Многоцветный анализ в проточной цитометрии для медико-биологических исследований

Идентификация NK-клеток (натуральных киллеров).

Среди больших гранулярных лимфоцитов (LGL, Large Granular Lymphocytes) выделяют отдельную популяцию клеток, получившую название натуральных киллеров или NK-клеток (Natural Killer). NK-клетки являются важным компонентом врожденной иммунной системы за счет наличия цитолитической активности против клеток-мишеней и способности продуцировать цитокины. Первоначально они были описаны на основании их функциональной способности уничтожать клетки некоторых опухолей гемопоэтического происхождения без предшествующей стимуляции. Таким образом, одной из основных функций данной субпопуляции клеток иммуной системы является защита собственного организма от видоизмененного «своего».

Как уже было сказано выше, NK-клетки являются носителями двух основных функций. Первая - это лизис опухолей и инфицированных вирусами клеток. Вторая - регуляция врожденного и адаптивного иммунных ответов за счет секреции хемокинов (CCL3, CCL4, CCL5 и XCL1) и цитокинов (GM-CSF, TNF-б, и IFN-г).

Способность NK-клеток взаимодействовать и убивать опухолевые, но не нормальные клетки была описана, а позже и объяснена рядом авторов. Этот эффект происходит за счет нескольких специализированных рецепторов, распознающих молекулы MHC класса I, которые экспрессируются на нормальных клетках. Эти рецепторы формируются на NK-клетках при ассоциации молекул CD94 с молекулами семейства NKG2 (CD159).

NK-клетки являются субпопуляцией лимфоцитов наиболее чувствительной к физиологическим и психологическим стрессам. В настоящее время доказано выраженное воздействие высоких физических нагрузок на NK-клетки. Их цитолитическая активность увеличивается при нарастании физической нагрузки и уменьшается после ее окончания.

В периферической крови NK-клетки составляют от 5 до 20 % циркулирующих лимфоцитов. По другим данным, среди лимфоидной популяции периферической крови человека NK-клетки составляет приблизительно 10-15%. Существует взаимосвязь между изменением активности NK-клеток и их количеством с клиническими признаками заболеваний у людей. Так, относительное количество NK-клеток и их активность существенно изменяется не только при опухолевых процессах и вирусной инфекции, но и при гнойном воспалении, нарушении функций центральной нервной системы (ЦНС), аутоиммунных заболеваниях и так далее (Whiteside T.L. et al., 1994).. Вероятно, что в результате применения более тонких и точных методов исследований, таких как проточная цитометрия и многопараметрический анализ, будут выявлены и другие изменения в субпопуляциях этих клеток при иных патологиях.

Рис. 15. Гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител против CD3 и CD16+CD56, меченых FITC и PE. На данной гистограмме отображены только CD45 позитивные лимфоциты. Квадранты: I1- NK-клетки; I2 - T-NK-клетки; I3 - негативные по CD3 и CD16+CD56 лимфоциты; I4 - T- клетки

Для выявления NK-клеток среди других лимфоцитов используют МА, распознающие различные маркеры, экспрессируемые на их поверхности. Однако многие поверхностные молекулы NK-клеток представлены и на других субпопуляциях лимфоцитов, и это накладывает свои особенности на идентификацию натуральных киллеров. В связи с этим для их локализации среди других лимфоцитов используют уникальную комбинацию из нескольких маркеров, таких как, CD56 и CD16 (Рис. 15). С другой стороны, NK-клетки не экспрессируют такие линейные маркеры, как CD3, CD14 и поверхностные Ig и это также используется при их локализации.

Одним из основных маркеров используемых для выявления NK-клеток является молекула CD16. Антиген CD16 представляет собой низко-аффинный рецептор для IgG (FcгRIII). Данный антиген существует в двух различных формах, кодируемых двумя различными генами: FcгRIIIA (или III-2) и FcгRIIIB (или III-1). Генетическая разнородность CD16 приводит к альтернативным путям ассоциации молекул с мембраной клеток. Первая трансмембранная форма (FcгRIIIA, 50-65 kDa) экспрессируется на NK-клетках, моноцитах и макрофагах. Вторая форма (FcгRIIIB, 48 kDa), ассоциированная с мембраной за счет гликозилфосфатидилинозитола (GPI), экспрессируется только на нейтрофилах.

Другим антигеном является молекула CD56. Данный антиген умеренно экспрессируется на субпопуляциях клеток периферической крови, таких как большие гранулярные лимфоциты и всех клетках с NK активностью. Молекула CD56 также экспрессируется отдельными субпопуляциями T лимфоцитов (Dargent J.L., et al., 1998).

Циркулирующие зрелые NK-клетки имеют фенотип CD3^-CD56⁺CD16⁺CD2^dim и отличаются от T-клеток отсутствием T-клеточного рецептора и CD3. В свою очередь, отличие от B-клеток заключается в том, что NK-клетки никогда не экспрессируют мембранные иммуноглобулины (Ig), однако, за счет экспрессии FcгRIII, они могут быть позитивными при окрашивании антителами. Поверхностные маркеры, экспрессируемые активированными NK-клетками, включают целый ряд молекул, таких как CD25, в1 (CD29) и в2 (CD18) интегрины, различные активационные антигены, включая HLA-DR, CD71 и CD69. В зависимости от степени активации NK-клеток поверхностные рецепторы могут изменять свою экспрессию за счет повышения или понижения (Whiteside T.L., et al., 1994; Rabinowich H., et al., 1993).

Рис. 16. Гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител против CD3 и CD8, меченных FITC и PE. На данной гистограмме отображены только CD45 позитивные лимфоциты. В зоне I1 находятся CD8⁺ NK-клетки.

Популяция NK-клеток обладает достаточной гетерогенностью по своему составу. Исследователи выделяют несколько их субтипов, а именно пре-NK-клетки, зрелые NK-клетки и активированные NK-клетки. Данная особенность связана с различной экспрессией маркеров клеточной поверхности. Среди популяции циркулирующих NK-клеток выделяют две основные субпопуляции. Первая экспрессирует CD16 и низкий уровень CD56 (CD16^{+(or high)}CD56^dim). Вторая экспрессирует CD56, однако, CD16 на них представлен в низкой плотности или полностью отсутствует (CD16^{-(or low)}CD56^bright). Последняя субпопуляция составляет приблизительно 10-20 % от общего количества NK-клеток. Они секретируют IFN-г и другие цитокины, и имеют меньшую цитолитическую активность. В свою очередь субпопуляция CD16^highCD56^dim составляет приблизительно 80-90% от NK-клеток периферической крови, они слабо секретируют цитокины, но обладают высокой цитолитической активностью (Warren H.S., et al., 1991).

Перечень других маркеров, экспрессируемых на своей поверхности NK-клетками, достаточно широк. Это - CD2, CD5, CD7, CD8, CD94, CD96, CD158, CD159 и многие другие. В настоящее время для локализации и характеристики NK-клеток наиболее широко используют двухпараметрический анализ экспрессии CD16 и/или CD56 на CD3-негативных клетках. Данная комбинация МА позволяет локализовать общую популяцию NK-клеток и количественно ее охарактеризовать (Рис. 15), но не охарактеризовать их субтипы.

Достаточно часто NK-клетки экспрессируют на своей поверхности б-цепь CD8 (Рис. 16), но в более низкой плотности, чем цитотоксические Т-клетки. Функция CD8 у NK-клеток до последнего времени была неясна, однако было показано, что субпопуляции NK-клеток человека, экспрессирующие бб гомодимер CD8 обладают большей цитотоксичностью, чем CD8^- NK-клетки, но механизмы этого оставались неизвестными. Позднее выяснилось, что соединение CD8б цепей в гомодимер индуцирует быстрое повышение внутриклеточного Ca²⁺ и, инициированное этим, увеличение экспрессии CD69. Хотя секреция цитолитических ферментов инициирует апоптоз NK-клеток, приток экзогенного кальция защищает CD8б⁺ NK-клетки от данного процесса. Данная защита от апоптоза может быть снята преинкубацией NK клеток с антителами против MHC класса I. Таким образом, данный механизм позволяет CD8б^?+ NK-клеткам сохранять жизнеспособность и принимать участие в многократном лизисе клеток-мишеней.

В последние годы исследователи уделяют большое внимание экспрессии CD38 на поверхности NK-клеток. Молекула CD38 это мембранный гликопротеин, представляющий собой фермент, регулирующий концентрацию цитоплазматического кальция. Кроме этого данный фермент обладает целым рядом других активностей таких, как аденозиндифосфат (ADP) рибозил циклазная, циклический аденозиндифосфат рибозил гидролазная и NAD гликогидролазная. Данная молекула также играет роль рецептора, модулируя межклеточные взаимодействия, и является переносчиком трансмембранных сигналов. Молекула CD38 экспрессируется на активированных Т-, В-, NK-клетках и некоторых других типах клеток.

В ряде работ приведены данные о том, что обработка CD38⁺ NK-клеток антителами против CD38 приводит к активации их литической способности. Однако это происходило только в тех случаях, когда было возможно взаимодействие CD38 со специализированными сигнальными молекулами. В случае NK-клеток роль такой молекулы играет CD16.

Представленные выше данные свидетельствуют в пользу того, что для наиболее полной характеристики NK-клеток необходимо определить на CD3-негативных клетках следующие поверхностные маркеры: CD16, CD56, CD38 и CD8. В свою очередь следует отметить, что CD38 и CD8 позволяют оценить цитотоксическую активность NK-клеток пациента и, как следствие этого, более корректно представлять картину, происходящую на данном этапе развития иммунного ответа. Для этих целей рекомендуется использовать следующие комбинации МА: CD3/CD16/CD56/CD45 и CD3/CD8/CD38/CD45.

Как уже было сказано выше, применение двухцветного окрашивания лимфоцитов с использованием комбинации антител CD3, CD56+CD16 позволяет локализовать NK-клетки и оценить их абсолютное и относительное количество (Рис. 15). Однако в этом случае отсутствует возможность определить их субтипы.

Другим вариантом окрашивания лимфоцитов для выявления NK-клеток является использование комбинации антител CD16 и CD56. На Рис. 17А представлена двухпараметрическая гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием МА против CD16 и CD56, меченных FITC и PE. Но в этом случае результат получается несколько завышенным, поскольку дополнительный вклад вносят Т-клетки, так как они могут экспрессировать на своей поверхности CD56 и CD16. Это особенно ярко проявляется при наличии различных патологий, когда резко возрастает количество Т-клеток, экспрессирующих данные структуры.

Рис. 17. Гистограммы распределения лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител против CD16 и CD56, меченных FITC и PE. На гистограмме А отображены все CD45⁺ позитивные лимфоциты. На гистограмме Б отображены только CD45⁺CD3^- лимфоциты.

Данную задачу позволяет решить применение многоцветного анализа и следующей комбинации МА CD3/CD16/CD56/CD45. В данной комбинации CD3 позволяет исключить из анализа Т-клетки (Рис. 17Б).

Рис. 18. Гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител против CD8 и CD38, меченных FITC и PE. На данной гистограмме отображены только CD45 позитивные лимфоциты. Область Н содержит CD8⁺CD38⁺ NK-клетки.

Ранее сообщалось, что CD38⁺CD8⁺ NK-клетки обладают высокой цитолитической активностью. Таким образом, знание о наличии данной субпопуляции, ее относительном и абсолютном количестве имеет важное диагностическое значение.

Для локализации CD38⁺CD8⁺ NK-клеток возможно использовать двухпараметрический анализ (Рис. 18), но более корректно применять трех- и четырехцветный анализ (CD3/CD8/CD38 и CD3/CD8/CD38/CD45).

В случае использования комбинации CD3/CD8/CD38 для выделения лимфоцитов используют морфологические параметры, но в результате этого всегда существует вероятность исключить из анализа часть больших гранулярных лимфоцитов, которые могут просто не попасть в выделенную зону при гейтировании. Использование CD45 для локализации всей популяции лимфоцитов является более корректным.

Комбинация моноклональных антител CD3/CD8/CD38/CD45 и многоэтапное позитивное и негативное гейтирование позволяет четко выделить активированные NK-клетки. На Рис. 19А представлена двухпараметрическая гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием МА против CD3

Рис. 19. Многоцветный анализ и последовательное гейтирование для локализации активированных NK-клеток. А - гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с использованием CD3 и светорассеяния под углом 90^о. Область D содержит Т-клетки, а область C - CD3 негативные лимфоциты. Б - гистограмма распределения CD3^- лимфоцитов периферической крови с использованием CD8 и CD38. CD8^dimCD38⁺ активированные NK-клетки. В - гистограмма распределения CD3⁺ лимфоцитов периферической крови с использованием CD8 и CD38. CD8^brightCD38⁺ активированные цитотоксические Т-клетки.

Дальнейший анализ проводят на отдельных гистограммах с использованием логических ограничений в зонах позитивных и негативных по CD3. На гистограмме, полученной с использованием гейтирования по CD3⁺, в зоне второго квадранта находятся активированные цитотоксические Т-клетки с фенотипом CD8^brightCD38⁺ (Рис. 19В).

Гейтирование по зоне CD3 негативных клеток, позволяет выявить активированные NK-клетки с фенотипом CD8^dimCD38⁺ (Рис. 19Б). Данное утверждение правомерно, поскольку CD8 экспрессируется не только на Т-клетках, но и на части популяции CD3 негативных клеток, а именно на NK-клетках.

Таким образом, используя данную комбинацию, МА возможно в одном образце определить активированные цитотоксические Т-клетки и активированные NK-клетки.

В последние годы становится весьма очевидной необходимость при типировании NK-клеток выявлять как общее количество, так и содержание отдельных их субпопуляций. Это связано с большим количеством вновь полученного фактического материала и несколькими направлениями развития современной иммунологии.

Результаты исследований показали, во-первых, ведущее значение NK-клеток и их цитотоксической функции при опухолевых и вирус-индуцированных процессах.

Во-вторых, наличие регуляторной функции у отдельных субпопуляций NK-клеток ставит вопрос об их клиническом и патогенетическом значении.

В-третьих, данные о наличии активационных рецепторов NK-клеток позволяют по-новому оценить их функциональную активность, не ставя трудоемких и весьма затратных экспериментов по киллингу клеток-мишеней.

В-четвертых, появилась возможность оценить степень воздействия лекарственной терапии на собственно NK-клетки как в норме, так и патологии, как in vivo, так и in vitro. Это позволяет значительно расширить возможности клинической фармакологии по поиску средств, напрямую влияющих на данную группу клеток (химиотерапия опухолей, антивирусная терапия и др.).

И, в-пятых, изучение субпопуляций NK-клеток и их функциональной активности может повлиять на наши представления о природе патологических процессов. Это весьма важно как для известных патологий, где значение NK-клеток уже определено, так и для других процессов, при которых значимость врожденных механизмов иммунитета недостаточно изучена. Как следствие этого, новые данные могут способствовать более корректной иммунотерапии различных патологических состояний с учетом ее влияния на данные клетки.

Идентификация Т-клеток и их субпопуляций по экспрессии бв-TCR и гд-TCR.

Многие микроорганизмы являются внутриклеточными паразитами и, обитая внутри клеток организма-хозяина, недоступны для антител. Облигатные внутриклеточные паразиты, в частности вирусы, способны размножаться только внутри клеток, используя репликационную систему клеток хозяина. Факультативно внутриклеточные микроорганизмы, такие как микобактерии и лейшмании, могут размножаться как в клетках, главным образом в макрофагах, так и вне клеток, но внутриклеточный способ существования для них более предпочтителен, поскольку обеспечивает защиту от факторов иммунной системы. Против данных микроорганизмов действует особый механизм приобретенного иммунитета, а именно клеточный иммунитет. Он обеспечивается отдельной субпопуляцией лимфоцитов, получившей название Т-клетки. В отличие от В-клеток, они дифференцируются в тимусе. Т-лимфоциты специализируются на уничтожении клеток организма, которые инфицированы размножающимися внутриклеточно возбудителями инфекции. Т-лимфоциты играют важную роль в элиминации опухолевых клеток, в реакциях трансплантат против хозяина и хозяин против трансплантата, гиперчуствительности замедленного типа и других реакциях организма, направленных на поддержание гомеостаза.

Оценка как относительного, так и абсолютного количества Т-клеток и их основных субпопуляций получила широкое распространение в лабораторной практике. При фенотипировании лимфоцитов эти данные являются диагностически значимыми при различных патологических состояниях иммунной системы, включая первичные и вторичные иммунодефициты. Динамика изменения субпопуляционного состава Т-клеток при некоторых патологиях представляет собой значительную ценность для контроля эффективности терапии, прогноза развития и течения заболевания (Hayball J.D., et al., 2000; Mandy F.F., et al., 2003).

К маркерам, характеризующим T-клетки, в первую очередь относят Т-клеточный рецептор (T-Cell Receptor, TCR). Подобно В-лимфоцитам, Т-лимфоциты несут на своей поверхности специфический рецептор для распознавания антигена. TCR является гетеродимером, состоящим из двух цепей.

Существует два типа TCR, каждый из которых ассоциируется с разными типами T-лимфоцитов. TCR1, состоящий из г- и д-цепей, появляется на ранних стадиях онтогенеза. TCR2 состоит из б- и в-цепей (Davis M.M., et al., 1988; Autran B., et al., 1989; Jarry A., et al., 1990;Van den Beemd R., et al., 2000).

Гены б- и в-цепей T-клеточного рецептора организованы так же, как и гены иммуноглобулинов. Имеются также сегменты V, D и J и гены константных областей (С). Формирование иммунокомпетентных T-клеток сопровождается транслокацией фрагментов V, D и J с образованием непрерывной последовательности VDJ. Как и при синтезе иммуноглобулинов, образование мРНК предусматривает удаление интронов между VDJ и С.

Рис. 20. Гистограммы распределения Т-клеток экспрессирующих TCR-Vв. Квадранты С2 содержат клетки с фенотипом CD3⁺TCR-Vв1⁺ и CD3⁺TCR-Vв14⁺.

Следует отметить, что уже выявлена специфичность отдельных вариантов V-сегмента ТCR. Так Vв17 является мишенью для суперантигена микоплазмы (MAS) и стафилококкового энтеротоксина B, а Vв8 для стафилококкового энтеротоксина Е. Описано, что при инфицировании вирусом Эпшейн-Бара наблюдалась быстрая клональная пролиферация CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих TCR Vв14, хотя в норме TCR Vв14 Т-клетки составляют только 2-7% (Рис. 20) (Haynes B.F., et al., 1995; Van den Beemd R., et al., 2000; Kelsen J., et al., 2004; Wada T., et al., 2007). Не исключено, что в будущем анализ наличия тех или иных Vв-субъединиц TCR может быть использован для персонифицированной терапии пациентов.

Примерно 87,2-98,4 % Т-клеток представляют собой вариант бв-TCR, и обозначаются эти клетки как бв-Т-клетки. Остальные 1.7-8.9 % T-клеток несут на своей поверхности гд-TCR и обозначаются как гд-Т-клетки (Таблица 4).

Таблица 4. Среднестатистическое содержание -T клеток и -T клеток в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (N = 60).

бв-Т-клетки подразделяются на две различные неперекрывающиеся субпопуляции. Клетки одной из них несут маркер CD4 и в основном "помогают" в осуществлении иммунного ответа или "индуцируют" его, данная субпопуляция получила название Т-хелперы. T-клетки другой субпопуляции несут маркер CD8 и обладают преимущественно цитотоксической активностью. Небольшая часть бв-Т-клеток не экспрессируют ни CD4, ни CD8. С другой стороны, большинство гд-Т-клеток, циркулирующих в периферической крови, также "дважды отрицательны". Однако некоторые из бв-Т-клеток все же экспрессируют молекулы CD8. Напротив, большая часть гд-Т-клеток в тканях экспрессируют CD8. Кроме молекулы CD8 гд -Т-клетки на своей поверхности могут экспрессировать CD56, CD94, CD161. Также было продемонстрировано, что цитостатическую активность гд-Т-клеток возможно стимулировать через CD122 (в-цепь рецептора IL-2) (Ichikawa Y., et al., 1991; Battistini L., et al., 1997; Fujimiya Y., et al., 1997).

гд-Т-клетки были изучены относительно недавно. Одной из особенностей гд-Т-клеток в отличие от бв-Т-клеток является то, что они распознают непептидные антигены, полученные из микробных патогенов, независимо от MHC. Данная субпопуляция выполняет целый ряд важных функций, так они могут усиливать иммунный ответ, производя большие количества интерферона-г (IFN-г), фактора некроза опухолей-б (TNF-б) и хемокины. Кроме этого, гд-Т-клетки имеют эффекторную (цитотоксическую) активность. С эволюционной точки зрения, гд-Т-клетки занимают уникальное место между высоко специфичными бв-Т-клетками и врожденной иммунной системой для выполнения защиты организма от патогенов. Экспериментальные данные показали, что роль гд-Т-клеток была весьма существенна в устойчивости организма против целого ряда микроорганизмов. Так функциональную значимость гд-Т-клеток отмечали в устойчивости к Mycobacterium, Borellia, Francisella tularensis, Salmonella и вирусов, включая вирус ВИЧ. Кроме того, гд-Т-клетки играют существенную роль и в противоопухолевом ответе, в частности было описано значительное увеличение этих клеток у пациентов с лимфомой. гд-Т-клетки также вовлечены в восстановление эпителия и гомеостаз. С другой стороны, гд-Т-клетки могут быть вовлечены в патогенез заболеваний с гиперактивацией иммунной системы, например, сахарного диабета, болезни Бехчета, а также бронхиальной астмы (Ichikawa Y., et al., 1991; McClanahan J., et al., 1999; Robak E., et al., 1999; Yin Z., et al., 2000). Содержание гд-Т-клеток в периферической крови варьирует, существуют половые и возрастные различия. Их количество увеличивается с момента рождения до наступления полового созревания, а в дальнейшем постепенно снижается. У женщин количество гд-Т-клеток несколько выше, и этот уровень сохраняется значительно дольше, чем у мужчин (Caccamo N., et al., 2006). гд-Т-клетки обладают очень быстрой (начинающейся после 4-6 дней), высокой (в 200 раз) и длительной (>7 месяцев) пролиферативной способностью в ответ на антиген. Кроме того, в течение иммунного ответа антиген-специфические гд-Т-клетки могут составлять до 48-98 % от общего количества циркулирующих гд-Т-клеток. Таким образом, обнаружение увеличенной циркулирующей субпопуляции гд-Т-клеток может позволить сделать предположение о недавней или продолжающейся хронической стимуляции, особенно на слизистых оболочках или участках кожи. Эта информация позволяет клиницистам делать предположение о возможном медленно прогрессирующем инфекционном заболевании (Chen Z.W., et al., 2003). На клеточной поверхности и бв-, и гд-антигенраспознающие рецепторы T-клеток располагаются непосредственно рядом с полипептидным комплексом, имеющим групповое название CD3. Это соседство и ассоциация с CD3 являются необходимым условием для экспрессии всего рецепторного комплекса на поверхности клеток. Приведенные выше факты свидетельствуют в пользу того, что для более полной характеристики Т-клеток пациента анализ следует проводить не только по такому линейно-специфическому маркеру как CD3, но и по наличию субпопуляций бв-T-клеток и гд-Т-клеток. Важность определения последних становится очевидной для целого ряда заболеваний. В первую очередь к ним относятся такие заболевания как ВИЧ-инфекция, вторичные и первичные иммунодефицитные состояния, сопровождающиеся длительной персистенцией микроорганизмов в организме человека на фоне депрессии Т-клеточного звена иммунной системы. И особенно важным становится определение гд-Т-клеток при оценке общего количества Т-клеток в тех случаях, когда от их количества зависит доза назначаемых препаратов (например, назначение антиретровирусной терапии ВИЧ-инфицированным пациентам).

Рис. 21. Гистограммы распределения Т-клеток и их субпопуляций, полученные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови с использованием комбинации моноклональных антител CD3/CD4/CD8/CD45. Анализ проводили на CD45 позитивных клетках.

Количественный анализ T-клеток является наиболее востребованным исследованием для иммунологического контроля состояний при синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД), мониторинга как за пациентами после трансплантации костного мозга, так и эффективности иммунодепрессивной терапии. Стандартные протоколы иммунофенотипирования, использующие четыре цвета, позволяют проводить идентификацию субпопуляций T лимфоцитов в одном образце (Рис. 21). Этот анализ предоставляет исследователю намного больше информации, но до последнего времени она находилась вне зоны внимания клиницистов (Reimann K.A., et al., 2000).

Рис. 22. Гистограммы распределения Т-клеток по плотности экслрессии CD3 на их поверхности. А - распределение CD3 позитивных Т-клеток у здорового донора. Б - распределение CD3 позитивных Т-клеток у пациента с вирусом Эпштейн-Бара.

Так, при использовании комбинации МА CD3/CD4/CD8/CD45 при обычном анализе периферических T-клеток достаточно часто наблюдается бимодальное распределение экспрессии CD3, которое предполагает наличие двух отличных субпопуляции T-клеток (Рис. 22Б). Помимо молекул CD3 антиген-специфический T-клеточный рецептор является другим пан-T-клеточным маркером, который необходимо использовать при анализе пациентов с иммунологическими расстройствами. Как было описано выше, существует два отличных типа TCR - бв-TCR и гд-TCR, которые различаются по происхождению в онтогенезе и функциональным свойствам. В медицинской практике, как правило, внимание клиницистов сосредоточено, прежде всего, на бв-T-клетках, которые составляют большую часть T-лимфоцитов. Остающиеся около 5% гд-T-клеток, как правило, выпадают из зоны внимания клиницистов, и эти клетки рассматривали исключительно при исследовании иммунитета слизистых оболочек и в тимусе. Данный этап необходим, так как большинство гд-Т-клеток, циркулирующих в периферической крови "дважды отрицательны" по CD4 и CD8. Другая их особенность заключается в том, что они имеют более высокую плотность экспрессии молекулы CD3 на своей поверхности (CD3^bright). На Рис. 22 изображено достаточно часто встречающееся распределение CD3 положительных лимфоцитов при бактериальных и вирусных инфекциях, первичных и вторичных иммунодефицитах. Как видно из Рис. 23, клетки находящиеся в зонах А, Б и В экспрессируют высокий уровень CD3. В свою очередь клетки в зоне А имеют фенотип CD3^brightCD4^-, в зоне Б CD3^brightCD8^dim и зоне В CD3^brightCD8^-. Все эти признаки характерны для гд-T-клеток. Чтобы выявить гд- и бв-T-клеток, как правило, используют следующую комбинацию МА бв-TCR/гд-TCR/CD3/CD45.

Рис. 23. Гистограммы распределения Т-клеток и их субпопуляций, полученные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови пациента с хроническим носительством вируса Эпштейн-Бара. В зонах А, Б и В находятся CD3^bright Т-клетки.

На Рис. 24 представлены гистограммы распределения Т-клеток, полученные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови пациента с хроническим носительством вируса Эпштейн-Бара. На Рис. 24А в квадранте F2 находятся гд-T-клетки, на Рис. 24Б в квадранте Е2 - бв-T-клетки.

Все изложенное выше свидетельствует в пользу того, что для наиболее полной фенотипической характеристики T-клеток необходимо проводить анализ не только линейно-специфичного маркера T-клеток CD3, но и определять субпопуляционный состав T-клеток по экспрессии Т-клеточного рецептора, а именно гд- и бв-TCR. Для этих целей следует использовать многоцветный анализ и следующие комбинации МА: CD3/CD4/CD8/CD45 и бв-TCR/гд-TCR/CD3/CD45.

Рис. 24. Гистограммы распределения Т-клеток, полученные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови пациента с хроническим носительством вируса Эпштейн-Бара.

Таким образом, более полная информация об экспрессии Т-клеточного рецептора в клинической практике значительно расширяет возможности для анализа состояния Т-клеточного звена иммунной системы не только с точки зрения адекватного выявления его дефектов, но и для правильного назначения химиотерапевтических препаратов, направленных на восстановление нормального функционирования защитных систем организма.

Идентификация регуляторных Т-клеток и Т-клеток памяти.

В крови человека присутствуют как наивные Т-клетки, так и Т-клетки памяти, различающиеся между собой по функциональным и фенотипическим признакам. Жизненный цикл Т-клеток в организме делится на две фазы. Независимая от чужеродного антигена стадия дифференцировки Т-клеток и стадия, связанная с присутствием чужеродного антигена. Первая из них завершается появлением в русле крови зрелых наивных Т-лимфоцитов, каждый из которых способен отвечать только на «свой» антиген. Стимулированные антигеном в ходе первичного ответа Т-клетки проходят дальнейшую дифференцировку (Sprent J., 1994).

Все Т-клетки памяти появляются в результате дифференцировки активированных антигеном наивных предшественников в ходе нормального развития первичного иммунного ответа in vivo. Экспрессия на клеточной поверхности различных изоформ молекулы CD45 позволяет разделить CD4⁺ Т-лимфоциты человека на наивные Т-клетки и Т-клетки памяти. Принято относить субпопуляцию CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ Т-лимфоцитов к Т-клеткам памяти и соответственно CD4⁺CD45RA⁺CD45R0- - к наивным Т-клеткам (Рис. 25). Подобное разделение основано исключительно на способности CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ Т-клеток, а не наивных Т-лимфоцитов, интенсивно отвечать на повторный контакт с антигеном in vitro. В свою очередь, быстрый и усиленный ответ Т-клеток памяти на специфический антиген является их важнейшим функциональным отличием от наивных предшественников (Sanders M.E., et al., 1988; Michie, C.A., et al., 1992).

Покоящиеся CD4⁺ Т-лимфоциты памяти также отличаются от наивных предшественников системой внутриклеточной сигнализации, приводящей к резистентности к действию Са²⁺-ионофоров. Чувствительная к действию Са²⁺-ионофоров популяция CD4⁺ Т-клеток человека составляет основную часть покоящихся наивных CD4⁺CD45RA⁺CD45R0- Т-лимфоцитов. В свою очередь, большинство резистентных к действию Са²⁺-ионофоров CD4⁺ Т-клеток являются покоящимися CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ Т-лимфоцитами памяти (Ishida Y., et al., 1988; Miller R.A., et al., 1991; Sigova A., et al., 1999; Хайдуков С.В., и др., 2003).

Рис. 25 Распределение лимфоцитов условно здорового лица (А и В) и пациента в послеоперационный период (Б и Г). На гистограммах В и Г анализ лимфоцитов проводили только с гейтированием по CD45. На гистограммах А и Б анализировали клетки при помощи многоэтапного гейтирования по CD45 и CD4.

Основная методическая сложность в исследованиях процесса дифференцировки CD4⁺ Т-лимфоцитов в периферической крови здоровых лиц связана с тем, что активированные клетки составляют лишь незначительную часть. Как правило, в крови здоровых лиц доля активированных CD4⁺ Т-клеток составляет менее 10% от общего числа CD4⁺ Т-лимфоцитов (Reimann K.A., et al., 2000).

Однозначным фенотипическим признаком дифференцировки покоящихся наивных CD4⁺CD45RA⁺CD45R0- Т-лимфоцитов человека в покоящиеся Т-клетки памяти принято считать появление на поверхности клеток молекул CD45R0 взамен изоформы CD45RA. Данная особенность позволяет выявить три субпопуляции CD4⁺ Т-лимфоцитов человека: покоящиеся наивные CD45RA⁺CD45R0- T-клетки, покоящиеся CD45RA-CD45R0⁺ T-клетки памяти и активированные - CD45RА⁺CD45R0⁺ Т-клетки (рис. 25). Все активированные CD4⁺CD45RA⁺CD45R0⁺ Т-лимфоциты возникают в процессе стимуляции наивных Т-клеток антигеном in vivo (Sanders M.E., et al., 1988; Michie, C.A., et al., 1992).

Рис. 26 Алгоритм анализа субпопуляций CD4⁺CD25⁺ Т-лимфоцитов человека: CD4⁺CD25^high - зона E, CD4⁺CD25^low - зона D, CD4⁺CD25- - зона C. В однопараметрических гистограммах представлено распределения молекул CD95⁺ на CD4⁺CD25^high, CD4⁺CD25^low и CD4⁺CD25- Т-лимфоцитах. Распределения молекул CD38, CD62L и HLA-DR на поверхности CD4⁺CD25^high, CD4⁺CD25^low и CD4⁺CD25- Т-клеток оценивалось аналогичным способом.

Появление молекул CD69 считают основным фенотипическим признаком наиболее ранней (первые часы) стадии активации наивных CD4⁺ Т-лимфоцитов. Как правило, в крови здоровых лиц не удается обнаружить присутствие более чем 1-4% CD4⁺CD69⁺ Т-клеток (Gerosa F., et al., 1991; Mascher B., et al., 1999; Pala P., et al., 2000).

Определение относительного количества CD4⁺CD45RA⁺CD45R0- и CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ лимфоцитов может служить хорошим диагностическим признаком. Этот эффект четко проявляется при развитии инфекции или при хирургическом вмешательстве, поскольку происходит накопление доли CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ клеток и снижение CD4⁺CD45RA⁺CD45R0-. Как видно из Рис. 25, определение относительного количества CD45RA⁺ и CD45R0⁺ клеток по всей популяции лимфоцитов мало информативен и только анализ по зоне CD4 позитивных клеток позволяет четко увидеть это различие.

Рис. 27. Многоэтапное гейтирование при анализе T-reg клеток в периферической крови. А - гистограмма распределения CD127 и CD25 после одновременного гейтирования по CD4 и CD45. В зоне Е находятся регуляторные клетки. Б - гистограмма распределения CD4 и CD25 после гейтирования только по CD45. Черные точки - T-reg клетки.

Популяция CD4⁺CD25⁺ Т-клеток человека гетерогенна по функциональным свойствам и фенотипическим признакам. Она включает в себя популяции пролиферирующих CD4⁺CD45RA⁺CD45R0⁺CD25^low Т-клеток и «регуляторных» (T-reg - T regulatory) CD4⁺CD45R0⁺CD25^high Т-лимфоцитов. Идентификацию этих популяций клеток принято проводить по совокупности количественных параметров экспрессии молекул CD38, CD62L, CD95 и HLA-DR. В подобном случае правильный выбор областей анализа (Рис. 26 и 28) в наибольшей степени определяет корректность описания субпопуляций CD4⁺CD25⁺ Т-лимфоцитов человека. Согласно проведенному анализу, фенотипические признаки субпопуляции CD25^high, CD25^low и CD25- Т-лимфоцитов полностью отвечают существующим критериям для данных типов Т-клеток (Jonuleit H., et al., 2001; Baecher-Allan C., et al., 2001; Shevach E.M., 2002).

T-reg клетки имеют следующий фенотип CD3⁺CD4⁺CD25^highCD45R0⁺CD95⁺, однако наиболее важным их маркером является FOXP3. Исследования показали, что FOXP3, который кодирует фактор транскрипции скурфин (scurfin), является главным регулирующим геном для развития и функционирования CD4⁺CD25^high регуляторных T клеток. Таким образом, самым точным маркером для идентификации T-reg клеток является как раз фактор транскрипции FOXP3. Однако он является внутриклеточным маркером, что значительно затрудняет работу по идентификации T-reg (Schubert L.A., et al., 2001).

Исследования последних лет показали, что экспрессия CD127 на T-reg клетках снижена или отсутствует. В свою очередь, эксперементы in vitro выявили, что экспрессия CD127 после активации Т клеток резко снижается. CD127 представляет из себя б-цепь гетеродимерного рецептора IL-7, который состоит из CD127 и общей г-цепи, которая представлена и у других рецепторов цитокинов (IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R, и IL-21R). CD127 экспрессируется на тимоцитах, T- и B-предшествинниках, зрелых T клетках, моноцитах, и некоторых других лимфоидных и миелоидных клетках. Показано, что IL-7R играет важную роль в пролиферации и дифференцировке зрелых T клеток (Ryan D.H., et al., 1997; Zaunders J.J., et al., 2006).

Таким образом, окончательный фенотип T-reg клеток будет выглядеть следующим образом: CD3⁺CD4⁺CD25^brightCD127^dim-to-negFOXP3⁺ и для их детектирования можно использовать данный фенотип T-reg, без выявления FOXP3. Для более точной локализации T-reg клеток предпочтительно использовать многоцветный анализ и многоэтапное гейтирование с использованием следующего набора МА - CD45-FITC, CD4-PC7, CD25-PC5 и CD127-PE (Рис. 27). Среднестатистические результаты анализа T-reg клеток взрослых условно здоровых лиц представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Среднестатистическое содержание субпопуляций регуляторных Т-клеток в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (N = 60).

Субпопуляции CD4⁺CD25⁺ Т-клеток проявляют неодинаковую чувствительность к действию иономицина. В иономицин резистентной фракции (ИР-фракции) значительно возрастает доля CD4⁺CD25^high Т-клеток по сравнению с кровью того же донора, а содержание CD4⁺CD25^low Т-лимфоцитов - уменьшается. Следовательно, большинство CD4⁺CD25^high Т-лимфоцитов представлено резистентными к действию иономицина клетками. Полного исчезновения CD4⁺CD25^low Т-лимфоцитов в ИР-фракции никогда не наблюдалось. Следовательно, и в составе CD4⁺CD25^low Т-лимфоцитов присутствуют клетки, различающиеся по своей чувствительности к действию иономицина. Изменение содержания субпопуляций CD4⁺CD25⁺ Т-лимфоцитов в ответ на действие иономицина напрямую зависело от исходной доли Т-клеток с данным фенотипом в крови. Однако обогащение ИР-фракции CD4⁺CD25^high Т-клетками и одновременное с ним снижение доли CD4⁺CD25^low Т-лимфоцитов наблюдалось наиболее часто.

В сравнении с CD4⁺CD25^high Т-лимфоцитами ПКЧ, ИР-популяция (Рис. 28) всегда обогащена клетками с высоким уровнем экспрессии молекул HLA-DR и CD95. Одновременно ИР CD4⁺CD25^high Т-лимфоциты характеризуются меньшей долей CD62L⁺ клеток (Рис. 28) и заметным снижением уровня экспрессии этих молекул. По сравнению с CD4⁺CD25^low Т-клетками ПКЧ, ИР-фракция обогащена CD95⁺ клетками с высоким уровнем экспрессии этих молекул (Рис. 28). При этом в ИР-фракции CD4⁺CD25^low Т-лимфоцитов наблюдалось выраженное уменьшение доли CD62L⁺ клеток и снижение уровня экспрессии этих молекул. Среди ИР CD4⁺CD25^low Т-лимфоцитов уменьшение доли CD38⁺ клеток (Рис. 28) происходит за счет лимфоцитов с низким уровнем экспрессии этого маркера. Появление молекул HLA-DR на CD4⁺ Т-лимфоцитах считается признаком поздней стадии активации этих клеток. Существование CD4⁺CD25⁺HLA-DR⁺ Т-клеток в ПКЧ не позволяет полностью разграничить данный этап активации Т-лимфоцитов от предыдущего. Большинство CD4⁺HLA-DR⁺ Т-клеток ПКЧ имеют, как правило, фенотип CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺. Скорее всего, на поздних стадиях активации in vivo в ходе нормального развития первичного иммунного ответа основная часть этих CD4⁺ Т-лимфоцитов человека качественно изменяет свой характер регуляции внутриклеточного Ca²⁺ и приобретает резистентность к действию низких доз иономицина.

Рис. 28. Анализ субпопуляций CD4⁺ Т-лимфоцитов человека до (а) и после (б) инкубации клеток с иономицином, проведенный методом проточной цитофлуориметрии и разработанного алгоритма (см. Рис. 26). По оси ординат приведены значения долей клеток в составе соответствующей субпопуляции.

Маркер наиболее поздней стадии активации in vivo Т-лимфоцитов человека - молекулы CD29 (VLA - Very Late Antigen) - часто используется как дополнительный признак покоящихся CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ Т-клеток памяти. В составе ИР-фракции CD4⁺CD45R0⁺CD29⁺ Т-клеток значительно больше, чем в исходной популяции того же донора (Рис. 29). Вместе с тем, на значительной доле (в среднем около половины) CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ Т-лимфоцитов ИР-фракции этот антиген отсутствует. Никаких экспериментальных данных в литературе о взаимосвязи молекул CD29 и CD45R0 до настоящего времени не описано. Степень обогащения ИР-фракции CD4⁺CD45R0⁺CD29⁺ Т-лимфоцитами зависит от исходной доли клеток с данным фенотипом в составе лимфоцитов ПКЧ, но во всех исследованных случаях молекулы CD29 экспрессируются на меньшей доле ИР CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ Т-клеток. Как правило, CD4⁺CD45R0-CD29⁺ Т-клетки в ощутимых количествах встречаются только в крови больных хроническими инфекциями. Сопоставимые результаты были получены для лимфоцитов здоровых лиц. Вероятнее всего, на поздней стадии активации большая часть CD4⁺CD45R0⁺CD29⁺ Т-лимфоцитов состоит из резистентных к действию иономицина клеток, а, возможно, определенная часть CD4⁺CD45R0⁺CD29- Т-лимфоцитов является чувствительными к его действию клетками.

Появление CD4⁺CD26⁺ Т-лимфоцитов также принято считать признаком специфической активации Т-клеток, хотя до сих пор остается неясным, на какой стадии дифференцировки появляется данный маркер. В норме, около четверти CD4⁺ Т-клеток ПКЧ экспрессируют молекулы CD26. В ИР-фракции доля CD4⁺CD26⁺ Т-лимфоцитов всегда значительно выше, чем в ПКЧ того же донора, и составляла, как правило, более половины соответствующей популяции (Рис. 29). Таким образом, значительная часть CD4⁺CD26⁺CD45RA-CD45R0⁺ Т-лимфоцитов человека является резистентной к действию иономицина.

Рис. 29 Анализ состава CD4⁺ Т-лимфоцитов человека до (а) и после (б) инкубации клеток с иономицином. Гистограммы показывают экспрессию CD45R0, CD26 и CD29 молекул на поверхности CD4⁺ Т-клеток.

В целом возникновение резистентности к действию низких доз иономицина и изменение гомеостаза ионов кальция в CD4⁺ Т-клетках наиболее характерно для самых поздних стадий дифференцировки активированных in vivo CD4⁺ Т-лимфоцитов человека. В полной мере это свойство характерно для долгоживущих покоящихся CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ Т-лимфоцитов памяти человека.

Как и следует ожидать от системы, работающей по принципу клональной селекции, каждый антиген активирует лишь ничтожно малую часть всей популяции Т-лимфоцитов. Для выполнения своих функций наивным Т-лимфоцитам необходима пролиферация (поскольку на антиген реагируют лишь немногие клоны, содержащие малое число клеток, и для развития интенсивного ответа требуется их предварительное размножение). По этой причине подавляющее большинство работ по изучению закономерностей активации Т-лимфоцитов выполнены in vitro с использованием митогенных лектинов (ConA и ФГА), смеси ФМА с Ca²⁺-ионофорами (иономицин), или МА к комплексу CD3-TCR. Каждый этап специфической активации Т-клеток in vivo происходит в конкретном микроокружении, полностью смоделировать которое в реальных условиях эксперимента вряд ли представляется возможным.

Общепринятый фенотип наивных CD4⁺ Т-клеток человека может быть описан как CD45RA⁺CD45R0-CD25-CD29-CD62L⁺CD69-CD95-HLA-DR-. Большинство покоящихся наивных CD4⁺CD45RA⁺CD45R0- Т-лимфоцитов, как и Т-клетки тимуса, являются чувствительными к действию Ca²⁺-ионофоров. Многократное возрастание ионов Ca²⁺ всегда происходит наиболее резко в первые минуты стимуляции Т-лимфоцитов и достигает максимума в течение 5-10 мин. Следовательно, чувствительность к присутствию ионов кальция в среде и к действию иономицина является необходимым условием для осуществления стадий индукции активации наивных Т-лимфоцитов.

Чувствительность ранних этапов активации (от момента начала поликлональной стимуляции и до появления на поверхности Т-лимфоцитов молекул CD25) к присутствию ионов кальция во внешней среде и их зависимость от амплитуды роста внутриклеточного Ca²⁺ в ответ на стимул признается большинством исследователей. Данный этап активации по продолжительности колеблется от 8 до 12 ч. Этот же временной интервал принято характеризовать и по появлению молекул CD69. Экспрессия молекул CD69 в активированных Т-клетках полностью подавляется EGTA. Среди лимфоцитов ИР-фракции присутствие CD4⁺CD45R0-CD45RA⁺CD69⁺ Т-клеток никогда не наблюдается. Скорее всего, большинство CD4⁺CD45RA⁺CD45R0^lowCD69⁺ Т^_лимфоцитов человека представляют собой чувствительные к действию иономицина клетки. Возможно, до появления молекул CD25 на активированных CD4⁺CD45R0-CD45RA⁺ Т-лимфоцитах эти клетки и проходят несколько этапов начальной стадии активации, но все они не сопровождаются качественными изменениями их чувствительности к действию иономицина. Следовательно, для инициации процесса активации чувствительность Т-клеток к иономицину совпадает с их наиболее сильной зависимостью от присутствия Ca²⁺ в среде. Так как ионы кальция всегда присутствуют в организме, то резистентность к действию иономицина просто не может появиться на данном этапе активации.

Одной из ключевых стадий процесса активации принято считать появление CD4⁺CD25⁺ Т-клеток. Влияние удаления ионов кальция с помощью EGTA из среды на экспрессию молекул CD25 Т-клетками сильно зависело от времени добавления хелатора. Как правило, чем на более ранней стадии ионы кальция были удалены из среды инкубации клеток, тем большее влияние это оказывало на экспрессию молекул CD25. Скорее всего, для индукции синтеза молекул CD25 de novo присутствие ионов кальция абсолютно необходимо. Экспрессия молекул CD25 на активированных Т-клетках, прошедших стадию индукции, значительно меньше зависит от EGTA. Для более поздних стадий активации какого-либо эффекта EGTA на CD25⁺ Т-клетки отмечено не было. Это свидетельствует о значительном снижении зависимости этой и, возможно, последующих стадий активации Т-клеток от присутствия ионов кальция в среде.

Доля CD4⁺CD25⁺ Т-клеток в составе ИР-фракции лишь незначительно отличалась от их содержания в крови того же донора. Это позволяет предположить появление ИР Т-клеток, в которых произошла перестройка гомеостаза ионов кальция, именно на данной стадии активации in vivo CD4⁺ Т-лимфоцитов. В популяции CD4⁺CD25⁺ Т-клеток ПКЧ присутствуют пролиферирующие и регуляторные CD4⁺ Т-лимфоциты. Существуют ли взаимные переходы между CD4⁺CD25^high и CD4⁺CD25^low популяциями, до сих пор остается неизвестным. Субпопуляции этих клеток проявляют неодинаковую чувствительность к Ca²⁺-ионофору. Большинство CD4⁺CD25^high Т-лимфоцитов представлено резистентными к действию иономицина клетками. В сравнении с CD4+CD25^high Т-лимфоцитами ПКЧ, ИР-фракция всегда обогащена HLA-DR⁺, CD95⁺ и CD38⁺ клетками с высоким уровнем экспрессии этих молекул, но одновременно содержит меньше CD62L⁺ клеток. В сравнении с CD4⁺CD25^low Т-клетками ПКЧ, ИР популяция обогащена CD95⁺ клетками с высоким уровнем экспрессии этих молекул. При этом в ИР-фракции CD4⁺CD25^low Т-лимфоцитов наблюдается выраженное уменьшение доли CD62L⁺ клеток. Скорее всего, Т-клетки с измененным гомеостазом ионов кальция появляются на стадии интенсивной пролиферации активированных CD4⁺ Т-лимфоцитов, но составляют меньшую долю этой популяции. В популяции регуляторных CD4⁺CD25^high Т-лимфоцитов доля ИР-клеток значительно выше. Какие-либо данные о зависимости этих популяций от присутствия ионов кальция в среде на настоящий момент отсутствуют.

Появление молекул HLA-DR является общепринятым признаком поздней стадии активации CD4⁺ Т-лимфоцитов. Специальных работ по изучению роли ионов кальция в экспрессии молекул HLA-DR не проводилось, но отмечается минимальный вклад кальмодулин-зависимых процессов (cAMP- или cGMP-зависимые протеинкиназы) в осуществление экспрессии. Доля ИР CD4⁺HLA-DR⁺ Т-клеток всегда была значительно выше, чем в крови того же донора. Скорее всего, на поздних стадиях активации in vivo большая часть активированных CD4⁺ Т-клеток качественно изменяет характер внутриклеточной регуляции ионов кальция и приобретает резистентность к действию иономицина.

Молекулы CD29 часто используются в качестве дополнительного признака покоящихся CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ Т-клеток памяти. Для этого маркера отсутствуют четкие указания на зависимость его экспрессии от стадии активации CD4⁺ Т-лимфоцитов. Роль ионов кальция в индукции экспрессии этих молекул также до сих пор неизвестна. ИР-фракция значительно обогащена CD4⁺CD45R0⁺CD29⁺ Т-клетками по сравнению с исходной популяцией в крови донора. Однако на значительной доле (в среднем около половины) CD4⁺CD45RA-CD45R0⁺ ИР Т-клеток этот антиген отсутствует. Скорее всего, на этой, достаточно поздней стадии активации CD4⁺ Т-лимфоцитов, происходит полная замена изоформы CD45RA на CD45R0. Вероятно, на этой стадии активации большая часть CD4⁺CD29⁺ Т-лимфоцитов состоит из резистентных к действию иономицина клеток. Никаких работ по сравнительному анализу функциональных свойств CD45R0⁺CD29- и CD45R0⁺CD29⁺CD4⁺ Т-клеток до настоящего времени не проводилось.