Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

НОВЫЕ БАКТЕРИОЦИНЫ ЛАКТОКОККОВ И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Специальности 03.00.07 - микробиология, 03.00.23 - биотехнология

Стоянова Лидия Григорьевна

Москва - 2008

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Антимикробный эффект молочнокислых бактерий человечество использовало в той или иной форме в течение столетий для продления срока годности пищевых продуктов за счет образования молочной кислоты с сопутствующим понижением рН, а также биологически активных веществ, обладающих бактерицидным действием на специфические группы микроорганизмов, включая и патогенные формы. Ведущее место в объяснении явления антагонизма молочнокислых бактерий отводится специфическим антибиотическим веществам белковой природы - бактериоцинам. Бактериоцины - это гетерогенные антибактериальные комплексы, разнообразные по уровню активности, спектру и механизму действия, молекулярной массе, физико-химическим свойствам, но основной биологически активной частью всех бактериоцинов является белковый компонент (Блинкова и др.,1984; 2004; Егоров и др.,1999; Nes et al., 2007). Считают, что бактериоциногения - явление, закономерное практически для всех видов бактерий. Говоря об экологическом значении бактериоцинов, необходимо отметить, что синтез этих веществ выполняет главную роль в конкуренции внутри популяции.

Интерес к использованию бактериоцинов, образуемых лактококками, резко возрос. Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья, поскольку широко используемые химические консерванты и некоторые антибиотики, увеличивающие срок хранения продуктов питания, вызывают опасения. Наиболее изученным и разрешенным для применения в качестве биологического консерванта является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков с 1998 года имеющий «GRAS» (Generally Recognized As Safe) cтатус, т.е. признанный Европейским парламентом как безопасный. Экспертный комитет по пищевым добавкам FAO/WHO (Пищевая и Сельскохозяйственная Организация ООН / Всемирная Организация Здравоохранения) рекомендовал использование низина в качестве консерванта для пищевых продуктов (код Е234). Низин не является чужеродным веществом для пищеварительного тракта человека, поскольку низинобразующие лактококки выделяют из слизистой носоглотки, а также кала животных и людей. Установлено, что низинобразующие штаммы имеют функцию поддержания экологического равновесия группы молочнокислых бактерий кишечного тракта. Являясь низкомолекулярным белком, низин легко переваривается, не оказывая влияния на микробиоту желудочно-кишечного тракта, не токсичен (Ross et al., 1999; Nete et al., 2006). Описаны несколько форм низинов (A, B, C, D, E, Z, R, Q) и родственных им лактицинов, отличающихся между собой по ряду физико-химических свойств, аминокислотному составу и спектру антибактериального действия, продуцентами которых являются разные штаммы одного подвида Lactococcus lactis subsp. lactis. Однако активность описанных природных продуцентов низкая (от 579 до 1886 МЕ/мл) и антимикробный спектр действия низина распространяется, в основном, на грамположительные бактерии (Franz et al., 1997; Buyong et al.; 1998, Janes, 1999; Lee and Paik, 2001; Zendo et al., 2003; Yildirim et al., 2004; Porgtharaqkui and Demirci, 2006).

Синтез бактериоцинов - наследственная особенность микроорганизмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ. В большинстве популяции лактококков синтез бактериоцинов можно индуцировать генно-инженерными методами, различными физико-химическими воздействиями: ультрафиолетовыми лучами, мутагенами химической природы, ДНК-тропными веществами, перекисями и другими агентами. Разработка методов селекции продуцентов низина началась еще в 70-ые годы ХХ-го века, но, к сожалению, была приостановлена. Вследствие этого в настоящее время имеются немногочисленные данные по этому вопросу.

Сегодня известны два основных производителя низина. Фирма «Aplin & Barrett, Ltd» (Beaminster, Dorset, UK) производит продукт «Низаплин», а «Chr. Hansen A/S» (Hoersholm, DK) выпускает «Кризин». Препараты обеих компаний имеют очень схожие характеристики, содержат 2,5% активного компонента, который переводится на антимикробную активность как 1х10⁶ МЕ/г. Получают их путем ферментации с помощью селекционного штамма Lactococcus lactis subsp. lactis (Breukink, de Kruijff, 1999).

В настоящее время учёные многих лабораторий мира изучают пути и способы направленного синтеза бактериоцинов для создания биологическим путем различных модификаций уже известных бактериоцинов, но с более ценными свойствами или же пытаются получить новые природные сбалансированные бактериоциногенные комплексы, безопасные для использования в качестве биоконсервантов. Возможность конструирования новых антимикробных аналогов (бактериоцинов) в перспективе может оказаться главным методом борьбы с антибиотикоустойчивыми патогенными бактериями. Особый научный интерес представляют молочнокислые стрептококки серологической группы N, которые по систематическому положению недавно выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «GRAS», куда отнесены микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных. Поэтому лактококки, как и их бактериоцины, могут быть использованы в качестве природных биологических консервантов.

Завышенное потребление теплоэнергоресурсов и потери продукции до 30% при транспортировке, переработке и хранении являются актуальными проблемами Агропромышленного комплекса РФ. Экономический эффект от использования низина в консервной промышленности велик и обусловлен сокращением продолжительности стерилизации продуктов и увеличением сроков их реализации: на 15-25 % снижаются теплоэнергозатраты, сохраняются биологическая и пищевая ценность продукта питания, продлеваются сроки хранения (Кудряшов и др., 1995). Создание технологии производства бактериоцинов в России позволит отказаться от закупки дорогостоящих препаратов, а использование высокоактивного продуцента определит рентабельноть производства бактериоцинов.

Цель и задачи исследования.

Цель исследований состояла в получении новых высокоэффективных бактериоцинов, образуемых лактококками Lactococcus lactis subsp. lactis, для практического использования в качестве биологических консервантов.

Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

скрининг природных бактериоцинобразующих штаммов лактококков из естественной среды обитания молочнокислых бактерий, какой является коровье и кобылье молоко, кисломолочные продукты лечебно-профилактического назначения разных территориальных зон, идентификация перспективных штаммов;

получение активных продуцентов бактериоцинов с использованием методов клеточной инженерии (протопластирования, слияния протопластов) и индуцированного мутагенеза;

на основе высокопродуктивных бактериоцинобразующих штаммов оптимизировать процесс синтеза бактериоцинов;

разработать методы выделения, очистки и идентификации новых бактериоцинов;

показать возможность практического использования бактериоцинобразующих лактококков и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов.

Научная новизна работы.

Впервые проведен скрининг бактериоцинобразующих штаммов мезофильных лактококков из лечебно-профилактических национальных продуктов смешанного молочнокислого и спиртового брожений курунги (Бурятия), Doogh (Иран), также из коровьего и кобыльего молока разных территориальных зон. Выделены новые высокоактивные бактериоцинобразующие природные штаммы: из свежего коровьего молока Московской области - штамм 119х с низинсинтезирующей активностью 3700 МЕ/мл (а.с. № I55I744), из Бурятии - штамм 194 с активностью 3600 МЕ/мл широкого спектра бактерицидного и фунгицидного действия, что является неизвестным свойством для лактококков этого вида. Выделенные штаммы идентифицированы как Lactococcus lactis subsp. lactis.

Разработана новая методика получения протопластов у бактериоцинобразующих лактококков, подобраны стабилизирующие буферные системы для регенерации протопластов, изучено влияние протопластирования на физиолого-биохимические свойства лактококков, в том числе и на синтез бактериоцинов. Установлено, что протопластирование, реверсия протопластов к клеточной форме и слияние протопластов лактококков могут служить методами селекции активных форм. Получены продуценты, в 10 - 14 раз превышающие активность родительских штаммов (а.с. № 1687616, серебряная медаль ВДНХ).

Оптимизирован синтез бактериоцинов компонентным составом среды за счет снижения содержания фосфата, замены углеводного компонента, внесения аминокислот и рН-статирования.

Разработана схема выделения и очистки новых бактериоцинов, синтезируемых перспективными штаммами L. lactis subsp. lactis разного происхождения. Получены и изучены их индивидуальные компоненты в хроматографически чистом виде. Установлено, что бактериоцины, синтезируемые гибридным штаммом F-116 и оригинальным природным штаммом 194, не имеют аналогов в компьютерной базе данных природных биологически-активных веществ BNPD (“Bioactive Natural Product Database”, Вerdy, Hungary).

Практическая значимость работы.

Выделены и идентифицированы новые природные перспективные бактериоцинобразующие штаммы мезофильных лактококков Lactococcus lactis. subsp. lactis, пополнившие коллекцию лактококков - активных продуцентов низина и новых бактериоцинов, обладающих уникальным для бактерий этого вида фунгицидным действием. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК природных новых бактериоцинобразующих штаммов депонированы в базу данных GenBank.

Использование в качестве ферментационных субстратов для получения бактериоцинов отходов ряда биотехнологических производств представляет реальную возможность решения проблемы защиты окружающей среды при одновременном удешевлении технологического процесса.

Изучена диссоциация продуцентов, что облегчает отбор активных вариантов при использовании штаммов в промышленном производстве бактериоцинов.

Разработана технология получения нового препарата ЛГС, синтезируемого гибридным штаммом F-116, обладающего широким спектром антимикробного действия, включая патогенные и условно-патогенные формы, развивающиеся в продуктах питания при хранении, что позволяет рекомендовать его в качестве биологического консерванта (Акт опытно-промышленных испытаний от 19.09.2007г.).

Разработаны лабораторные регламенты на процесс синтеза бактериоцинов природным штаммом L. lactis subsp. lactis 194 как биологического консерванта фунгицидного действия для производства сырокопченных колбас (Акт испытаний от 16.06. 2006 г.).

Результаты исследований вошли в учебники для студентов вузов, подготовленные в соавторстве с сотрудниками кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова. Разработаны курсы лекций и практических занятий для подготовки специалистов в Биотехнологическом центре МГУ: «Актуальные проблемы микробиологии», «Бактериоцины молочнокислых бактерий» и др.

Работа с 1985 года была поддержана постановлениями Совмина СССР, ГКНТ, Правительства Москвы, Международной Правительственной программой между СССР и Индией, межвузовской программой «Биотехнология в российских вузах», грантами РФФИ 98-04-49822 и 01-04-48661 «Управление процессами биосинтеза биологически активных веществ микроорганизмами», ФЦАТП N 60123.01.02 по фундаментальным и поисковым исследованиям и разработкам Минпромнауки России «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2004 годы»; блок 2 «Проектно-прикладные исследования».

Положения, выносимые на защиту.

Выделение и идентификация новых бактериоцинобразующих штаммов Lactococcus lactis из молока, молочных продуктов и национальных кисломолочных напитков лечебно-профилактического назначения разных территориальных зон.

Селекция активных бактериоцинобразующих штаммов с помощью метода клеточной инженерии (слияния протопластов) и индуцированного мутагенеза (с использованием ультрафиолетовых лучей и супермутагенов химической природы).

Оптимизация синтеза бактериоцинов компонентным составом ферментационной среды и стабилизацией рН в процессе ферментации. Использование в качестве ферментационных субстратов для получения низина отходов ряда биохимических производств.

Разработка способа выделения эффективных бактериоцинов из культуральной жидкости, идентификация новых антибиотических комплексов.

Практическое использование перспективных бактериоцинобразующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов.

Личный вклад соискателя.

Соискателю принадлежит определяющая роль в выборе направления исследований, постановке цели и задач для ее выполнения, разработке схем проведения экспериментов на всех этапах исследований, анализе и обобщении результатов. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель лично принимала участие в экспериментах, интерпретации полученных результатов, подготовке научных публикаций, выступала с докладами на конференциях и международных симпозиумах.

Апробация результатов.

Результаты диссертационной работы были представлены и доложены на различных конференциях и международных конгрессах. Сделано 45 докладов, в том числе на: ХVI World's Poultry Science Congress, Brasilia, I978; VI съезде Всесоюзного микробиологического общества, Рига, 1980; Всесоюзной конференции «Создание химико-фармацевтических препаратов биотехнологическими методами», Москва, 1985; VП съездe ВМО «Достижения микробиологии - практике», Алма-Ата, 1983; конференции «МГУ-Главмикробиопрому», 1985; Всесоюзных конференциях: «Биосинтез ферментов микроорганизмами», Кобулети, 1986; «Биосинтез вторичных метаболитов», Пущино 1987; «Разработка и применение антибиотиков немедицинского происхождения», Москва, 1987; «Микроорганизмы - ингибиторы и стимуляторы роста животных и растений», Ташкент, 1989; Second International Symposium on Overproduction of microbial products. Сzechoslovakia, 1988; I-st International Symposium of Chiral Molecules, Paris, France, 1988; International Conference “Biotechnology and Food», Stuttgart, 1989; The Forth and Fifth Symposium of Lactic Аcid Bacteria, The Netherlands, I993, 1996; The 2-nd Workship оn Lantibiotics, The Netherlands, 1994; Международной конференции «Прикладная биотехнология на пороге ХХI века», Москва, 1995; Международная научно-техническая конференция «Пища. Экология. Человек», Москва, 1995; XIX-ом Международном симпозиуме ICFMH - FOOD MICRO, Slovenia, 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов», М., 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием “Автотрофные микроорганизмы” памяти академика РАН Е. Н. Кондратьевой, М., 2005; 10-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённая 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна, 2006, Москва-Пущино; Научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий». Углич. 2007; The International scientific and practical conference Biotechology. Water and food stuffs. Moscow. 2008.

Публикации.

По материалу диссертации опубликовано 100 печатных работ, в том числе 6 обзоров и разделы в 2-х монографиях, 34 статьи, 45 тезисов, 5 авторских свидетельств, заявка на патент, 6 нормативных документов.

Соискатель награждена 3 медалями ВДНХ «За достигнутые успехи в развитии народного хозяйства СССР»:

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I) и заключения по литературному обзору, экспериментальной части, которая включает материалы и методы (глава II), результаты и их обсуждения (глава III), заключения, выводов, списка литературы (430 наименований, из них 279 иностранные публикации) и 10 приложений, которые включают: методику определения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК; заключения о результатах определения патогенных свойств штаммов лактококков: акты опытно-промышленных испытаний, лабораторные регламенты на синтез бактериоцинов Lactococcus lactis subsp. lactis штаммами F-116 и 194.

2. Содержание работы

Обзор литературы. (глава I) включает 5 разделов, содержащие описание: характеристики лактококков (раздел 1), современное состояние вопроса по свойствам, структуре, классификации, биосинтезу и механизму действия бактериоцинов (раздел 2), селекции продуцентов бактериоцинов, включая использование естественного отбора ценных форм, искусственного отбора методом клеточной инженерии (слияние протопластов) и индуцированного мутагенеза (раздел 3), хранения продуцентов (раздел 4), применения молочнокислых бактерий и их бактериоцинов в качестве биологических консервантов (раздел 5) и заключение.

3. Экспериментальная часть

Объекты и методы исследования

В работе использовали сырое коровье молоко без консервантов молочных комбинатов г. Москвы, Клина (Московская область), г. Улан-Удэ (Бурятии), Ирана, кобылье молоко из Башкирии и национальные кисломолочные напитки: курунга из Бурятии, кумыс из Башкирии и «Doogh» из Ирана.

Выделение бактериоцинобразующих лактококков проводили поэтапно.

Для выделения мезофильных лактококков из курунги, кумыса и «Dough» 5 % испытуемого материала высевали в жидкую среду МРС (HiМedia, India), используемую для культивирования молочнокислых бактерий и параллельно делали высев на среду Сабуро для выращивания дрожжей, содержащую (г/л): глюкоза -- 40,0; пептон -- 10,0; агар -- 18,0; левомицетин -- 0,001 (Стоянова и др., 2006).

Мезофильные лактококки выращивали на агаровых средах в течение 3 - 4 суток и отделяли от других молочнокислых бактерий по виду колоний на чашке Петри и при микроскопировании препаратов. Для выделения активных низинобразующих штаммов L. lactis subsp. lactis с помощью стерильного репликатора проводили высев кислотообразующих колоний с поверхности агаровой среды, приготовленной на основе гидролизата молока с индикатором, на газон с тест-культурой Bacillus coagulans 429 и параллельно высевали на твердую среду вышеуказанного состава без тест-культуры. Отбирали клоны, образующие наибольшую зону задержки роста.

Для микроскопических исследований морфологии молочнокислых бактерий, выросших в молоке или молочных продуктах, готовили фиксированные препараты. Фиксированный препарат рекомендуется окрашивать метиленовым синим в течение 2-3-х мин, поскольку именно этот краситель слабо окрашивает основной фон препарата (казеин молока) и хорошо прокрашивает клетки, что обеспечивает четкость препарата (Стоянова, 2005).

Морфологию изучаемых штаммов и микробиоты курунги, кумыса и иранского напитка «Doogh» изучали традиционными методами с помощью микроскопа МБИ-15 с фазово-контрастным конденсором КФ-4, а также проводили их электронно-микроскопическое исследование с помощью сканирующего электронного микроскопа “Can Scan”фирмы «Gresham» (Англия). Препараты фиксировали 5%-ным раствором глутарового альдегида в ацетат-вероналовом буфере в течение 1 ч, обезвоживали спиртом увеличивающейся концентрации (10° -- 100°) с экспозицией 30 мин при каждой концентрации и выдерживали в амилацетате в течение 1 ч (Герхард, 1984; Стоянова, Егоров, 1988).

Идентификацию бактерий проводили, руководствуясь перечнем культуральных и физиолого-биохимических признаков (Хоул и др., 1997; Степаненко, 2006). Физиолого-биохимические свойства наиболее активных по бактериоцинобразующей активности выделенных штаммов лактококков оценивали по потреблению углеводов, потребности в факторах роста, уровню их ингибиторной активности, спектру действия. При изучении ферментативной активности был использован ряд углеводов, включающий сахара, сахароспирты, полисахариды. Потребность выделенных штаммов в факторах роста изучали по влиянию 20-ти аминокислот, 5 витаминов, пуриновых и пиримидиновых оснований, способных включаться в метаболизм лактококков. Методом дробного исключения определяли один или группу факторов, необходимых для роста (Герхард, 1984; Стоянова, Егоров, 1999). Количество молочной кислоты определяли методом титрования, а качественную реакцию на молочную кислоту проводили по реакции «серебряного зеркала» (Инихов, Брио, 1971; Стоянова, 2005).

Бактериоцинсинтезирующую активность молочнокислых бактерий определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культуры Bacillus coagulans 429 в мм. В качестве стандарта на грамположительные бактерии использовали коммерческий препарат низина «Nisaplin» (фирма “Aplin & Barrett, Ltd”, Великобритания) с активностью 1х10⁶ МЕ/г; на грамотрицательные бактерии -- левомицетин, с активностью 100 мкг/мл (ЗАО «Биофарм Право-Альфа», Россия); на грибы и дрожжи -- нистатин (ОАО «Биосинтез» с активностью 100000 ед./г). Для титрования бактериоцина использовали суспензию 17-часовой культуры бактерий, которыми засевали среду, приготовленную на фосфатном буфере с рН 5,5 (Стоянова и др., 1996).

При изучении спектра ингибирующего действия штаммов лактококков в качестве тест-культур использовали 5 штаммов грамположительных бактерий: Micrococcus luteus 128, M flavus 45, Bacillus mycoides 32, B.subtilis 2, B.coagulans 429, Staphylococcus aureus 144; 5 штаммов грамотрицательных бактерий: Alcaligenes faecalis 82, Escherichia coli 52; Pseudomonas aeruginosa 21, P.fluorescens 19, Proteus vulgaris 206; а также пять штаммов микроскопических грибов, включая дрожжи: Aspergillus niger 369, Penicillium chrysogenum 32, Fusarium oxysporum 9, Candida guilliermondii 217, Rhodotorula aurantiaca 226 (Стоянова, Аркадьева, 2000). Штаммы были получены из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Чувствительность к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с использованием дисков. Был испытан ряд антибиотиков, ингибирующих синтез белка: тетрациклин, левомицетин, сизомицин, стрептомицин, доксициклин, олеандомицин, неомицин, ампициллин, канамицин, рифампицин; и синтез клеточной стенки: бензилпенициллин, карбенициллин, метициллин, ристомицин, цефалексин, цефалотин, низин (Галкина, 1984, Егоров, 2005).

Таксономическое положение выделенных штаммов лактококков подтверждали методом генотипирования, основанном на анализе сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (Cusick, O'Sullivan, 2000; Суходолец и др., 2005). Секвенирование очищенных фрагментов генов 16S рРНК проводили по методу Сэнгера (Sаnger et al., 1977), используя автоматический секвенатор Beckman Coulter. При построении филогенетического дерева использовали последовательности близких по физиолого-биохимическим свойствам референтных штаммов: Lactococcus lactis subsp. lactis AB100798, AB118034, AJ419572, L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis AY920468, AY920469, L. lactis subsp. cremoris AB100792, AB100802, полученные из базы данных NCBI. Секвенирование проводили в ФГУП НИИ генетика.

Для проведения селекционной работы по использованию метода слияния протопластов лактококки инкубировали до ранней стадии экспоненциального роста, обеспечивающей достаточный урожай молодых активно растущих клеток. Клетки отделяли центрифугированием при 1380 g в течение 20 мин, отмывали от среды культивирования стабилизирующим буфером, обрабатывали лизоцимом, растворенным в стабилизирующем буфере в концентрации 1 - 2 мг/л и выдерживали при 37°С в течение 0 -- 60 мин. В некоторых вариантах опыта для усиления действия лизицима клетки перед обработкой лизоцимом выдерживали в буфере с добавлением 0,01% 2-меркаптоэтанола (фирма «Ferak», Германия) в течение 10 -- 30 мин, сочетали действие лизоцима с б-амилазой животного происхождения (фирма «Reanal», Венгрия), ЭДТА (этилен-диамин-тетраацетат-натрия, фирма «Reanal»), как рекомендовано рядом исследователей (Gabor, Hotchkiss, 1979; Стоянова и др., 1987; 1990; Белясова и др., 2002).

Изучали влияние аминокислот, способных включаться в синтез пептидогликана клеточной стенки лактококков по типу аналога D-аланина, на рост культур и процесс протопластирования (Стоянова и др., 1987; Nouaille et al., 2004). Были использованы глицин, лизин, глутаминовая кислота и DL-треонин в концентрации от 0,1% до 1,0 %, которые добавляли в ферментационную среду (Стоянова и др., 1988).

В качестве стабилизаторов были опробованы семь буферных систем, приготовленных на основе трис-НС1-буфера с добавлением 3 мМ MgCl₂ и 0,6 М сахарозы (рН 8,0); 0,9 М КС1 и 0,02 М MgSО₄ (рН 7,5); 0,9 M KC1 и 0,25 М ЭДТА (рН 7,6); на основе TES-буфера с добавлением 5 мМ СаCl₂ и 0,5 М сахарозы (рН 7,2); углеводные: с 0,6 М глюкозы, растворенной в трис-НС1-буфере, с 0,8 М глюкозы в буфере, приготовленном на основе 0,5 М лимонно-кислого трехзамещенного натрия, 1 М аммония хлористого и 0,05 М ЭДТА (рН 6,4).

Способность протопластов регенерировать клеточную стенку изучали при параллельном высеве на гипертоническую среду соответствующих разведений суспензии протопластов, отмытых от лизирующей смеси, в стабилизирующем буфере и воде. Гипертонической регенерационной средой служила двухслойная агаровая среда, приготовленная на основе ферментационной с добавлением в качестве стабилизаторов реагентов: 0,6 М глюкозы: 0,5 M сахарозы; 0,05 M глицина и 0,5 M СаС1₂; 0,5 M СаС1₂; 0,9 M MgSO₄, 0,6 M KCl. Верхний мягкий слой ее содержал 0,8% агар-агара, а нижний - 2,0%. Протопласты, полученные на регенерационной среде, высевали в обрат, культивировали при обычных для L. lactis subsp lactis условиях, изучали их морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства. Параллельно проводили высев протопластов из лизирующей смеси в обрат, изучали возможность развития протопластоподобных L-форм в среде с микродозами лизоцима.

Для слияния протопластов устанавливали маркированность отобранных штаммов по ряду фенотипических признаков: потребность в углеводах, ростовых компонентах и чувствительности к антибиотикам, что послужило основой для составления селективных сред при отборе полученных рекомбинантов.

Жизнеспособные протопласты лактококков, отмытые от лизоцима и ресуспендированные в стабилизирующем аммонийно-цитратном буфере, смешивали перекрестно в том же буфере с добавлением ПЭГ - 6000 (полиэтиленгликоль, фирма «Reanal», Венгрия) и вышеуказанных стабилизаторов, инкубировали при 37°С в течение 20--40 мин. В качестве селективных сред для отбора рекомбинантов служила агаровая ферментационная среда с 1% глюкозы (полноценная среда для гибридов и родительских штаммов), среды с 1% сахарозы, фузидином и низином (100 мкг/мл). Изучали сегрегацию клонов по их низинсинтезирующей активности на разных средах. Полученные гибридные штаммы оценивали по скорости роста, ферментативной активности в отношении сбраживания углеводов, накопления бактериоцинов, спектру антимикробной активности.

Для изучения плазмидного профиля родительских штаммов и гибридных, полученных в результате слияния протопластов, использовали известный электрофоретический метод с выделением плазмидной ДНК с помощью лизоцима, растворенного в 25 мМ трис-НСl (рН 8,0) с добавлением 0,25 М ЭДТА и 30 мкл 20% SDS в 50 мМ трис-HCl (Румер, Лившиц, 1992).

Экспериментальные исследования по использованию индуцированного мутагенеза для повышения низинсинтезирующей способности лактококков были проведены известными методами по традиционным показателям. В качестве объектов служили природный штамм L. lactis subsp. lаctis 119, выделенный из простокваши Экспериментального завода ВНИМИ, штамм F-116, полученный в результате слияния протопластов, и их протопласты. Были использованы ультрафиолетовые лучи (УФЛ) и химические мутагены: нитрозоэтилмочевина (НЭМ) и нитрозогуанидин (НГ).

При обработке химическими мутагенами отмытые от среды молодые культуры экспоненциальной фазы роста и их протопласты ресуспендировали в цитратном буфере (рН 6,4) и обрабатывали раствором НЭМ (20 мг/мл) и НГ (500 мг/мл) в том же буфере, инкубировали при 37°С. Пробы отбирали с разными экспозициями: для НГ - 10, 30, 60, 90 минут , а для НЭМ - 30, 60, 90, 120, 150 минут. Для каждого опыта просчитывали по 120 колоний. Полученные наиболее активные варианты изучали по ряду физиолого-биохимических свойств: динамике роста и синтезу низина, потреблению углеводов, чувствительности к антибиотикам.

В экспериментах по использованию отходов биотехнологичесих производств для синтеза низина был отобран мутантный штамм №10, полученный ступенчатым воздействием УФЛ на природный штамм 119. В работе использовали следующие субстраты: картофельный сок, представляющий собой отход при переработке картофеля на крахмал после отделения крахмала и мезги (Москворецкая овощная база); пермеаты культуральных жидкостей Bacillus subtilis и Aspergillus awamori -- отходы при производстве амилолитического фермента б-амилазы и глюкоамилазы, образующиеся после концентрирования ферментов на ультрафильтрационных мембранах типа УАМ-150П, послеспиртовая барда - отход производства этилового спирта после отгона последнего из сброженного спиртового сусла (Мичуринский спиртзавод); а также фугат культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiaе, являющийся отходом при производстве хлебопекарных дрожжей (Московский дрожжевой завод); обезжиренное молоко (обрат) и сыворотка - вторичное сырье при производстве сливок и творога, получены с производственно-экспериментального завода ВНИМИ. К субстратам, представляющим пермеаты B.subtilis и A.awamori, добавляли глюкозу после стерилизации в виде стерильного 20%-го раствора. В послеспиртовую барду было добавлено осахаренное спиртовое сусло, чтобы общее количество глюкозы в смеси составляло 0,5;1; 2; 3; 4%. Исследования проводили на технологическом стенде ВНИИПБ.

Изучен биохимический состав вышеуказанных субстратов. Количество редуцирующих сахаров в средах определяли по методу Бертрана (Стоянова, 1976); количество аминного азота определяли методом формольного титрования (Плешков, 1968), общего азота -- по методу Несслера, фосфора -- по методу Бриггса, аминокислотный состав анализировали с помощью ТСХ (тонкослойной хроматографии) с применением пластинок «Silufol» (Иванова и др., 1986), сухих веществ -- рефрактометрическим методом, содержание золы -- по методике, изложенной в руководстве (Штыркова и др., 1986). В качестве контроля использовали обезжиренное молоко.

При оптимизации синтеза новых бактериоцинов перспективными штаммами L. lactis subsp. lаctis: природным штаммом 194 и гибридным F-116, изучали влияние компонентов ферментационной среды. Эксперимент проводили по схеме методом изменения количества или исключения составных компонентов среды: уменьшения содержания фосфатов в виде КН₂РО₄ от 2,0 до 0,5%, увеличения содержания или замена углеводного компонента, изменения содержания дрожжевого автолизата, являющегося источником аминного азота, витаминов и нуклеиновых оснований. Динамику роста выделенных штаммов в средах оптимизированного состава изучали в стационарных условиях в течение 24 часов. В качестве факторов, влияющих на продукцию бактериоцинов, исследовали 17 источников углеводов в среде в концентрации 1%, глюкозы и сахарозы в концентрации 2%. Методом дробного исключения одного или нескольких компонентов в среде культивирования установлены отличительные признаки штаммов по усвоению ростовых компонентов. Значительное место в исследованиях занимали вопросы о потребностях лактококков в отдельных аминокислотах, добавляемых в среду культивирования в концентрации 0,01%.

Влияние рН-статирования ферментационной среды на синтез бактериоцина штаммами 194 и F-116 с проводили в стационарных условиях при 30С в колбах объемом 450 мл и в ферментере фирмы LKB объемом 5 л с автоматической стабилизацией уровня рН 10%-ным раствором NaOH на уровне 5,9 - 6,0.

Изучали диссоциацию штаммов L. lactis subsp. lаctis 194 и гибридного F-116 на агаровой среде по характеру диссоциативных изменений их морфологии, а также антибиотическую активность диссоциантов к разным тест-организмам на низин, левомицетин, нистатин. В качестве тест-культур использовали: для низина - B.coagulans, левомицетина - E.coli, для нистатина - A.niger.

Сравнивали способы хранения разных штаммов лактококков в течение длительного хранения (до 24 лет) по стабильности их производственно-важных физиолого-биохимических свойств: жизнеспособности клеток, бродильной и антибиотической активностей. Были использованы различные способы хранения - хранение под вазелиновым маслом, в обрате с частыми пересевами и в лиофильном состоянии. Для повышения устойчивости микроорганизмов к дегидратации при лиофилизации использовали разные криопротекторы: 10% сывороточный альбумин, 30% лошадиная сыворотка, 20% раствор сахарозы, комплексные защитные среды, содержащие (в %): 10 сахарозы + 5 желатины; 1 желатины + 10 сахарозы + 1 глютамата натрия + 0,5 цитрата натрия. Изучали влияние состава защитной среды и способа подготовки бактериальной суспензии на антибиотическую активность и выживаемость лиофилизированных культур (Стоянова, Аркадьева, 2000; Стоянова и др., 2004).

Токсикологические исследования новых бактериоцинобразующих штаммов L. lactis subsp lactis: низинобразующего штамма 119х, гибридного штамма F-116 и штаммов №№ 10, 25, 52, полученных индуцированным мутагенезом, проводили на лабораторных животных (белых мышах и морских свинках) в соответствии с методическими указаниями (11 Государственная фармакопея, 1990; Хабриев, 2005).

В работе по выделению и идентификации бактериоциноподобных веществ использовали штаммы L. lactis subsp. lactis разного происхождении. Для их выделения и очистки использовали в качестве экстрагентов ряд таких растворителей, как ацетон, гексан, н-бутанол, метанол и хлороформ в разных концентрациях (Стоянова и др., 2007).

Для обессоливания экстракта использовали картриджи: Диапак-SO₃Н, Диапак-МПС-200, Диапак-С-16 (ЗАО «БиоХимМак, СТ», Москва). Десорбцию проводили ацетонитрилом и трифторуксусной кислотой в различных концентрациях. Для препаративного извлечения бактериоцинов из культуральной жидкости использовали смесь ацетон -- уксусная кислота -- вода в соотношении 4:1:5. Концентрирование фильтратов проводили на роторном испарителе (UP-1-M3) при +55 - +60°С, 74 об/мин.

Колоночную хроматографию проводили на носителе Kieselgel 60 фирмы «Merck» (ФРГ). Анализ полученных фракций проводили методом ТСХ в системе метанол:вода (96:4) в сочетании с биоавтографией на тест-организмы B.coagulans 429 и B.subtilis АТСС 6633. Спектры снимали на спектрофотометре Shimadzu UV-160 1PC (Japan). Масс-спектры выделенных антибиотиков регистрировали на приборе VISION методом MALDI - TOF в режиме положительных ионов на матрице -- DHB (2,5-дигидрокси-бензойная кислота). Анализ свойств бактериоцинов проводили помощью компьютерной базы данных BNPD (Вerdy, Hungary).

Для подтверждения белковой природы синтезируемых новых антибиотических комплексов были проведены исследования по влиянию специфического ингибитора синтеза белка левомицетина (100 мкг/мл) на рост продуцентов, синтез белка и синтез бактериоцинов. Белок определяли по методу Лоури (Lowry еt al., 1951). Термостабильность бактериоцинов определяли, прогревая экстракты при 55^оС в течение 90, 120, 150 мин, при 100^оС в течение 5, 15 и 30 мин, затем охлаждая и тестируя на антагонистическую активность.

pH-стабильность бактериоцинов определяли, инкубируя экстракты в интервале pH от 2-х до 10 в течение 4 ч, затем разводя в буфере с pH 7 и определяя бактерицидную и фунгицидную активность.

Методом лиофильной сушки наработана опытная партия бактериоцина ЛГС. Параметры сушки: температура замораживания - 40^оС, температура сублимации - 30^оС, максимальная температура продукта - 60^оС. Сравнивали бактериоцин ЛГС с коммерческим препаратом «Nisaplin» фирмы «Aplin & Barrett, LTD» по уровню антибиотической активности и спектру антимикробного действия.

Экспериментальные исследования по апробации бактериоцина ЛГС и гибридного штамма L. lactis subsp. lactis F-116 для хранения охлажденного мяса и рыбы проводили на технологическом стенде ВНИХИ. Сравнивали их эффективность с коммерческим препаратом низина, лизоцимом в концентрации 0,25 %, препаратом ППС-10 (полимерный пленкообразующий состав). Образцы обрабатывали вышеуказанными консервантами посредством распыления на поверхность, упаковывали в пленку под вакуумом и хранили в условиях бытового холодильника при 4С. Были проведены микробиологические исследования образцов рыбы через 5, 10, 15 суток хранения, а мяса - в течение 85 суток с интервалом 7, 10, 20 дней (ГОСТ Р 51448-99). Изучали санитарно-бактериологическое состояние образцов на наличие патогенных микроорганизмов, включая бактерии группы кишечной палочки (БГКП), Salmonella gallinarum, Listeria monocytogenеs, в соответствии с ГОСТ 10444.13-94 и СанПиН 2.3.2.1078-01, определяли присутствие ряда бактерий, способных развиваться при температуре, близкой к 5C, в условиях повышенной влажности: Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Enterococcus sp., споровые аэробные и анаэробные формы, включая бактерии из рода Clostridium, Bacillus cereus, а также дрожжи и плесени.

Изучали возможность использования гибридного штамма L. lactis subsp. lactis F-116 для обессахаривания яичного белка, как предварительного этапа его обработки перед высушиванием, с целью увеличения срока хранения сухого белка. Использовали яичный белок куриных яиц птицефабрики ВНИИПП. Для ускорения процесса ферментации в жидкий яичный белок вносили дрожжевой автолизат в количестве 35 мг% по аминному азоту. По окончании процесса обессахаривания яичный белок подвергался высушиванию тепловой распылительной сушкой на полупроизводственной установке «Ниро-Атомайзер» (Дания). Температура в зоне сушки - 55-60^оС. Количество глюкозы определяли ферментным методом с глюкозооксидазой (Лукомская, Городецкий, 1961; Стоянова и др., 1982). Контроль качества продукта осуществляли по ГОСТ 30 3642-96.

Проводили эксперименты по использованию культуральной жидкости штамма L. lactis subsp. lactis 194, обладающего фунгицидной активностью, для хранения образцов колбасных изделий: сервелат сырокопченый «Зернистый» ТУ 9213038-510-323-26-03, колбаса сырокопченая «Свиная» ГОСТ 16131-86.

Проведена идентификация грибной плесени с поверхности зараженных колбас с использованием классических микологических методов и современных определителей: по типу колоний, цвету, характеру роста, а также по типу конидий, плодового тела, структуре аскоспор (Raper, Fennel, 1965; Hoog еt al., 2000, Klich, 2002).

Образцы колбасных изделий, обсемененные плесневым грибом, были продезинфицированы 70%-ным спиртовым раствором до полного очищения от гриба, а затем опытные образцы были обработаны культуральной жидкостью с антибиотической активностью 4000 МЕ/мл, рН 4,2. Контрольные (без обработки) и опытные образцы вышеуказанных колбасных изделий были заложены на хранение при температуре 10^оС на 2 месяца.

Статистическую обработку результатов всех исследований проводили с использованием компьютерных программ Excel 200 (Microsoft Inc., 1999), Statistica for Windows, v. 5.0 (StatSoft Inc., 1995), рассчитывая среднюю арифметическую, доверительные интервалы, стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (Р<0,05).

4. Результаты исследований и их обсуждение

Выделение природных активных бактериоцинобразующих штаммов мезофильных лактококков и их идентификация.

Национальные кисломолочные продукты смешанного молочнокислого и спиртового брожений, распространенные среди народов Азии, Башкирии, Ирана и других стран помимо вкусовой и питательной ценности обладают рядом свойств, обуславливающих их применение в лечебно-профилактических целях. Одним из определяющих свойств является их высокая ингибиторная активность по отношению патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. При микроскопировании курунги из Бурятии и «Doogh» из Ирана в поле зрения видны дрожжи и молочнокислые бактерий, представленные палочками и кокками, единичными и собранными в цепочки разной длины. В кумысе, полученном из Башкирии, приготовленном на производственной кумысной закваске, лактококки не были обнаружены. Микробиота кумыса из Башкирии состояла из молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и дрожжей Torula lactis (рис.1).

Рис.1. Микробиота курунги (1,2); иранского напитка “Doogh”(3) (электронный сканирующий микроскоп, увеличение 1 х 4000) и кумыса (4) (в световом микроскопе, 1х 900).

Нами разработан метод выделения и дифференциации бактериоцинобразующих штаммов мезофильных лактококков из вышеуказанных продуктов. Из курунги было выделено 36 бактериоцинобразующих штаммов с активностью, рассчитанной по низину, от 450 до 2700 МЕ/мл, отобран штамм К-205 с активностью 2700 МЕ/мл. Из иранского продукта «Doogh» было выделено 25 штаммов мезофильных кислотообразующих молочнокислых бактерий, 4 штамма из их числа обладали высокой бактериоцинпродуцирующей активностью, отобран штамм IR3 с активностью 3400 МЕ/мл (табл.1).

Всего из молока и молочных продуктов разных территориальных зон выделено более 500 штаммов мезофильных бактериоцинобразующих лактококков. Наиболее перспективные были изучены и идентифицированы до подвида Lactococcus lactis subsp. lactis.

Первоначальная идентификация включает комплекс фенотипических признаков, основанных на изучении морфологических и физиолого-биохимических свойств лактококкков (Хоулт и др., 1997; Ленгелер и др., 2005). По морфологии и культуральным свойствам все выделенные бактерии близки к молочнокислым мезофильным бактериям рода Lactococcus. На плотных агаровых средах с гидролизатом молока или синтетической с фосфатом и дрожжевым автолизатом колонии были круглые блестящие с ровными краями диаметром от 1,5 мм до 3,0 мм. При глубинном инкубировании лактококки образовывали колонии лодочкообразной формы.

При росте в обрате штаммы образовывали плотный молочный сгусток за 8-10 час с максимальной кислотностью рН 3,9 - 4,5, что характерно для L. lactis subsp. lactis. Исключение составляли штаммы 119 из простокваши и К-205 из курунги, которые образовывали за это же время сметанообразный сгусток, по консистенции характерный для лактококка L.lactis subsp. cremoris. Для дифференцирования L. lactis subsp. lactis от L. lactis subsp. cremoris и от L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis учитывали характер глубинного роста на плотных средах с гидролизатом молока: L.lactis subsp. cremoris образуют темные круглые колонии на поверхности среды, а L.lactis subsp. lactis bv. diacetylactis - глубинные колонии неправильной формы в виде кусочков ваты; при микроскопировании клетки имели палочковидную форму. К тому же эти подвиды редко встречаются в природных источниках (Фостер, Нельсон, 1987).

Штаммы лактококков, выделенные из молока московского региона, слабо или вовсе не сбраживали пентозы - ксилозу и арабинозу, а также маннит, которых всегда мало в молоке и молочнокислых продуктах (Riley et al., 2002). Но штаммы К-205 из и IR-3, выделенные из курунги и напитка «Doоgh» (соответственно), являющиеся продуктами смешанного молочнокислого и спиртового брожения и вследствие этого адаптированные к спиртовому субстрату, могли сбраживать сахароспирты, в том числе и маннит, что не характерно для L.lactis subsp. lactis, но является дифференцирующим признаком для L.lactis subsp. сremoris (табл.1).

Табл. 1. Отличительные фенотипические признаки бактериоцинпродуцирующих лактококков

Отличительным признаком молочнокислых бактерий является высокая потребность в сложных питательных веществах, пуринах, пиримидинах, аминокислотах, витаминах. Штамм 119 отличался весьма ограниченной потребностью в ростовых компонентах, но пролин и урацил стимулировали его рост (табл.1).

Чувствительность штаммов к антибиотикам является не только фенотипическим признаком, но и обязательным, так как при использовании культур, резистентных к лекарственным препаратам, в пищевой и медицинской практике, плазмиды, несущие гены лекарственной устойчивости, могут передаваться в макроорганизм и патогенные бактерий (Temmreman, 2003; Зигангирова и др., 2006). По результатам изучения чувствительности изучаемых штаммов к антибиотикам было выявлено, что штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез белка: тетрациклину, доксициклину и левомицетину, в меньшей степени к аминогликозидным антибиотикам - канамицину, сизомицину, неомицину и стрептомицину. Все штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки. Чувствительность к пенициллину является видовым признаком для лактококков. Но штамм 194, выделенный из коровьего молока, устойчив к нему, что может быть последствием применения этого препарата при лечении коров.

Важным критерием отбора бактериоцинобразующих штаммов является спектр их антимикробного действия. Выделенные штаммы из молока г. Москвы и г. Клина подавляли рост только грамположительных бактерий, включая спорообразующие бациллы B.subtilis, B.сoagulans, B.mycoides, микрококки M.luteus, M.flavum, S.aureus, что характерно для низина A (препарат «Nisaplin») и низинпродуцирующего лактококка штамм МГУ (табл. 2).

Следует отметить, что лактококки, выделенные из молока и молочных продуктов Бурятии и Ирана, отличались от штаммов Московской области высоким уровнем антибиотической активности, обладали широким спектром антибактериального действия: эффективно подавляли рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий: A.faecalis, P.vulgaris, E.coli, P.aeruginosa, а также мицелиальных грибов: A.niger, P.chrysogenum, F.оxysporum, R.aurantiaca, C.guilliermondii. Ингибирование роста микроскопических грибов, в том числе и дрожжей, является неизвестным биологическим свойством для L.lactis subsp. lactis, и мы обнаружили это лишь у лактококков, выделенных из молока Бурятии и Ирана. Следовательно, имеет место и штаммовая специфичность лактококков по синтезу бактериоцинов. Представленные данные можно рассматривать не только как пример реакции биологической системы на неблагоприятные факторы внешней среды, но и как системы взаимоотношений дрожжей и лактококков в природных экосистемах.

Табл. 2. Антимикробный спектр действия штаммов лактококков разного происхождения.

Рис.2. Родственные взаимоотношения штаммов лактококков, основанные на сходстве нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.

Таксономическое положение выделенных культур классическими микробиологическими методами идентификации бактериоцинобразующих штаммов лактококков было подтверждено генотипическим методом, основанным на анализе сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, как Lactococcus lactis subsp. lactis. Уровень генетического родства всех изучаемых штаммов по отношению к штаммам L. lactis subsp. cremoris составил всего 95,4 - 96,6 %, хотя по ряду физиолого-биохимических признаков штамм 119 был близок к лактококкам этого подвида. Фингерпринты всех штаммов различаются, что свидетельствует о генетических различиях между выделенными штаммами (рис. 2).

Таким образом, используя основной прием селекции микроорганизмов, основанный на естественном отборе активных продуцентов, были выделены из природных источников новые оригинальные бактериоцинобразующие штаммы L. lactis subsp. lactis, проведена сравнительная оценка продуцентов и выбор наиболее перспективных штаммов.

Разнообразие штаммов, имеющих различное географическое происхождение и обладающих сходными функциональными возможностями, является следствием специфических условий, которые формируются в экологической среде их обитания. Полученные результаты вносят существенный вклад в представление о механизмах адаптации лактококков к стрессовым условиям среды обитания и роли этих микроорганизмов в эволюционных процессах.