56

Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Ультраструктурная реорганизация коры надпочечников при экстремальных воздействиях (общей гипоксии, гипертермии и генетически детерминированных нарушениях метаболизма)

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Колдышева Елена Владимировна

Новосибирск - 2009

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессорЛушникова Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессорБгатова Наталья Петровна

доктор биологических наук, профессорСелятицкая Вера Георгиевна

доктор биологических наук, профессорТолстикова Татьяна Генриховна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава

Защита диссертации состоится «______» ____________ 2009 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 001.037.01 в ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

Автореферат диссертации разослан «______» _____________2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.037.01

доктор биологических наукМолодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Надпочечники занимают одно из центральных мест в регуляции и реализации таких жизненно важных процессов, как рост, развитие (включая все этапы онтогенеза), репродуктивное поведение и адаптация организма к изменяющимся условиям существования, особенно при развитии общего адаптационного синдрома (стресс-реакции).

Важность адаптивных перестроек структурно-функциональных систем организма, а именно его адекватное функционирование и выживание при кратковременном или хроническом действии стрессирующих факторов, определило на многие десятилетия приоритетное направление в изучении функциональной активности надпочечников - выяснение закономерностей их синтетической активности в динамике стресс-реакции с расшифровкой физиологической роли синтезируемых ими гормонов (Селье Г., 1967; Озернюк Н.Д., 1992; Кириллов О.И., 1994; Aguilera G. et al., 1996). Это направление исследований доминирует до сих пор, несмотря на то, что в последнее время все большее внимание уделяется изучению роли синтезируемых надпочечниками гормонов в регуляции и пространственно-временной организации физиологических (прежде всего, обменных) процессов, иммунного ответа и репродуктивного поведения, в том числе в различные периоды онтогенеза (Розен В.Б., 1984; Анциферова Н.Д., 1993, 1997; Parker C.R. et al., 1997; Nussdorfer G.G., Mazzocchi G., 1998; Yen S.C., Laughlin G.A., 1998; Rainey W.E. et al., 2001, 2002; Chen C.C., Parker C.R., 2004).

В основе регуляторного воздействия гормонов надпочечников на тканевые и внутриклеточные структуры лежит регуляция активности соответствующих генов, способных индуцировать и подавлять биосинтез белков, углеводов, липидов и влиять на энергетический и пластический обмен в органах-мишенях (Панин Л.Е., 1983; Розен В.Б., 1984; Чернышева М.П., 1995; Панин Л.Е. и др., 2001; Обут Т.А., 2004).

Реализация общего адаптационного синдрома осуществляется через активацию гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси (системы) и сопряжена с усилением синтеза и секреции надпочечниками кортикостероидов и катехоламинов, служащих мощными регуляторами обмена веществ в органах и тканях.

При этом интенсивное и длительное напряжение адреналовых желез, вызванное стрессирующими факторами, может вызывать истощение их пластических и энергетических ресурсов и обусловливать развитие адреналовой недостаточности, которая проявляется в резком снижении синтеза кортикостероидов (Laureti S. et al., 1998), что ведет к нарушению многих жизненно важных функций.

Адреналовая недостаточность может развиваться и вследствие других причин, среди которых наиболее значимыми являются аутоиммунные заболевания, инфекционные процессы (например, туберкулез), массивные геморрагические повреждения, рак и генетически детерминированные заболевания (Shah B. et al., 1986; Werbel S.S., Ober K.P., 1993; Muscatelli F. et al., 1994; Oelkers W., 1996; Korenke G.C. et al., 1997).

Существенное влияние на функциональную активность надпочечников, их способность регулировать жизненно важные процессы и индуцировать адекватный адаптивный ответ оказывает процесс старения (Yen S.C., Laughlin G.A., 1998). Старение и хронический стресс реализуются посредством сходных физиологических и молекулярно-биологических механизмов, взаимно потенцируя друг друга.

По мнению некоторых исследователей, хронический стресс ускоряет процесс старения организма, при этом стареющий организм теряет способность завершать стрессовый ответ, и это отражается на его возможностях по поддержанию гомеостаза (Дильман В.М., 1981, 1983; Pare W., 1965; Sapolsky R.M. et al., 1983). Старение, как и стрессовая реакция, сопровождается увеличением секреции глюкокортикоидов и снижением синтеза и секреции андрогенов надпочечниками (Lehmann J.M. et al., 1995; Kern W. et al., 1996; Yen S.C., Laughlin G.A., 1998).

Постулируется положение, согласно которому гиперсекреция кортизола в позднем онтогенезе возникает в результате дегенеративных изменений головного мозга и нарушения ингибирования их синтеза из-за утраты чувствительности глюкокортикоид-опосредованного механизма обратной связи.

Показано, что в гиппокампе мелких грызунов с возрастом исчезает примерно 50% сайтов связывания I типа (минералокортикоидных рецепторов) и примерно такое же количество сайтов II типа (глюкокортикоидных рецепторов) (Sapolsky R.M., 1993). Увеличение стрессорной нагрузки на протяжении жизни или введение глюкокортикоидов в фармакологических дозах способствуют гибели нейронов гиппокампа и снижению его ингибирующего влияния на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось.

Нарушения функциональной активности надпочечников при хроническом стрессе и в процессе геронтогенеза могут развиваться не только в результате изменения секреторной активности клеток гипоталамуса и гипофиза, но также из-за изменений микроокружения адренокортикоцитов в разных структурно-функциональных отделах железы.

Физиологический рост, регенерация и функциональная активность надпочечников регулируются адренокортикотропным гормоном, нейротрансмиттерами, нейропептидами, цитокинами и разветвленной сетью ростовых факторов (Bornstein S.R., Chrousos G.P., 1999; Hammer G.D. et al., 2005; Karpac J. et al., 2005). В коре надпочечников выявлена дифференциальная экспрессия ряда цитокинов (интерлейкина-6, интерлейкина-1в, фактора некроза опухоли б, фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, фактора, индуцирующего г-интерферон, трансформирующего фактора роста в1) (Judd A.M., 1998).

Эти цитокины синтезируются как адренокортикоцитами, так и постоянно присутствующими в коре надпочечников макрофагами и лейкоцитами. Адренокортикоциты и хромаффинные клетки имеют на своей поверхности рецепторы к интерлейкинам 1, 2 и 6, которые могут влиять на их пролиферативную и биосинтетическую активность (Nussdorfer G.G., Mazzocchi G., 1998).

Несмотря на то, что в последнее время вопросам регенерации надпочечников, особенно их коры, стало уделяться больше внимания, следует отметить, что эта проблема еще далека от разрешения. В исследованиях, посвященных регенераторным возможностям коры надпочечников, в большей степени освещены эмбриональные и онтогенетические (до периода геронтогенеза) аспекты зональной регенерации адренокортикоцитов (Mitani F. et al., 1999; Ennen W.B. et al., 2005).

Представлены некоторые морфологические критерии изменения структурно-функционального состояния адренокортикоцитов в условиях общего охлаждения организма (Алябьев Ф.В. и др., 2007). Резервные возможности органа, особенно с точки зрения его регенераторных возможностей и компенсаторно-приспособительных реакций при воздействии на организм экстремальных экзогенных факторов и старении, изучены недостаточно.

Большое значение для разработки прогностических критериев состояния надпочечников имеет выяснение закономерностей и особенностей внутриклеточной реорганизации адренокортикоцитов, в том числе и органелл, вовлеченных в процессы стероидогенеза, при действии экстремальных факторов и в процессе геронтогенеза.

Цель исследования - изучить общие закономерности и особенности тканевой и внутриклеточной реорганизации коры надпочечников экспериментальных животных при действии экстремальных экологических факторов (гипоксии, гипертермии) и при генетически детерминированных метаболических нарушениях, обусловливающих преждевременное старение.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1. На основе сравнительного гисто-стереологического анализа изучить закономерности пространственной тканевой реорганизации коры надпочечников при экстремальных экологических воздействиях (гипоксии и гипертермии).

2. Выяснить закономерности внутриклеточной реорганизации адренокортикоцитов крыс и мышей при экстремальных экологических воздействиях.

3. Изучить регенераторные возможности адренокортикоцитов на основе количественной оценки их общей численности в коре надпочечников в период посттепловой реституции.

4. Изучить особенности возрастной реорганизации коры надпочечников крыс линии OXYS, подверженных преждевременному старению.

5. Изучить особенности внутриклеточной реорганизации адренокортикоцитов в процессе естественного (крысы Вистар) и преждевременного (крысы OXYS) старения, обусловленного нарушениями метаболизма.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное морфологическое исследование структурной реорганизации коры надпочечников мелких грызунов при действии экстремальных экологических факторов (гипобарической гипоксии и общего перегревания организма) и в процессе естественного и преждевременного старения.

Показано, что при острых стрессирующих воздействиях и в позднем онтогенезе развивается атрофия коры надпочечников, при многократных стрессирующих воздействиях - гипертрофия.

Атрофические изменения коры надпочечников при действии острых стрессирующих факторов носят транзиторный характер, в процессе геронтогенеза атрофия коры является отражением необратимого инволютивного процесса и наиболее выражена при генетически детерминированных нарушениях метаболизма, обусловливающих преждевременное старение.

Впервые установлено, что общей закономерностью структурной реорганизации коры надпочечников при действии стрессирующих факторов и в процессе геронтогенеза является диспропорциональный характер изменений размерных характеристик образующих кору структурно-функциональных зон.

При острых стрессирующих воздействиях уменьшение ширины клубочковой и пучковой зон сопровождается увеличением ширины сетчатой зоны. При многократных воздействиях стрессирующего фактора происходит более значительное увеличение ширины пучковой зоны по сравнению с сетчатой при уменьшении ширины клубочковой зоны.

Впервые показано, что в процессе естественного старения (крысы Вистар) происходит такое же ремоделирование коры надпочечника, как и при многократных стрессирующих воздействиях, заключающееся в непропорциональном увеличении ширины пучковой зоны. У преждевременно стареющих крыс OXYS стрессогенный фенотип коры надпочечника развивается уже в молодом возрасте (5 мес), и в позднем онтогенезе происходит его реверсия. Установлено, что закономерностью возрастной структурно-функциональной реорганизации коры надпочечников является уменьшение ширины сетчатой зоны.

Установлено, что при действии на организм однократных и многократных стрессирующих факторов в коре надпочечников развиваются стереотипные морфофункциональные изменения: делипидизация адренокортикоцитов, нарастание гетерогенности адренокортикоцитов и полнокровие капилляров, особенно в сетчатой зоне. Показано, что морфофункциональные перестройки в надпочечниках сопровождаются изменениями показателей электропроводности - увеличением коэффициента поляризации и низкочастотного сопротивления.

Впервые показано, что общей закономерностью пространственной реорганизации коры надпочечников у мелких грызунов при действии экстремальных экологических факторов (гипобарической гипоксии и общем перегревании) и в процессе геронтогенеза является увеличение объемной плотности, объемного и поверхностно-объемного отношения капилляров к адренокортикоцитам.

Увеличение объемного отношения капилляров вносит основной вклад в увеличение стромально-паренхиматозных отношений при действии экстремальных факторов и старении. Показано, что введение нероболила снижает, но не устраняет диспропорциональный характер изменений структурных плотностей капилляров и адренокортикоцитов.

Впервые показано, что при остром и хроническом действии экстремальных экологических факторов сохраняется регенераторный потенциал адренокортикоцитов, что у крыс проявляется в значительном увеличении ширины камбиального слоя, а у мышей - в увеличении концентрации адренокортикоцитов в 1 мг ткани в период посттепловой реституции.

Впервые установлены особенности внутриклеточной реорганизации адренокортикоцитов при действии экстремальных экологических факторов и в процессе геронтогенеза. Показано, что стрессогенная внутриклеточная реорганизация адренокортикоцитов определяется тремя основными событиями - развитием общего адаптационного синдрома (истощение липидных капель, уменьшение объемного отношения липосом к митохондриям), нарастанием регенераторно-пластической недостаточности клеток (сегрегация нуклеолонемы, деструкция митохондрий, усиление процессов аутофагоцитоза) и развитием процессов внутриклеточной регенерации. Впервые показано, что отличием возрастного ремоделирования адренокортикоцитов от стрессогенного является увеличение объемного отношения липосом к митохондриям и накопление в клетках липофусцина.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные представляют собой новые знания о закономерностях структурной реорганизации коры надпочечников при действии экстремальных экологических факторов и в процессе старения. Полученные результаты раскрывают особенности тканевых, клеточных и внутриклеточных перестроек коры надпочечников при острых и хронических стрессирующих воздействиях и в процессе естественного и преждевременного старения, обусловленного генетически детерминированными нарушениями обмена веществ.

Данные о выраженности регенераторных реакций адренокортикоцитов имеют большое значение для выяснения резервных возможностей надпочечников при развитии адаптивно-компенсаторных реакций и старении организма.

Результаты исследования имеют фундаментальное значение, поскольку показывают наличие общих биологических детерминант в формировании стрессогенного и возрастного вариантов ремоделирования коры надпочечников. Полученные данные могут быть использованы для разработки морфофункциональных диагностических и прогностических критериев состояния как адреналовой железы, так и организма в целом при экстремальных воздействиях (гипоксия и гипертермия), а также в процессе старения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Закономерностью адаптивно-компенсаторного и возрастного ремоделирования коры надпочечников является диспропорциональный характер изменений размерных характеристик ее структурно-функциональных зон.

Стрессогенный вариант ремоделирования коры характеризуется непропорциональным увеличением ширины пучковой зоны и уменьшением ширины клубочковой зоны. Для возрастного ремоделирования характерно стойкое уменьшение ширины сетчатой зоны.

2. К закономерностям пространственной реорганизации коры надпочечника при экстремальных экологических воздействиях, при естественном и преждевременном старении относится увеличение объемной плотности, объемного и поверхностно-объемного отношения капилляров к адренокортикоцитам, которое определяет увеличение объемного отношения стромы к паренхиме.

3. При острых и хронических стрессирующих воздействиях сохраняется регенераторный потенциал адренокортикоцитов, что проявляется в выраженном увеличении камбиального слоя, особенно в условиях многократного действия стрессирующего фактора. Гиперпластические реакции адренокортикоцитов в постстрессовый период проявляются в значительном увеличении концентрации клеток в 1 мг ткани.

4. Внутриклеточная реорганизация адренокортикоцитов после экстремальных воздействий (гипоксия и гипертермия) определяется тремя основными событиями - развитием общего адаптационного синдрома, нарастанием регенераторно-пластической недостаточности клеток и развитием процессов внутриклеточной регенерации. Возрастное ремоделирование адренокортикоцитов в отличие от стрессогенного проявляется в увеличении объемного отношения липосом к митохондриям и накоплении в клетках липофусцина.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 2-м Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995); 2-м Международном симпозиуме по проблемам саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма (Чолпон-Ата,1995); Конференции молодых ученых СО РАМН (Новосибирск, 1996); Международной конференции «Эндокринные механизмы регуляции функций в норме и патологии» (Новосибирск, 1997); 3-м Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997); 8-й научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1998); 4-м Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2002); 3-м Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти Ю.Г.Целлариуса (Новосибирск, 2004); 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), заседании Ученого совета ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 35 работ, из них 9 - в рецензируемых журналах по списку ВАК.

В качестве модели генетически детерминированных метаболических нарушений, обусловливающих преждевременное старение организма, использовали разновозрастных крыс OXYS.

Продолжительность экстремальных воздействий определялась выживаемостью животных и соответствовала периоду времени, после которого отмечалась их массовая гибель. Опытных и контрольных животных содержали в обычных условиях вивария на стандартном рационе, при свободном доступе к воде и корму. Эксперименты проведены в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных (Страсбург, 1986) и одобренными биоэтическим комитетом ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН. В зависимости от характера воздействий животные были разделены на 3 опытных серии.

I. Воздействие гипобарической гипоксии. Использованы 104 крысы линии Вистар в возрасте 4 мес массой тела 180 - 200 г, которых подвергали одно- и многократным воздействиям общей гипоксии. При однократном воздействии животных помещали в барокамеру Кравченко на «высоту» 9000 м на 1 ч. Скорость подъема составляла 50 м/c (в группу входило 33 животных). Летальность составила 9%, смерть животных наступала через 30 мин после «поднятия на высоту».

При многократных воздействиях животных в течение 11 сут ежедневно на 1 ч «поднимали» на высоту 5000 м в той же барокамере. На 12-е сутки животных на 1 ч «поднимали» на высоту 9000 м (всего в группу вошло 24 животных). В данной группе летальность составила 12,5%; все животные погибли после понятия на высоту 9000 м.

Для коррекции негативных эффектов гипоксических воздействий на кору надпочечников применяли синтетическое андрогенное стероидное соединение - нероболил (19-норандростеронфенилпропионат), который обладает анаболическим действием. По своей химической структуре данное соединение занимает промежуточное положение между эстрогенными и андрогенными гормонами, его анаболическое действие по сравнению с другими производными тестостерона характеризуется как более слабое. Коммерческий препарат нероболил (фирма «Гедеон Рихтер», Венгрия) предварительно подогревали до температуры тела крыс и вводили в мышцу бедра в дозе 5 мг на 100 г массы тела животного двукратно за 24 и 12 сут до однократного гипоксического воздействия. Эксперименты проведены на 20 животных.

При многократных воздействиях гипоксии на фоне введения нероболила крысам двукратно за 24 и 12 сут до декапитации вводили нероболил в дозе 5 мг на 100 г массы тела. Затем (после 2-й инъекции нероболила) животных подвергали многократным воздействиям гипобарической гипоксии по схеме, приведенной выше. В данной серии экспериментов использовано 7 животных.

В качестве дополнительной контрольной группы на введение нероболила использованы 8 крыс, которым препарат вводили в дозе 5 мг на 100 г массы тела двукратно за 24 и 12 сут до декапитации для оценки его действия на кору надпочечников при отсутствии гипоксических воздействий. Животных во всех экспериментальных группах выводили из опыта через 1 сутки после завершения манипуляций. Контрольных (интактных) крыс (12 животных) в каждой серии экспериментов декапитировали в те же сроки, что и опытных.

II. Общее перегревание организма. В эксперименте использованы 44 мышей-самцов линии СВА в возрасте 3 мес, массой тела 20 - 30 г. Животных помещали в термальную камеру при температуре 42 - 43 ⁰С на 35 мин. Контрольную группу составили 8 мышей. Забор материала для морфологического исследования производили через 30 мин, на 3-и, 7-е и 14-е сутки после общего перегревания.

III. Преждевременное старение организма, обусловленное генетически детерминированными метаболическими нарушениями. Сравнительный анализ возрастной структурной реорганизации коры надпочечника проведен у крыс двух линий - Вистар и OXYS. Линия OXYS получена путем отбора и инбридинга крыс линии Вистар, чувствительных к галактоземическому действию галактозы, с генетически детерминированным дефектом метаболизма (Соловьева Н.А. и др., 1975), выражающимся в повышенной чувствительности к окислительному стрессу и развивающимися с возрастом органопатиями (Салганик Р.И. и др., 1994; Лушникова Е.Л. и др., 1999; Колосова Н.Г. и др., 2002).

Изменения, наблюдаемые у животных, рассматриваются как синдром ускоренного старения, ключевым фактором патогенеза которого является прогрессирующее нарушение структуры и функции митохондрий (генетически детерминированные нарушения метаболизма) (Колосова Н.Г. и др., 2001).

В экспериментах использованы крысы Вистар и OXYS трех возрастных групп: 5 мес (массой 230 - 250 г), 14 мес (массой 420 - 600 г) и 26 мес (массой 330 - 450 г). Животные в возрасте 5 мес находились в фазе прогрессивного роста, в возрасте 14 мес - в фазе стабильного роста, в возрасте 26 мес - в фазе регрессивного роста.

Методы светооптического и электронно-микроскопического исследования. Из эксперимента животных выводили путем декапитации в первой половине дня. Затем производили вскрытие грудной и брюшной полостей и макроскопическое обследование органов.

Надпочечники отделяли от жировой капсулы, взвешивали и проводили визуальную оценку их состояния.

Кроме надпочечников, для гистологического исследования брали образцы сердца, легкого, печени, почек, селезенки. Правый надпочечник фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Левый надпочечник помещали в 4%-ный раствор параформальдегида. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином с постановкой реакции Перлса, суданом черным В (Меркулов Г.А., 1961, Елисеев В.Г., 1967), ставили PAS-реакцию. Аскорбиновую кислоту выявляли с помощью кислого раствора азотнокислого серебра (Пирс Э., 1962).

Светооптическое исследование и морфометрический анализ (измерение ширины коры надпочечника) проводили в универсальном микроскопе «Leica DM 4000B» (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры «Leica DFC 320» (Германия) и компьютерной программы «Leica QWin V3».

Для электронно-микроскопического исследования образцы левого надпочечника размерами не более 1 мм³, первоначально фиксированные в 4%-ном растворе параформальдегида, постфиксировали в 1%-ном растворе четырехокиси осмия в течение 2 ч.

После стандартной обработки образцы ткани заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие срезы получали на ультратомах Tesla и LKB-III. Полутонкие срезы окрашивали 1% раствором азура II и использовали для морфологического исследования, морфометрического и стереологического анализа. Ультратонкие срезы контрастировали в растворах уранилацетата и цитрата свинца, затем исследовали в электронном микроскопе JEM 1010 (фирмы «Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 40 кВ.

Методики количественного морфологического анализа. Морфометрический и стереологический анализ. Проведен тканевый стереологический анализ каждой зоны и морфометрическое измерение ширины коркового слоя надпочечников.

Тканевый стереологический анализ проводили на полутонких срезах. Анализировали неперекрывающиеся поля зрения при увеличении в 1320 раз с использованием хорошо разработанных методик (Автандилов Г.Г. и др. 1981; Непомнящих Л.М. и др., 1984; Weibel E.R., 1969), основанных на подсчете числа точек тестовой системы, попавших на профиль исследуемой структуры (Р_i), и числа пересечений тестовой линии с границами этой структуры (С_i). Для подсчетов применяли многоцелевую тестовую систему - решетку, состоящую из коротких отрезков, в которой отрезок тестовой линии является стороной ромба (n = 36, Р_т = 72, L_т = 282,0 мкм). Число наложений тестовой системы для каждой зоны надпочечника составляло 15 - 25 для каждого животного.

В качестве основных количественных показателей, характеризующих структурные перестройки надпочечника, были выбраны объемная (Vv) и поверхностная (Sv) плотности адренокортикоцитов, их ядер, капилляров, клеток соединительной ткани без их дифференциации, основного вещества и волокон соединительной ткани.

Объемную плотность стромы определяли путем сложения объемных плотностей капилляров, клеток, волокон и основного вещества соединительной ткани; объемную плотность паренхимы определяли путем сложения объемной плотности цитоплазмы и ядра адренокортикоцитов.

На основании первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные, описывающие количественные взаимоотношения между различными компонентами стромы и паренхимы: поверхностно-объемное отношение структур (Sv_i/Vv_i), объемное отношение стромы к паренхиме (Vv_стр/Vv_пар), отношение объема капилляров к объему адренокортикоцитов (Vv_син/Vv_адр), поверхностно-объемное отношение капилляров к адренокортикоцитам (Vv_син/Vv_адр) и ядерно-цитоплазматическое отношение (Vv_я/ Vv_цит).

Ультраструктурный стереологический анализ адренокортикоцитов проводили на негативах при конечном увеличении в 36 000 раз (первоначальное увеличение 12000 раз).

Оценивали объемную плотность митохондрий, липидных включений, цитоплазмы. Поверхностную плотность определяли для митохондрий, липидных включений. На основании первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные - объемные и поверхностно-объемные отношения основных ультраструктур. Число наложений тестовой системы для каждой зоны надпочечника для каждого животного составляло 30 - 40.

Методика определения численности популяции адренокортикоцитов. Для учета колебаний численности популяции адренокортикоцитов использовали метод щелочной диссоциации фиксированных тканей (Бродский В.Я. и др., 1983; Непомнящих Л.М. и др., 2003). После взвешивания надпочечники мышей целиком погружали в 10% раствор нейтрального формалина не менее чем на 10 сут, надпочечник крыс разрезали на 4 части.

Фиксированный образец помещали в 50% раствор KOH не более чем на 17 ч, затем образец промывали, в последней порции объемом 1 мл образец оставляли при комнатной температуре на 3 - 4 ч. Суспензию окрашивали 1 - 2 каплями 1% раствора азура-эозина и ею заполняли счетную камеру Фукса - Розенталя. Подсчет адренокортикоцитов производили в 5 последовательно заполняемых камерах, каждая из которых содержала два фиксированных по объему отдела. Концентрацию клеток определяли в десяти повторах.

Методика электрофизиологического исследования. Оценку электропроводности ткани надпочечника осуществляли с помощью стандартных электроимпедансометра «Тонус-2» и датчиковых устройств на низкой (10 кГц) и высокой (1 МГц) частотах. Величина тестирующего тока не влияла на физиологические свойства тканей и составляла 10 мкА (Осенний А.С. и др., 1993).

По результатам измерений рассчитывали коэффициент поляризации (Кп), равный отношению импедансов на низкой и высокой частотах. Активный электрод имел диаметр 60 мкм. Индифферентный электрод представлял собой диск площадью 100 мм² и толщиной 12 мм (Торнуев Ю.В. и др., 1990; Хачатрян А.П. и др., 1991). Осуществляли три последовательных измерения электропроводности с их последующим усреднением (Бородин Ю.А. и др., 1993).

Статистическая обработка результатов включала нахождение средних значений изучаемых параметров, вычисление дисперсии и ошибок средних. Математическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ MS Excel XP. Во всех случаях применяли методы дисперсионного и регрессионного анализа. Графики и диаграммы получены с привлечением компьютерных программ Microsoft Office Excel и Adobe Photoshop. Вопрос о значимости различий решался с помощью t-критерия Стьюдента. Значимыми считали различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Тканевая реорганизация надпочечника при экстремальных экологических воздействиях (гипоксии и общем перегревании) и преждевременном старении на фоне генетически детерминированных метаболических нарушений

Гипоксические воздействия. Однократное воздействие гипоксии не приводило к изменениям массометрических показателей у крыс Вистар. Многократное пребывание в условиях гипобарической гипоксии не вызывало изменения массы тела экспериментальных животных, но масса надпочечников достоверно возрастала на 12% (p<0,05), приводя к увеличению их относительной массы на 11% (p<0,05). Введение нероболила не вызывало изменения массы тела и надпочечников. Введение нероболила с последующими гипоксическими воздействиями сопровождалось значительным анаболическим эффектом: масса тела животных после однократного и многократных гипоксических воздействий по сравнению с контролем возрастала на 7 - 8% (p<0,05). Масса надпочечников при однократном воздействии с предварительным введением нероболила не изменялась по сравнению с контролем, обусловливая снижение относительной массы надпочечников на 9% (p<0,05). После многократных гипоксических воздействий на фоне введения нероболила масса надпочечников возрастала на 8% (p<0,05), что обусловило сохранение относительной массы надпочечников.

Однократное гипоксическое воздействие вызывало достоверное уменьшение ширины коры надпочечников на 21% (p<0,05), в то время как после многократных гипоксических воздействий происходило увеличение этого показателя на 26% (p<0,05). Введение нероболила обусловило снижение ширины коры надпочечников на 15% (p<0,05). После однократного гипоксического воздействия на фоне введения нероболила наблюдалось снижение этого показателя на 20% (p<0,05), тогда как после многократных гипоксических воздействий на фоне введения нероболила этот показатель практически не отличался от контроля.

Гипоксические воздействия вызывали значительные изменения ширины зон коры надпочечника и их размерных соотношений. Наиболее значительно изменялись размерные характеристики клубочковой зоны и камбиального (суданофобного) слоя. При однократных и многократных гипоксических воздействиях и введении нероболила происходило существенное уменьшение ширины клубочковой зоны (на 37 - 47%). Ширина камбиального слоя, который состоял из мелких адренокортикоцитов с полиморфными и, как правило, гиперхромными ядрами, значительно возрастала после многократных гипоксических воздействий (на 114%), в том числе и на фоне введения нероболила (на 133%), а также после введения только нероболила (на 83%). Эти данные свидетельствуют о том, что многократные стрессирующие воздействия и введение анаболического стероида стимулируют гиперпластические реакции адренокортикоцитов. Ширина пучковой зоны возрастала (на 38%) только при многократных гипоксических воздействиях, после однократного гипоксического воздействия этот показатель уменьшался без введения нероболила на 38%, на фоне введения - на 23%, после введения только нероболила - на 26%, после многократных гипоксических воздействий на фоне нероболила - на 30%. Значительно возрастала при стрессируюших воздействиях ширина сетчатой зоны: после однократной гипоксии - на 31%, после многократных гипоксических воздействий - на 24%, после введения нероболила - на 19%, после многократных гипоксических воздействий на фоне введения нероболила - на 62%. Этот показатель не изменялся только после однократного гипоксического воздействия на фоне предварительного введения нероболила.

Описанные выше изменения обусловили изменения соотношения ширины зон коры надпочечника в ряду «клубочковая : пучковая : сетчатая». В контрольной группе это соотношение составил 1 : 4 : 1,6, после однократной гипоксии - 1 : 3,8 : 3, после многократных гипоксических воздействий - 1 : 7 : 2,5, после ведения нероболила - 1 : 4 : 2,6, после однократного гипоксического воздействия на фоне введения нероболила - 1 : 4,7 : 2,4, после многократных гипоксических воздействий на фоне введения нероболила - 1 : 3 : 3. Значительное увеличение ширины пучковой зоны при многократных гипоксических воздействиях отражает степень напряжения организма при развитии стресс-реакции и усиление синтеза глюкокортикоидов. При этом введение нероболила сопряжено с уменьшением ширины пучковой зоны, особенно в сочетании с многократными гипоксическими воздействиями. Эти изменения позволяют предположить, что нероболил обладает сходными с глюкокортикоидами свойствами и, как следствие, обусловливает снижение их секреции при стресс-реакции. Увеличение ширины сетчатой зоны после однократного и многократных стрессирующих воздействий свидетельствует о важной роли вырабатываемых ею гормонов (прежде всего, дигидроэпиандростерона) в реализации общего адаптационного синдрома. Важно отметить, что при стрессирующих воздействиях и введении нероболила значительно уменьшалась ширина клубочковой зоны, что, вероятно, связано с угнетением соответствующей дифференцировки камбиальных клеток.

По данным светооптического исследования, после однократного гипоксического воздействия общий план строения коры надпочечника был изменен в результате выраженного полнокровия капилляров пучковой и особенно сетчатой зон, что придавало им ячеистый вид. Клетки камбиального слоя не содержали липидных включений и образовывали небольшие тяжи, которые чаще всего вдавались как в пучковую, так и клубочковую зоны. В пучковой зоне отчетливо различались наружная и внутренняя субзоны. Адренокортикоциты наружной субзоны содержали небольшое количество мелких липидных включений. Во внутренней субзоне основная популяция адренокортикоцитов была представлена «светлыми» клетками, «темные» клетки были единичными. В ряде случаев происходило «жировое» перерождение клеток - формирование слоистых липидных масс, занимавших практически весь объем клеток. Гетерогенность адренокортикоцитов сетчатой зоны была более выраженной, чем в пучковой зоне. В клетках практически не регистрировались липидные включения; размеры клеток значительно варьировали, возрастало количество мелких клеток, особенно вблизи мозгового вещества. Аскорбиновая кислота в адренокортикоцитах пучковой и сетчатой зон не выявлялась, что отражало усиление синтеза стероидных гормонов (Артишевский А.А., 1977). В сетчатой зоне капилляры были значительно расширены, заполнены, в основном, плазмой. В строме часто встречались многочисленные макрофаги, цитоплазма которых была заполнена большим количеством осмиофильных липидных включений. Появление таких форм макрофагов свидетельствовало об усилении гибели и резорбции адренокортикоцитов в сетчатой зоне.

После многократных гипоксических воздействий архитектоника клубочковой зоны существенно не изменялась, часть липидных включений положительно окрашивалась суданом черным В. Наблюдалось значительное расширение камбиального слоя, вызванное пролиферацией камбиальных клеток. В пучковой зоне различались две субзоны, которые дифференцировались по характеру липидных включений. В наружной субзоне адренокортикоциты содержали суданофильные включения, число которых значительно уменьшалось по сравнению с интактными животными. В адренокортикоцитах внутренней субзоны липидные включения встречались крайне редко, но регистрировались оптически «пустые» везикулярные структуры. «Темные» клетки практически отсутствовали, аскорбиновая кислота не выявлялась. Следует отметить, что в пучковой зоне у животных этой группы встречались очаги некроза адренокортикоцитов. В адренокортикоцитах сетчатой зоны содержались единичные суданофильные включения, которые иногда сливались в огромные вакуоли. Капилляры пучковой и сетчатой зон были полнокровными, а в сетчатой зоне - заметно расширенными; некоторые были обтурированы липидными массами.

Введение нероболила не изменяло существенно общий план строения коры надпочечников. Отмечалось увеличение камбиального слоя, клетки которого иногда образовывали небольшие выросты в направлении пучковой зоны. В пучковой зоне хорошо различались две субзоны: адренокортикоциты наружной субзоны содержали большое количество преимущественно суданофильных, а внутренней - суданофобных липидных включений. Во внутренней субзоне регистрировались отдельные «темные» клетки. Адренокортикоциты сетчатой зоны содержали незначительное количество липосом, отличались полиморфизмом. В этой зоне часто встречались двуядерные или только что разделившиеся клетки. Отмечались стаз и выраженное диффузное полнокровие капилляров. Следует отметить, что некоторые капилляры были обтурированы липидными конгломератами.

После однократного гипоксического воздействия на фоне введения нероболила архитектоника всех зон коры надпочечника существенно не отличалась от контроля. Клетки камбиального слоя образовывали лентовидные скопления на границе между клубочковой и пучковой зонами. В наружной пучковой субзоне адренокортикоциты содержали большое количество липосом, отличались мономорфностью; «темные» клетки практически не встречались. Следует отметить появление двуядерных адренокортикоцитов. Во внутренней субзоне количество липидных включений в адренокортикоцитах было уменьшено. Капилляры в этой зоне были умеренно полнокровными. Адренокортикоциты сетчатой зоны сохраняли структурно-функциональную гетерогенность (по содержанию липосом), которая была менее выражена, чем при однократном гипоксическом воздействии без воздействия нероболила. Часто встречались двуядерные и недавно разделившиеся клетки. В строме сетчатой зоны присутствовало большое количество макрофагов, содержавших большое количество осмиофильных липидных включений. В этой зоне регистрировалось выраженное полнокровие капилляров, часто стаз крови; некоторые капилляры были заполнены липидными массами.

После многократных гипоксических воздействий на фоне введения нероболила отмечалось значительное увеличение камбиального слоя. Образовывавшие его мелкие адренокортикоциты часто формировали выросты по направлению к пучковой зоне. Наружная пучковая субзона характеризовалась выраженным клеточным полиморфизмом. Практически все адренокортикоциты содержали множественные липосомы, часто липосомы сливались, образуя вакуоли, занимавшие большую часть клетки. Часто встречались двуядерные клетки. Адренокортикоциты внутренней субзоны содержали мелкие, оптически прозрачные везикулы. Отмечалось умеренное полнокровие капилляров. В сетчатой зоне была выражена гетерогенность клеточного пула. Число липидных включений в клетках было в основном незначительным, возрастало количество мелких клеток с гиперхромными ядрами. Появлялись двуядерные клетки. Наблюдалось выраженное полнокровие капилляров (многие были заполнены плазмой), в части из которых отмечались скопления липидных масс.

Морфологические изменения, выявленные после воздействия гипоксии, - уменьшение липидных включений и аскорбиновой кислоты, усиление гетерогенности клеточного пула и выраженное полнокровие капилляров - являются структурным эквивалентом усиления продукции кортикостероидов и их секреции в условиях стресс-реакции (Юдаев Н.А., 1976; Артишевский А.А. 1977; Виноградов В.В., 1998). При этом гиперемия рассматривается некоторыми авторами как проявление повышенной секреции кортикостероидов (Козлов В.И., Пугачев М.К., 1990). Выявленный комплекс морфологических изменений отмечался как после одно-, так и многократных воздействий, что свидетельствует о длительном сохранении состояния напряжения и гиперфункции адреналовой железы. Гипоксические воздействия вызывают также гибель адренокортикоцитов и их элиминацию, наиболее выраженные при обоих режимах гипоксии в клубочковой зоне. При однократном гипоксическом воздействии эти процессы обусловливают атрофию коры надпочечников, которая манифестирует даже при предварительном введении анаболического стероида нероболила. При многократных гипоксических воздействиях происходила гипертрофия коры надпочечников, обусловленная индукцией регенераторных реакций адренокортикоцитов на клеточном уровне, морфологическими критериями этих процессов являются не только увеличение ширины коры (за счет пучковой и сетчатой зон), но и выраженное увеличение камбиального слоя, появление двуядерных клеток как в пучковой, так и в сетчатой зонах. Предварительное введение нероболила способствует сохранению ширины коры надпочечников на уровне контрольных значений, но вызывает значительные изменения в соотношении ширины ее зон.

Изменения пространственной реорганизации тканевого микрорайона адреналовой железы при разных режимах гипоксических воздействий, в том числе и с предварительным введением нероболила, носили как стереотипный, так и разнонаправленный характер. После однократного гипоксического воздействия происходило достоверное уменьшение объемной плотности (на 9%, p<0,05) и увеличение поверхностной плотности (на 15%, p<0,05) адренокортикоцитов пучковой зоны, а после многократных гипоксических воздействий отмечена тенденция к увеличению поверхностной плотности адренокортикоцитов. Это вызывало увеличение поверхностно-объемного отношения адренокортикоцитов после обоих режимов воздействий (на 23 и 15%), что свидетельствовало об уменьшении размеров клеток. При обоих видах гипоксических воздействий в пучковой зоне отмечено увеличение объемной плотности ядер адренокортикоцитов, а также ядерно-цитоплазматического отношения (на 48 и 36%, p<0,05).

Объемная и поверхностная плотности капилляров в пучковой зоне после однократного гипоксического воздействия возрастали непропорционально (соответственно на 104 и 31%), что обусловливало снижение поверхностно-объемного отношения капилляров (на 37%, p<0,05) и отражало увеличение их размеров в результате полнокровия. После многократных гипоксических воздействий эти показатели не отличались от контроля.

После однократного гипоксического воздействия в пучковой зоне возрастала объемная плотность компонентов соединительной ткани (на 49%, p<0,05), в основном за счет присутствовавших там макрофагов. В результате разнонаправленных изменений объемной плотности адренокортикоцитов и компонентов соединительной ткани происходило увеличение (на 108%, p<0,05) объемного отношения стромы к паренхиме, тогда как после многократных воздействий гипоксии это соотношение не изменялось. Следует отметить, что такое выраженное увеличение объемного отношения стромы к паренхиме было обусловлено в основном значительным увеличением объемной плотности капилляров.

В сетчатой зоне однократное гипоксическое воздействие также вызывало снижение (на 15%, p<0,05) объемной плотности адренокортикоцитов. При многократных гипоксических воздействиях этот показатель не изменялся, но происходило увеличение (на 14%, p<0,05) поверхностной плотности адренокортикоцитов. Это обусловило увеличение (на 14%, p<0,05) их поверхностно-объемного отношения и свидетельствовало об уменьшении размеров клеток. Объемная плотность ядер адренокортикоцитов сетчатой зоны практически не изменялась при обоих режимах воздействия, в то время как поверхностная плотность достоверно уменьшалась (на 21%, p<0,05) после однократной гипоксии.

В сетчатой зоне после однократного гипоксического воздействия также возрастали объемная (на 114%) и поверхностная (на 56%) плотности капилляров. После многократных гипоксических воздействий на фоне незначительного снижения объемной плотности капилляров отмечалось увеличение (на 35%, p<0,05) их поверхностной плотности, что способствовало увеличению их поверхностно-объемного отношения на 45% (p<0,05). Поверхностно-объемное отношение капилляров к адренокортикоцитам было увеличено при обоих режимах гипоксии (на 78 и 32%, p<0,05) (рис. 1), а объемное отношение стромы к паренхиме было увеличено (на 145%, p<0,05) только после однократной гипоксии (рис. 2).

Рис. 1. Поверхностно-объемное отношение капилляров к адренокортикоцитам в коре надпочечников крыс Вистар после гипоксических воздействий и введения нероболила. * - p<0,05 по сравнению с контролем; + - p<0,05 по сравнению с введением нероболила.

Введение нероболила не вызывало заметных изменений объемных и поверхностных характеристик основных тканевых компонентов как в пучковой, так и в сетчатой зонах. Исключение составили поверхностно-объемные отношения ядер адренокортикоцитов и капилляров к адренокортикоцитам в пучковой зоне (уменьшение на 12 и 57%, p<0,05).

После однократного и многократных гипоксических воздействий на фоне введения нероболила в пучковой зоне объемная плотность адренокортикоцитов достоверно снижалась как по отношению к контролю, так и по отношению к группе только с введением нероболила. Поверхностная плотность существенно не изменялась, что обусловливало увеличение их поверхностно-объемного отношения (на 19%, p<0,05 по сравнению с контролем) после однократного воздействия. После многократных гипоксических воздействий на фоне введения нероболила возрастала объемная плотность ядер адренокортикоцитов (на 41%, p<0,05) и ядерно-цитоплазматическое отношение (на 52%, p<0,05) как по отношению к контролю, так и введению нероболила.

Рис. 2. Объемное отношение стромы к паренхиме в коре надпочечников крыс Вистар после гипоксических воздействий и введения нероболила. * - p<0,05 по сравнению с контролем; + - p<0,05 по сравнению с введением нероболила.

После обоих видов гипоксических воздействий на фоне введения нероболила возрастала объемная плотность капилляров (на 91 и 84%, p<0,05 по сравнению с контролем, и на 177 и 176%, p<0,05 по сравнению с введением нероболила). В результате разнонаправленных изменений объемной плотности адренокортикоцитов и компонентов стромы в пучковой зоне происходило увеличение объемного отношения стромы к паренхиме: после однократного воздействия гипоксии - на 93,8 и 157% соответственно по отношению к контролю и введению нероболила (p<0,05), после многократной гипоксии - соответственно на 73,8 и 130,6% (p<0,05).

В сетчатой зоне после однократного гипоксического воздействия на фоне введения нероболила уменьшались объемная плотность адренокортикоцитов (на 15%) и объемная и поверхностная плотности ядер адренокортикоцитов (соответственно на 51 и 59%). Увеличение поверхностно-объемного отношения адренокортикоцитов и достоверное снижение ядерно-цитоплазматического отношения отмечалось при обоих режимах гипоксического воздействия. Однократное гипоксическое воздействие на фоне введения нероболила сопровождалось значительным увеличением (на 156%, p<0,01) объемной плотности капилляров. Выявлено также увеличение поверхностно-объемного отношения капилляров к адренокортикоцитам при обоих режимах воздействия (соответственно на 73 и 45%, p<0,05). Объемное отношение стромы к паренхиме возрастало только после однократного гипоксического воздействия (соответственно на 202 и 150%, p<0,05, при сравнении с группой контроля и введением нероболила).