммунный ответ практически не сопровождается формированием клеток памяти. При иммунном ответе на Т-независимые антигены вырабатываются иммуноглобулины класса М и эффективность Т-независимого ответа во много раз ниже. В свою очередь, Т-зависимые антигены в отсутствии Т-клеток лишены иммуногенности. При ответе на эти антигены требуется подключение Т-лимфоцитов. Т-зависимые антигены обеспечивают и определяют кооперативное взаимодействие В- и Т-клеток. В результате такого взаимодействия происходит переключение синтеза с IgM на IgG.
Основываясь на современных данных, различают два пути образования различных репертуаров антител: T-зависимый путь в герминальных центрах и T-независимый путь вне них. Точная функция второго пути и генерирование IgM+CD27+ B-клеток в настоящее время окончательно не выяснена. Однако, IgM+CD27+ B-клетки играют существенную роль в гуморальном ответе против T-независимых патогенов таких, как инкапсулированные бактерии (Weller S., et al., 2004).
Рис. 12. Гистограмма распределения CD27 и CD19 на лимфоцитах периферической крови. Квадрант С2 - субпопуляция В-клеток памяти.
Рис. 13 Гистограммы распределения CD3, HLA-DR и CD19 на лимфоцитах периферической крови. CD3-CD19+ В-клетки (квадрант А-J1), CD3-HLA-DR+ клетки (квадрант Б-J1).
Активация зрелых B-клеток с T-зависимым антигеном приводит к образованию плазматических клеток двумя независимыми путями дифференцировки. Активированные B клетки могут войти в экстрафолликулярные пролиферативные центры, где они быстро дифференцируются в короткоживущие плазматические клетки, секретирующие IgM. С другой стороны, активированные B-клетки могут попасть в герминальный центр, где происходят различные молекулярные перестройки, такие, как соматические гипермутации, переключение изотипов Ig и отбор высокоафинных вариантов. Антиген-селективные В-клетки герминального центра являются предшественниками двух типов клеток (высокоафинных В-клеток памяти и долгоживущих плазматических клеток), которые являются ответственными за долгосрочную гуморальную устойчивость (Calame K., 2001; Banchereau J., et al., 1992).
Помимо перечисленных выше молекул рецепторного и ко-рецепторного комплекса, на поверхности В-клеток экспрессируются антигены МНС класса II (HLA-DR). Они принимают участие в представление антигенов, а В-клетки являются антиген-представляющими клетками. Однако HLA-DR антигены также представлены на активированных Т- и NK-клетках. Этим объясняется несовпадение относительного количества CD3-CD19+ В-клетки и CD3-HLA-DR+ клетки при некоторых патологиях (Рис. 13).
Рис. 14. Гистограммы распределения CD19, CD5 и CD27 на лимфоцитах периферической крови. А - анализ по зоне СD19 позитивных клеток (зона D). Б - распределение СD19 позитивных клеток находящихся в зоне D. Квадрант Е1 - В-1 клетки (CD19+CD5+), квадрант Е4 - В-клетки памяти (CD19+CD27+).
Оценка относительного и абсолютного количества В-клеток является одним из важных диагностических признаков. При воспалительных заболеваниях наблюдаются колебания количества В-клеток в зависимости от типа и стадии иммунного ответа.
Все изложенное выше приводит к тому, что наиболее полную характеристику относительного количества B-клеток и их субпопуляционного состава можно получить при следующей комбинации МА: CD19/CD5/CD27/CD45.
В связи с тем, что молекула CD19 представляет собой линейно специфический маркер В-клеток и не встречается на других популяциях клеток периферической крови, данный антиген рекомендуется для количественной оценки общей популяции B-клеток. Однако, CD5 и CD27 также экспрессируются на поверхности Т-клеток. Гейтирование по зоне СD19 позитивных клеток, как показано на Рис. 14, позволяет четко локализовать как В-1 клетки (CD19+CD5+), так и В-клетки памяти (CD19+CD27+).
Таким образом, в настоящее время оценка и характеристика В-клеточной популяции лимфоцитов является не только важной задачей с точки зрения научных интересов, но и позволяет врачу-клиницисту получить дополнительную информацию о возможном наличии аутоиммунного процесса. Одновременно, что очень важно, современные подходы позволяют оценить эффективность уже сформировавшегося ответа по наличию В-клеток памяти. Расширение потенциальных возможностей современной проточной цитометрии значительно увеличивают точность оценки всех этих диагностически-значимых моментов. Применение многоцветного окрашивания и многоэтапного гейтирования позволяют провести многопараметрический анализ клеток периферической крови с высокой точностью и достоверностью в одной пробе пациента. Данный подход значительно облегчает интерпретацию полученных результатов анализа и позволяет судить о функционировании В-клеточного звена иммунной системы больных при разнообразных патологических состояниях.
...Подобные документы
Основные блоки проточного цитометра. Принципиальная схема устройства. Принцип работы проточного цитофлуориметра. Сравнительная характеристика приборов для проточной цитометрии. Особенности работы диагностических наборов для проточной цитометрии.
реферат [272,3 K], добавлен 18.01.2015Функции, локализация и виды лимфоцитов. Кооперация клеток в иммунном ответе. Краткая характеристика методов оценки Т- и В- лимфоцитов. Аллергические реакции гуморального типа. Методы лабораторной диагностики аллергии. Иммунологическая толерантность.
реферат [24,3 K], добавлен 21.01.2010История клинических исследований XX века. Понятие и виды медико-биологических исследований. Морально-этические проблемы взаимоотношение врача и испытуемого. Основные принципы проведения испытаний и экспериментов. Правила опубликования результатов.
реферат [25,1 K], добавлен 26.02.2015Текущее состояние клинической лабораторной диагностики РФ и тенденции ее развития. Современная структура лабораторной службы. Представление об основных нормативных документах, регулирующих деятельность КДЛ. Принципы и формы централизации исследований.
реферат [58,7 K], добавлен 10.12.2014Система методов медико-биологических исследований. Электрофизиологические, фотометрические методы. Основные группы медицинских электронных приборов и аппаратов. Структурная схема съема, передачи и регистрации медико-биологической информации.
реферат [26,3 K], добавлен 11.12.2008Главные задачи микробиологических исследований клинической лабораторной диагностики. Оснащение бактериологической лаборатории, высокопроизводительная автоматизированная техника идентификации микроорганизмов, стандартизация микробиологической диагностики.
реферат [47,1 K], добавлен 09.10.2010Предпосылки для появления доказательной медицины. Практика получения и применения научно-обоснованных результатов медицинских исследований. Изучение связи между незначительным и серьезным нарушением принципов добросовестной практики научных исследований.
презентация [269,2 K], добавлен 25.10.2014Первичные и врожденные нарушения нормального иммунного статуса, обусловленные дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа. Факторы, определяющие неспецифическую резистентность. Действие гормонов, нейромедиаторов и пептидов на клетки.
презентация [502,4 K], добавлен 05.02.2017Иммунные реакции клеточного типа. Основные задачи и функции Т-лимфоцитов в организме, их дифференцировка. Схема клеточного иммунного ответа. Недостаточность хелперной функции Т-лимфоцитов, наблюдаемая при синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД).
презентация [872,7 K], добавлен 24.09.2013Общие сведения о крови и кроветворении, закономерности и значение лабораторной и инструментальной диагностики. Типы проводимых анализов: гематологический, биохимический, иммунологический, бактериологический, паразитологический, системы свертывания.
дипломная работа [180,6 K], добавлен 02.02.2018Последовательность проведения клинических исследований при изучении нового лекарства. Переход от клеток и тканей к испытаниях на животных. Клинические испытания на здоровых людях - добровольцах. Многоцентровые испытания с участием больших групп пациентов.
презентация [297,4 K], добавлен 29.01.2014Спермограмма - метод лабораторной диагностики, заключающийся в описании общих свойств и микроскопии нативных препаратов эякулята. Назначение данной процедуры и оценка ее необходимости для диагностики мужского здоровья. Варианты морфологии сперматозоидов.
реферат [28,8 K], добавлен 05.11.2010На основании клинической картины, данных анамнеза, факторов наличия у пациента социальных и медико-биологических факторов риска, результатов лабораторных исследований постановка диагноза - инфильтративный туберкулез легких. Методы лечения болезни.
история болезни [21,4 K], добавлен 17.06.2015Факторы, определяющие уровень доказательности рекомендаций. Выявление исследований, данных, оценка их качества по оценочным таблицам. Число исследований и количество включенных больных. Иерархия типов исследований. Алгоритм проведения мета-анализа.
презентация [54,2 K], добавлен 23.09.2015Изучение источников и особенностей применения стволовых клеток. Исследование технологии выращивания искусственных органов на основе стволовых клеток. Преимущества биологического принтера. Характеристика механических и электрических искусственных органов.
презентация [2,1 M], добавлен 20.04.2016Инструментальные методы медицинской диагностики при рентгенологических, эндоскопических и ультразвуковых исследованиях. Сущность и разработка методов исследований и методика их проведения. Правила подготовки взрослых и детей к процедуре обследования.
реферат [61,5 K], добавлен 18.02.2015Эпидемиология и маркеры вирусного гепатита В, С и кори. Использование тест системы для выявления антител и антигенов. Установление причины развития хронической формы инфекции, выявление особенностей иммунного ответа. Проведение лабораторной диагностики.
дипломная работа [148,4 K], добавлен 10.11.2015Общее понятие о ВИЧ-инфекции и синдроме приобретенного иммунного дефицита. Исследование механизма действия ВИЧ на иммунную систему. Определение путей инфицирования и выявление клинических проявлений ВИЧ/СПИД. Медико-социальные последствия болезни.
презентация [1,2 M], добавлен 01.12.2012Изучение особенностей центральной модуляции функций иммунной системы посредством центрально обусловленных изменений уровня различных гормонов в крови. Описание путей и механизмов регуляции иммунного ответа. Гормональная регуляция иммунного ответа.
презентация [355,5 K], добавлен 17.05.2015Диагностическая значимость показателей липидного обмена у лиц с заболеваниями сердечно-сосудистой системы и эндокринной патологии в зависимости от пола и возраста. Анализ данных лабораторных исследований Краевой клинической больницы в Забайкальском крае.
реферат [18,5 K], добавлен 27.04.2013