Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование

Слияние протопластов бактериоцинобразующих лактококков L. lactis subsp. lactis как метод селекции.

В исследованиях, проведенных в последние годы, выявлена принципиальная возможность получения суперпродуцентов биологически активных веществ, в том числе и антибиотиков, а также штаммов с улучшенными технологическими свойствами в результате использования метода слияния протопластов, позволяющего соединить полные геномы и цитоплазмы родительских штаммов с целью передачи им генетической информации. В отличие от генно-инженерных методов при слиянии протопластов вся ДНК может подвергаться рекомбинации, и в случае удачной рекомбинации можно ожидать возрастание «степени новизны» в получении новых продуктов метаболизма. К основным этапам этого метода следует отнести: получение протопластов, собственно слияние, культивирование продуктов слияния в селективных условиях и процесс регенерации полученных рекомбинантов.

Получение протопластов.

Лактококки трудно перевести в форму протопластов общепринятым методом, т. е. с помощью лизоцима. Известно, что клеточная стенка низинпродуцирующих штаммов довольно толстая и в зависимости от кислотности среды культивирования составляет от 31% до 42 % от сухой массы клетки. Причем, низин присутствует в ней не в свободном состоянии, а в виде Ca-низинового комплекса, и большая часть его связана с клеточной стенкой (Hurst, 1981; Steen et al., 2003; Mainardi et al., 2005). В связи с этим нами разработана новая методика получения протопластов у бактериоцинобразующих лактококков, подобраны стабилизирующие буферные системы, среды для регенерации протопластов.

Для повышения чувствительности клеточной стенки лактококков к лизоциму использовали тиоловое соединение 2-меркаптоэтанол, сочетали действие лизоцима с б-амилазой (табл. 3). Прединкубация лактококков в меркаптоэтаноле предполагает, что агент действует не на литический фермент, а на клеточную стенку, в какой-то мере разрыхляя ее, что проявилось в снижении оптической плотности бактериальной суспензии за период инкубации в литической смеси. Количество протопластов у низкоактивных штаммов 729 и 1605 составило 17,6-14,2%, у активных продуцентов (штаммов МГУ и 119) - 20-23,4%. 2-меркаптоэтанол разрушает S - S связи низина, который локализован в клеточной стенке лактококков и является полипептидом с высоким содержанием дисульфидных связей, разрывает дисульфидные связи в поверхностном белковом слое клеточной стенки. При этом высвобождаются различные ферменты, локализованные в районе клеточной стенки, в частности, кислая фосфатаза, что облегчает таким образом доступность глюкановой матрицы для лизоцима.

Внесение в раствор лизоцима в трис-НС1-буфере с 0,25 М ЭДТА способствовало протопластированию всех штаммов. ЭДТА как мембранотропный агент способен изменять или удалять некоторые немуреиновые компоненты клеточной стенки, что сопровождается выходом небольшого количества пептидогликана в среду, а также инициацией гидролиза молодых цепей пептидогликана. Резко снизилась ОП₆₅₀ суспензии штамма 729 на 29,4 %, мутантного штамма 1605 - на 17,4, у штаммов 119 и МГУ - на 19,3 и 23,9 %, соответственно. Сочетание лизоцима с Ь-амилазой в соотношении 1:1 усилило эффективность формирования протопластов: количество протопластов у штамма 729 составило 58%, у 1605 - 35,6%, у штаммов 119 и МГУ - 54,2 и 52,7% соответственно. В данном варианте опыта происходит атака пептидоглюкана по двум связям: лизоцим, являясь ацетилмурамидазой, разрывает в (1>4) связи в пептидогликане клеточной стенки лактококков, б-амилаза действует на б (1> 4) связи в глюкановой матрице.

Более эффективным было предварительное выращивание лактококков в среде с увеличивающимися концентрациями аминокислот (табл. 4).

Табл. 3. Влияние 2-меркаптоэтанола, ЭДТА и б-амилазы на протопластирование штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis с помощью лизиоцима, растворенного в трис-HCl-буфере.

Табл. 4. Влияние оптимальных концентраций L-глицина, L-глутаминовой кислоты, L-лизина и DL-треонина в среде предварительного выращивания на протопластирование штаммов 1605 и 119 L. lactis subsp. lactis.

Аминокислота, поступая извне и включаясь в синтез пептидогликана по типу сродства к аланину или другим мукополимерным аминокислотам, ингибирует образование связей между пептидными субъединицами. Блокирование синтеза мономера с последующей остановкой синтеза полимера ведет к ингибированию роста микроорганизма и образованию «ослабленной» клеточной стенки, аминокислота как бы подготавливает клетку к действию литического фермента. Определены минимально ингибирующие рост концентрации глицина, глутаминовой кислоты, лизина и DL-треонина для протопластирования лактококков, отличающихся по низинсинтезирующей активности (табл. 4). Наиболее благоприятным для протопластирования было предварительное выращивание лактококков в среде с DL-треонином в концентрации 0,1% для штамма МГУ и 0,2% для штаммов 119 и 1605, что способствовало получению до 98% протопластов

Рис. 3. Изменение оптической плотности бактериальных суспензий штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis 729 и 1605 в лизирующей смеси с аммонийно-цитратным буфером и в дистиллированной воде (а). 1 - штамм 729; 2 - штамм 1605.

А Б

В Г

Рис. 4. Электронные микрофотографии Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 119: А -- интактные клетки, выращенные в биосинтетической среде; Б -- интактные клетки, выращенные в той же среде с добавлением 0, 2% DL- треонина; В - протопласты в лизирующей смеси; Г - L- формы (увеличение 1х40000, 1х15000).

Из 7-ми буферных систем для стабилизации протопластов наиболее эффективным для формирования протопластов оказался стабилизирующий буфер, приготовленный на основе натрия лимоннокислого, хлористого аммония и ЭДТА (рН 6,4). По-видимому, сказалось действие ЭДТА и цитрата. По разнице ОП₆₅₀ суспензии протопластов в аммнонийно-цитратном стабилизирующем буфере и в воде судили о степени протопластирования. Процесс протопластирования контролировали в фазово-контрастном микроскопе МБИ-15 и по действию осмотического шока (рис. 3).

В процессе протопластирования интактные клетки превращаются в протопласты. Цепочки стрептококков разрываются, овальная форма их переходит в сферическую. В поле зрения электронного сканирующего микроскопа (рис. 4) видны множественные отдельные протопласты характерной формы, очевидно отсутствие клеточной стенки. Но, следует отметить, что процесс протопластирования происходит не повсеместно. Имеются клетки с неполным лизисом клеточной стенки, так называемые L-формы.

Рис. 5. Уровень антибиотической активности штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis после протопластирования и регенерации. Примечания: 1 -- интактные клетки; 2 -- протопласты; 3 -- регенерированные в среде с ПЭГ; 4 -- регенерированные в среде с ПЭГ и микродозами лизоцима.

Установлено, что протопластирование, регенерация и реверсия протопластов к клеточной форме, может служить методом повышения синтеза бактериоцинов: низкоактивные штаммы 729 и 1605 увеличили синтез низина в 3 раза (рис.5). При этом популяция потеряла способность к утилизации лактозы и галактозы. У активных штаммов-продуцентов эти изменения не были столь очевидны, а незначительное повышение (5 - 6%) может быть следствием высвобождения низина при разрушении клеточной стенки.

Внесение микроколичеств ПЭГа способствует незначительному повышению уровня низинообразования у протопластов штаммов 729 и 1605 на 15-20%. ПЭГ способствует агрегации протопластов, их слиянию, вызывает некоторое увеличение антибиотической активности. Инкубирование протопластов с микродозами лизоцима выявило образование L- форм, у которых синтез бактериоцинов увеличился на 22- 30% (у штаммов 1605 и 729) и на 6% у активного низинсинтезирующего штамма 119х.

Протопластирование лактококков, регенерация протопластов привели к наследственным изменениям, которые могут быть связаны с экспрессией генов, а также с проявлением действия «молчащих» генов, что обнаружилось в фенотипе культур с низкой антибиотической активностью. Нельзя также полностью исключить внутриштаммовое слияние протопластов и, соответственно, рекомбинантные явления перед регенерацией протопластов. Таким образом, протопластирование можно рассматривать как метод селекции микроорганизмов

Цель следующего этапа работы состояла в получении новых гибридных штаммов L. lactis subsp. lactis с помощью метода клеточной инженерии - слияния протопластов. Для образования рекомбинантных форм в результате слияния протопластов необходимы по крайней мере три процесса: цитоплазматическое взаимодействие, взаимодействие ДНК - ДНК, реверсия клеточной формы.

В таблице № 5 обобщены отличительные физиолого-биохимические признаки шгаммов, что послужило основой для составления селективных сред при культивировании и отборе полученных в результате слияния протопластов рекомбинантов. Необходимым условием отбора адаптивных рекомбинантов являлась их исходная неспособность образовывать колонии на данной селективной среде (с сахарозой, низином, фузидиевой кислотой).

Табл. 5. Отличительные признаки штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis, отобранных для слияния протопластов.

В результате исследований по разработке методики слияния протопластов было установлено, что реверсия к клеточной форме зависит от состава компонентов среды. При слиянии с использованием ПЭГ в сочетании с 0,6 М КСl реверсия не произошла, а при использовании 0,6 М глюкозы или сахарозы реверсия имела место.

Количество колоний в первом варианте опыта с использованием в качестве фузагена ПЭГ с глюкозой при слиянии штамма 729 со штаммом 1605 составило 3,2 x10², а с использованием глицина и СаС1₂ - 5,9х10¹. Полученные гибриды обладали способностью к сбраживанию арабинозы, мальтозы, раффинозы, а антибиотическая активность популяции поднялась до уровня активных продуцентов (5150 МЕ/мл).

Во втором варианте опыта, где для слияния были взяты мутантный штамм 1605 и дикий, активный низинообразователь штамм 119, количество колоний на полноценной среде с глюкозой составило 1,3x10⁴, с глицином и СаС1₂ - 3х10², с активностью популяции 3220 МЕ/мл, популяция приобрела устойчивость к низину и фузидиевой кислоте.

В третьем варианте при слиянии штаммов 119 и МГУ были получены гибриды низин- и фузидин-резистентные с активностью 2500 МЕ/мл, т. е. на уровне исходных (родительских). Количество колоний, регенерированных после слияния, с использованием в качестве фузагена ПЭГ с глюкозой было в 10,2 раза больше, чем ПЭГ с глицином и СаС1₂.

Табл. 6. Физиолого-биохимические признаки первичной популяции гибридов, полученных при слиянии протопластов на полноценной среде с глюкозой.

В четвертом варианте гибриды приобрели устойчивость к фузидину по типу родительского штамма 1605, их антибиотическая активность снизилась до 470 МЕ/мл. Результаты показали, что при слиянии протопластов активных бактериоцинобразующих штаммов, как между собой, так и со штаммами с низкой антибиотической активностью, высокоактивные гибриды не были получены. Возможно причина состоит в недостаточной гомологии ДНК-ДНК, а также бактериоциногенности популяций штаммов, отобранных для слияния.

Наиболее эффективные гибриды были получены при слиянии родственных штаммов с низкой антибиотической активностью: штамма 729 и его мутанта, штамма 1605. Активные клоны были получены при подращивании колоний после слияния протопластов на среде с низином: 35% имели активность в интервале 2850 - 3000 МЕ/мл, 26% - от 3850 до 5200 МЕ/мл (рис. 6).

При электронно-микроскопическом исследовании препаратов слившихся протопластов штаммов 729 и 1605 зафиксированы моменты агломерации протопластов, индуцируемой ПЭГ с глюкозой. На рис.7 б нагляден начальный момент слияния - контакт двух сливающихся протопластов с образованием кратерообразного канала, через который происходит слияние цитоплазм. Электронные микрофотографии являются иллюстративным подтверждением состоявшегося процесса слияния протопластов у штаммов лактококков.

Рис. 6. Распределение гибридных клонов по низинсинтезирующей активности после слияния протопластов Lactococcus lactis subsp. lactis родственных штаммов 729 и 1605 на селективных средах с :1 - глюкозой; 2 - сахарозой; 3 - фузидиевой кислотой; 4 - низином.

.а б .

Рис. 7. Электронные микрофотографии слияния протопластов Lactococcus lactis subsp. lactis штаммов 729 и 1605, агломерация протопластов в растворе ПЭГ (а); процесс слияния протопластов (б). Увеличение 1 х 3000 и х 20000 соответственно.

Штаммы, полученные слиянием протопластов, обладали широким спектром антибактериального действия, эффективно подавляли рост не только грамположительных бактерий, но и грамотрицательных, обладали и фунгицидным действием, что является малоизвестным биологическим свойством бактериоцинов, синтезируемых L. lactis subsp. lactis. Следует отметить, что родительские штаммы гибрида имели другой спектр действия: 729 незначительно подавлял рост микрококков, но не подавлял золотистый стафилококк, а его мутант 1605 приобрел антибиотическую активность по отношению к нему, штамм 1605 избирательно подавлял рост дрожжей и мицелиальных грибов (табл.7).

Табл. 7. Антимикробный спектр действия родительских штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis 729, 1605 и их гибридов F-116, F-118, F-119, F-146

Примечание: (Р?. 0,05).

Свойства рекомбинантов стабильно сохранялись после рассева и выделения индивидуальных колоний. При слиянии протопластов происходит перенос как хромосомной, так и плазмидной ДНК, в результате чего формируются не гетерокарионы, а истинные рекомбинанты.

Электрофоретический анализ плазмидных профилей гибридных штаммов F-116 и F-119 показал наличие у них как родительских, так и приобретенных плазмид. Родительский штамм 729 имел 5 плазмид размером 11,4; 7,7; 2,6; 2,1 и 1,8 МДа, а штамм 1605 - 2,0; 3,8; 5,0; 8,0; 35 МДа. Гибридные штаммы, полученные при слиянии протопластов, имели плазмиды 11,4; 9,5 МДа и более мелкие плазмиды в разных комбинациях, присутствующие в обоих родителях. Однако штамм F-116 имел плазмиду 10 МДа, у штамма F-119 отсутствовали плазмиды 7,7 и 5,0 МДа, т. е. этот штамм потерял по одной из родительских плазмид (рис.8).

Рис. 8. Плазмидный профиль штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis.

При компьютерной обработке результатов секвенирования генов 16S рРНК и сравнительном анализе полученных нами последовательностей полученных гибридных штаммов с последовательностями тех же генов вышеуказанных типовых штаммов между ними обнаружилось высокое сходство. Гибридные штаммы F-119 и F-116, показали 100%-ное сходство фрагментов генов 16S рРНК с референтным штаммом L. lactis subsp. lactis АJ4I9572, штаммом МГУ и их родительскими штаммами 729 и 1605 (рис.2).

Использование метода слияния протопластов показало его перспективность для получения штаммов лактококков с повышенной антимикробной активностью и расширенным спектром антимикробного действия. Выделен новый стабильный гибридный штамм L. lactis subsp. lactis F-116 с активностью 4200 МЕ/мл, что в 12-14 раз выше активности родительских штаммов. Высокая частота возникновения вариантов, превышающих по активности исходные штаммы, делает данный метод весьма перспективным для использования в процессе поддерживающей селекции, обогащения популяции штаммов-продуцентов бактериоцинов активными вариантами.

Индуцированный мутагенез лактококков Lactococcus lactis subsp. lactis.

Изучение закономерностей спонтанной и индуцированной мутагенами изменчивости микроорганизмов по синтезу бактериоцинов, разработка условий, повышающих эффективность действия мутагена, имеет исключительно важное теоретическое и практическое значение. Эффективной дозой облучения УФЛ интактных клеток штамма 119 следует считать дозу 76 тыс. эрг/мм², что соотвествовало экспозиции в 10 мин (табл.8).

Табл. 8. Выживаемость Lаctococcus lactis subsp. lаctis 119 в зависимости от времени УФ-облучения

Примечание: к-«+-вариантам» относили клоны, продуктивность которых была выше по отношению к исходной.

После облучения и культивирования на среде с низином наблюдали следующую сегрегацию клонов по антибиотикообразованию: 30% обладали антибиотической активностью от 1500-2000 МЕ/мл, 40% от 2500-3200 МЕ/мл и 15% «+ вариантов» от 3080-3800 МЕ/мл, т.е. произошло увеличение активности на 40,4% (рис.9). В популяции отсутствовали клоны, чувствительные к низину. Довольно высокая концентрация низина замедляет рост микроорганизмов, но оказывает и селективное действие (Литвинова, Силева и др.,1976; Kim et al., 1997).

Рис. 9. Сегрегация клонов штамма Lаctococcus lactis subsp. lаctis 119 по низинобразующей активности при разных дозах УФЛ: А -- спонтанная изменчивость; Б -- сегрегеция клонов на среде с низином; В -- сегрегеция клонов при обработке УФЛ в течение 10 мин; Г -- сегрегеция клонов при двойной обработке УФЛ по 10 мин.

Максимальное накопление низина (4100 МЕ/мл) достигнуто при обработке НЭМ-ой в течение 90 минут и инкубирования штаммов на селективной среде с низином (рис. 10). В результате комбинированного воздействия УФЛ и НЭМ на штамм 119 был отобран вариант № 25 с антибиотической активностью, на 60 % превышающей активность исходного штамма, что составило 4200 МЕ/мл. Данный штамм приобрел способность к утилизации раффинозы, использовал сахароспирты, что не характерно для мезофильных гомоферментативных лактококков. Варианты № 8, полученный однократным воздействием УФЛ, и № 6, полученный обраработкой НЭМой) после лиофилизации и 10 пассажей реветировали к исходному штамму 119 по уровню антибиотической активности и спектру сбраживаемых углеводов.

Рис. 10. Сегрегация клонов штамма Lаctococcus lactis subsp. lаctis 119 по низинобразующей активности при обработке химическими мутагенами: а - сегрегеция клонов при обработке протопластов НГ-ом; б - сегрегеция клонов при обработке интактных клеток НЭМ-ой; в - сегрегеция клонов при комбинированной обработке интактных клеток УФЛ в течение 10 мин и НЭМ-ой.

Стабильные варианты были получены в результате двухступенчатого воздействия УФЛ или комбинированного воздействия УФЛ, НГ и НЭМ на протопластированные клетки штамма 119 (варианты № 10, 11, 25 и 52 с низинсинтезирующими активностями, до 70 % превышающими активность исходного штамма. Полученные варианты ускорили ферментационный процесс синтеза бактериоцинов, изменили спектр сбраживаемых углеводов и устойчивость к аминогликозидным антибиотикам, ингибирующих синтез белка, а именно: сизомицину и канамицину. Мутантные штаммы были низинобразующими. Из этих штаммов ступенчатым воздействием УФЛ был отобран мутантный штамм № 10 для исследований по разработке технологии получения низина. Этот мутантный штамм на базовой среде с глюкозой, разработанной в лаборатории антибиотиков (Баранова и др., 1974), синтезировал низин с активностью 3850 МЕ/мл.

В промышленных условиях для получения низина обычно используют среды, содержащие молоко и молочные продукты, богатые аминокислотами и витаминами. В качестве источников углерода нередко применяют картофельный крахмал, кукурузную муку или другие растительные материалы, отходы ферментативного производства (Лапинска, 1974; Кудряшов и др., 1995).

Использование в качестве ферментационных субстратов отходов биотехнологических производств.

Из данных, представленных в таблице 10, видно, что все испытанные отходы биотехнологических предприятий могут быть использованы для производства пищевого консерванта низина, но лучшими из них являются сыворотка и пермеат культуральной жидкости A. awamori - отход при производстве глюкоамилазы. Уровень низина на основе этого пермеата всего на 4% ниже, чем на сыворотке и достигал 72% по отношению к контролю (обезжиренному молоку). Добавление 0,5% глюкозы увеличивало накопление низина до 77,5%, что даже превысило уровень синтеза низина на основе сыворотки, используемой английской фирмой «Aplin & Barrett, LTD» при производстве препарата «Nisaplin». Использование в качестве ферментационных субстратов вышеперечисленных отходов представляет реальную возможность эффективного решения проблемы защиты окружающей среды при одновременном удешевлении технологического процесса синтеза низина. Но все же наиболее перспективными для биотехнологии следует считать штаммы, синтезирующие бактериоцины, отличные от низина, обладающие широким спектром антимикробного действия.

Табл. 9. Накопление низина Lactococcus lactis subsp. lactis штаммом 10 на субстратах, представленных отходами биотехнологических производств с добавками глюкозы.

Примечания: РВ* - содержание редуцирующих веществ; « - » - измерения не проводили; «Пер к.ж.» - пермеат культуральной жидкости. (Р ? 0,05). Тест - культура - B.coagulans.

Оптимизация синтеза бактериоцинов перспективными штаммами L.lactis subsp. lаctis.

При использовании тех или иных сред для культивирования микроорганизмов важное значение имеет качественная характеристика отдельных компонентов. Вследствие высокой потребности лактококков в биологически активных веществах для синтеза определенного бактериоцина важно выяснить, какой именно компонент ферментационной среды ответственен за рост лактококков и синтез бактериоцина. Известно, что углеводы и фосфаты являются основными необходимыми компонентами для конструктивного и энергетического обмена лактококков.

При изучении влияния разных углеводов на синтез бактериоцинов гибридным штаммом L.lactis subsp. lаctis F-116 и природным 194, синтезирующим бактериоцины широкого спектра антимикробного действия, было установлено, что уровень накопления бактериоцина штаммом 194 в среде с маннозой повысился на 15%, с галактозой, фруктозой - на 10%, а с сахарозой - на 24% по сравнению со средой, содержащей глюкозу (рис. 11).

Рис.11. Влияние углеводов на синтез бактериоцинов штаммами Lactococcus lactis subsp. lactis 194 (1) и F-116 (2).

Наиболее благоприятным углеводом для роста и развития лактококков штамма F-116 была также сахароза: прирост биомассы в среде, содержащей 2% КН₂РО₄ и 1% сахарозы, составил 20,6%, бактериоцинсинтезирующая активность культуральной жидкости была максимальной (рис.12), что согласуется с исследованиями ряда авторов (Klaenhammer, 1993; De Vuyst, 1994).

Источники азота оказывают важное влияние на образование антибиотических веществ микроорганизмами. Обычно в средах для культивирования лактококков источником азота служат белки и продукты их гидролиза - пептоны, гидролизаты, отдельные аминокислоты (Stuart et al., 1999; Koning et al, 2002). В наших экспериментах при исключении из среды дрожжевого автолизата как источника аминного азота, рост культуры и синтез бактериоцина приостанавливался.

Аминокислоты непосредственно участвуют в синтезах структурных белков, различных полипептидов, ферментов, бактериоцинов и антибиотиков белковой природы. Например, треонин, серин, цистеин, лизин и аспарагиновая кислота являются предшественниками лантионина и -метиллантионина, входят в состав молекулы низина (Hurst, 1981; Jensen, Hammer, 1993). Из группы ароматических кислот (триптофан, фенилаланин, тирозин) ни одна не индуцировала синтез. То же можно сказать и об аминокислотах группы серина (глицин, цистеин, цистин), группы пировиноградной кислоты (аланин, валин, лейцин), а также о гистидине. При внесении в среду культивирования штамма F-116 изолейцина мы повысили уровень антибиотической активности на 20,5% (табл.10).

Табл. 10. Влияние аминокислот на рост Lactococcus lactis subsp. lactis штаммов F-116 и 194 и синтез бактериоцина в базовой ферментационной среде (Р ? 0,05).

Для штамма 194 наиболее благоприятной была аспарагиновая кислота, при добавлении которой антибиотическая активность культуральной жидкости увеличилась на 16,6%, а внесениев среду лизина и треонина - на 11%, валина, глутаминовой кислоты, серина - на 6% при почти одинаковом накоплении биомассы. Очевидно, что влияние аминокислот на синтез бактериоцинов у исследуемых штаммов неодинаково, штаммы синтезируют разные антибиотические вещества.

При синтезе большинства веществ микроорганизмы нуждаются в неорганических фосфорсодержащих соединениях в виде фосфат-ионов. Они необходимы для роста микроорганизмов, синтеза многих жизненно важных соединений. Следует отметить, что избыток фосфатов обычно благоприятно влияет на рост биомассы, способствует ассимиляции углеводов, если фосфат выступает как аллостерический регулятор некоторых ферментативных реакций (Novak et al., 1997; Andersen et al., 2001). Однако, во время синтеза, отдельные этапы которого подвержены отрицательному влиянию фосфатов, накопление бактериоцина начинается с момента, когда содержание фосфата в среде снижается (Yother et al., 2002). Изменяя содержание калия фосфорнокислого от 2,0% до 0,5%, мы наблюдали изменение динамики роста штаммов 194 и F-116, а также и уровня антибиотической активности культуральной жидкости (табл.11). При уменьшении количества фосфата в среде от 2% до 0,5% рост культур и синтез бактериоцина снижался.

Существует корреляция между концентрацией фосфора в среде и использованием углеводов из среды культивирования (Безбородов, 1991; De Vuyst, 1994; Chan et al., 2002). Изучение роста и развития лактококков на средах, содержащих 1,0 - 0,5% КН₂РО₄ в сочетании с удвоенным содержанием сахарозы или глюкозы, показало, что за 9 часов инкубирования в среде с 2% глюкозы уровень активности увеличился на 13,8%, при замене глюкозы на сахарозу уровень антибиотической активности увеличился на 24,6%. Дисахарид сахароза - наиболее благоприятный углевод для синтеза бактериоцина.

Внесение в ферментационную среду с уменьшенным содержанием КН₂РО₄ (1%) 70 мг% дрожжевого автолизата, 2 % сахарозы и 0,01 % изолейцина способствовало повышению уровня бактериоцинпродуцирующей активности штамма L. lactis subsp. lactis F-116 на 60%.

Оптимальной средой для штамма 194 была среда, содержащая 0,5 % КН₂РО_4, 2% сахарозы и 0,01% аспарагиновой кислоты, что способствовало повышению синтеза бактериоцина на 59%. Итак, достижение максимального уровня бактериоцинобразующей активности проведено путём оптимизации состава ферментативной среды по фосфору, азоту и углероду.

Табл. 11. Влияние различных концентраций фосфата в ферментационной среде с дрожжевым автолизатом и без него на рост L.lactis subsp. lactis штамма 194 и синтез бактериоцина.

рН-статирование ферментационного процесса на уровне 6,0 способствовало увеличению синтеза бактериоцинов лактококками. В итоге синтез бактериоцина штаммом F-116 был увеличен в 1,9 раза, а штаммом 194 в 1,8 раза (8200 и 6400 МЕ/мл) соотвественно (табл.12).

Табл.12.Влияние рН-статирования ферментационной среды на рост культуры и синтез бактериоцинов природным штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и гибридным штаммом F -116.

Диссоциация продуцентов бактериоцинов Lactococcus lactis subsp.lactis

Интерес представляет изучение диссоциации бактерий штамма 194, отобранного по признаку высокого уровня и широкого спектра антимикробного действия. Было установлено, что этот штамм на агаровой оптимизированной среде диссоциировал на G (мелкие, прозрачные колонии) и S (крупные, белые колонии). Причём вариант G доминировал, составляя около 88% от общего числа анализированных колоний. Более высокой активностью обладали клоны, образующие колонии G-фенотипа. Возможно, что меньший размер и плотность колоний более активных вариантов отражает способность данной клеточной популяции эффективнее осуществлять функцию продукции химических веществ с антимикробным действием, что влияет и на рост самой бактериальной популяции. Диссоциация штаммов L. lactis subsp. lactis на G и S варианты имела место при множественных пассажах на агаровых средах с глюкозой.

Наиболее активными по бактериоцинсинтезирующей активности являлись G-варианты. У G-диссоциантов природного штамма 194 широкого спектра антимикробного действия активность по низину составила 4500 МЕ/мл, по левомицетину - 1630 ед/мл, а фунгицидная активность, рассчитанная по нистатину, - 2200 ед/мл, что на 35,4, 21,8 и 48,5% (соответственно) выше по сравнению с активностью S-вариантов. Гибридные штаммы подвержены диссоциации в меньшей степени. Полученные данные по диссоциации продуцентов позволят проводить его селекцию по целевому признаку.

Оптимизация способов хранения штаммов Lactococcus lactis subsp.lactis -- продуцентов бактериоцинов.

Важной проблемой, решение которой необходимо для обеспечения эффективности биотехнологических производств, является разработка способов длительного хранения культур-продуцентов, обеспечивающих стабильность их жизнеспособности, таксономических показателей и уровня их физиолого-биохимической активности.

Табл. 13. Влияние состава защитной среды на выживаемость Lactococcus lactis subsp.lactis гибридного штамма F-116 в процессе лиофилизации.

В зависимости от состава защитной среды выживаемость штамма F-116 варьировала от 30% до 90% (табл. 13). В лиофилизированной культуре антибиотическая активность сохраняется на уровне исходной при использовании защитной среды на основе сахарозы, желатины с добавлением глутамата и цитрата. В процессе лиофилизации количество жизнеспособных клеток изменилось незначительно: выживаемость составила в среднем 40 - 50%. Наибольший уровень выживаемости клеток наблюдали у штамма 194, которая составляла 51,6%, наименьший - у штамма МГУ - 40,5%. Наблюдалась некоторая тенденция к снижению антибиотической активности у лиофилизированных культур, что, возможно, связано с повреждением нуклеиновых кислот, внутриклеточных белков, пептидов в процессе лиофилизации (Демина, Лысенко, 1989), либо с накоплением в популяции неактивных диссоциантов (Милько, Егоров, 1992; Милько и др., 2007), которая может иметь место при анабиозе культур. Однако после второго, третьего пассажей культур в обрате физиолого-биохимическая активность изучаемых штаммоов полностью восстановлена: плотный молочный сгусток образовался через 10 часов инкубирования, антибиотическая активность достигла исходного уровня (до лиофилизации).

Результаты исследования свидетельствовали, что лиофилизация обеспечивала длительную жизнестойкость культур молочнокислых бактерий (до 24 лет). Для полного восстановления физиолого-биохимических свойств лиофильно высушенных культур требовалось подращивание их в обрате как элективной среде их обитания.

Выполненные токсикологические исследования на экспериментальных животных показали отсутствие токсичности у новых выделенных штаммов: низинобразующего штамма 119х, гибридного штамма F-116, штаммов № 10, 25, 52, полученных в результате индуцированного мутагенеза (Заключения о патогенности имеются в приложениях к диссертации).

Выделение, очистка и идентификация бактериоцинов, синтезируемых перспективными штаммами L. lactis subsp. lactis.

Разработана схема выделения и очистки новых бактериоцинов, синтезируемых лактококками, включающая экстракцию, реэкстракцию и кристаллизацию (Стоянова и др., 2007).

Сравнительное изучение бактериоцинов, образуемых штаммами L. lactis subsp. lactis разного происхождения показало, что бактериоцины, синтезируемые штаммами 119х и штаммом МГУ, по физико-химическим свойствам не отличались от низина А, обладали основными свойствами, мигрировали к катоду, являлись катионными полипептидами, были термоустойчивы (рис. 12).

Рис.12. Тонкослойная хроматография бактериоциноподобных комплексов, продуцируемых гибридным штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis F-116, его родителями в сравнении с низином и низинобразующими штаммами МГУ и 119х. Система MeOH-H₂O (96:4). Биоавтография на пластинках “Silufol”, тест-организм - B.coagulans.

Из культуральной жидкости гибридного штамма L. lactis subsp. lactis F-116 был выделен антибиотический комплекс, представляющий собой сложную смесь биологически активных компонентов и состоящий из фракций ЛГС-Н, ЛГС-С и ЛГС-В.

Физико-химические и биологические свойства компонентов антибиотического комплекса, синтезируемого гибридным штаммом F-116 представлены в таблице 14.

Табл. 14. Физико-химические и биологические свойства компонентов антибиотического комплекса, образуемого штаммом L. lactis subsp. lactis F-116

Примечания:.^*/ Получены из фракции ЛГС-Н методом препаративного электрофореза на бумаге в электролите Е₁, 550 В, 2,5 ч. Проявление реактивом Паули и биоавтографией с использованием тест-организмов B.subtilis и B.coagulans.^**/ Представлено расстояние, пройденное веществом от стартовой линии к катоду, в см: «0 см» (на линии старта) - электронейтральное вещество; «3,3-11 см» ( миграция к катоду) - вещество оснувного характера.

Анализ свойств этого комплекса с помощью физико-химических анализов и компьютерной базы данных BNPD позволяют сделать следующие выводы:

1. Фракции относятся к различным классам органических соединений.

2. Основным компонентом бактериоцина ЛГС является электрофоретически неподвижная фракция ЛГС-Н, распадающаяся в кислой среде на две субъединицы с молекулярными массами 3353 и 3161,6 Да. По химической структуре и антибиотическому действию фракция ЛГС-Н идентичена полипептидному антибиотику низину А, основному компоненту коммерческого препарата “Nisaplin”, не содержит ароматических группировок (ИК- , УФЛ-спектры, отсутствие реакции Паули).

3. Компоненты ЛГС-В и ЛГС-С в литературе не описаны и, по нашим данным, являются новыми природными биологически активными веществами. На основании проведенных физико-химических исследований компонент ЛГС-В (R_f = 0,83) отнесен к группе алкилароматических кетонов, содержащих также гидроксильные группы, является низкомолекулярным гидрофобным соединением (М 506 Да) и обладает широким спектром антимикробного и фунгицидного действия.

Из природного штамма L. lactis subsp. lactis 194 был выделен антибиотический комплекс, представляющий собой смесь трех биологически активных компонентов.

Табл. 15. Физико-химические и биологические свойства компонентов антибиотического комплекса, образуемого штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis 194 в сравнении низином.

Основной фракцией этого комплекса является гидрофобная фракция 194-В с молекулярной массой 1995 Да. Она содержит нуклеотидно-пептидные связи, близкая по R_f и биологическому действию к низину (табл.15). Фракция Б - электронейтральное в кислой среде алифатическое соединение с двойными связями, обладало незначительной антибиотической активностью в отношении грамположительных бактерий.

Фракция А - это низкомолекулярное алифатическое соединение, содержащее кетонную группу, двойные связи, обладающее широким спектром антимикробного действия, является новым не описанным в литературе природным соединением с молекулярной массой 607,5 Да (табл.15).

Низкомолекулярные гидрофобные компоненты новых бактериоцинов отнесенные к группе алкилароматических кетонов, содержат реакционноспособные ненасыщ...