Показана динамика аутоантител, ревматоидного фактора и криоглобулинов у больных с острыми вирусными гепатитами на ранних этапах инфекционного процесса. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С выявлены аутоантитела, криоглобулины и ревматоидный фактор в высоких титрах.

Установлено, что наличие аутоиммунных проявлений у больных ОВГ не зависят от выраженности цитолитического синдрома.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Проведено клиническое обследование 606 больных вирусными гепатитами различной этиологии, из них 447 больных острыми вирусными гепатитами (167 больных ОВГА, 125 ОВГВ, 137 ОВГС, 18 ОВГД) и 159 больных хроническими вирусными гепатитами (15 больных ХВГВ и 144 ХВГС) на базе ИКБ №2 г. Москвы с 1997-2008 г.

Больные были разделены на группы по степени тяжести в соответствии с инструкцией Министерства Здравоохранения СССР № 408 от 12.07.88г и приказу Комитета Здравоохранения г. Москвы №283 от 06.07.2000г «О совершенствовании медицинской помощи больным вирусными гепатитами» (таблицы 1,2).

Больные острыми вирусными гепатитами обследовались двухкратно: в разгар клинических проявлений, на высоте выраженности интоксикационного синдрома (1 период) и в периоде ранней реконвалесценции, т.е. в момент клинического выздоровления, но на фоне отсутствия полной нормализации биохимических показателей функции печени (2 период). Больные хроническими вирусными гепатитами обследовались однократно.

В целях верификации этиологии вирусного поражения печени определялись серологические маркеры в сыворотке крови методом ИФА: HBsAg, anti-HBcor IgM, anti-HAV IgM, anti-HCV IgM, anti-HCV IgG, anti-HDV IgM, anti-HDV IgG. Для дополнительного подтверждения диагноза ОВГС в сыворотке крови этой группы больных определяли белки core, NS3, NS4, NS5.

Активная репликация вируса у больных хроническим вирусным гепатитом С подтверждена полуколичественным методом ПЦР на HCV-РНК в сыворотке крови с определением генотипа вируса. Всем больным с хроническим вирусным гепатитом В был выполнен полуколичественный анализ для выявления HBV-ДНК методом ПЦР в сыворотке крови.

Методом непрямой иммунофлуоресценции установлены ASMA, AMA, ANA (набор реагентов ATS COMVI-I IMMCО Diagnоstic СШA). Anti-LKM-1 были определены методом иммуноферментного анализа (набор реагентов ImmuLisa Anti-Liver-Kindey Microcomal (аnti-LKM-1) Antibody ELAISA IMMCO Diagnostic СШA). Криоглобулины исследованы качественным визуализационным методом. Ревматоидный фактор (РФ) определялся в сыворотке полуколичественным методом латекс_агглютинации на слайде производства фирмы HUMAN (Германия) в соответствии с рекомендациями фирм производителей.

Для оценки цитокинового профиля у больных острыми и хроническими вирусными гепатитами изучена концентрация цитокинов (ИФН-б, ИФН-г, ФНО-б, ИЛ-1в, ИЛ-4, ИЛ-6) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (тест-системы ООО «Протеиновый контур» С-Петербург), а у больных с ХВГ также спонтанная и стимулированная NDV и ФГА продукции данных цитокинов МНПК. Иммунный статус у больных ХВГ изучен с помощью определения CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 антигенов методом иммунофлюоресценции. Данные исследования проведены в лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (зав. лабораторией д.м.н., проф. М.В. Киселевский).

Больным с ХВГ проводилась аспирационная пункционная биопсия печени по Менгини с последующим гистологическим и морфологическим исследованием полученных биоптатов печени. Полученные гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином для выявления лимфоидной инфильтрации печени и пикрофуксином по Ван-Гизону для выявления соединительной ткани. В лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН методом иммуногистохимии на криосрезах и иммуноцитохимии на мононуклеарных клетках, выделенных из биоптатов, определяли иммунофенотип клеток печени. Из мононуклеарных лейкоцитов гепатобиоптатов были приготовлены мазки, которые окрашивались эозин-азуром по Романовскому-Гимза и по Браше с контрольной обработкой РНК-азой. Световую микроскопию и фотографирование иммунных клеток печени в окрашенных мазках проводили с помощью фотовидеосистемы Axioplan 2 (фирмы Carl Zeiss, Германия).

Проводили традиционные общеклинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, а также по показаниям проводилось ультразвуковое исследование печени.

Таблица 1. Распределение больных острыми вирусными гепатитами А, В, С и Д по тяжести течения заболевания, полу и возрасту

Таблица 2. Распределение больных хроническими вирусными гепатитами В и С по возрасту и полу

Результаты клинических и лабораторных исследований внесены в карты индивидуального обследования. При статистической обработке результатов исследования количественные признаки выражались как M ± s (среднее ± стандартное отклонение). Частотные признаки (число лиц с наличием или отсутствием признака) выражались в процентах. Для выявления межгрупповых различий при условии нормального распределения количественного признака использовался критерий Стьюдента, в других случаях применялись методы непараметрической статистики: критерий І, коэффициент корреляции Пирсона (r) и Спирмена (rS) Все различия считались достоверными при значении p<0,05. Статистическая обработка данных проводилась с использованием стандартного пакета программ Statistica for Windows (2000, версия 6.0) фирмы Statsoft Inc. и пакета программ Microsoft Exсel (2003) корпорации Microsoft.

Результаты исследований и их обсуждение.

В результате проведённого исследования, у больных ОВГА, ОВГВ, ОВГС и ОВГД нами установлено наличие аутоантител на раннем этапе клинических проявлений, в разгар интоксикации (в 1-ом периоде) и в периоде ранней реконвалесценции (во 2-ом периоде).

Среди больных ОВГА в разгар клинических проявлений АSMA определялись в диагностических тирах у 50% больных легкого и 70,8% больных ОВГА среднетяжелого течения, в периоде ранней реконвалесценции у 42,9% и 63% соответственно; АМА диагностировали у 25% больных легкого течения и у 17% больных среднетяжелого течения в 1-ом периоде, а во 2-ом периоде у 14,3% и 6,2% больных соответственно. ANA обнаружили у больных ОВГА легкого течения в 1-ом периоде у 7,2% и во 2-ом периоде у 3,6% больных, у больных среднетяжелого течения у 4,6% больных в 1-ом периоде и у 6,2% больных во 2-ом периоде (таблица 3). По сравнению с АSMA и АМА ANA определялись реже (до 4 больных). Однако, ANA диагностировали как среди больных ОВГА легкого, так и среднетяжелого течения в разгар клинических проявлений и в периоде ранней реконвалесценции в тирах от 1:5 до 1:80. Следует отметить, что среди больных ОВГА легкого течения ANA в 1 периоде выявляли в титре 1:40 и 1:80, во 2-м периоде в титре 1:40, а среди больных среднетяжелого течения от 1:5 до 1:40, причем титр 1:40 диагностировали только во 2 периоде заболевания. ANA - антитела против основных компонентов ядра клетки (нуклеопротеида и белка хроматина) и появляются они при более глубокой деструкции гепатоцитов. Невысокая частота выявления ANA от 3,6% до 6% среди больных ОВГА свидетельствует об отсутствии длительного течения цитолитического синдрома с выраженной деструкцией гепатоцитов до ядерного материала, что подтверждает патогенез ВГА, для которого характерна кратковременная вирусемия, сопровождающаяся непродолжительным цитолизом без глубоких деструктивных поражений паренхимы печени (Шейлок Ш. 1999), сменяющаяся быстрой элиминацией вируса.

Существуют различные точки зрения на патогенетическое значение аутоантител, причем часть авторов считает, что они не имеют клинического значения (Fried M.W,et al. 1993, Meyer zum Buschenfelde K.H. et al. 1995.), другие же указывают на развитие аутоиммунного гепатита 1 типа после перенесенного ВГА как у взрослых (Vento S. et al. 1991, Clifford BD. .et al.1995, Tagle Arrospide M., leon Barua R. 2003), так и у детей (Huppertz H.I. et al. 1995), причём вирус гепатита А выполняет роль триггера в развитии АИГ.

Таблица 3. Частота выявления аутоантител у больных ОВГА

Таблица 4. Сравнительная характеристика биохимических показателей больныхОВГА легкого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания.

**- достоверные различия между группами больных

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания.

**- достоверные различия между группами больных

Рисунок 1. Распределение криоглобулинов у больных ОВГА в зависимости от тяжести течения заболевания.

Рисунок 2. Распределение ревматоидного фактора у больных ОВГА в зависимости от тяжести течения заболевания

Рисунок 3. Частота выявления аутоантител у больных ОВГД тяжелого течения

В связи с этим представляло интерес изучить динамику биохимических показателей цитолиза гепатоцитов у больных с наличием иммунных нарушений и при их отсутствии в сопоставлении с тяжестью заболевания (таблицы 4-7).У больных ОВГА легкого течения с наличием аутоиммунных нарушений и без аутоиммунных проявлений показатели цитолиза (АЛТ, АСТ), уровень ГГТ достоверно не отличались. Также не было достоверных различий в показателях уровнях билирубина и общего белка. Уровень ЩФ у больных с аутоиммунными нарушениями был выше по сравнению с группой больных без аутоантител в 1 и 2-ом периоде. Известно, что образование АМА связано с перекрестными реакциями антигена клеток желчных протоков и микроорганизмов (Шерлок Ш. 1999, Чепель Э. 2008) и сопровождается нарушением оттока желчи и накоплением её в канальцах, возможно, из-за разрушения желчных протоков среднего калибра. АМА перекрестно реагируют с субклеточным компонентом грамотрицательных и грамположительных бактерий, белки чувствительные для АМА выявляются в некоторых видах энтеробактерий и вероятно эти аутоантитела изначально направлены против антигенов энетробактерий (Шерлок Ш. 2002), возможно с этим и связан большой процент встречаемости синдрома холестаза у взрослых. Следовательно, у больных с аутоиммунными нарушениями риск развития холестаза выше

У больных ОВГА среднетяжелого течения с наличием аутоиммунных нарушений уровень билирубина был достоверно выше в 1 периоде заболевания (p<0,05) по сравнению с группой больных среднетяжелого течения без аутоиммунных нарушений. Достоверных различий в показателях цитолиза (АЛТ, АСТ), уровнях ГГТ, ЩФ и общего белка между больными ОВГА с аутоантителами и без них не было (таблицы 6-7).

При ОВГА описаны системные иммунные нарушения в виде криоглобулинемии (КГ), появление ревматоидного фактора (РФ), развитие васкулитов, нефрита.

Поэтому представляло интерес изучить динамику уровня КГ и РФ у 20 больных ОВГА легкого течения и у 25 больных ОВГА среднетяжелого течения в сыворотке крови в 1-ом и 2-ом периоде заболевания. Было установлено наличие КГ у 45% больных ОВГА легкого течения в 1-ом периоде и у 15% во 2-ом периоде, у больных ОВГА среднетяжелого течения КГ были определены у 64% больных в 1-ом периоде и у 36% больных во 2-ом периоде (рисунок 1). У 45% больных ОВГА легкого течения и 64% больных среднетяжелого течения было установлено наличие КГ в 1-ом периоде и выявлен мочевой синдром ("мочевой синдром" входит протеинурия, гематурия, лейкоцитурия и цилиндрурия), который сохранялся к моменту реконвалесценции у 15% больных ОВГА легкого течения и 36% больных среднетяжелого течения. Полученные нами данные свидетельствуют, что у больных ОВГА развитие мочевого синдрома, вероятно, связано со смешанной криоглобулинемией, так как первый тип мембранопролиферативного гломерулонефрита в настоящее время ассоциируется с вирусной инфекцией (Crovatto M. et al. 2002).

РФ установлен у 6 (30%) больных ОВГА легкого течения в 1-ом периоде наблюдения и у 4 (20%) во 2-м периоде. В группе больных ОВГА среднетяжелого течения РФ выявлен у 11(44%) больных в 1-ом периоде наблюдения и у 7 (28%) во 2-ом периоде (рисунок 2). Частота выявления РФ в диагностических титрах как в 1-ом, так и во 2-ом периоде заболевания достоверно выше у пациентов группы среднетяжелого течения. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что подобные аутоиммунные проявления возникают уже на ранних стадиях ОВГА, что совпадает с единичными сообщениями, имеющимися в доступной нам литературе.

Среди больных ОВГВ аутоантитела определялись у больных среднетяжелого течения. При обследовании 42 больных ОВГВ среднетяжелого течения мы обнаружили АSMA у 69% из них в 1-ом периоде и у 62% во 2-ом периоде, ANA у 4,7% больных только в 1-ом периоде и ни у одного больного во 2-ом периоде, AMA мы не установили ни в 1-ом ни во 2-ом периоде (таблица 8).

Наличие аутоантител при острых вирусных гепатитах в разгар клинических проявлений объясняется массивным распадом гепатоцитов и обнаружение этих аутоантител отражает выраженность цитолитического синдрома. Следовательно, отсутствие аутоантител при ОВГВ легкого течения можно объяснить тем, что время обследования этих больных совпало с периодом стихания интоксикационного синдрома и купированием синдрома цитолиза.

У больных ОВГВ среднетяжелого течения с наличием аутоиммунных нарушений и без аутоиммунных проявлений показатели цитолиза (АЛТ, АСТ) достоверно не отличались, также не было достоверных различий в показателях уровня билирубина (таблица 9). Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии прямой зависимости аутоиммунных нарушений от распада гепатоцитов. Появление аутоантител, вероятно, связано с активацией аутореактивных Т-клеток путем молекулярной мимикрии собственных антигенов высоким уровнем вирусемии.

При обследовании 18 больных ОВГД тяжелого течения на наличие АМА, ASMA и anti-LKM-1 были обнаружены АМА в титре 1:160 у 11% больных, ASMA в титре 1:160 и anti-LKM-1у 1 5,5% больных как в 1-ом, так и во 2-ом периоде (рисунок 3). Обнаружение АМА и ASMA в высоких титрах у больных ОВГД подтверждает общепринятое мнение о выраженной деструкции гепатоцитов при ОВГД.

У больных ОВГС аутоантитела определялись как у больных легкого, так и среднетяжелого течения. Среди 43 больных ОВГС легкого течения мы обнаружили АSMA у 23,3% из них в 1-ом периоде и у 9,3% во 2-ом периоде, ANA у 4,7% больных в 1-ом периоде и у 3 7% больных во 2-ом периоде, AMA выявили у 16,2% больных в 1-ом периоде и не обнаружили ни у одного больного во 2-ом периоде, анти-LKM-1 мы не выявили в разгар клинических проявлений и только в периоде реконвалесценции обнаружили у 2,3% больного. При обследовании 92 больных ОВГС среднетяжелого течения мы установили АSMA у 29,3% больных в 1-ом периоде и у 15,2%во 2-ом периоде, ANA в 1-ом и во 2-ом периоде определялся у 4,3% больных, AMA выявили у 15,2% больных в 1-ом периоде и у 4,3% больных во 2-ом периоде, аnti-LKM-1 были установлены у 3,3% больных в разгар клинических проявлений и сохранялись к периоду реконвалесценции (таблица 10).

Обнаруженные АSMA, АМА и ANA в разгар клинических проявлений у больных ОВГС легкого течения отражают выраженность цитолитического синдрома в результате деструкции гепатоцитов, что косвенно подтверждается отсутствием ANA и исчезновением у основного числа пациентов АSMA и АМА к периоду реконвалесценции в результате раннего купирования синдрома цитолиза.

Выявление у больных ОВГС среднетяжелого течения АSMA, АМА и ANA как в 1-ом, так и во 2-ом периоде - это следствие продолжающейся персистенции HСV, в результате которой происходит активация аутореактивных Т-клеток путем молекулярной мимикрии собственных антигенов с антигенами вируса. АМА, как правило, выявляются редко и в низких титрах.

Таблица 10. Частота выявления аутоантител у больных ОВГС

Таблица 11. Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ОВГС легкого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания.

**- достоверные различия между группами больных

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания.

**- достоверные различия между группами больных

В нашем исследовании АМА диагностировались только в 1-ом периоде заболевания. Известно, что у млекопитающих и бактерий есть общность митохондрий, особенно у грамотрицательных энтеробактерий, что может обусловливать перекрестные реакции АМА с субклеточными компонентами грамотрицательных бактерий, в избытке циркулирующих у больных ОВГ при недостаточной дезинтоксикационной функции печени в разгар инфекционного процесса (Шерлок Ш. 2002). Возможно, что АМА с самого начала направлены против антигенов энтеробактерий, и таким образом поддерживают аутоиммунный процесс. Следовательно, появление АМА объясняется перекрестными реакциями с субклеточными компонентами грамотрицательных бактерий, которые активируются в толстом кишечнике в разгар интоксикации. Обнаружение aнти-LKM-1 напрямую связывают с молекулярной мимикрией между антигенными структурами квазивидов вируса и эпитопами клеток хозяина. У обследованных нами больных ОВГС легкого течения aнти-LKM-1 определялись только во 2-ом периоде, т.е. при длительной персистенции HCV вируса и достаточном уровне вирусемии, обеспечивающем в результате сходства антигенов HCV с эпитопами клеток хозяина аутореактивность цитолитических лимфоцитов на эпитопы цитохрома Р450 2Д (Kamm...